Dugo nekodirajući rna myd88 potiče rast i metastaze u hepatocelularnom karcinomu reguliranjem myd88 ekspresije putem modifikacije h3k27 | stanična smrt i bolest

Dugo nekodirajući rna myd88 potiče rast i metastaze u hepatocelularnom karcinomu reguliranjem myd88 ekspresije putem modifikacije h3k27 | stanična smrt i bolest

Anonim

teme

  • Hepatocelularni karcinom
  • Duge nekodirajuće RNA
  • Metastaza
  • onkogcnczom

Sažetak

Pojačana ekspresija Myd88 pronađena je kod različitih tumora parenhima, posebno u hepatocelularnom karcinomu, a mali je mehanizam njegove regulacije. Za puno dugih nekodirajućih RNA se izvještava da reguliraju proteine ​​koji kodiraju gene koji se pridružuju pomoću različitih mehanizama. U našem istraživanju potvrdili smo novu dugu nekodirajuću RNA Myd88 aberantnu ureguliranu u HCC smještenu uzvodno od Myd88 i potvrdili pozitivan odnos regulacije među njima što ukazuje da Lnc-Myd88 može sudjelovati u pojačanom izrazu Myd88 u HCC-u. Analiza stjecanja i gubitka funkcije otkrila je da Lnc-Myd88 može promicati proliferaciju i metastaze HCC-a i in vitro i in vivo . Pored toga, ChIP testovi su pokazali da Lnc-Myd88 može povećati Myd88 ekspresiju pojačavanjem H3K27Ac u promotoru Myd88 gena, što rezultira aktiviranjem oba NF- κ B i PI3K / AKT signalnog puta. Zaključno, predložili smo da Lnc-Myd88 može poslužiti kao nova dijagnoza i terapijski cilj za HCC.

Glavni

Hepatocelularni karcinom (HCC) jedan je od najčešćih karcinoma i treći vodeći uzrok smrti povezane s rakom u svijetu , 1, 2 od kojih se polovina pojavljuje u kini. 3, 4 Iako je postignut veliki napredak u terapijskim metodama, poput resekcije jetre, transplantacije jetre, kemoterapije i radioterapije, prognoza bolesnika s HCC još uvijek je loša. Identificirana je HCC s sklonošću intrahepatičkim ili ekstrahepatičkim metastazama što dovodi do visoke stope recidiva nakon operacije. 6, 7, 8 Poznato je da molekularni mehanizmi koji stoje na bazi onkogeneze i metastaze HCC nisu dobro istraženi i još uvijek je pred nama velika prepreka u istraživanju novih biomarkera koji mogu pridonijeti poboljšanju dijagnoze i prognozi HCC-a. 9

Duge nekodirajuće RNK (lncRNA) definirane su kao podskupina nekodirajućih RNK ​​bez ili ograničene sposobnosti kodiranja proteina koja su sastavljena od više od 200 nukleotida. 10, 11 Akumulacijski istraživači dokazuju da lncRNA prikazuju više kritičnih funkcija u biološkom razvoju različitih tumora putem kompliciranih mehanizama, uključujući onkogenezu i progresiju tumora. 10, 11, 12, 13 Značajno je da je mnogo lncRNA igralo ulogu u HCC-u, uključujući HULC, HEIH, MVIH, HOTAIR i tako dalje. 14, 15, 16, 17 Mehanizmi lncRNA su široko istraženi, uključujući moduliranje procesa transkripcije i post-transkripcije gena, kontroliranje ekspresije gena pomoću kromatinskog remodeliranja, podešavanje funkcije proteina ili lokalizacije. 18 Uz to, istraživači su otkrili da lncRNA mogu sudjelovati u ekspresiji gena kroz epigenetsku regulaciju, uključujući metilaciju, acetilaciju i ubikvitaciju. 19

Napredavanjem sekvenciranja i napomenom čitavih genoma, nova studija otkriva da gotovo> 65% lncRNA smještenih unutar 10 kb poznatih gena koji kodiraju proteine, a koji je poznat kao teorija 'Flank10kb', sugerirajući da može postojati cis- djelujući ili transregulacijske veze između lncRNA i poznatih gena. 20, 21 Uz to, veći dio lncRNA dijelio je dvosmjerni promotor s genima koji kodiraju proteine, što ukazuje da lncRNA mogu modulirati ekspresiju susjednih gena koji kodiraju proteine ​​na način dvosmjerne transkripcije. 22, 23 Time smo istražili interakciju lokacijsko povezanih lncRNA i gena koji kodiraju proteine, proveli smo sustavnu pretragu koristeći puno baza podataka, uključujući PubMed, RNAdb, LNCipedia, UCSC pretraživač genoma i lncrnadb. Konačno, prepoznata lncRNA pod nazivom LOC105377033 izabrana je kao kandidat lncRNA smještena uzvodno od Myd88 s udaljenošću od 20kp i predstavila je obrnuti smjer transkripcije s Myd88. Nadalje smo ga prozvali Lnc-Myd88. Myd88 je definiran kao kancerogeni gen u HCC-u, promičući rast i metastaze ljudskog HCC-a, 12, 24, 25 koji mogu poslužiti kao prognostički i terapeutski ciljni faktor za HCC, 26 dok funkcija Lnc-Myd88 u HCC-u i dalje ostaje nejasna.

U ovom istraživanju pokušali smo utvrditi ulogu Lnc-Myd88 u HCC-u, uključujući hepatokarcinogenezu i progresiju. Pored toga, pokušali smo identificirati mehanizam pomoću kojeg Lnc-Myd88 regulira izraz Myd88.

Rezultati

Lnc-Myd88 je reguliran velikom korelacijom s Myd88 u tkivima HCC-a i povezan je s lošom prognozom

Na temelju bioinformatičkih analiza utvrdili smo da se Lnc-Myd88 nalazio uzvodno od Myd88, s razmakom od oko 20 kb. Prvo, kako bismo istražili je li Lnc-Myd88 međusobno povezan s HCC-om, otkrili smo njegovu ekspresiju u tumorskim tkivima i odgovarajućim susjednim normalnim jetrenim tkivima. Lnc-Myd88 bio je značajno reguliran u HCC tkivima u usporedbi s susjednim normalnim jetrenim tkivima (slika 1a), što ukazuje da je Lnc-Myd88 mogao biti uključen u nozogenezu HCC-a. Budući da je Lnc-Myd88 bio de-novo lncRNA, izveli smo eksperimente kako bismo utvrdili njegovu sposobnost kodiranja proteina i subcelularnu lokalizaciju u tkivima jetre i staničnim linijama. Da bismo utvrdili može li transkript Lnc-Myd88 kodirati bjelančevine, savjetovali smo se s Kodiranim kalkulatorom proteina (//cpc.cbi.pku.edu.cn/) (dopunska slika S1A). U usporedbi s ANRIL-om, dobro proučena nekodirajuća RNA, Lnc-Myd88 je bio skloniji nekodiranju RNA. Prema rezultatima RT-PCR-a pojačanog izdvojenom citoplazmom RNA i nuklearnom RNA, otkrili smo da se Lnc-Myd88 nalazio uglavnom u jezgri staničnih linija Huh7 i SMMC-7721 (dopunska slika S1B).

Image

Lnc-Myd88 je reguliran velikom korelacijom s Myd88 u tkivima hepatocelularnog karcinoma i povezan je s lošom prognozom. ( a ) Ektopna ekspresija Lnc-Myd88 u tkivima HCC tumora i odgovarajućim susjednim normalnim jetrenim tkivima otkrivena je kvantitativnim PCR-om u stvarnom vremenu normaliziranim na GAPDH ( N = 110, P <0, 001). ( b ) Pojačana ekspresija Myd88 u tkivima HCC-a u usporedbi sa susjednim normalnim tkivima jetre otkrivena je kvantitativnim PCR-om u stvarnom vremenu normaliziranim na GAPDH ( N = 110, P <0, 001). ( c ) Pozitivna povezanost između nivoa ekspresije Myd88 i Lnc-Myd88 utvrđena Pearsonovom analizom ( N = 110, r 2 = 0, 5665, P <0, 001). ( d i e ) Relativna razina ekspresije proteina Myd88 u HCC tkivima i susjednim tkivima testirana je Western blottingom i imunohistokemijskim ispitivanjima (izvorno povećavanje × 200). ( f ) Prema srednjoj vrijednosti, pacijenti su podijeljeni u dvije skupine prema Lnc-Myd88 izrazu u HCC tkivima. Test za rangiranje bio je korišten za izračunavanje ukupnog preživljavanja i preživljavanja bez recidiva

Slika pune veličine

Myd88 je bio poznat kao promotor tumora, koji se nalazio u različitim rakovima i povezan je s razvojem tumora, posebno u HCC-u. Pokazalo se da Myd88 potiče proliferaciju, invaziju, metastazu tumorskih stanica i korelira s prognozom bolesnika s HCC-om. Ektopska ekspresija Myd88 potvrđena je qRT-PCR-om, Western blottingom i IHC-om u našem istraživanju (Slike 1b). Da bismo otkrili da li postoji povezanost između nivoa ekspresije Lnc-Myd88 i Myd88 kod HCC tumora, proveli smo qRT-PCR u 110 parova uzoraka tkiva. Prema rezultatima qRT-PCR, proveli smo Pearsonovu korelacijsku analizu kako bismo otkrili povezanost između nivoa ekspresije Myd88 i Lnc-Myd88. Rezultati su pokazali pozitivnu povezanost s P- vrijednošću <0, 001 i r2 = 0, 5665, što sugerira da postoji pozitivna regulacijska veza između Lnc-Myd88 i Myd88 (slika 1c). Da bismo razumjeli značaj aberantne ekspresije Lnc-Myd88 u HCC-u, istražili smo potencijalnu povezanost između ekspresije Lnc-Myd88 i kliničkih patoloških značajki pacijenata. Kao što je prikazano u Tablici 1, srednja vrijednost postavljena je kao granična vrijednost za klasificiranje razine ekspresije Lnc-Myd88, pacijenti su tada podijeljeni u skupine visoke Lnc-Myd88 i niske Lnc-Myd88. Statistička analiza pokazala je da je veća razina ekspresije Lnc-Myd88 u HCC povezana s povećanom veličinom tumora, lošijim stupnjem diferencijacije tumora i metastazama. Međutim, nisu pronađene korelacije s ekspresijom Lnc-Myd88 za druge kliničke parametre, uključujući dob, spol, HBsAg, razinu AFP u serumu, cirozu i broj tumora. Nadalje, analiza preživljavanja pokazala je da su pacijenti s visokom Lnc-Myd88 ekspresijom u HCC-u imali znatno lošiju prognozu od onih s niskom Lnc-Myd88 ekspresijom, s nižim ukupnim postotkom preživljavanja i kraćim razdobljem recidiva (Slika 1f).

Tablica pune veličine

Lnc-Myd88 potiče staničnu proliferaciju i metastaze in vitro

Da bismo istražili biološke funkcije Lnc-Myd88 in vitro , najprije smo otkrili endogenu razinu Lnc-Myd88 u HCC staničnim linijama, kako je prikazano na Dodatnoj slici S1C, postojala je različita raspodjela za ekspresiju Lnc-Myd88 u HCC ćeliji linije, među kojima je SMMC-7721 pokazao najnižu razinu dok Huh7 pokazuje veću endogenu ekspresiju. Prema testu gubitka i dobitaka koji su objavili razni istraživači, odabrali smo SMMC-7721 staničnu liniju za konstrukciju Lnc-Myd88 modela prekomjerne ekspresije i Huh7 staničnu liniju za izgradnju modela Lnc-Myd88 knockdown (slika 2a). Prema rezultatima ispitivanja stvaranja klona, ​​u usporedbi s kontrolnim skupinama, otkrili smo da postoji više klonova formiranih u ekstremno prekomjerno eksprimiranim grupama Lnc-Myd88, dok je padom Lnc-Myd88 očito inhibirana sposobnost formiranja klona u Huh7 stanicama (Slika 2c), Nadalje, u analizama CCK8 otkrili smo da stanice Lv-Lnc-Myd88-SMMC-7721 pokazuju povećanu proliferaciju u odnosu na stanice Lv-NC-SMMC-7721, dok je proliferacija stanica sh-Lnc-Myd88-Huh7 bila potisnuta, što ukazuje da Lnc-Myd88 može pospješiti rast HCC stanica (Slika 2b). Osim toga, kako bismo potvrdili funkciju Lnc-Myd88 u staničnom rastu, proveli smo EdU test obojenja (Slika 2d). Stabilna ektopično prekomjerna ekspresija Lnc-Myd88 povećala je broj EDU-pozitivnih jezgara stanica SMMC-7721 u odnosu na kontrole. Osim toga, u usporedbi s kontrolama, stabilno rušenje Lnc-Myd88 smanjilo je broj EdU-pozitivnih jezgara Huh7 stanica. Pretpostavili smo da li je Lnc-Myd88 ubrzao proliferaciju HCC stanica promičući napredovanje staničnog ciklusa i inhibirajući apoptozu stanica. Zatim smo iskoristili FACS tehnologiju kako bismo istražili može li Lnc-Myd88 utjecati na stanični ciklus i apoptozu stanica. Eksperimenti sa staničnim ciklusom pokazali su smanjenje populacije G0 / G1 i porast populacije S-faze u Lnc-Myd88-prekomjerno eksprimiranim SMMC-7721 stanicama, dok je knockdown Lnc-Myd88 imao suprotne učinke u Huh7 stanicama (Slika 3a). Nadalje, rezultati ispitivanja stanične apoptoze pokazali su da prekomjerna ekspresija Lnc-Myd88 može smanjiti staničnu apoptozu u stanicama SMMC-7721, dok ćelije sh-Lnc-Myd88-Huh7 dobiti povećanje apoptoze u usporedbi s kontrolama (Slika 3b). Svi ovi rezultati dokazali su da Lnc-Myd88 potiče rast i proliferaciju HCC stanica.

Image

Lnc-Myd88 potiče proliferaciju HCC stanica in vitro . ( a ) Učinkovitost transfekcije ektopične ekspresije i prigušivanje gena Lnc-Myd88 u stanicama SMMC-7721 i Huh7 određena je qRT-PCR. ( b ) Sposobnost proliferacije otkrivena je testom CCK8, prekomjerna ekspresija Lnc-Myd88 promovirala je proliferaciju stanica SMMC-7721, dok je oborenje Lnc-Myd88 inhibiralo proliferaciju Huh7 stanica. ( c ) Testovi formiranja kolonije provedeni su na različito tretiranim HCC stanicama tijekom 2 tjedna, prikazani su reprezentativni grafikoni. ( d ) EdU imunofluorescentnim bojenjem potvrdio je funkciju Lnc-Myd88 na proliferaciji HCC stanica. Izvorno uvećanje × 200. Stabilna prekomjerna ekspresija Lnc-Myd88 povećala je proliferaciju SMMC-7721 stanica dok je padom Lnc-Myd88 smanjena proliferacija Huh7 stanica. Svi su pokusi izvedeni u tri primjerka i prikazani su kao srednja vrijednost ± SEM (* P <0, 05, ** P <0, 01)

Slika pune veličine

Image

Lnc-Myd88 regulira stanični ciklus hepatoma, staničnu apoptozu i staničnu migraciju in vitro . ( a ) Analiza staničnog ciklusa stanica SMMC-7721 stabilne prekomjerne ekspresije Lnc-Myd88 i Huh7 stanica stabilne prigušene ekspresije Lnc-Myd88 provedena je protočnom citometrijom. Distribucija staničnog ciklusa prikazana je na grafovima. ( b ) Stanice su kultivirane kompletnim medijem s 0, 5 mM peroksida preko noći, a brzina apoptoze stanica otkrivena je protočnom citometrijom pomoću pribora za bojenje u Dodatku V-APC / 7-AAD. Vredni graf prikazuje postotak apoptotičkih stanica. ( c ) Analiza invazije i migracije Lnc-Myd88 ćelija prekomjerno eksprimiranih i utihnutih. Vrijednosni grafikon prikazuje broj ćelija migriranih ili upadanih kroz membranu. Izvorno uvećanje × 200. Svi eksperimenti su izvedeni u tri primjerka i prikazani su kao srednja vrijednost ± SEM (* P <0, 05, ** P <0, 01)

Slika pune veličine

Korelacijska analiza između Lnc-Myd88 i kliničkopatoloških karakteristika pokazala je da Lnc-Myd88 može promovirati metastazu HCC-a. Da bismo istražili je li Lnc-Myd88 imao izravnu funkcionalnu ulogu u invaziji stanica i migraciji stanica, proveli smo probne testove. Rezultati su pokazali da su sposobnosti migracije i invazije SMMC-7721 stanica značajno povećane kada je Lnc-Myd88 prekomjerno izražen, dok je knockdown Lnc-Myd88 značajno smanjio migraciju stanica i invaziju u Huh7 stanicama (Slika 3c). Na temelju gornjih rezultata, predložili smo da Lnc-Myd88 potiče migraciju i invaziju HCC stanica.

Lnc-Myd88 pojačava rast tumora i metastaze in vivo

Da bismo dodatno istražili funkcionalnu ulogu Lnc-Myd88 in vivo , uspostavili smo model ksenotransplantacije u kojem je golom mišu supkutano ubrizgan Lnc-Myd88 ektopično prekomjerno eksprimiran i kontroliran SMMC-7721 stanicama (slike 4a i b). Otkrili smo da su ksenografti proizvedeni iz stanica prekomjerno eksprimiranih Lnc-Myd88 brže od kontrolnih skupina, a konačni volumen i težina tumora bili su veći od kontrolnih (Slika 4c). Također smo otkrili razinu ekspresije Myd88 u tumorskim uzorcima iznad IHC-a, a ekspresija Myd88 povećana je u stanicama Lv-Lnc-Myd88-SMMC-7721 u usporedbi s kontrolama (Slika 4d). Zatim, kako bismo istražili promjene metastaznih stanica pluća u HCC-u, izgradili smo model ksenoplafta repne vene. U svaku smo skupinu postavili dvije skupine s osam miševa, jednoj skupini smo ubrizgali Lnc-Myd88 oborene Huh7 stanice, a drugoj su kontrolne skupine transficirane s GFP-om (Slika 4e). Rezultati su otkrili da su u kontrolnoj skupini formirani neki čvorovi na metastazi na plućima sa šest miševa koji su na kraju eksperimenta pokazali kolonizaciju pluća, dok su samo tri miševa utvrdila kolonizaciju pluća u knockdown grupi s manje i manjih tumora u odnosu na kontrolnu skupinu (Slika 4f). Svi rezultati kolonizacije pluća potvrđeni su histološkim pregledom (slika 4 g). Uzeto zajedno, ovi rezultati su pokazali da Lnc-Myd88 potiče rast i metastazu HCC tumora in vivo . Zatim smo istražili mehanizam Lnc-Myd88 u HCC-u.

Image

Lnc-Myd88 pojačava rast tumora i metastaze in vivo . ( a – c ) BAB / c goli miševi (u dobi od 6 tjedana) supkutano su presadili stanice SMMC-7721, stanice Lv-Lnc-Myd88-SMMC-7721 (1 × 10 7 ) u desnoj preponi i Lv-NC SMMC -7721 (1 × 10 7 ) stanica u lijevoj preponi (5 miševa u svakoj grupi). Volumen tumora je izračunat svakih 5 dana nakon transplantacije, a miševi su ubijeni 30 dana nakon implantacije. Lnc-Myd88 jača rast tumora SMMC-7721 stanica kod golih miševa. Volumen svakog tumora izračunat je kao duljina × širina 2 × 0, 5. ( d ) Razina ekspresije Myd88 u uzorcima tumora određena IHC-om. Izvorno uvećanje × 200. ( e ) U modelu ksenografta repne vene miševima (po 8 u svakoj skupini) ubrizgana je Huh7 stanica (1 × 10 7 suspendirana u 200 μl PBS) kroz repnu venu i ubijena 5 tjedana kasnije, pluća metastaze su ispitivane u svakoj skupini, in vivo fluorescentnim sustavom za slikanje. ( f ) U usporedbi s knockdown grupom Lnc-Myd88 (tri su miševa predstavila kolonizaciju pluća), šest je miševa pokazalo kolonizaciju pluća s više i većim tumorima u kontrolnoj skupini. ( g ) Svi rezultati kolonizacije pluća potvrđeni su histološkim pregledom (H&E). Izvorno uvećanje × 200 (* P <0, 05, ** P <0, 01)

Slika pune veličine

Lnc-Myd88 inducira regulaciju Myd88 pojačanom acetilacijom promotora Myd88

S obzirom na značajnu funkciju promicanja tumora Lnc-Myd88 in vitro i in vivo , upitali smo se je li učinak Lnc-Myd88 povezan sa susjednim genom Myd88. Prema analizi baze podataka ENCODE, otkrili smo da je u usporedbi s promocijskom regijom Lnc-Myd88, uzvodno od početnog mjesta za transkripciju Myd88, u promotorskoj regiji Myd88 bilo mnogo CpG otoka. Bilo je i obogaćivanje H3K27Ac i H3K4m3, ali niska koncentracija H3K27m3 u promotorskom području Myd88 u stanicama H1-hESC i K562, što ukazuje da modifikacija histona može sudjelovati u izrazu Myd88 u regulaciji transkripcije (Slika 5a). Stoga smo proveli testove imunoprecipitacije kromatinom (ChIP) kako bismo otkrili obogaćivanje H3K27Ac, ​​H3K27m3 i H3K4m3 promotora u pet uparenih tkiva koja su verificirana s abberantnom nereguliranom ekspresijom Myd88 i Lnc-Myd88 u tumorima u usporedbi s susjednim normalnim tkivima. Kao što je prikazano na (Slika 5b), otkrili smo da se acetilacija H3K27 u promotoru Myd88 obogatila, dok u promotoru Myd88 nije bilo razlike između H3K27m3 i H3K4m3. Stoga bismo mogli izvući hipotezu da Lnc-Myd88 može sudjelovati u acetiliranju H3K27 u promotoru Myd88. Da potvrdimo ovu hipotezu, testirali smo obogaćivanje H3K27Ac u promotoru Myd88 testom ChIP, kao što je prikazano na slici 5c, uregulacija Lnc-Myd88 rezultirala je poboljšanim H3K27Ac Myd88, dok je smanjenjem Lnc-Myd88 smanjeno obogaćivanje H3K27Ac Myd88, Kao što je dokumentirano u prethodnim izvještajima, pojačana acetilacija H3K27 bila je važan agonist za ekspresiju gena. Zatim smo koristili qRT-PCR za otkrivanje nivoa ekspresije mRNA Myd88 u HCC stanicama tretiranim Lnc-Myd88 i otkrili smo da u usporedbi s kontrolama dolazi do pojačane ekspresije Myd88 u stanicama Lv-Lnc-Myd88-SMMC-7721, dok je razina ekspresije Myd88 smanjena u stanicama sh-Lnc-Myd88-Huh7 (Slika 5d). Zatim smo testirali alternaciju na razini proteina primjenom Western blottinga i dobili iste rezultate (Slika 5e). Na osnovu gore spomenutih rezultata IHC, donosimo zaključak da Lnc-Myd88 može regulirati ekspresiju Myd88 na mRNA i razini proteina u HCC stanicama regulirajući obogaćivanje H3K27Ac u promotorskoj regiji Myd88.

Image

Lnc-Myd88 inducira regulaciju Myd88 pojačanom acetilacijom promotora Myd88, a zatim aktivira NF- κ B i PI3K / AKT signalne putove. ( a ) Predviđanje obogaćivanja H3K4m3, H3K27Ac i H3K27m3 u promotorskom području Myd88 putem baze podataka ENCODE. ( b ) Obogaćivanje H3K4m3, H3K27Ac i H3K4m3 u promotornoj regiji Myd88 kod bolesnika s HCC-om. ( c ) Promjena obogaćivanja H3K27Ac u promotorskom području Myd88 u HCC stanicama tretiranim Lnc-Myd88. ( d i e ) Promjena mRNA i razina proteina Myd88 u HCC stanicama inducirana Lnc-Myd88. GAPDH korišten je kao kontrola opterećenja. ( f i g ) Razine NF- κ B, p-NF- κ B, AKT, p-AKT i GAPDH ispitivane su Western blotom u SMMC-7721 i Huh7 stanicama tretiranim s Lnc-Myd88. Eksperimenti su izvedeni u tri primjerka; podaci su izraženi kao srednja vrijednost ± SEM (* P <0, 05, ** P <0, 01)

Slika pune veličine

NF- κ B i PI3K / AKT signali potiču se reguliranjem Myd88 induciranim Lnc-Myd88

Prema prethodnim literaturama, Myd88 je dokumentiran kao promotor tumora kod različitih karcinoma, posebice kod HCC, pokazano je da potiče proliferaciju, invaziju, metastazu tumorskih stanica putem aktiviranja signalnih putova NF- κ B i PI3K / AKT. Budući da smo otkrili da Lnc-Myd88 može potaknuti rast i metastazu HCC stanica in vitro i in vivo i regulirao ekspresiju Myd88 u razini transkripcije podešavanjem obogaćivanja H3K27ac promotora Myd88, pitali smo se mogu li NF- κ B i PI3K / AKT signalni putevi bili su uključeni u mehanizam kancerogene funkcije Lnc-Myd88. Da bismo potvrdili ovu hipotezu, testirali smo ekspresiju ova dva puta zapadnim blottingom. Kao što je prikazano na slici 5f, na sreću, prekomjerna ekspresija Lnc-Myd88 u velikoj mjeri jača aktivaciju NF- κ B u stanicama SMMC-7721, a propadanje Lnc-Myd88 uspjelo je značajno inhibirati unutarnju aktivnost NF- κ B u MyD88 stanicama visoke ekspresije Huh7. Također, otkrili smo da uregulacija Lnc-Myd88 značajno poboljšava intrinzičnu aktivaciju AKT u stanicama SMMC-7721, a regulacija Lnc-Myd88 smanjuje aktivaciju AKT u stanicama Huh7 (Slika 5g). Sve u svemu došli smo do zaključka da Lnc-Myd88 može pospješiti progresiju tumora ureguliranjem Myd88 i zatim aktiviranjem NF- κ B i PI3K / AKT putova signala.

Rasprava

Posljednjih godina zabilježeni su dugi nekodirajući RNA kao značajne regulatorne molekule uključene u više bioloških procesa i raznih bolesti, uključujući HCC. 23 Od različitih i kompliciranih mehanizama lncRNA, modifikacije histona, uključujući acetilaciju, metilaciju i ubikvitaciju, pojavljuju se kao ključni regulatorni mehanizam interakcije između lncRNA i njihovih susjednih gena koji kodiraju proteine. 27, 28 Na primjer, dokumentirano je da DNMT regrutuju lncRNA za promicanje metilacije CpG otoka ili modificiranje trimetilacije H3K27 u promotorskoj regiji gena. Nadalje, dokazano je da dio lncRNA izvršava svoju funkciju u regulaciji acetilacije H3K27ac u promotorskoj regiji gena. 29 U ovom istraživanju, na osnovu gore spomenutih kompliciranih molekularnih mehanizama, pokušali smo istražiti potencijalni obrazac regulacije između lncRNA i susjednih gena koji kodiraju proteine. 20

Nađeno je da je Myd88 prekomjerno izražen u različitim vrstama karcinoma parenhima, a mali je mehanizam njegove regulacije poznat. Kao što je izviješteno u prethodnim studijama, poboljšani Myd88 ne samo da može izbjeći apoptotsku stimulaciju i promicati napredak staničnog ciklusa, već također dati tumorskim stanicama ojačane sposobnosti proliferacije, migracije i invazije, posebno u HCC-u. A funkcija Myd88 koja promovira tumor pripisana je aktiviranju NF- k B i PI3K / AKT signalnih putova neovisnih o TLR / IL-1R. 30, 31, 32

Lnc-Myd88 kao novi lncRNA potvrđen u našoj studiji prvi je put prijavljen u ljudskom HCC-u. Konkretni aberantni izraz Lnc-Myd88 koji pokazuje pozitivno reguliranje s Myd88 podrazumijevao je da može postojati regulatorni odnos između njih. Prema analizi baze podataka Encode, otkrili smo da se Lnc-Myd88 nalazio uzvodno od gena koji kodira protein Myd88, i prikazao je obrnuti smjer transkripcije s Myd88. Zbog gore spomenutih rezultata ChIP testova, Lnc-Myd88 pokazao je pozitivnu povezanost s obogaćivanjem H3K27Ac u promotorskom području Myd88, što ukazuje da Lnc-Myd88 može regulirati ekspresiju Myd88 putem modifikacija histona. I sljedeći eksperimenti s sekvencijama ChIP potvrdili su našu hipotezu da je Lnc-Myd88 pojačao Myd88 ekspresiju povećanjem obogaćivanja H3K27Ac u promotorskoj regiji, a zatim aktivirao NF- κ B i PI3K / AKT signalne putove.

Zaključno, naša je studija identificirala novi Lnc-Myd88 koji ima pozitivan odnos sa susjednim promotorom tumora Myd88 u humanoj HCC. Lnc-Myd88 može povećati Myd88 ekspresiju kroz pojačani H3K27Ac u promotoru Myd88 gena. Aberantna ekspresija Lnc-Myd88 povećala je razinu Myd88, što je rezultiralo aktiviranjem i NF- κ B i PI3K / AKT signalnih putova, a zatim promoviralo proliferaciju i metastaze HCC-a i in vitro i in vivo . Budući da pojačana ekspresija Lnc-Myd88 ukazuje na agresivnije tumore i lošiji klinički ishod u HCC-u, predložili smo da Lnc-Myd88 može biti novi indeks za kliničku dijagnozu i može poslužiti kao potencijalna terapijska meta za HCC. Svi naši nalazi su korisni za istraživanje mehanizma lncRNA u karcinogenezi i progresiji HCC-a, što može doprinijeti istraživanju novih prognoza i potencijalnih terapijskih pokazatelja HCC-a.

Metode i materijali

Uzorci bolesnika i stanične linije

Ukupno 110 uparenih HCC svježih tkiva sastoji se od tumora i susjednih normalnih uzoraka dobiveno je od pacijenata koji su podvrgnuti resekciji jetre u Centru za transplantaciju jetre u Prvoj podružničkoj bolnici Medicinskog sveučilišta u Nanjingu od listopada 2012. do studenog 2013. Odobreno od našeg institucionalnog etičkog odbora, sve pacijenti u našoj studiji dali su svoj informirani pristanak da sudjeluju u našoj studiji prije operacije. Sva svježa tkiva su sakupljena i zamrznuta u tekućem dušiku u roku od 10 minuta. Dijagnoza svih bolesnika bila je histopatološki potvrđena, a kliničke karakteristike svih bolesnika sažete su u tablici 1. HepG2, SNU423, SMMC-7721, Hep3B, 97H, 97 L, humane stanične linije humanog hepatoma i ljudska normalna stanična linija L02 u ovoj studiji dobiveni su od KeyGen-a (Nanjing KeyGen Biotech Co., Ltd, Jiangsu, Kina). Sve ćelije uzgajane su u mediju DMEM (Gibco, New York, CA, SAD), prethodno tretiranom 10% fetalnim goveđim serumom, 80 U / ml penicilin natrija na 37 ° C u vlažnom zraku koji sadrži 5% ugljičnog dioksida.

Kvantitativni PCR u stvarnom vremenu

Ukupni RNA uzoraka i stanica svježeg tkiva ekstrahirani su reagensom TRIzol prema uputama proizvođača (IInitrogen, Carlsbad, CA, SAD). QRT-PCR je proveden za procjenu razine ekspresije Lnc-Myd88 i mRNA svih relevantnih gena. Da bismo izvukli RNA iz citoplazme i citonukleusa, koristili smo SurePrep nuklearni ili citoplazmatski komplet za pročišćavanje RNA tvrtke Thermo Fisher Scientific (Rochester, Waltham, MA, SAD). Kao unutarnja kontrola koristili su se GAPDH.

Ektopska ekspresija i prigušivanje gena Lnc-Myd88, prigušivanje gena Myd88

Da bi se prekomjerno izrazio Lnc-Myd88, puna duljina Lnc-Myd88 subklonirana je u lentivirusni vektor GV367 (Gene, Šangaj, Kina). Sekvencija šRNA koja cilja Lnc-Myd88 klonirana je u lentivirusni vektor pLL3.7 (Gene) kako bi se oborio ekspresija Lnc-Myd88, a isti proizvođač osigurao je špinru s negativnom kontrolnom dlakom bez homologije sekvenci prema ljudskim genima. Lentivirusni plazmidni vektori koji kodiraju RNA kratkih dlačica (shRNA) koji ciljaju Myd88 ili scramble shRNA generirani su i označeni kao sh-Myd88 i sh-NC, respektivno. Svi su vektori označeni pojačanim zelenim fluorescentnim proteinom (EGFP). Transfekcija stanica provedena je prema uputama proizvođača, a učinkovitost transfekcije potvrđena je qRT-PCR, a zatim su stanice podvrgnute ekstrakciji RNA ili funkcionalnom ispitivanju.

Stanična proliferacija i invazija

Sposobnost proliferacije HCC stanica testirana je testom klonske formacije, Kit za brojanje stanica-8 (Dojindo Laboratories, Kumamoto, Japan), imunofluorescentnim testom bojenja EDU (5-etinil-2'-deoksiuridin) (Milipore, Billerica, MA, SAD) prema uputama proizvođača. Stanična analiza migracije i invazije provedena je korištenjem probojne komore (veličina pora 8 µm; Millipore). U testima migracije, stanice su uzgajane u gornjoj komori sa medijem bez seruma. Međutim, u testovima invazije, donja komora je dodana u mediju sa 10% FBS-a. Nakon 48 h, stanice koje su migrirale ili prodrle kroz membranu fiksirane su metanolom, obojene kristalno ljubičastom bojom i prebrojane.

Analiza protočne citometrije staničnog ciklusa i apoptoze

Za analizu staničnog ciklusa, stanice Lv-NC-SMMC-7721, Lv-Lnc-Myd88-SMMC-7721, sh-NC-Huh7 i sh-Lnc-Myd88-Huh7 podvrgnute su gladovanju u serumu kako bi izazvale sinkronizaciju staničnog ciklusa. Stanice u razdoblju rasta logaritma su sabrane i fiksirane u 70% -tnom etanolu tokom noći na -20 ° C. Sljedećeg dana stanice su isprane i inkubirane u propidijevom jodidu te analizirane protočnom citometrijom. Za analizu apoptoze, stanice su uzgajane s kompletnim medijem s 0, 5 mM peroksida preko noći, a bojanje Annexin V-APC / 7-AAD je također izvedeno pomoću protočne citometrije prema proizvođaču (Roche, Basel, Švicarska).

In vivo eksperimenti

Goli miševi BAB / c, stari 6 tjedana ili stariji, kupljeni su u centru za životinje Sveučilišta Nanjing (Nanjing, Jiangsu, Kina), koje je uzgajao i dozvolio Odbor za proučavanje životinja na Sveučilištu Nanjing. U modelu potkožne transplantacije, pet miševa je implantirano Lv-Lnc-Myd88-SMMC-7721 stanice (1 × 10 7 ) u desnoj preponi i Lv-NC SMMC-7721 stanice (1 × 10 7 ) u lijevoj preponi. Izračunali smo volumen tumora svakih 5 dana nakon transplantacije i ubili ih 30 dana nakon implantacije. Za model ksenografta repne vene, osam miševa iz svake skupine ubrizgano je stanicama (1 × 10 7 suspendirano u 200 μl PBS) kroz repnu venu i ubijeno 5 tjedana kasnije. Jedna grupa su bile stanice s-Lnc-Myd88-Huh7, a druga su stanice s-NC-Huh7 koje su sve označene s EGFP. Tumori pluća su vizualizirani fluorescencijom pomoću izvora svjetlosti 470 nm (Lightools Research, Encinitas, CA, SAD).

Imunohistokemijski test

Uzorci tkiva fiksirani su u 4% paraformaldehidu na 4 ° C i odsječeni na kriške. Nakon deparafinacije i rehidratacije, dijelovi su stavljeni u štednjak na 5 minuta da bi se antigen obnovio pomoću citratne metode. H20 O suzbija aktivnost endogene peroksidaze radi smanjenja pozadine. Potrebno je također blokirati u normalnom kozjem serumu s 5% BSA u TBS na sobnoj temperaturi. Odjeljci se inkubiraju s primarnim antitijelom (1: 400 razrjeđenja) preko noći na 4 ° C i zatim isperu tri puta u PBS-u. Nakon inkubiranja sa sekundarnim antitijelima, odsjeci su podvrgnuti reakciji DAB. Fotografirajte dijelove pomoću digitalne kamere za mikroskop (Nikon, Tokio, Japan).

Kromatinske imunoprecipitacije

ChIP je proveden upotrebom skupa za analizu ChIP-a prema protokolu proizvođača (17-610; Millipore). Sakupljeno je 1x10 7 –5x10 7 stanica. Formaldehid se upotrebljava za umrežavanje proteina u DNK 20-30 minuta. Zatim sonikatnim lizatom odrežite DNK na veličinu fragmenta od 200-1000 bp. Nakon određivanja koncentracije DNK i veličine fragmenta, u uzorke dodamo primarno antitijelo, anti-H3K27m3, anti-H3K27ac, anti-H3K4m3 i IgG, i zrnce proteina A / G i inkubiramo preko noći na 4 ° C. Umrežavanje je obrnuto inkubacijom 4 sata na 65 ° C. DNA je oporavljena ekstrakcijom fenol / kloroform. Primeri su korišteni za detekciju humane Myd88 promotorske regije PCR-om.

Western blotting

Da bi se dobili proteini, uzorci tkiva i kultivirane stanice otopio je RIPA regent plus fenilmetansulfonilfluorid (Beyotime, Nantong, Kina). Dosljedno, 30 mg proteina je napunjeno u svaku stazu, frakcionirano pomoću SDS PAGE, preneseno na PVDF membranu. And then the membrane was incubated at 4 °C overnight with human-specific antibody of Myd88 (Abcam, London, UK), p-NF- κ B and NF- κ B (CST, Boston, MA, USA), p-AKT/AKT (Abcam, London, UK), GAPDH (CST). The results were visualized by a chemiluminescent detection system (Pierce ECL substrate western blot detection system; Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) and exposure to autoradiography film.

Statistička analiza

All experimental assays were repeated independently in triplicate. Data were expressed as mean±SEM Two-tailed Student's t- test was used to assess the statistical differences between groups. All statistical data were carried out using Statistical Program for Social Sciences 19.0 software (SPSS, Palo Alto, CA, USA) and presented with Graphpad prism 5.0 (GraphPad Software, La Jolla, CA, USA). P -value less than 0.05 was considered as significant.

Bilješka izdavača

Springer Nature ostaje neutralan s obzirom na zahtjeve za jurisdikciju u objavljenim mapama i institucionalnoj pripadnosti.

Dodatna informacija

PDF datoteke

  1. 1.

    Dodatna informacija

    Dodatne informacije nalaze se u ovom radu na web stranici Cell Death and Disease (//www.nature.com/cddis)