Lispro ublažava p-amiloide i pridružene patologije kod alzheimerovih miševa | stanična smrt i bolest

Lispro ublažava p-amiloide i pridružene patologije kod alzheimerovih miševa | stanična smrt i bolest

Anonim

teme

  • Alzheimerova bolest
  • Patologija
  • farmakokinetika
  • fosforilacija

Sažetak

Litij se u Sjedinjenim Američkim Državama prodaje od 1970-ih kao lijek za bipolarni poremećaj. U novije vrijeme, istraživanja su pokazala da litij može poboljšati kognitivni pad povezan s Alzheimerovom bolešću (AD). Međutim, trenutna litijeva farmaceutska farmaceutska sredstva (karbonatni i citratni kemijski oblici) koju su odobrile američke agencije za hranu i lijekove imaju uski terapeutski prozor i nestabilnu farmakokinetiku koja bez pažljivog praćenja može uzrokovati ozbiljne štetne učinke. Ovdje smo istražili sigurnosni profil, farmakokinetiku i terapijsku učinkovitost LISPRO (ionski kokristal litij-salicilata i l-prolina), litijev salicilat i litij-karbonat (Li2CO3). Otkrili smo da LISPRO (oralni tretman u trajanju od 8 tjedana) smanjuje β- amiloidne plakove i fosforilaciju tau smanjujući neuroinflamation i inaktivirajući glikogen sintaza kinazu 3 β u transgeničnim Tg2576 miševima. Naime, citokinski profili iz mozga, plazme i splenocita sugerirali su da 8-tjedno oralno liječenje LISPRO-om smanjuje protuupalne citokine, pojačava protuupalne citokine i suzbija bubrežnu ciklooksigenazu 2 u transgeničnim miševima Tg2576. Farmakokinetičke studije pokazale su da LISPRO omogućuje značajno višu razinu litija u mozgu i stalniju razinu litija u plazmi i u B6129SF2 / J (dvotjedni oralni tretman), i na transgenični Tg2576 (8-tjedni oralni tretman) miševima u usporedbi s Li2CO3. Oralna primjena LISPRO-a tijekom 28 tjedana značajno je smanjila β- amiloidne plakove i tau-fosforilaciju. Pored toga, LISPRO je značajno povisio pre-sinaptičku (sinaptofizin) i post-sinaptičku proteinu (post-sinaptički protein 95) u mozgu od transgenih 3XTg-AD miševa. Uzeto zajedno, naši podaci sugeriraju da LISPRO može biti vrhunski oblik litija s poboljšanom sigurnošću i djelotvornošću kao potencijalnim novim lijekom za modificiranje bolesti protiv AD.

Glavni

Alzheimerova bolest (AD) nepovratno utječe na pamćenje i kogniciju, a jedno je od najkritičnijih briga za javno zdravlje starijih osoba. Izvanstanični amiloidni plakovi (uglavnom amiloid- β , A β ) 1 i intracelularni neurofibrilarni slojevi (NFT-ovi; upareni spiralni filamenti hiperfosforiliranog tau) 2 su neuropatološke oznake AD-a, koje snažno utječu na hipokampus i neokortex. 3 Trenutno je američka Uprava za hranu i lijekove (FDA) odobrila inhibitore acetilkolinesteraze (tj. Donepezil, rivastagmin i galantamin) i / ili N- metil d-aspartat antagoniste (tj. Memantin) za AD intervenciju. 4 Međutim, nijedna farmakološka ili nefarmakološka intervencija nije u potpunosti dostupna koja bi bila učinkovita u sprječavanju ili usporavanju napredovanja bolesti. Stoga, veliki broj pacijenata s AD-om i onih koji pružaju njegu hitno čekaju bolje alternative.

Litij se koristi za liječenje manije i depresije od sredine 20. stoljeća 5., i unatoč pojavi novih lijekova, još uvijek se smatra zlatnim standardom u liječenju bipolarnog poremećaja. 6, 7 Iako je litij trenutno odobren kao FDA stabilizator raspoloženja za liječenje bipolarnog poremećaja, također se uobičajeno propisuje bez oznaka za druge neuropsihijatrijske simptome, uključujući suicidnost i impulzivnu agresiju, 6 kao i neurodegenerativne bolesti poput AD. 8 Nunes i kolege primijetili su u 18-mjesečnom kliničkom istraživanju da su pacijenti s AD-om svakodnevno liječeni mikro dozama litija obavljali na konzistentnoj razini pregled mini-mentalnog statusa, što ukazuje na zaustavljeni pad kognitivnog sustava u usporedbi s placebo skupinom. 9 Štoviše, Forlenza i kolege izvijestili su u svojoj jednogodišnjoj kliničkoj studiji da pacijenti s amnestičnim blagim kognitivnim oštećenjem liječenim kroničnim litijem s malim dozama napreduju prema AD u usporedbi s placebo skupinom. 7 Liječeni bolesnici imali su veći stupanj kognicije na skali za procjenu AD i imali su smanjene koncentracije fosforiliranog taua u svojoj cerebrospinalnoj tekućini (CSF), što ukazuje na litij kao potencijalno terapijsko sredstvo za AD. 7

Nekoliko mehanizama može biti podloga potencijalne učinkovitosti zaštite od litija za AD (vidi sliku 1). Važan mehanizam litija je taj da on inhibira određene enzime na nekompetitivan način zamjenjujući potreban dvovalentni kation, magnezij. 10 Klein i Melton identificirali su glikogen sintaza kinazu 3 β (GSK3 β ) kao jednu takvu molekularnu metu litija. 11 U kontekstu AD, ovaj enzim fosforilira tau u najviše serinskih i treoninskih ostataka u uparenim spiralnim vlaknima. Aktivnost GSK3 doprinosi i produkciji A β i smrti neuronskih stanica posredovanih Ab. 12 P je izveden iz proteina amiloidnog prekursora (APP) sekvencijalnom proteolizom, kataliziranom enzimom cijepanja proteina aspartil proteaze β-mjesto amiloidnog prekursora prekida, a potom proteolizom γ-sekretaze ovisne o presenilinom. 13 Terapeutske doze litija blokiraju proizvodnju A β peptida interferirajući s cijepanjem APP-a na γ-sekretaznom koraku, bez inhibicije obrade Notch, ciljajući na GSK3 α . 14 Litij također blokira nakupljanje A β u mozgu miševa koji prekomjerno eksprimiraju APP inhibicijom GSK3P, implicirajući njegov zahtjev za maksimalnom obradom APP. 15 Kako GSK3 β također fosforilira tau protein, inhibicija GSK3 β nudi novi pristup smanjenju stvaranja i β- amiloidnih plakova i NFT-a. Zanimljivo je da kombinirani transgeni miševi koji prekomjerno eksprimiraju GSK3 β s transgeničnim miševima koji izražavaju tau s trostrukom frontotemporalnom demencijom s mutacijom parkinsonizma-17 razvijaju prefibrilarne tau-agregate koji su spriječeni litijem. 16

Image

Shematski prikaz staničnog i molekularnog mehanizma usmjerenog prema litiju aktiviranjem nekoliko neurotrofičnih i pridruženih signala kod Alzheimerove bolesti. Litij inhibira GSK3 (i α i β izoformu) i aktivnost inozitola mono / polifosfataze (IMPase, IPPase). Inhibicija GSK3 litijem smanjuje tau fosforilaciju i proizvodnju A β peptida interferiranjem γ -sekretaznog cijepanja APP obrade. Nadalje, inhibicija inozitol monofosfaze litijem može regulirati klirens agregiranog fosforiliranog tau i A β peptida. Nadalje, litij povećava ekspresiju BDNF, što aktivira ERK / MAPK put i dodatno povećava ekspresiju elementa odgovora cAMP faktora nuklearne transkripcije (CREB). Prema tome, aktivacija BDNF-a može pojačati neurogenezu i smanjiti pro-upalne reakcije (IL-1 β i TNF α ) kod Alzheimerove bolesti

Slika pune veličine

Unatoč svojim ljekovitim prednostima, poznato je da trenutni litijevski lijekovi (tj. Kemijski oblik karbonata i citrata) odobreni od FDA uzrokuju ozbiljne kratkotrajne i dugoročne nuspojave kod ljudi. Lijekovi imaju uski terapeutski prozor (0, 6–1, 5 mM), jer najčešće korištene litijeve soli polako prelaze krv-moždanu barijeru, 17, 18 što zahtijeva višestruke doze tijekom dana da bi se postigla sigurna terapijska razina u plazmi. Nadalje, potrebne terapijske doze često dovode do prekomjernog nakupljanja litijevih iona u perifernim organima, posebno u bubrezima i srcu. Dehidratacija u terapiji litijem može rezultirati bubrežnom i srčanom toksičnošću, hipotireoidizmom, hiperparatiroidizmom, debljanjem i nefrogenim dijabetesom insipidusom. 19 Litijeva intoksikacija nastaje supraterapijskim koncentracijama u serumu što uzrokuje simptome poput gubitka svijesti, mišićnog tremora, epileptičnih napadaja i plućnih komplikacija. 20 Kao takav, primjena litija zahtijeva često praćenje razine kemije u krvi i razine litijeve u plazmi, što može obeshrabriti liječnike da propisuju litij u korist drugih terapeutika koji ne zahtijevaju praćenje razine u plazmi kako bi se izbjegli uočeni potencijalni nuspojave. To se posebno odnosi na starije osobe koje često imaju niz popratnih bolesti koje zahtijevaju polifarmaciju. Zbog toga postoji potreba za sigurnijom i boljom formulacijom litija za liječenje AD.

Ranije smo izvijestili o razvoju novog ionskog kokristala litija s organskim anionom, salicilnom kiselinom i l-prolinom (LISPRO, LP). Jedinstvena kristalna struktura LISPRO ne utječe negativno na bioaktivnost litija na nekoliko potencijalnih terapijskih ciljeva povezanih s liječenjem AD, naime indukcijom neurotrofičnog faktora (BDNF) mozga koji nastaje iz neurona, inhibicijom proizvodnje dušikovog oksida (NO) iz mikroglije, neuronska diferencijacija i inhibicija GSK3 β u neuralnim matičnim stanicama. Iako je LISPRO nadmašio ili odgovarao učinkovitosti ekvimolarnih koncentracija litijeve soli u tim ciljevima in vitro , kokristal izrazito modulirao farmakokinetiku litija in vivo . Na primjer, štakori koji su primijenjeni s jednom oralnom visokom dozom LISPRO-a imali su razine litija u mozgu u 48 sati, dok one koje su dobile ekvimolarni ekvivalent konvencionalnog karbonatnog kemijskog oblika litija nisu. Pored toga, LISPRO je stvarao postojanu plazmu litija u plazmi tijekom 48 sati, dok je karbonatni kemijski oblik litija stvarao tipični plazmi litijev šiljak za koji se misli da je povezan s štetnim događajima. 21, 22 Osim toga, salicilna kiselina u kristalu smanjuje neuroinflamation povezan s AD, što je aktivni metabolit aspirina. Ovi podaci ukazuju na potencijal za povećanu sigurnost sigurnosti i učinkovitosti učinkovitosti LISPRO-a.

U ovom istraživanju detaljnije smo procijenili terapijsku učinkovitost i sigurnosni profil LISPRO-a za ublažavanje patologije slične AD-u u sustavima staničnih kultura i transgenih modela miša (tj. Tg2576 i 3XTg-AD miševa). Otkrili smo da LISPRO ima vrhunski farmakokinetički i sigurnosni profil u usporedbi s tradicionalnim kemijskim oblikom litija, što nas promovira u daljnjem ispitivanju terapijske učinkovitosti liječenja AD.

Rezultati

Farmakokinetika litija tijekom liječenja kroničnim LP, LC i LS

U našem prethodnom istraživanju pratili smo farmakokinetiku litija nakon jednokratne doze LP i LC oralnim davanjem. Koristeći muške štakora Sprague-Dawley, profili plazme i mozga mjereni AAS-om pokazali su da LP proizvodi vrlo stabilan nivo litija u 48 sati nakon tretmana, dok je nivo litija gotovo nepropoznatljiv nakon 48 sati tretmana LC-om. 21 U ovom istraživanju istraživali smo farmakokinetiku litija u plazmi i mozgu nakon kroničnog liječenja miševima LP, LC ili LS do Tg2576 i 3XTg-AD, kao i miševima B6129SF2 / J divljeg tipa. Niske ili visoke doze LP, LC ili LS, koje daju litij 1, 125 odnosno 2, 25 mM / kg / dan, pokazale su stalna povećanja razine litija u plazmi i mozgu između 1 i 2 tjedna liječenja u B6129SF2 / J miševa, s visokom dozom dajući višu razinu litija (slike 2a i b). Nisu pronađene statistički značajne razlike između tretmana u koncentraciji litija u plazmi pri bilo kojoj dozi. Suprotno tome, nakon 2 tjedna liječenja, LP je postigao značajno više razine litija u mozgu u usporedbi s LC i LS.

Image

Farmakokinetika litija u plazmi i mozgu nakon kroničnog oralnog liječenja s LISPRO (LP), litijev salicilat (LS) i Li2C03 (LC) kod B6129SF2 / J, Tg2576 i 3XTg-AD miševa. ( a, b ) Miševi B6129SF2 / J ( n = 2–4 miševa / grupa, mužjak) u dobi od dva mjeseca tretirani su 1 ili 2 tjedna (tjedne) tri prehrane koje sadrže LP, LC ili LS, dajući litij u 1, 125 ili 2, 25 mM / kg / dan. ( c, d ) Tg2576 miševi ( n = 8, 4 ženke / 4 mužjaka) u dobi od 6 mjeseci liječeni su 8 tjedana s dvije prehrane koje su sadržavale LP ili LC, a prinos litija iznosio je 2, 25 mM / kg / dan. ( e, f ) Nadalje, ženke 3XTg-AD ( n = 4–8 miševa / skupina) u dobi od 5 mjeseci liječene su 28 tjedana tri dijeta koja su sadržavala LP, LS ili LC, čime je litij iznosio 2, 25 mM / kg / dan, ili normalni miš miša (Teklad 2018). Razina litija u krvi i mozgu mjerena je atomskom apsorpcionom spektroskopijom (AAS). Omjer litija mozga i plazme izračunat je za svakog pojedinog 3XTg-AD miša ( f ). Svi su miševi dobili normalnu pitku vodu i chow ad libitum . Statistička analiza provedena je korištenjem ANOVA s post analizom s Fisherovim LSD testom (* P <0, 05; ** P <0, 01). Nije bilo značajne razlike u razinama litija u plazmi ili mozgu između miševa B6129SF2 / J tretiranih LC- i LS ( P > 0, 05). Nije bilo detektiranog litija u plazmi i homogenata mozga u kontroliranim miševima B6129SF2 / J, Tg2576 i 3XTg-AD sa hranom Teklad 2018 dijetom (Ctrl, podaci nisu prikazani)

Slika pune veličine

U Tg2576 miševima, tretman LP i LC pokazao je stalne poraste razine litija u plazmi i mozgu tijekom 8-tjednog liječenja, s značajno višim razinama litija u plazmi pomoću LC tretmana u usporedbi s LP-om samo tijekom dvotjednog liječenja (Slika 2c). Međutim, nakon 8-tjednog liječenja, LP je osigurao značajno više razine litija u mozgu u usporedbi s LC-om (slika 2d). Kod 3XTg-AD miševa nije primijećena značajna razlika ni u plazmi ni u litiju u mozgu nakon 28 tjedana LP, LC ili LS tretmana (Slika 2e). Treba napomenuti da je omjer litija mozga i plazme u LP-u nakon 28 tjedana bio veći u usporedbi s LC i LS tretmanom (Slika 2f), dok razlika nije dostigla značaj (LP i LS, P = 0, 98; LP i LC, P = 0, 84; LS i LC, P = 0, 85). Razine litija pokazale su se neizrecive razine i u plazmi i u mozgu kod netretiranih kontrolnih miševa.

Kronični tretman LP smanjuje β- amiloidne plakove u Tg2576 i 3XTg-AD miševima

Pokazalo se da tretman litijem smanjuje stvaranje β in vitro, 14 dok postoje i kontroverzni rezultati koji se odnose na njegovu sposobnost smanjenja proizvodnje β in vivo. 23, 24 Utvrdili smo na p- amiloidne plakove kroničnim tretmanom s LC ili LP kod Tg2576 miševa i s LC, LS ili LP u 3XTg-AD miševima. Kod Tg2576 miševa, 8-tjedno liječenje LP-om značajno je smanjilo A β opterećenje (pozitivno područje p- amiloidnih plakova) u usporedbi s LC-tretiranim, kao i neobrađenim kontrolnim Tg2576 miševima, što je utvrdio IHC pomoću specifičnih A β 17-24 4G8 antitijelo (slike 3a i b). Slično tome, tretman LP-om značajno je smanjio i topljive i netopive vrijednosti A β kako je određeno ELISA (slika 3c). Međutim, i A β opterećenje i A β nisu se promijenile nakon LC tretmana. U 3XTg-AD miševima, 28-tjedni LP tretman značajno je smanjio A β teret, što je utvrđeno IHC primjenom antitijela A β 17–24 specifičnih 4G8 i A β 1-16 specifičnih 6E10 (Slike 3d i e), ali opterećenje A β nije značajno izmijenjen nakon tretmana LS ili LC.

Image

Peroralni tretman LP smanjuje p- amiloidnu patologiju kod miševa Tg2576 i 3XTg-AD. Tg2576 miševi u dobi od 8 mjeseci ( n = 9; 5 mužjaka / 4 ženke) i ženke 3XTg-AD u dobi od 5 mjeseci ( n = 4–8 miševa / skupina) tretirani su 8 ili 28 tjedana, respektivno dijeta koja sadrži LP, LS ili LC, daje litij od 2, 25 mM / kg / dan, ili normalnu mišju gulaš kako je naznačeno. Ove doze odabrane su tako da daju koncentraciju litija u mozgu od 0, 25–0, 50 mM, što spada u raspon kliničke terapije za AD. 7, 15 Svi su miševi dobili chow i normalnu pitku vodu ad libitum . Odjeci mišjeg tkiva mozga i homogenati pripremljeni su od svakog miša nakon tretmana. ( a, d ) Koronalni presjeci pola mozga analizirani su bojenjem anti-A p protutijela (4G8). ( b, e ) Postotak 4G8 pozitivnih plakova (prosjek ± SEM) kvantificiran je analizom slike kao što je prethodno opisano. 59, 60 ( c ) Ukupno topljivi i netopljivi A β 1-40, 42 peptida iz homogenata analizirani su ELISA analizom i prikazani su kao pikogrami A β peptida po mg ukupnog proteina. Tretman LP-om, ali ne i LC-om, značajno je smanjio ukupni rastvorljivi i netopljivi nivo A β 1-40, 42 . T -test za dva uzorka i jednosmjerni ANOVA test za više neovisnih uzoraka pokazali su značajne razlike između LP i LC ( b, c ) i između LP, LS i LC u usporedbi s kontrolnom prehranom (Ctrl) ( e, * P < 0, 05, ** P <0, 01). Nije bilo uočljivih niti značajnih razlika i u 4G8 pozitivnim A β plakovima i u cerebralno topljivim / netopljivim razinama A β 1-40, 42 u odjeljcima mozga i u homogenatima između LC i Tg2576 liječenih kontrolnih miševa tretiranih LC-om (Ctrl, P > 0, 05)

Slika pune veličine

Kronični tretman LP smanjuje tau fosforilaciju inhibicijom GSK3 β u Tg2576 i 3XTg-AD miševima

U Tg2576 miševima 8-tjedni tretman LP značajno je smanjio fosforilaciju tau-a (p-tau (Thr 231 )) u usporedbi s netretiranom kontrolom, što je određeno IHC i WB analizama (Slike 4a i b). Pored toga, tretman LP značajno je povećao inhibitornu fosforilaciju GSK3 β (Ser 9 ), što je određeno WB (slika 4c). Međutim, tau ili GSK3p inhibitorna fosforilacija nije izmijenjena tretmanom s LC. U 3XTg-AD miševima, 28-tjedni LP tretman značajno je smanjio tau fosforilaciju (p-tau (Thr 231 )) u CA1 kako je određeno IHC (Slike 4d i f). Pored toga, tretman LP imao je tendenciju smanjenja tau fosforilacije p-tau (Thr 231 ) u CA3, ali ovo smanjenje nije bilo statistički značajno za p-tau (Thr 231 ) (Slike 4d i g) (LP i LS, P = 0, 771; LP i LC, P = 0, 31; LS i LC, P = 0, 233). LC ili LS tretman nije značajno promijenio tau fosforilaciju u CA1 ili CA3 kako je određeno IHC. Pored toga, tretman LP značajno je smanjio tau fosforilaciju (p-tau (Ser 396 )), što je određeno IHC (slika 4h) i tau fosforilacijom (p-tau (Ser 396, Ser 404, Thr 181 i Thr 231 )), kao određeno WB (slike 4i i j). LC i LS su također smanjivali tau fosforilaciju na nekoliko mjesta, osobito p-tau (Ser 396 i Thr 231 ), iako manje od LP.

Image

Oralni tretman LP smanjuje tau hiper-fosforilaciju u miševima Tg2576 i 3XTg-AD - Reprezentativne mikrografije koje pokazuju IHC obojenje odsjeka mozga s Tg2576 i 3XTg-AD miševa oralno liječenih 8 i 28 tjedana, dijetom koja sadrži LP, LS ili LC, donoseći litij pri 2, 25 mM / kg / dan, ili kontroliraju dijetu Teklad 2018, kako je detaljno prikazano na slici 3 gore. Prikazani su obojenost od IHC i kvantifikacija p-tau (Thr 231, a, d ) i p-tau (Ser 396, e ) imunoreaktivnosti u CA3 od Tg2576 ( a ) i CA1 / CA3 od 3XTg-AD odsjeka mozga ( d, e ). Postotak p-tau (Thr 231 ) ili p-tau (Ser 396 ) pozitivnih područja (prosjek ± SEM) kvantificiran je analizom slike u CA1 / CA3 3XTg-AD miševa ( f - h ). ANOVA post-hoc analizama upotrebom Fisherova LSD testa za više uzoraka otkriva značajne razlike u fosforiliranom tau-u između tretiranih LP i kontrolnih miševa (* P <0, 05, ** P <0, 01). Homogenati mišjeg mozga podvrgnuti su se Western blot (WB) analizi s antitijelima protiv p-tau (Thr 231 ), p-tau (Ser 396 ), p-tau (Ser 404 ), p-tau (Thr 181 ), ukupno tau, GAPDH ( b, i ), pGSK3 β (Ser 9 ), ili ukupni GSK3 β ( c ). Kao što je prikazano ispod WB, analiza denzitometrije pokazuje omjere gustoće opsega p-tau-ukupnog tau-a ( b, donja ploča) ili GAPDH ( j ) i pGSK3 β na ukupni GSK3 β ( c, donja ploča). Statistička t- test analiza WB podataka pokazala je značajno smanjenje omjera p-tau (Thr 231 ) prema ukupnom tau ( b ) i porast pGSK3 β (Ser 9 ) na ukupni GSK3 β ( c ) u LP u usporedbi s LC -tretirani Tg2576 miševi (** P <0.01). Jednosmjerna ANOVA i post hoc analiza otkrile su značajne razlike u omjeru p-tau-a i GAPDH-a ( j ) u usporedbi s kontrolnim liječenjem (Ctrl, * P <0, 05, ** P <0, 01). Slični rezultati i imunokemijskog bojenja i WB analiza dobiveni su sa PHF1 antitijelom (podaci nisu prikazani) kod Tg2576 tretiranih s LISPRO miševima. Nije bilo primjetne i značajne razlike u razinama p-tau (Thr 231 ) i inaktiviranom pGSK3 β (Ser 9 ) u mozgu homogenata između LC i kontrolnih Tg2576 miševa hranjenih dijetom ( P > 0, 05)

Slika pune veličine

Liječenje LP-om smanjuje mikroglijsku upalu, istovremeno pojačavajući mikroglijsku A β fagocitozu i autofagiju

Koliko god mikroglija CD40 / CD40L signalizacija može poboljšati A β generacije 25 i umanjiti A β fagocitozu, 26 utvrdili smo učinke LP na ekspresiju CD40, signalizaciju CD40 / CD40L i A β fagocitozu u primarnim mikroglijskim stanicama. Primarne mikroglijske stanice su tretirane s LP (0–20 mM) u prisutnosti IFN y (100 U / ml) i / ili CD40 liganda (CD40L, 1 µg / ml) tijekom 8 sati. Tretman LP-om značajno inhibira ekspresiju CD40-a izazvanu IFNy na način ovisan o dozi (Slika 5b), što je određeno FACS analizom, kao i IFNγ / CD40L-inducirano otpuštanje pro-upalnih citokina (tj., TNF α i IL-12p70), kako je utvrđeno ELISA-om (slika 5c). Da bi se procijenio učinak LP na mikroglijsku A β fagocitozu, primarne mikroglijske stanice prethodno su se inkubirali s 10 mM LP ili vehiklom (1% dimetil sulfoksidom) u trajanju od 6 sati, nakon čega je slijedila 1-satna inkubacija s fluorescentnom oznakom A β 1–42 ( FITC-A β 1-42 ). LP je značajno povećao unos A β 1-42 u primarne mikroglijske stanice, o čemu svjedoči povećana stanično povezana (unutarćelijska) i smanjena vanćelijska fluorescencija (Slika 5d). Sarkar i sur. 27 je prvi pokazalo da litij pojačava autofagiju i čisti mutirane proteine ​​(lovatin i α- sinuklein) inhibiranjem inozitol monofosfataze. Nakon toga, nekoliko staničnih kultura i istraživanja na životinjama pokazalo je indukciju autofagičnih putova litijem. 28 Da bi se ispitao učinak LP i LC na autofagiju, primarne mikroglijske stanice su 18 sati tretirane s LP ili LC (10 mM), nakon čega je slijedila permealizacija i bojenje s autofagičnim markerom LC3B antitijelom. I LP i LC tretman značajno su poboljšali autofagiju (Slika 5a).

Image

LP inhibira periferne i neuroinflamation, istodobno promičući mikroglijsku autofagiju i A β fagocitozu. ( a ) Za određivanje mikroglijske autofagije, mišje primarne mikroglijske stanice prethodno su tretirane s LP, LC, LiCl ili L-prolinom na 10 mM ili PBS (Ctrl) 18 sati, nakon čega je slijedila permealizacija, bojenje s poliklonalnim antitijelom zečjeg LC3B i vizualizacija pomoću Alexa Fluor 647 kozjeg anti-zečjeg IgG (komplet za protutijela LC3B, Molekularne sonde). Intenzitet fluorescencije autofagosoma (Autosom) i citosola kvantificiran je korištenjem softvera za digitalnu mikroskopiju Slidebook (srednja vrijednost ± SD). I LP i LC tretmani značajno su poboljšali mikroglijsku autofagiju (** P <0, 01). Imajte na umu da nije bilo značajne razlike u intenzitetu fluorescencije autofagosoma i citosola između LC, LP i LiCl ( P > 0, 05). L-prolin nije uspio promovirati nijednu zapaženu autofagiju. Pored toga, mišje primarne mikroglijske stanice tretirane su LP-om (0–20 mM) u prisutnosti IFN γ (100 U / ml) ili / i CD40 ligandom (CD40L, 1 µg / ml) tijekom 8 sati, a zatim su ispitane na pro-upalna mikroglijska aktivacija, procijenjena protočnom citometrijskom analizom (FACS) i ELISA analizom. ( b ) FACS analiza pokazala je značajna smanjenja doze ovisna o dozi u IFN y- induciranoj ekspresiji CD40. Podaci su prikazani kao prosječni postotak stanica koje eksprimiraju CD40 (CD40 Exp) (± SEM) iz dva neovisna pokusa. ( c ) Supernatanti mikroglijskih kultura sakupljeni su i podvrgnuti citokinu ELISA kako je naznačeno. Podaci su prikazani kao prosječni pg TNF α ili IL-12p70 po mg ukupnog staničnog proteina (± SEM) iz tri neovisna pokusa. Za određivanje fagocitoze mikroglijske A β , primarna mikroglijska stanica prethodno je tretirana s LP u 10 mM ili nosačem (1% DMSO u mediju) u trajanju od 6 sati, a zatim je inkubirana 1 h M FITC-A β 1-42 tokom 1 h ( d ). Stanični supernatanti i lizati analizirani su na vanćelijsku (Extra, gornja ploča) i stanično povezana (Cell-Asso, donja ploča) FITC-A β 1-42 pomoću fluorometra. Podaci su predstavljeni kao relativni pregib srednje fluorescentne promjene (prosjek ± SEM), izračunato kao srednja fluorescencija za svaki uzorak na 37 ° C podijeljeno sa srednjom fluorescencijom na 4 ° C ( n = 4 za svako predstavljeno stanje) (** P <0, 01). LDH test nije pokazao značajno povećanje stanične toksičnosti izazvane LISPRO do 20 mM u primarnim mikroglijalnim stanicama (podaci nisu prikazani). Za određivanje perifernih i neuroinflamation, krvna plazma ( e ), kultura koja se uzgaja u splenocitima ( f ) i moždani homogenati mozga ( g, h ), tretirani s Tg2576 i tretirani Tg2576 miševi (Ctrl), podvrgnuti citokinu i sCD40L ELISA. Podaci su prikazani kao srednje ± SEM vrijednosti citokina (pg / ml plazme ili medija) ( e, f ) ili kratki porast citokina dobivenih iz tkiva mozga ili sCD40L za LC ili LP tretirane nad neobrađenim miševima ( g, h ), n = 9 za miševe tretirane LP i LC; n = 6 miševa za neobrađene miševe, (* P <0, 05; ** P <0, 01). Nije bilo primjetne ili značajne razlike u razini citokina u mediju obrađenom u plazmi i splenocitima između LC-a i tretiranih neobrađenih miševa ( P > 0, 05)

Slika pune veličine

Kronični tretman LP inhibira periferne i neuralne upale kod Tg2576 miševa

S obzirom da LP može modificirati p- patologiju p- amiloidnog plaka kod transgeničnih AD miševa, željeli smo utvrditi je li smanjenje A β povezano s protuupalnim učinkom. Kod Tg2576 miševa 8-tjedni tretman LP značajno je povećao razinu protuupalnih citokina u plazmi (tj. IL-4 i IL-10) u usporedbi s netretiranim kontrolama, kako je utvrđeno ELISA (Slika 5e). Pored toga, liječenje LP povećavalo je IL-10 u splenocitima, dok je smanjio pro-upalne citokine (tj., TNF a i IL-12p70), mjereno ELISA-om (Slika 5f). Liječenje LP-om nije promijenilo IL-2 ili IFNγ u plazmi, što je utvrđeno ELISA-om (slika 5e). Tretman LP-om također je povećao razinu protuupalnih citokina u mozgu (tj., TGF β 1 i IL-10), dok je prigušivao nivo sCD40L (slike 5 g i h) kako je analizirao ELISA. Ni jedan izmjereni citokin nije promijenjen LC tretmanom. Uzeti zajedno, ovi nalazi pokazali su da LP prigušuje protuupalnu mikroglijsku aktivaciju, istovremeno promovirajući β fagocitozu i autofagiju.

LP tretman smanjuje aktivnost GSK3 β i tau fosforilaciju in vitro

Kako je in vivo inhibirao tau fosforilaciju i povećao inhibitornu fosforilaciju GSK3 β , dodatno smo istražili ove aktivnosti LP in vitro . HeLa stanice prekomjerno eksprimiraju ljudski tau divljeg tipa (HeLa / tau stanice), stanice ljudskog neuroblastoma SH-SY5Y i primarne stanice neurona tretirane su LP-om u povećanim koncentracijama (0, 2, 5, 5 i 10 mM) 12 h, nakon čega slijedi analiza tau i / ili GSK3 β fosforilacije putem WB. LP se značajno povećao u inhibitornoj fosforilaciji GSK3 β (Ser 9 ) u HeLa / tau stanicama (Slika 6a). Ovo povećanje anti-tau fosforilacije povezano je sa smanjenjem na 10 mM, što je naznačeno PHF1 (prepoznaje fosfo-Ser 396 ) i imunoreaktivnošću fosfo-tau (Thr 231 ) u stanicama HeLa / tau (Slika 6b). Slično tome, LP (5 i 10 mM) značajno je povećao inhibitornu fosforilaciju GSK3 β (Ser 9 ) u humanom neuroblastomu SH-SY5Y i primarnim neuronskim stanicama (Slika 6c). Uzeti zajedno, ovi nalazi potvrđuju da LP smanjuje tau fosforilaciju inaktivacijom GSK3 β .

Image

LP smanjuje tau fosforilaciju uz povećanje inhibicijske fosforilacije GSK3 β (Ser 9 ) u kultiviranim stanicama. Humane tau stabilno transficirane HeLa stanice (HeLa / tau stanice) ( a, b ), stanice ljudskog neuroblastoma (SH-SY5Y) ( c ), (lijeva ploča) i primarne stanice neurona ( c ), (desna ploča) su tretirane s LP u naznačenim koncentracijama (0-10 mM) 12 h, nakon čega slijedi analiza staničnih lizata WB. Status inhibicijske fosforilacije GSK3 β detektiran je anti-fosfo-GSK3 β (Ser 9 ) i ukupnim GSK3 β antitijelima ( a ). Status fosforilacije tau detektiran je anti-fosfo-tau (p-tau (Thr 231 )) i PHF1 antitijela kao što je prethodno korišteno 61 ( b ). Ukupni tau (fosforiliran i ne-fosforiliran) otkriven je tau46 ( b ). Rezultati Svjetske banke reprezentativni su za dva neovisna eksperimenta za pGSK3 β (Ser 9 ) i ukupni GSK3 β , te tri pokusa, za PHF1, p-tau (Thr 231 ) i ukupno tau s triplikatima za svako stanje liječenja. Densitometrijska analiza ispod svake ploče s figurama WB-a pokazuje omjer gustoće opsega pGSK3 β (Ser 9 ) i ukupnog GSK3 β, kao i p-tau (Thr 231 ) u ukupnom tau-u. T- test pokazao je značajno povećanje odnosa pGSK3 β (Ser 9 ) prema ukupnom GSK3 β i smanjenje p-tau-a za ukupni tau za HeLa / tau stanice tretirane s 10 mM LISPRO u usporedbi s kontrolnom skupinom (0 mM) (* P <0, 05; ** P <0, 01). Pored toga, opaženo je značajno povećanje omjera pGSK3 β (Ser 9 ) prema ukupnom GSK3 β za obje SH-SY5Y stanice i diferencirane neuronske stanice tretirane s LISPRO od 5 ili 10 mM u usporedbi s kontrolnom skupinom (0 mM) (* P <0, 05) ( c ). Izlučeni A β 1-40, 42 peptidi nisu bili otkriveni pomoću A β ELISA kondicioniranog medija iz HeLa / tau stanica sa ili bez LISPRO tretmana (podaci nisu prikazani)

Slika pune veličine

Liječenje LP pojačava diferencijaciju neuronskih stanica, a kronično liječenje sprečava gubitak kortikalnih neuronala i sinaptičkih proteina

Da bi se ispitao učinak LP na diferencijaciju neuronskih stanica, uzgajane stanice mišjeg neuroblastoma N2a tretirane su LP i LC na 10 mM tijekom 24 sata, nakon čega je slijedila analiza neuronskih markera (tj. Β -bubulina III i fosfo-sinapsina I (Ser 62 –67 )) imunocitokemijskim (ICC) i WB analizama. LP-tretirane N2a stanice značajno su poboljšale diferencijaciju, o čemu svjedoči pojačana ekspresija β- tubulina III i fosfo-sinapsina I (Ser 62-67 ) u usporedbi s LC (Slike 7a-c). Uz to, liječenje LP-om značajno je poboljšalo diferencijaciju uzgajanih matičnih stanica miševa i humanih neurona (MNSC i HNSC) u usporedbi s LC tretmanom, o čemu svjedoče pojačani markeri neurona (tj. MAP2 i fosfo-sinapsin I). Štoviše, MNSC-stanice tretirane LP-om pokazale su pojačanu ekspresiju Tau46, ukupnog tau-a i MAP2 u usporedbi sa stanicama tretiranim LC-om (Slike 7d-g). Uzeto zajedno, ovi nalazi pokazuju da je LP značajno povećao diferencijaciju matičnih stanica neurona.

Image

LISPRO značajno promovira diferencijaciju neuronskih stanica i sprječava gubitak neuronskog i sinaptičkog proteina kod 3XTg-AD miševa. Mišji neuroblastom (N2a stanice, a ), matične stanice mišjih neuronskih stanica (MNSC, d ) i ljudske neuralne matične stanice (HNSC, H9-izvedeni, f) tretirani su s LP, LC, LiCl ili L-prolinom (10 mM) za 24 h, 4 dana ili 14 dana, respektivno. Te stanice su zatim permealizirane sa 0, 05% Triton X-100 u trajanju od 5 minuta, isprane i obojene mišjim monoklonskim antitijelom anti- p- turbulina III, zečjim antifosfonapsinom I (Ser 62 i Ser 67 ) poliklonalnim antitijelom, mišjim anti -MAP2 monoklonsko antitijelo, mišje anti-ukupno tau (tau46) antitijelo ili zečje anti-GFAP poliklonsko antitijelo preko noći na 4 ° C. Alexa Fluor 488 kozji protu-mišji IgG (zeleni) korišten je za otkrivanje p -tubulina III, MAP2, a ukupan tau i Alexa Fluor 594 magarac anti-zečji IgG (crveni) upotrijebljeni su za otkrivanje fosfo-sinapsina I i GFAP ( a, d ). DAPI bojenje je korišteno za otkrivanje nuklearne DNK. Konfokalne slike snimio je Olympus Fluoview FV1000 laserskim skenirajućim konfokalnim mikroskopom. Paralelno, stanice N2a ( b ), MNSC ( e ) i HNSC ( g ) tretirane su s LP, LC, LiCl ili L-prolinom na 10 mM, lizirane su puferom za liziranje stanica, a zatim podvrgnute WB analizi P - tubulin III, fosfo-sinapsin I, MAP2, ukupni tau i GFAP. Kao što je naznačeno ispod svake ploče WB, omjeri gustoće opsega β -tubulina III i fosfo-sinapsina I (p-sinapsina I) u β- aktina ( c), MAP2, ukupni tau i fosfo-sinapsin I u β- aktin ( e ) i MAP2 i GFAP do β- aktina ( g ) prikazani su kao srednja ± SEM Ovi podaci reprezentativni su za tri neovisna pokusa sa sličnim rezultatima (* P <0, 05; ** P <0, 01). Nije bilo uočljive ili značajne razlike u β -tubulinu III, fosfo-sinapsinu I, MAP2, ukupnoj tau i GFAP imunofluorescenciji i WB analizi između LC, LiCl ili L-prolin tretmana ( P > 0, 05) za sve tri diferencirane N2a stanice, MNSC i HNSC, respektivno. Odjeljci moždanog tkiva i homogenati pripremljeni od miševa tretiranih LP-, LS- ili LC ili neobrađenih kontrolnih 3XTg-AD, podvrgnuti su IHC obojenju i WB analizama neuronskih i pre- i post-sinaptičkih proteina, koristeći NeuN, sinaptofizin i PSD95 antitijela, respektivno. Nisu primijećene statistički značajne, ali povećane promjene ukupnog broja imunoreaktivnih (NeuN) pozitivnih stanica u tretiranim LP- i LS-om u usporedbi s neobrađenim kontrolnim miševima ( h ). ( i ) Međutim, razina proteina sinaptofizin (Synapto) i PSD95 značajno je povišena u miševima tretiranim LP- i LS-om u usporedbi s kontrolnim miševima tretiranim LC-om i netretiranim. Kao što je navedeno ispod IHC i WB ploča, postotak omjer neuN imunoreaktivnih pozitivnih stanica, sinaptofizin i PSD95 u odnosu na GAPDH omjere gustoće određen je analizom slike (prosjek ± SEM). Podaci su analizirani jednosmjernom ANOVA i post-hoc testiranjem s Fisherovim LSD testom (* P <0, 05; ** P <0, 01)

Slika pune veličine

Kako bi se ispitalo može li liječenje LP-om spriječiti gubitak neurona, petomjesečni miševi 3XTg-AD tretirani su LP, LC ili LS 28 tjedana, nakon čega slijedi IHC analiza pomoću anti-NeuN antitijela. Tretman LP i LS povećao je broj pozitivnih stanica obilježenih NeuN-om u regiji neokorteksa u usporedbi s neliječenim kontrolnim miševima (Slika 7h). Pored toga, miševi tretirani LP- i LS 3XTg-AD pokazali su pojačanu ekspresiju pre- i post-sinaptičkih proteina (tj. Sinaptofizin i PSD95) analizom WB (slika 7i). Skupno, ovi nalazi sugeriraju da kronično davanje LP ili LS miševima 3XTg-AD značajno sprečava gubitak neurona i poboljšava ekspresiju pre- i post-sinaptičkih proteina.

I akutni i kronični tretman LP ne povećava ekspresiju COX2

Prethodne studije in vitro i in vivo pokazale su da litijev klorid inhibira konstitutivnu GSK3 β aktivnost u bubregu, izazivajući tako ekspresiju ciklooksigenaze 2 (COX2); proizvodeći upalu i toksičnost. 29, 30, 31 Za usporedbu utjecaja LP i LC na bubrežnu GSK3 β aktivnost i ekspresiju COX2, uzgajane stanice humanog bubrežnog proksimalnog tubula (HRPT) tretirane su LP ili LC na 0, 10, 20 ili 30 mM tijekom 12 h, Zanimljivo je da i LP i LC povećavaju inhibicijsku fosforilaciju GSK3 β (Ser 9 ), dok je samo LC povećao ekspresiju COX2 (slike 8a i b). Prema tome, LC-inducirana COX2 ekspresija je neovisna o GSK3 β aktivnosti.

Image

LISPRO ne povećava ekspresiju COX2 in vitro i in vivo - Ljudske primarne bubrežne proksimalne tubulusne stanice (ATCC PCS-400-010) uzgajane su u mediju INVitro GRO (BioreclamationIVT) i tretirane s LP, LC, LiCl ili L-prolinom na 0 do 30 mM tijekom 12 h. Te stanice su zatim lizirane s puferom za liziranje stanica i analizirane s WB na COX2, ukupnu ekspresiju GSK3 p i fosfo GSK3 β (Ser 9 i Thr 390 ) koristeći anti-COX2 antitijelo ( a ) i anti-fosfo- i ukupna GSK3 β antitijela ( b ). Napominjemo da nisu postojale značajne razlike u ekspresiji COX2 ili GSK3 β fosforilaciji između LC i LiCl tretmana. Tretman L-prolinom nije izazvao promjene u ekspresiji COX2 i GSK3 β fosforilaciji. Muški miševi B6129F2 / J (težine 20–25 g, dvomjesečni mladići) tretirani su s 3 prehrane koja je sadržavala LP, LC ili LS ili kontrolirali dijetu Teklad 2018, tijekom 1 ili 2 tjedna, dajući litij u 1, 125 ili 2, 25 mM / kg / dan. Svi su miševi dobili normalnu pitku vodu i chow ad libitum . ( c ) Bubrezi su prikupljeni nakon liječenja i analizirani od strane IHC-a na ekspresiju COX2 u bubrežnoj meduli. ( d ) Pored toga, mikrosalni proteini bubrega ekstrahirani su za procjenu ekspresije COX2 WB analizom. Omjer gustoće raspona COX2 prema P- aktinu WB određen je analizom ImageJ (prosjek ± SEM) u duplikatima od šest miševa iz svake skupine. Statistička analiza provedena je korištenjem ANOVA (* P <0, 05, n = 6 za LP, LC i, LS; n = 3 za kontrolnu prehranu). Nadalje, Tg2576 miševi su tretirani s dvije dijete koje su sadržavale LP ili LP, dajući litij sa 2, 25 mM / kg / dan tijekom 8 tjedana. ( e ) Bubrezi su prikupljeni nakon liječenja i analizirani od strane IHC-a na ekspresiju COX2 u bubrežnoj meduli. ( f ) Bubrežni mikrosomalni proteini ekstrahirani su za procjenu WB ekspresije. ( g ) Kvantifikacija omjera gustoće raspona WB između COX2 i β - aktina među ctrl, LP i LC tretmanima određena je ImageJ analizom. Statistička analiza provedena je korištenjem ANOVA-e, nakon čega je slijedio Fisher LSD post-hoc (* P <0, 05, ** P <0, 01, n = 9 po liječenju)

Slika pune veličine

Da bi se uspoređivali učinci LP, LS i LC tretmana na bubrežnu COX2 ekspresiju in vivo , 6-tjedni miševi B6129SF2 / J stari 6 tjedana hranjeni su dva tjedna dijetom koja je sadržavala LP, LC ili LS u malim ili visokim dozama (1.125 ili 2.25 mM Li / kg / dan). Kao što pokazuju analize WB i IHC, niti LP, LC i LS tretman ne mijenjaju ekspresiju COX2 pri niskim dozama, mada su B6129SF2 / J tretirani LC-om pokazali tendenciju povećanja. Suprotno tome, samo je LC značajno povisio ekspresiju COX2 pri velikoj dozi (slike 8c i d). Nadalje, kako bi se ispitalo da li kronična primjena litija inducira ekspresiju COX2 u kontekstu patološkog stanja, transgeni Tg2576 AD miševi tretirani su s LP i LC sa 2, 25 mM Li / kg / dan (visoka doza) 8 tjedana. Kao što se očekivalo, i IHC i WB analize pokazuju da samo LC tretman pokazuje značajno povećanje COX2 ekspresije (slike 8e-g). Nije nađena statistički značajna razlika između LP-tretiranih Tg2576 AD miševa i netretiranih kontrola.

Rasprava

Unatoč uskom terapijskom prozoru (0, 6–1, 5 mM) i mogućnosti ozbiljnih nuspojava, litij se koristi kao terapija prve linije za smanjenje maničnih epizoda i suicidnosti u bolesnika s bipolarnim poremećajem zbog nedostatka boljih alternativa. 32 Prethodno smo pokazali da litijev karbonat odobren od FDA stvara vrlo oštre vršne koncentracije litija u plazmi i mozgu nakon oralnog doziranja, nakon čega slijedi brzi pad štakorica. Suprotno tome, LISPRO je pokazao stalnu razinu litija u plazmi i mozgu do 48 h bez oštrog vrha. 21 Na temelju tih nalaza, pretpostavljamo da LISPRO može spriječiti drastičnu promjenu razine litija u plazmi viđenim trenutnim litijevim lijekovima i održati stabilne terapijske doze te bi na taj način predstavljao značajno poboljšanje u odnosu na trenutne litijeve lijekove za željeno vrijeme sporo ispuštanje u perifernu krv. Slično gore navedenim nalazima, naši nedavni podaci (8 tjedana liječenja na Tg2576 miševima) pokazali su značajno stabilne razine litija u plazmi tijekom vremenskog razdoblja (Slika 2c), kao i višu razinu litija u mozgu u usporedbi s Li2C03 (Slika 2d). Što je još važnije, B6129SF2 / J miševi tretirani s LISPRO pokazali su značajno više razine litija u mozgu s malim (1, 125 mM / kg / dan) i visokim (2, 25 mM / kg / dan /) koncentracijama u usporedbi s Li 2 CO 3 (Slike 2a-b). Nadalje, naša nedavna studija također je pokazala usporedivu razinu litija u mišjoj plazmi 3XTg-AD kao rezultat litijevog salicilata, Li 2 CO 3 ili LISPRO (liječenje od 28 tjedana). Nadalje, omjer litija od mozga i plazme u skupini liječenoj LP-om bio je neznatno viši (LP i LS, P = 0, 98; LP i LC, P = 0, 84; LS i LC, P = 0, 85) u odnosu na skupine liječene s LS i LC (Slike 2e-f). Litij je primjenjivan u liječenju nekoliko neurodegenerativnih bolesti, uključujući AD. Zabilježeno je da litij sprječava stvaranje A β peptida inhibirajući aktivnost GSK3 α , koja interferira s cijepanjem APP y- sekretaze. 14, 33, 34 Što se tiče LP-a, očekivali smo da bi dodavanje salicilata, koji je primarni derivat metabolita acetil-salicilne kiseline (aspirin), mogao zajednički djelovati na poboljšanju sigurnosti i modificiranju farmakološkog djelovanja litija za prigušivanje AD patologija. Podaci studije sugeriraju da aspirin djeluje na upalne kaskade, ireverzibilno inhibira COX1 i modificira aktivnost enzima COX2, suzbijajući proizvodnju prostaglandina i tromboksana. Iako litij ima protuupalna svojstva, nekoliko studija pokazuje da kronični litij može inducirati COX2 ekspresiju inhibicijom GSK3 β aktivnosti. Naši podaci također su pokazali da i litijev karbonat i LISPRO inaktiviraju GSK3 β , ali samo litijev karbonat aktivira COX2 dok LISPRO suzbija COX2 zbog protuupalnih svojstava salicilatnog aniona. Nedavna epidemiološka studija pokazala je da aspirin u niskim dozama s litijem ima sinergističke učinke povećanjem 17-hidroksi-dekosaheksanske kiseline (17-OH-DHA), protuupalnog metabolizma DHA mozga, što značajno smanjuje rizik od pogoršanja bolesti kod bipolarnih bolesnika u usporedbi s drugim nesteroidnim protuupalnim lijekovima i glukokortikoidima, inhibitorom COX2. 35 Zajedno, salicilna kiselina povećala je mozak 17-OH-DHA, 36, a litij reducirao neuroinflamation, 37, 38 dok je zwitterionski l-prolin značajno smanjio higroskopsko svojstvo matične soli salicilata utječući na stvaranje čvrste faze. Pod pretpostavkom da je gornja hipoteza tačna, željeli smo istražiti bioaktivnost LISPRO-a u smislu ublažavanja patologije AD-a u sustavima staničnih kultura i transgenih (Tg2576 i 3XTg-AD) modela miša. Pokazali smo da su 8-tjedni LisPRO-tretirani Tg2576 AD miševi značajno smanjili rastvorljive i netopive razine A β , kao i A β opterećenje u usporedbi s Li2CO3 - i kontrolno tretiranim Tg2576 AD miševima (slike 3a-c). Da bismo ispitali učinak LISPRO na generacije β u 5-mjesečnih miševa 3XTg-AD, liječili smo ih LISPRO, litijev salicilat, Li 2 CO 3 i kontrolirali dijetu 28 tjedana s jednakim dozama litija (2, 25 mM / kg / dan / dan) ). Pokazali smo da je LISPRO tretmanom značajno smanjio izvanstanične A β plakove, što je dokazano obojanjem IHC primjenom antitijela 4G8 i 6E10 (Slike 3d i e). Uzeti zajedno, ovi nalazi pokazali su da LISPRO suzbija stvaranje i topljivog i netopljivog A β u modelima Tg2576 i 3XTg-AD na mišima.

Nadalje, nekoliko dokaza dokazalo je da je litij izravan inhibitor GSK3 β i također povećava inhibitornu serin-fosforilaciju enzima. 11, 39 Stoga smo htjeli ispitati može li LISPRO smanjiti tau fosforilaciju u staničnoj kulturi i AD mišjim modelima. Koristeći humani HeLa / tau, humani neuroblastom SHSY-5Y i primarne stanične neuronske stanice, otkrili smo da liječenje LISPRO inhibira fosforilaciju tau u koncentracijama 5–10 mM, što je povezano s povećanjem inhibicijske fosforilacije GSK3 β (Ser 9 ) (Slike 6a-c). Uzeti zajedno, ovi nalazi pokazali su da LISPRO inaktivira aktivnost GSK3 β , čime smanjuje tau fosforilaciju. Budući da je litij prikladan inhibitor za inhibiciju GSK3 β in vivo , također smo ispitali je li LISPRO-posredovana supresija aktivnosti GSK3P povezana s prigušivanjem tau fosforilacije kod Tg2576 miševa. U ovom smo modelu pokazali da 8-tjedni tretman LISPRO značajno smanjuje p-tau (Thr 231 ) fosforilaciju u usporedbi s Li2CO3 i kontrolom (slike 4a i b). These findings were also correlated with increased pGSK3 β (Ser 9 ) inhibitory phosphorylation, indicating inactivation of GSK3 β activity (Figure 4c). To confirm these data obtained in the Tg2576 AD mouse model, we next investigated whether chronic administration of LISPRO could also reduce tau phosphorylation in 3XTg-AD mice. Thus, we treated 5-month old 3XTg-AD mice with LISPRO, lithium salicylate, Li 2 CO 3, or control diet for 28 weeks with equal doses of lithium (2.25 mM/kg/day). IHC staining using p-tau (Thr 231 ) and p-tau (Ser 396 ) antibodies as well WB analyses using multiple p-tau (Ser 396, Ser 404, Thr 181, and Thr 231 ) amino-acid residues demonstrated that LISPRO, and in many cases lithium salicylate, significantly attenuates tau phosphorylation compared to Li 2 CO 3 and control (Figures 4d–j).

Inflammatory processes are thought to have an active role in AD formation and progression. Preclinical as well as postmortem analyses of AD patient brains have provided tons of evidence indicating the dysregulation and/or uncontrolled activation of microglial and astrocytic cells, activation of complement cascade, inflammatory enzymes such as COX2, inducible nitrate oxide synthase, reactive oxygen species, and calcium dysregulation pathways in brain, CSF, and blood. 40, 41, 42 Although it is inconclusive whether these changes are initiating or secondary consequences, pro-inflammatory such as IL-1 β , IL-6, TNF α , NO, and anti-inflammatory cytokines such as IL-4, IL-10, TGF β elevated in the CSF and blood of AD patients. 41, 43, 44 Multiple lines of evidence showed that lithium down-modulates the pro-inflammatory cytokine responses in animal models and is of therapeutic benefits in several neurodegenerative diseases. 45, 46 Specifically, Nassar and Azab conclude that lithium has anti-inflammatory properties that may contribute to its therapeutic activity by down-regulation of COX2, inhibition of IL-1 β , TNF α , and upregulation of IL-2 and IL-10. 47 On the other hand, in contrast to above findings, large bodies of evidence indicated that lithium also induces pro-inflammatory cytokines production such as IL-4 and IL-6 in certain disease conditions. 48, 49 Based on these reports, we sought to examine if the efficacy of LISPRO for reducing AD-like pathology in transgenic Tg2576 mice is associated with modulation of pro- and anti-inflammatory cytokine responses. We showed that LISPRO treatment significantly increases the expression of anti-inflammatory cytokines such as IL-4, IL-10, and TGF- β 1, whereas it decreases the expression of pro-inflammatory cytokines such as INF γ , IL-12p70, and sCD40L in Tg2576 mouse brains compared with control- and LC-treated Tg2576 mouse brains (Figures 5e–h). Taken together, these findings suggest that LISPRO might reduce A β pathology at least in part via upregulated anti-inflammatory and down-regulated pro-inflammatory cytokine responses in Tg2576 mice.

We demonstrated that CD40-CD40L interaction is critical for brain pro-inflammatory responses in aggravating AD-like pathology. 50 As LISPRO treatment reduced A β production in cell culture and transgenic (Tg2576 and 3XTg-AD) mouse models, we next hypothesized that reduction of A β pathology might correlate with decreased microglial CD40 expression and/or increased phagocytosis by microglia. In this regard, we found that decreased expression of microglial CD40 and brain soluble CD40L expression by LISPRO treatment might help attenuate A β associated pathology, suggesting that disruption of CD40-CD40L signaling could also be involved in attenuation of A β pathology in Tg2576 and 3XTg-AD mouse models. As expected, LISPRO suppresses IFNγ-induced CD40 expression (Figures 5b and c) and enhances microglial phagocytosis of A β (Figure 5d) in cultured primary microglial cells. Moreover, multiple lines of evidence demonstrated that lithium enhances autophagy at low doses (10 mM). 27, 28 In this regard, we found that LISPRO treatment enhances autophagy markers LC3B in cultured primary microglial cells (Figure 5a). Collectively, our data suggest that LISPRO-mediated attenuation of A β pathology is associated with several therapeutic endpoints, including upregulated anti-inflammatory and down-regulated pro-inflammatory cytokines, suppression of CD40 that disrupts CD40-CD40L signaling, increased microglial phagocytosis of A β , and upregulated autophagy.

Furthermore, to investigate whether LISPRO treatment could modulate neuronal cell differentiation, cultured mouse neuroblastoma N2a, as well as murine and human stem cells was treated with LISPRO, Li 2 CO 3, and control. Our data from IHC staining and supportive WB analyses using β -tubulin III, phospho-synapsin I (Ser 62–67), MAP2, and total tau antibodies demonstrated that LISPRO treatment significantly promotes neuronal cell differentiation compared to Li 2 CO 3 (Figures 7a–g). Cheng and Chuang reported that lithium increases the suppression of p53 and expression Bcl-2 providing neuronal survival. 51 In addition, it has been shown that administration of lithium as well as mood-stabilizing agent valproate, increases Bcl-2 levels in the cortical region. 52 Based on these findings, we also wanted to examine whether LISPRO could prevent cortical neuronal loss in 5-month-old 3XTg-AD mice treated with LISPRO, lithium salicylate, Li 2 CO 3, or control diet for 28 weeks. Quantitative analysis of neuronal cell numbers using the neuronal marker anti-NeuN antibody, displayed that LISPRO and lithium salicylate treatments, respectively, yield an increased survival neurons in the neocortex region of 3XTg-AD mice (Figure 7h). We further examined whether LISPRO treatment could modulate the expression of synaptic proteins in 3XTg-AD mice brain, and found that LISPRO and lithium salicylate significantly increase the protein expression of synaptophysin (Pre-synaptic) and PSD95 (Post synaptic) in these transgenic mice (Figure 7i).

Finally, one of the major side-effects of lithium includes renal toxicity secondary to increased expression of COX2 and ensuing inflammation. It has been shown that acute and chronic administration of lithium could enhance COX2 expression by suppressing GSK3 β activity in renal cell lines and mouse models. 29, 30 We observed the effect of LISPRO on COX2 expression in renal cells from the Tg2576 AD as well as wild-type B6129SF2/J mouse models. We treated HRPT with LISPRO and Li 2 CO 3 . IHC staining and supportive WB data indicated that LISPRO treatment does not enhance COX2 expression in HRPT renal cells (Figures 8a and b). To further test the effect of LISPRO treatment on COX2 expression in vivo , we orally fed B6129SF2/J and Tg2576 mouse lines with LISPRO, lithium salicylate, and Li 2 CO 3 for 2, and 8 weeks, respectively, with low (1.125 mM/kg/day) and high doses (2.25 mM/kg/day). Our IHC and supportive WB findings indicated that LISPRO treatment does not increase COX2 expression (Figures 8c–g).

In sum, our data support our hypothesis that LISPRO is a better alternative formulation of lithium in terms of safety and efficacy in ameliorating AD pathology in cell culture and two different transgenic mouse models. Nevertheless, further translational research is warranted to fully validate LISPRO as a safe and effective disease modifying therapy for AD and other neurodegenerative diseases.

Materijali i metode

Reagensi

For preparation of LISPRO (LP), lithium salicylate (LS) (98% pure, anhydrous, 1 mM (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)) and L-proline (99% pure, Sigma-Aldrich, 1 mM) were dissolved in 2.0 ml of hot deionized water. The resulting solution was maintained on a hot plate (75–90 °C) to allow slow evaporation of solvent until colorless crystals had formed, which were collected and dried (evaporation at 1 atmospheric pressure). For preparation of lithium carbonate (LC), (99% ACS grade, 1 mM (Sigma-Aldrich)) were suspended in 1–2% methylcellulose (12–18 cP, 1–2% in H 2 O (20 °C) (Sigma-Aldrich)) solution.

antitijela

Primary antibodies include anti-A β 1-16 (6E10, Covance Research Products, Emeryville, CA, USA), anti-A β 17-24 (4G8, Covance Research Products), anti-p-tau (Thr 231, EMD Millipore, Billerica, MA, USA), anti-p-tau (Ser 202, AT8, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA), anti-p-tau (Ser 404 ), anti-p-tau (Thr 181, AT270, AnaSpec, Fremont, CA, USA), anti-total tau (tau46, Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA), anti-synaptophysin (Cell Signaling Technology), anti-GSK3 β (Ser 9, Thermo Fisher Scientific), anti-COX2 (Thermo Fisher Scientific), anti-light chain 3B (LC3B) (Thermo Fisher Scientific), anti- β -tubulin III (Thermo Fisher Scientific), anti-p-synapsin I (Thermo Fisher Scientific), anti- microtubule associated protein 2 (MAP2) (Thermo Fisher Scientific), anti-glial fibrillary acidic protein (GFAP) (Thermo Fisher Scientific), anti- neuronal nuclei (NeuN) (Thermo Fisher Scientific), anti- post synaptic density protein 95 (PSD95) (Thermo Fisher Scientific), and anti-glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) (Thermo Fisher Scientific) antibodies. Paired helical filament 1 (PHF1) antibody was kindly provided by Dr. Peter Davies (Albert Einstein University).

Stanična kultura

HeLa cells stably transfected with wild-type 4R0N human tau (HeLa/tau cells; kindly provided by Dr. Chad Dickey, University of South Florida (USF) (Tampa, FL, USA)), human neuroblastoma SH-SY5Y cells (ATCC, Manassas, VA), murine neuroblastoma cells (N2a cells), murine neuronal stem cells (STEMCELL Technologies, Vancouver, BC, Canada), human neural stem cells (H9-Derived, ATCC) were cultured in Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) with 10% fetal bovine serum, 1 mM sodium pyruvate, and 100 U/ml of penicillin/streptomycin. Kidney cells were cultured in InVitro GRO medium (BioreclamationIVT, ATCC). Splenocytes from individual mice were prepared and treated as previously described. 53 Primary neuronal cells were obtained from cerebral cortices of Tg2576 mouse embryos, between 15 and 17 days in utero , as described previously. 54 These cells were treated with LP or LC at 0, 2.5, 5, 10, 20, or 30 mM for 12 h, supernatants were collected and cells were washed with ice-cold PBS 3X and lysed with cell lysis buffer (20 mM Tris, pH 7.5, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1% v/v Triton X-100, 2.5 mM sodium pyrophosphate, 1 mM β -glycerolphosphate, 1 mM Na 3 VO4, 1 μ g/ml leupeptin, and 1 mM PMSF) (Sigma-Aldrich).

In addition, murine primary culture microglia was isolated from mouse cerebral cortices, as described previously. 55, 56 In brief, cerebral cortices from newborn mice (1-day old) were isolated under sterile conditions and mechanically dissociated at 4 °C. Cells were grown in RPMI 1640 medium supplemented with 5% fetal calf serum, 2 mM glutamine, 100 U/ml penicillin, 0.1 μ g/ml streptomycin, and 0.05 μ M 2-mercaptoethanol for 14 days, after which only glial cells remained. Astrocytes were separated from microglial cultures using a mild trypsinization protocol as described. 57 Greater than 98% of these glial cells stained positive for anti-Mac-1 antibody (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN, USA) by fluorescence-activated cell sorting (FACS) analysis. 58

Enzimski imunosorbentni test

Enzyme-linked immmunosorbent assay (ELISA) was performed according to the manufacturer's instruction. Total A β species, including A β 40, 42 in cell conditioned media and brain homogenates were detected by A β 1–40/42 ELISA kits (IBL America, Minneapolis MN, USA) according to the manufacturer's instructions. In addition, cytokines (TNF α , IL-10, and IL-12 (p70)) levels in brain homogenates and or in cell conditioned media were measured by ELISA (R &D Systems, Minneapolis, MN) according to the manufacturer's instructions. A β levels are represented as pg/mg (mean±SEM) of total cellular protein.

Microglial inflammatory activity analysis

To determine the effect of LP on microglial pro-inflammatory activity, primary microglial cells were treated with LP (0–20 mM) in the presence of interferon γ (IFN γ ) (100 U/ml) and/or CD40 ligand (CD40L, 1 μ g/ml) for 8 h, and then pro-inflammatory microglial activation was assessed by FACS and ELISA analyses of CD40, tumor necrosis factor α (TNF α ), and interleukin-12 protein 70 (IL-12p70). 55, 58

Phagocytosis analysis

To determine the effect of LP on microglial A β phagocytosis, primary microglia were pre-treated with LP at 10 mM or vehicle (1% dimethyl sulfoxide) for 6 h followed by incubation with 1 μ M fluorescein isothiocyanate (FITC)-A β 42 for 1 h. Cellular supernatants and lysates were analyzed for extracellular and cell-associated FITC-A β 42 using a fluorometer and data were represented as the relative fold of mean fluorescence change, calculated as the mean fluorescence for each samples at 37 °C divided by mean fluorescence at 4 °C.

Autophagy analysis

In addition, the effect of LP and LC on microglial autophagy was determined by pretreating microglial cells with LP, LC (10 mM), or phosphate-buffered saline (PBS) for 18 h, followed by permeabilization, staining with autophagic marker LC3B antibody and determination of fluorescent intensity of autophagosome and cytosol by a Slidebook digital microscopy (Version 5.0.0.1, Olympus America Inc., NY USA).

životinje

Triple transgenic (3XTg-AD) mice harboring APP SWE, PSEN1 (PS1/M146V) and tau (P301L) mutations (3XTg-AD, The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME, USA), Tg2576 mice harboring APP SWE (Taconic, Hudson, NY, USA), and wild-type B6129SF2/J mice (the Jackson Laboratory) were housed under standardized 12 h-light/12-h dark cycle at ambient temperature and humidity with diet and water available ad libitum at the USF vivarium. The mice were allowed to acclimate for a period of one week before any treatment. All experiments were conducted in accordance with USF Institutional Animal Care and Use Committee approved protocols and guidelines of the National Institutes of Health.

Lithium treatment

Adult male B6129SF2/J mice (2-month old) were treated for 2 weeks (acute) with one of six diets, consisting of normal mice chow diet (Teklad 2018) containing low or high doses of LP (0.18 or 0.35%; equivalent to 292 or 583 mg/kg/day), LS (0.10 or 0.20%; equivalent to 162 or 325 mg/kg/day), or LC (0.025 or 0.05%; equivalent to 42 or 83 mg/kg/day), yielding 1.125 or 2.25 mM Li/kg/day, respectively, for all forms of lithium. In addition, both male and female Tg2576 (8-month old) and 3XTg-AD mice (5-month old) were fed for 8 and 28 weeks (chronic) with one of four diets, respectively, consisting of normal mice chow alone or normal chow supplemented with LC (0.05%), LS (0.20%), or LP (0.35%). These doses were chosen based on the literature and a pilot study conducted at our laboratory using low- and high doses of lithium salts.

Plasma and brain lithium measurement

After LP, LS, or LC treatment, mice were anesthetized with isoflurane, blood was collected by cardiac puncture, the heart and vasculature were carefully perfused with ice-cold PBS containing heparin (10 U/ml) and brain tissue was removed for lithium determination using atomic absorption spectroscopy (AAS). Blood was centrifuged at 1, 600 × g at room temperature for 10 min and 100 μ l plasma was diluted 10 fold in 10% isopropyl alcohol containing 5% trichloroacetic acid (IPA), vortexed, and incubated for 10 min to precipitate proteins. Supernatants were clarified at 3000 × g for 30 min prior to measuring lithium content (AA-6200, Shimadzu, Kyoto, Japan at the Interdisciplinary Research Facility at USF). Each brain was divided coronally, the front half was rinsed with PBS, weighed, suspended in an equal volume of concentrated HNO 3, heated for 1 h at 100 °C, cooled to room temperature, centrifuged at 3000 × g for 1 h, and the supernatant was diluted 10 fold in 10% isopropyl alcohol prior to measuring lithium content using AAS (Shimadzu AA-6200). Peak absorbance were determined referring to values obtained for standards 1% HNO 3 lithium solution (HIGH-PURITY STANDARDS, Charleston, SC, USA).

Western blot analiza

The posterior half of each brain was equally divided sagittally and one portion (one-fourth of brain) was immediately frozen at liquid nitrogen, and stored at −80 °C for western blot (WB) analyses. Brains were homogenized (Minilys homogenizer, Bertin Technologies) in RIPA lysis buffer (Cell Signaling Technology) containing protease and phosphatase inhibitor cocktail (Thermo Fisher Scientific) and centrifuged at 14 000 rpm for 1 h at 4 °C. For WB analyses, supernatants from cell lysates or homogenized tissue were electrophoretically separated using 10% bicine/tris gel (8 M urea) for proteins less than 5 kD or 10% tris/SDS gels for larger proteins. Electrophoresed proteins were transferred to nitrocellulose membranes (Bio-Rad, Richmond, CA, USA), washed and blocked for 1 h at room temperature in tris-buffered saline containing 5% (w/v) non-fat dry milk (TBS/NFDM). After blocking, membranes were hybridized overnight with various primary antibodies, washed and incubated for 1 h with the appropriate HRP-conjugated secondary antibody in TBS/NFDM. Blots were developed using the luminol reagent (Thermo Fisher Scientific) and densitometry analysis was performed using an ImageJ software (Java 1.6.0_20, NIH, USA) as used previously. 59, 60

Imunohistokemijska analiza

The other posterior portion (one-fourth) of each brain was fixed in fresh 4% paraformaldehyde solution for cryostat sectioning and free-floating 25- μ m coronal sections were collected and stored in PBS with 100 mM sodium azide at 4 °C. Immunohistochemical (IHC) staining was conducted according to the manufacturer's instruction using a Vectastain ABC Elite kit (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA) coupled with the diaminobenzidine substrate. Biotinylated anti-phospho-tau antibodies against different phospho-tau residues were used as primary antibodies. Images were acquired as digitized tagged-image format files to retain maximum resolution using a BX60 bright field microscope with an attached CCD camera system (Olympus DP-70, Tokyo, Japan). Digital images were routed into a Windows PC for quantitative analyses using an ImageJ software after obtaining a threshold optical density that discriminated staining from background. Each anatomic region of interest was manually edited to eliminate artifacts and selection bias was controlled for by analyzing each region of interest in its entirety. 61

Immunocytochemical analysis

After 30 min fixation with fresh 4% paraformaldehyde solution, ICC staining was conducted by indirect method and visualized by appropriate immunofluorescence dye (ie, FITC)-labeled secondary antibodies. Images were acquired as digitized tagged-image format files to retain maximum resolution using a confocal microscope with an attached CCD camera system (Olympus DP-70).

Statistička analiza

All data were normally distributed; therefore, in instances of single mean comparisons, Levene's test for equality of variances followed by the t -test for independent samples were used to assess significance. In instances of multiple mean comparisons, one-way analysis of variance with post hoc Fisher's LSD test was used. Alpha was set at 0.05 for all analyses. The statistical package for the social sciences release IBM SPSS 23.0 (IBM, Armonk, NY) was used for all data analyses.