Dugotrajno epigenetsko prigušivanje protokaderina kromosoma 5q31 uključeno je u ranu i kasnu fazu kolorektalne tumoregeneze modulacijom onkogenih putova | onkogena

Dugotrajno epigenetsko prigušivanje protokaderina kromosoma 5q31 uključeno je u ranu i kasnu fazu kolorektalne tumoregeneze modulacijom onkogenih putova | onkogena

Anonim

teme

  • Epigenetika raka
  • Stanična signalizacija
  • Rak debelog crijeva
  • onkogcnczom

Sažetak

Gubitak funkcije gena za supresor tumora može se dogoditi kao rezultat epigenetskog prigušivanja velikih kromosomskih područja, naziva se epigenetskim prigušivanjem dugog dosega (LRES), a analize na cijelom genomu otkrile su da je LRES prisutan u mnogim vrstama raka. Ovdje koristimo analizu armature Illumina Beadchip za metilaciju kako bismo identificirali LRES na 800 kb kromosoma 5q31 u kolorektalnim adenomima i karcinomima ( n = 34) u odnosu na normalnu epitelijsku kolonu DNK ( n = 6). Ovo područje obuhvaća 53 pojedinačna gena protocadherina ( PCDH ) podijeljena u tri genske skupine. Hipermetilacija unutar tih genskih klastera je asinhrona; dok se većina PCDH hipermetilacije događa rano, a očituje se u adenomima, metilacija PCDHGC3 promotora nastaje kasnije u prijelazu adenoma - karcinom. PCDHGC3 je hipermetiliran u karcinomima 17/28 (60, 7%) prema analizi metilacijskog niza. Kvantitativna lančana reakcija transkripcije i polimeraze u stvarnom vremenu pokazala je da je PCDHGC3 najveći eksprimirani PCDH u normalnom epitelu debelog crijeva i da je postojala snažna recipročna veza između metilacije PCDHGC3 i ekspresije u karcinomima ( R = -0, 84). PCDH LRES obrasci odražavaju se u kolorektalnim staničnim linijama tumora; Adenomske stanične linije se ne metiliraju na PCDHGC3 i pokazuju obilnu ekspresiju na razini mRNA i proteina, dok je ekspresija potisnuta u staničnim linijama hipermetiliranog karcinoma ( R = -0, 73). Kratko interferirajuća RNA-posredovana redukcija PCDHGC3 dovela je do smanjenja apoptoze u RG / C2 adenomskim stanicama, a prekomjerna ekspresija PCDHGC3 u HCT116 stanicama rezultirala je smanjenjem stvaranja kolonije, u skladu s mogućnostima supresije tumora za PCDHGC3. Daljnja funkcionalna analiza pokazala je da PCDHGC3 može suzbiti Wnt i cilj sisavaca signal signala rapamicina u staničnim linijama kolorektalnog karcinoma. Uzeto zajedno, naši podaci sugeriraju da je PCDH LRES važan lokus supresije tumora u kolorektalnom karcinomu i da PCDHGC3 može biti jak marker i pokretač tranzicije adenoma - karcinom.

Uvod

Razvoj kolorektalnih karcinoma karakterizira nakupljanje višestrukih genetskih i epigenetskih promjena (Cho i Vogelstein, 1992). U oko 60–80% sporadičnih kolorektalnih karcinoma (CRC) tumorigeneza se pokreće mutacijama gena adenomatozne polipoze coli ( APC ) (Miyoshi i sur., 1992; Powell i sur., 1992). Kako je APC bitna komponenta kompleksa uništavanja koji regulira promet β-katenina, transkripcijskog koaktivatora WNT signalnog puta (Klaus i Birchmeier, 2008), ovo ističe konstitutivnu aktivaciju Wnt / β-katenin signalnog puta kao preduvjet za kolorektalnu tumorigenezu. Naknadne somatske mutacije koje se često identificiraju u kolorektalnom karcinomu (CRC-ovi) smatraju se „pokretačima“ potrebnima za tumorigenezu (Wood i sur., 2007), a mutacije u genima BRAF , KRAS , PIK3CA , PTEN i TP53 odražavaju važnost RAS-a -MAPK, PI (3) K i p53 putovi (Fearon, 2011). Većina (∼ 80%) sporadičnih CRC-a pokazuje kromosomsku nestabilnost koju karakterizira aneuploidija (Pino i Chung, 2010), dok manja skupina (∼ 15%) s popravkom neispravnosti neusklađenosti pokazuje mikrosatelitsku nestabilnost (MSI). MSI je također povezan s povećanom učestalošću DNA hipermetilacije na više genskih lokusa i takvi su tumori definirani kao da imaju CpG otočni metilatorski fenotip (CIMP) (Ahuja i sur., 1997; Weisenberger i sur., 2006).

Iako je hipermetilacija specifična za tumor prevladava u mnogim karcinomima, uključujući rak debelog crijeva, stadijsku specifičnost i posljedice različitih epigenetskih promjena manje su dobro definirane od genetskih oštećenja (Jones i Baylin, 2007). Hinomometilacija DNA na cijelom genomu sveprisutna je čak i u ranim benignim tumorima i povezana je s kromosomskom nestabilnošću (Ji i sur., 1997 .; Matsuzaki i sur., 2005.), onkogenom aktivacijom (Baylin i Ohm, 2006.) i deregulacijom otisnutih lokusa (Cui i sur., 2003). Hipermetilacija SFRP Wnt antagonista (Suzuki i sur., 2004) i tumora supresor RASSF1 (Greenspan i sur., 2006) uočena je u izoliranim žarištima kripte; iako se većina slučajeva hipermetilacije pojavljuje rano u kolorektalnoj tumorigenezi, mali podskup „kasnih“ tihih gena, uključujući MLH1 , su specifični za karcinom i mogu biti povezani sa zloćudnom napredovanjem (Ibrahim i sur., 2011; Oster i sur., 2011).

Uzeto zajedno sa specifičnim događajima prigušivanja gena, epigenetska supresija može uključivati ​​i transkripcijsko zaključavanje koje obuhvaća velike kromosomske domene, što rezultira u koordiniranom ušutkivanju brojnih gena. Takvo epigenetsko prigušivanje dugog dosega (LRES) opisano je kod raka debelog crijeva na kromosomu 2q14.2, na MLH1 lokusu 3p22 i, u posljednje vrijeme, Ikarosovom lokusu 7p12 (Frigola i sur., 2006 .; Hitchins i sur., 2007 .; Javierre i sur., 2011). LRES-u i CIMP-u se predlaže da dijele zajedničku etiologiju (Wong i sur., 2011). LRES je također identificiran na dodatnim lokusima i u različitim vrstama karcinoma odraslih, uključujući pluća (Rauch i sur., 2007), karcinom dojke (Novak i sur., 2008) i rak prostate (Coolen i sur., 2010), a također i u Wilmsov tumor - dječji karcinom bubrega (Dallosso i sur., 2009). Uobičajena LRES regija od 800 kbp identificirana u karcinomu dojke i Wilmsov tumor nalazi se na kromosomu 5q31; ovo područje sadrži 53 gena superkamije protokadherina ( PCDH) u tri višegenetska grozda (α-, β- i γ- PCDH s; nomenklatura organizacije ljudskog genoma , i , respektivno ).

PCDH funkcije pretežno su proučavane u stanicama neurona, iako se ekspresija PCDH također primjećuje u ostalim stanicama, uključujući crijeva, pluća i bubrege (Bass i sur., 2007; Dallosso i sur., 2009). PCDH imaju izvanćelijske kadherinske domene uključene u staničnu adheziju (Obata i sur., 1995; Fernandez-Monreal i sur., 2009; Schreiner i Weiner, 2010) i unutarćelijske domene, koje mogu translocirati u jezgru i regulirati ekspresiju gena (Haas i sur. ., 2005; Hambsch i sur., 2005). γ-protocadherini su sposobni da vežu i negativno reguliraju članove porodice fokalne adhezijske kinaze (FAK), uključujući PYK2 (Wang i sur., 2009), a također reguliraju preživljavanje neurona kroz interakcije citoplazmičke domene s programiranom staničnom smrću 10 ( PDCD10 ) ( Lin i sur., 2010). Protocadherini također međusobno djeluju i fosforiliraju ih receptorskom tirozin kinazom enkodiranom RET protokonegenom (Schalm i sur., 2010), a također pokazuju i unutarćelijsko zadržavanje, što može utjecati na oblikovanje unutarćelijske membrane kroz njihove varijabilne citoplazmatske domene (Fernandez- Monreal i sur., 2009 .; Hanson i sur., 2010 .; O'Leary i sur., 2011).

Iako se o molekularnim funkcijama protokaderina u vezi s biološkom tumorom malo zna, raznolike i složene stanične aktivnosti koje posreduju vjerojatno utječu na ključne stanične putove koji su uključeni u staničnu smrt i proliferaciju. Doista, naše studije odabranih γ-PCDH, PCDHGA2, PCDHGA6 ili PCDHGA12, u Wilmsovu tumoru pokazale su njihovu sposobnost suzbijanja aktivnosti Wnt puta in vitro (Dallosso i sur., 2009); ovo je bilo podržano proteomskom analizom proteina koji djeluju na γ-PCDH, a koji su pokazali interakciju s β-kateninom (Han i sur., 2010), zajedno s nekoliko drugih proteina uključenih u karcinogenezu.

Prethodno smo otkrili hipermetilaciju nekih 5q31 PCDH gena u staničnoj liniji kolorektalnog karcinoma HCT116, što nas je potaknulo da istražimo može li se PCDH LRES pojaviti i kod primarnog kolorektalnog karcinoma. Ovdje pokazujemo da je 5q31 LRES također čest u kolorektalnom adenomu (CRA) i karcinomu. Utvrđujemo da, za razliku od većine događaja prigušivanja unutar regije LRES, protocadherin PCDHGC3 u velikoj mjeri nije metiliran u normalnim i adenomskim tkivima, ali često se epigenetički utišava u karcinomima. Kako je to ujedno i najjače izraženi PCDH u normalnom epitelu debelog crijeva, uloga PCDHGC3 ispitivana je u modelima RAK-a i karcinoma. PCDHGC3 je sposoban negativno regulirati Wnt i cilj sisavaca signala rapamicina (mTOR), što je u skladu s funkcijom supresije tumora u kolorektalnom karcinomu.

Rezultati

Epigenetske promjene višestrukih 5q31 protokaderina u kolorektalnoj tumorigenezi i prigušivanje PCDHGC3 povezano s karcinomom

Ispitali smo DNK profil metilacije gena na 5q31 (slika 1a) u normalnom epitelu debelog crijeva od 6 pojedinaca koji nisu karcinomi, 6 CRA (svi mikrosatelitski stabilni (MSS)) i 28 CRC (pet MSI i 23 MSS) koristeći metilacijske matrice. Većina PCDH-ova iz , i hipermetilirani su bilo u adenomima, karcinomima ili u oba u odnosu na normalno tkivo (18 od 22 PCDH- a ispitivanih nizovima, 82%) (Slika 1b ), a svi adenomi i karcinomi pokazali su hipermetilaciju gena koji obuhvaćaju tri PCDH nakupine. Metilacija u genima koji nisu PCDH uz bokove genskog sklopa stabilna je u usporedbi s raširenim promjenama uočenim u sva tri PCDH klastera (Slika 1c). Nijedan gen smješten unutar 500 kbp (7 centromernih gena i 11 telomernih) PCDH lokusa ne pokazuje nikakve dokaze hipermetilacije u odnosu na normalne kontrole. Stoga analiza metilacijskog niza identificira LRES na PCDH lokusu na kromosomu 5q31 u kolorektalnom karcinomu.

Image

Hipermetilacija višestrukih gena protokadherina u 5q31 u kolorektalnim tumorima. ( a ) Organizacija protokaderinskog grozda smještenog na kromosomu 5q31. Lokus snage 800 kbp sadrži tandemski raspored od 53 paralognih gena koji kodiraju protokadherin koji pripadaju potklasterima α, β i γ (, , ). Širina prethodno identificirane regije LRES prikazana je crvenim okvirom. ( b ) Hijerarhijsko grupiranje podataka iz Illumina Infinium Human Metilacije27 metilacijskog niza normalne epitelije debelog crijeva (NCE) od 6 osoba koje nisu karcinomi, 6 CRA (svi MSS) i 28 CRC (5 MSI i 23 MSS). Podaci su normalizirani u odnosu na srednje vrijednosti NCE. Hipermetilacija PCDH uočena je u 18/22 ispitanih PCDH-a i prevladava u CRA i CRC. PCDHGC3 je izuzetak (sa strelicom). ( c ) Promjene metilacije 5q31 DNA specifične su za genske nakupine PCDH . Svaka kutija grupira gene u one koji pripadaju α, β i γ PCDH klasterima ili non- PCDH gene smještene unutar 500 kbp uzvodno (cen) ili nizvodno (tel) PCDH gena. Srednje razine metilacije ilumina infinija za svaku skupinu tkiva su prikazane, pokazujući da, unatoč raširenim epigenetskim promjenama PCDH i u CRA i CRC, metilacija promotora uglavnom nije promijenjena izvan LRES. Atipična 'kasna' hipermetilacija PCDHGC3 istaknuta je crvenom bojom. ( d ) RT-PCR u stvarnom vremenu dva normalna uzorka debelog crijeva (plava i svijetloplava) u odnosu na domaćinstvo TBP-a .

Slika pune veličine

Hipermetilacija PCDH pronađena je i u MSI i u MSS tumorima, što sugerira da povećana metilacija nije samo posljedica CIMP-a. Za 17/18 hipermetiliranih PCDH , pojačana metilacija pronađena je i u adenomima i u karcinomima u odnosu na normalno debelo crijevo (dopunska slika 1; P <0, 03 i <0, 04, Mann-Whitney U- test). Kasna hipermetilacija, odnosno karcinomi, a ne adenomi, primjećuje se samo kod gena PCDHGC3 (slike 1b i c). PCDHGC3 ima nisku razinu metilacije u svim normalnim uzorcima i uzorcima adenoma te je hipermetiliran u oko polovine ispitivanih karcinoma (15/28, 53, 6%) prema analizi nizova.

U našem istraživanju Wilmsovog tumora, primijetili smo da LRES obuhvaća mnogo gena koji nisu eksprimirani u odgovarajućem normalnom tkivu (Dallosso i sur., 2009). Da bismo identificirali varijacije genske ekspresije povezane s karcinomom debelog crijeva, ispitivali smo naš skup podataka Affymetrix exon microarray (Oster i sur., 2011). Analiza normalne ekspresije gena epitela debelog crijeva pokazuje da je broj pojedinačnih PCDH transkripata općenito vrlo nizak (dopunska tablica 1). Mnogi se transkripti ne mogu otkriti iznad pozadine (ispitani 14/47 PCDH ), a srednja ekspresija PCDH je u 10. pertilenti srednje ekspresije gena debelog crijeva ( n = 6). Međutim, robusno izražavanje agregata [zaštićeno je e-poštom] bilo je detektirano analizom njihovih egzona 2–4 ​​s konstantnom regijom nizvodno (Slika 1a). Za usporedbu, nije bilo moguće prepoznati agregatni [zaštićen e-poštom] izraz zbog nepropusnosti skupa sondi sa signalima koji se mogu detektirati iznad pozadine. Od pojedinačnih PCDH koje se mogu lako otkriti višestrukim setovima sonde u tkivu debelog crijeva, PCDHGC3 pokazuje snažnu ekspresiju, a važno je da također pokazuje recipročnu vezu s razinama metilacije Infinium DNA (Dopunska slika 2).

Da bismo potvrdili podatke mikroračuna ekspresije, koristili smo kvantitativnu analizu lančane reakcije transkripcije polimeraza u stvarnom vremenu (RT – PCR) ekspresije PCDH . Analiza dvaju normalnih uzoraka tkiva epitela debelog crijeva pokazala je agregatnu [zaštićenu putem e-pošte] ekspresiju koja je više od 40 puta veća od agregatnog [zaštićen e-poštom] izraza (slika 1d). Kvantifikacija pojedinačnih transkripta PCDH u stvarnom vremenu potvrđuje njihovu relativno malu brojnost. Međutim, među našom kvantitativnom analizom 19 pojedinačnih PCDH-ova , ekspresija PCDHGC3 bila je značajno veća od ostalih analiziranih PCDH (36 do 938 puta), što je otprilike ekvivalentno generiranju TBP-a za održavanje. Ovaj obrazac izražavanja u skladu je s našim prethodnim radom i iz drugih, opisujući kontrastne profile izraza za genske klastere [zaštićen e-poštom] i [zaštićen e-poštom] , sa strogo specifičnim izrazom [zaštićen e-poštom] , ali široko rasprostranjen ] ekspresija u embrionalnim i odraslim tkivima (Bass i sur., 2007 .; Novak i sur., 2008; Dallosso i sur., 2009). Trudili smo se okarakterizirati staničnu ekspresiju PCDHGC3 proteina u mikroračunima tkiva raka debelog crijeva, ali nažalost naša protutijela na PCDHGC3 nisu bila prikladna za imunohistokemiju.

Ova analiza pokazuje da je PCDH LRES često povezan s ranim fazama kolorektalne tumorigeneze. Suprotno tome, i jedinstveno unutar lokusa, podaci iz niza sugeriraju da je hipermetilacija protokaderina PCDHGC3 strogo povezana s prijelazom adenoma - karcinom. Kako je PCDHGC3 najveće izražen PCDH u 5q31, naši podaci sugeriraju da njegova epigenetska deregulacija može biti važna u progresiji kolorektalnog karcinoma. Iz tih smo razloga usredotočili naše naknadne istrage na PCDHGC3 .

Epigenetsko prigušivanje PCDHGC3 kod kolorektalnog karcinoma

Za rigoroznu validaciju naših podataka, napravili smo kvantitativnu analizu metilacije i ekspresije PCDHGC3 u podskupini naših normalnih skupina uzoraka adenoma i karcinoma koristeći bisulfitnu piroakvaciju i RT-PCR u stvarnom vremenu (Slika 2). Piroakvizacijom šest susjednih CpG dinukleotida smještenih između +15 i +47 u odnosu na početno mjesto transkripcije PCDHGC3 (slika 2a) potvrđeno je da se razine metilacije mijenjaju između uzoraka ( P <0, 0005, Kruskal-Wallisov test). PCDHGC3 se praktički ne metilira u normalnim tkivima (prosječno 5, 6%, standardna devijacija (sd) 2, 8%, n = 10). Prosječna metilacija u adenomima bila je veća (prosjek 14, 2%, sd = 15, 3%, n = 10). Međutim, ovo povećanje bilo je pripisano onim adenomima koji su pokazali visokorazrednu displaziju (prosječno 24, 7%, sd = 15, 9%, n = 5), a adenomi s niskorazrednom displazijom nisu hipermetilirani (prosjek 3, 8%, sd = 2, 5%, n = 5). To je u suprotnosti s karcinomima od kojih je većina (81%) hipermetilirana (prosjek 43, 7%, sd = 28, 0%, n = 16). Prema tome, analiza više CpGs piroakvizacijom otkriva veću učestalost hipermetilacije karcinoma nego što je naznačeno pomoću metilacijskih matrica, pri čemu je posljednja tehnika u našoj analizi nepodijeljena za tri karcinoma (dopunska tablica 2).

Image

Kvantitativna analiza metilacije i ekspresije gena PCDHGC3 . ( a ) Piroakviziranje šest CpG dinukleotida uz PCDHGC3 početno mjesto transkripcije (+15 do +47). Za adenomi: niska, niskorazredna displazija; visoka, visokokvalitetna displazija. Jedna zvjezdica ukazuje na značajnu promjenu ( P <0, 03) između normalnog epitela debelog crijeva i adenomi displazije visokog stupnja, a dvije zvjezdice ukazuju na značajne razlike između karcinoma i normalnih ( P <0, 02) i adenomi niske stupnjeve displazije ( P <0, 05) ( Kruskal-Wallisova jednosmjerna analiza varijance s Bonferroni korekcijom za višestruko testiranje). ( b ) Recipročni odnos između PCDHGC3 srednje vrijednosti metilacije piro - posljedičnim (crni markeri) i PCDHGC3 ekspresije gena RT-PCR u stvarnom vremenu (otvoreni markeri) u uzorcima bolesnika (kružni, trokutasti i kvadratni markeri predstavljaju normalne uzorke, adenom i karcinom, respektivno). ( c ) Ekspresija PCDHGC3 analizirana RT-PCR u stvarnom vremenu niža je u metiliranim (M) karcinomima od normalnog epitela (NCE), kolorektalnom adenomu (CRA) i nemetiliranom (U) karcinomu (CRC). * P <0, 01, t- test.

Slika pune veličine

Kao što se očekivalo, metilacija PCDHGC3 i ekspresija gena bili su obrnuto korelirani (Spearmanov koeficijent korelacije ranga = –0, 78, P = 2, 58 × 10 −5 ), što sugerira da je metilacija funkcionalno povezana sa ušutjivanjem gena (Slika 2b). Ekspresija gena je nepromijenjena između normalnih i adenoma ili nemetiliranih karcinoma, ali ekspresija PCDHGC3 u metiliranim karcinomima značajno je smanjena ( P <0, 01, Mann-Whitney U- test) (Slika 2c). PCDHGC3 hipermetilirana podskupina tumora uključuje tri MSI karcinoma i MSI je usko povezan s CIMP-om. Iako su ovi tumori pokazali značajno nižu ekspresiju PCDHGC3 u odnosu na ostatak metiliranog karcinoma ( P <0, 02, MSS-metiliran u odnosu na MS-metiliran, Mann-Whitney U- test ), razine metilacije PCDHGC3 nisu bile značajno veće ( P = 0, 37, Mann-Whitney U- test). Ove studije snažno podržavaju metilaciju PCDHGC3 kao markera tranzicije karcinoma CRA i potencijalno kritičnu epigenetsku leziju u progresiji karcinoma debelog crijeva.

PCDH LRES u staničnoj liniji kolorektalnog karcinoma

Budući da stanične stanice raka vjerno odražavaju epigenetske nedostatke njihova tumora podrijetla, pokazale su se neprocjenjivim u funkcionalnoj karakterizaciji važnih putova raka (Paz i sur., 2003). LRES smo procijenili u staničnim linijama koje potječu od RAK-a i karcinoma ispitivanjem DNA metilacije odabranih promotora 5q31 gena smještenih preko lokusa. Kao što je gore prikazano za primarne uzorke tumora, PCDH hipermetilacija je široko rasprostranjena u genima iz genske skupine [zaštićena e-pošta] , [zaštićena e-pošta] i [zaštićena e-pošta] (slika 3a; dopunska tablica 2). Metilacija je uočena u svakom ispitivanom PCDH (između 42, 9% (3/7) i 100% (7/7) staničnih linija ispitanih za svaki test). Ispitali smo dodatnih pet PCDH gena u HCT116 stanicama i da li je sve pronađeno visoko metilirano (dopunska tablica 2). Važno je da ova analiza također pokazuje da se granice hipermetilirane regije održavaju u uzgojenim stanicama, jer metilacija nije pronađena u popratnim genima ( DNAJC1 , WDR55 i DIAPH1 ). HCT116 stanična linija, o kojoj je izvješteno kao visoko CIMP (Yagi i sur., 2010), ima najveću učestalost metiliranih PCDH (8/8). Značajno je da je metilacija gena PCDHGC3 niska ili odsutna u staničnim linijama adenoma, a gen je u većini ili djelomično metiliran u većini linija karcinoma (slike 3a i b). Kvantitativna analiza ekspresije i metilacije DNA utvrdila je snažnu recipročnu vezu ( R = -0, 73, P = 0, 048, Spearmanova rang-veza), kao što je gore prikazano za primarne uzorke (Slika 3c).

Image

Epigenetsko prigušivanje PCDHGC3 u staničnim linijama karcinoma debelog crijeva. ( a ) Metilacija DNA PCDH gena u staničnim linijama kolorektalnog adenoma i karcinoma. Kombinirana analiza bisulfita i restrikcije PCDH- a i bočni non- PCDH geni pokazuju da uzgajane stanice rekapituliraju 5q31 metilacijski obrazac uočen u tumorima pacijenta. - / +, ismijani / probavljeni uzorci, respektivno. U, nemetilirani COBRA signal; M, metilirani signal. Analiza dodatnih PCDH- ova na staničnoj liniji dana je u Dodatnoj tablici 2. ( b ) Piroakviziranje PCDHGC3 u staničnim linijama kolorektalnog tumora potvrđuje hipermetilaciju specifičnu za karcinom. Linije Adenoma prikazane su otvorenim okvirima, a linije karcinoma sivim okvirima. ( c ) Recipročni odnos između metilacije PCDHGC3 promotora (crne trake) i ekspresije (sive šipke) u stanicama tumora utvrđenih piroakviranjem i RT-PCR u stvarnom vremenu. Razine ekspresije gena prikazane su u odnosu na gen TBP za vođenje kućanstva. ( d ) Farmakološka i genetska reaktivacija transkripcije PCDHGC3 . Kvantitativni RT-PCR u realnom vremenu za ekspresiju PCDHGC3 u HCT116 DNMT1 i DNMT3B dvostrukim stanicama (DKO), u usporedbi s roditeljskim HCT116 stanicama i HCT116 stanicama koje su tretirane demetilirajućim agensom 5-aza-2-deoksicitidin (AZA). Inset je imunoblot koji pokazuje reaktivaciju PCDHGC3 proteina. ( e ) Imunoblotiranje CRA i CRC staničnih linija za PCDHGC3 protein pokazuje veću ekspresiju u nemetiliranim linijama adenoma i karcinoma, a smanjeni protein u metiliranim karcinomima.

Slika pune veličine

Kvantitativna RT-PCR analiza u „realnom vremenu“ stanične linije „DKO“, DNMT1 / DNMT3b dvostruka linija izbijanja izvedena iz HCT116 (Rhee i sur., 2002), pokazuje derepresiju PCDHGC3 u odnosu na roditeljsku liniju. Tretiranje s 5-azacitidinom inhibitorom metiltransferaze DNA također je uspjelo vratiti ekspresiju, ali u manjem opsegu (465- i 62-puta ekspresija nad roditeljskim HCT116 stanicama, respektivno) (Slika 3d). Derepresija je također provjerena na razini proteina imunoblotingom (slika 3d, umetanje). Kao što se očekivalo, na epigenetske eksperimentiranje ne može utjecati na ekspresiju nemetiliranih gena koji nisu PCDH koji spajaju područje LRES. Ekspresija nekoliko drugih PCDH nije utjecala ili su pokazali znatno smanjena porasta promjene nabora u ekspresiji gena u ovim eksperimentima, što vjerojatno sugerira dodatne neepigenetske čimbenike koji ograničavaju brzinu u ovim stanicama (Dopunska tablica 3).

Obrazac ekspresije proteina PCDHGC3 među staničnim linijama adenoma i karcinoma također je ocijenjen imunoblotingom (Slika 3e). Dok je pet staničnih linija dobivenih adenomom pokazalo da se PCDHGC3 proteina lako može otkriti, 6/8 ćelijskih linija karcinoma dobivenih od PCDHGC3 ima malo ili nimalo. Od dvije druge linije karcinoma, SW480 stanice su također pokazale smanjeni PCDHGC3; prema tome, samo jedna od osam linija karcinoma (HCA7) zadržava razinu proteina PCDHGC3 sličnu liniji adenoma. Ove analize potvrđuju promjene ekspresije proteina PCDHGC3 na prijelazu adenoma - karcinom, a također pokazuju da su kolorektalne stanične linije prikladni surogat za in vitro analizu PCDH funkcije.

PCDHGC3 utjecaj na apoptozu i Wnt signalizaciju

Gornji podaci govore da je prigušivanje PCDHGC3 kritično povezano s prijelazom adenoma - karcinoma u kolorektalni karcinom. Pokušali smo istražiti funkcionalne implikacije gubitka PCDHGC3 u ovom kritičnom razdoblju tijekom karcinogeneze primjenom in vitro modela adenoma koji smo prethodno okarakterizirali (Greenhough i sur., 2010). To je uključivalo kratko interferiranje RNA (siRNA) posredovanog propadanja PCDHGC3 u ne-tumorigenskoj premalignoj CRA staničnoj liniji, RG / C2 (Paraskeva i sur., 1989.), za koje smo pokazali da eksprimiraju PCDHGC3 protein (slika 3e). U normalnim uvjetima, ova stanična linija podvrgava se relativno visokoj bazalnoj apoptozi i tako predstavlja model sustava za ispitivanje faktora koji moduliraju preživljavanje. Nakon pada PCDHGC3, udio plutajućih (apoptotskih) stanica je smanjen (71%; P = 0.020, Studentov t- test) u usporedbi s kontrolnim siRNA transfekcijama (Slika 4a). Ovaj smanjeni broj plutajućih stanica povezan je s jasnim smanjenjem cijepljene poli- (ADP-riboze) polimeraze (PARP) (od 55, 5 do 36, 4% cijepanog PARP-a slikovnom denzitometrijom), supstrata kaspaze-3, pokazujući tako smanjenje apoptoze u stanicama sa reduciranim PCDHGC3 (slika 4a).

Image

PCDHGC3 djeluje na apoptozu, rast stanica i Wnt signalizaciju. ( a ) PCDHGC3 suzbija apoptozu u modelu ćelijske linije adenoma. Ciljano rušenje siRNA PCDHGC3 u RG / C2 stanicama kolorektalnog adenoma rezultira smanjenjem plutajućih stanica (* P <0, 05 t -test trostrukog testa). Imunoblotiranje (dolje) potvrđuje učinkovitu obradu PCDHGC3 i kontrolu koncentracije β-aktina u vođenju kućanstva. Niži udio cijepljene poli- (ADP-riboze) polimeraze u obrubljenim uzorcima ukazuje da je promatrano brojanje stanica povezano sa smanjenjem apoptoze u transfektiranim stanicama. ( b ) Suzbijanje formiranja kolonije HCT116 nakon transfekcije cCDNA PCDHGC3 . Nakon odabira i bojenja, kolonije su brojene. Prikazani su prosječni broj kolonija i reprezentativni tanjuri. * P <0, 01 t -test trostrukog testa; CFU, jedinice koje formiraju kolonije. ( c ) Suzbijanje reporterskih aktivnosti β-katenina / T-ćelija koje prate ekspresiju PCDHGC3 . HCT116 i SW480 stanice su kofeficirane s PCDHGC3 cDNA ili praznim vektorskim plazmidom zajedno s Super8XTOPFLASH (TOPFLASH) ili Super8XFOPFLASH (FOPFLASH) plazmidi. Imunobloting (dolje) pokazuje nivoe ekspresije heterolognog proteina i kontrolnog opterećenja β-aktina i razine endogenog ukupnog i ne-fosforiliranog β-katenina. Kao što smo prethodno opazili, ne-fosfo-p-katenin nije moguće otkriti u stanicama HCT116. RLU, relativne svjetlosne jedinice.

Slika pune veličine

Naši dosadašnji rad pokazao je da PCDHGA2, PCDHGA6 i PCDHGA12 mogu regulirati Wnt signalizaciju i svojstva rasta u normalnim stanicama i stanicama raka (Dallosso i sur., 2009). Ekspresija PCDHGC3 također značajno inhibira rast kolonija (66% supresija formiranja kolonija) u HCT116 stanicama (Slika 4b). Zatim smo ispitali učinak prekomjerne ekspresije PCDHGC3 na transkripciju posredovanu s β-kateninom / T-stanicama. U tim smo eksperimentima koristili i stanice SW480 i HCT116, jer je poznato da imaju različite Wnt mutacije puta (truncting APC mutacija i aktivirajuća mutacija β-katenina u SW480, odnosno HCT116, respektivno). U obje stanične linije, prekomjerna ekspresija PCDHGC3 bila je u mogućnosti da značajno suzbije aktivnost reportera (Slika 4c). U stanicama SW480 smanjenje aktivnosti reportera povezano je sa smanjenjem endogenih razina "aktivnog" (ne-fosforiliranog) β-katenina (slika 4c, donja ploča).

Uzeti zajedno, ovi eksperimenti pokazuju da je PCDHGC3 pro-apoptotičan u adenomskom kontekstu, suzbija rast karcinomskih stanica i je u stanju potisnuti Wnt / β-katenin / T-staničnu transkripcijsku aktivnost kao što smo to prethodno opazili s nekoliko drugih PCDH paraloga (PCDHGA2, PCDHGA6, PCDHGA12) (Dallosso i sur., 2009). Stoga su biološke aktivnosti PCDHGC3 u skladu s funkcijom gena za supresor tumora.

PCDHGC3 i drugi onkogeni putevi

S obzirom da se pokazalo da γ-PCDHs potiskuje FAKs (Wang i sur., 2009), te da se pokazalo da je potreban FAK nizvodno od Wnt / c-myc signalizacije u crijevnoj tumorigenezi (Ashton i sur., 2010), istraživao je učinak pada PCDHGC3 u RG / C2 stanicama na nivoima FAK i PYK2 (Slika 5a). Imunobloting nije pokazao promjene u ukupnom FAK-u, fosfo-Tyr402 PYK2 ili ukupnom PYK2. Analizirali smo i mTOR, jer je pokazano da Wnt signalizacija vrši utjecaj p-katenina na post-transkripcijski utjecaj putem mTOR staze (Inoki i sur., 2006.), a inhibicija mTOR-a može inhibirati kolorektalnu tumorigenezu (Gulhati i sur., 2009), I fosfo-Ser2448 mTOR i ukupni mTOR povećani su nakon pada PCDHGC3 u stanicama RG / C2 adenoma, kao što je fosforilirani 4EBP1, važan čimbenik u poboljšanoj transformaciji proteina nizvodno od mTOR (Hsieh i sur., 2010). Potvrdili smo da učinak obustave PCDHGC3 na mTOR nije specifičan za ćeliju ili zbog off-target efekata obaranjem PCDHGC3 s drugom siRNA u HCA7 stanicama (dopunska slika 3a). Prekomjerna ekspresija PCDHGC3 pune duljine u stanicama karcinoma SW480, s druge strane, dovela je do značajno smanjenog mTOR-a i fosforiliranog 4EBP1 (slika 5b); transfekcija C-terminalne domene PCDHGC3 sama nije utjecala na mTOR nivoe (dopunska slika 3b). Također smo ispitali je li PCDHGC3 moduliran fosfo-AKT, za koji se zna da je uzvodno od Wnt i mTOR staza, ali nisu primijećene promjene koje proizlaze iz PCDHGC3 modulacije (podaci nisu prikazani). Kako je mTOR važan regulator autofagije (Jung i sur., 2010), a pokazalo se da su protokadherini kolokalizirani pomoću autophagijskog markera LC3 (Hanson i sur., 2010), analizirali smo i LC3 proteine ​​u našim stanicama adenoma i karcinoma, ali nije došlo do pomaka u LC3-I / LC3-II ili promjene u nivou p62, koji su markeri autofagije (Klionsky i sur., 2008.) imunoblotingom (slika 5).

Image

Modulacija razine proteina PCDHGC3 utječe na mTOR put. ( a ) RG / C2 stanice su transficirane ili kodiranim kontrolnim siRNA (si-ve) ili PCDHGC3 siRNA (siGC3), a proteini su analizirani imunoblotingom, ( b ) karcinomske stanice SW480 su transfektirane praznim vektorom (vektorskim) ili PCDHGC3 prekomjernom ekspresijom plazmid i proteini analizirani su imunoblotingom.

Slika pune veličine

Ove studije nadalje naglašavaju regulatorne kapacitete PCDHGC3 u onkogenim putovima i sugeriraju da gubitak PCDHGC3 može imati učinak na daljnji niz ne samo na transkripcijske aktivnosti posredovane Wnt / β-kateninom, već i na transformaciju proteina kroz mTOR (Hsieh i sur., 2010 ).

Rasprava

U ovom su istraživanju karakterizirali novo područje LRES-a na kromosomu 5q31 kod kolorektalnog karcinoma. Nadalje, pokazujemo da se DNA hipermetilacija više gena unutar LRES regije ne odvija sinkronizirano; jedan gen posebno, PCDHGC3 , prešućen je samo na prijelazu adenoma - karcinom. Naše funkcionalne studije pokazuju da protein PCDHGC3 ima sposobnost inhibicije rasta i da može suzbiti ključne onkogene puteve u staničnoj liniji kolorektalnog karcinoma, u skladu s funkcijom supresori tumora.

Prije smo pokazali PCDH LRES kod Wilmsovog tumora (Dallosso i sur., 2009), a sličan LRES demonstriran je u karcinomu dojke (Novak i sur., 2008). U novije vrijeme, PCDH hipermetilacija također je bila vidljiva u analizi genoma karcinoma prostate u cijelom genomu (Kobayashi i sur., 2011). Uzeto zajedno s ovom studijom, ovo sugerira da su kromosomi 5q31 grupirani PCDH supresori tumora u nekoliko različitih karcinoma. Pored PCDH lokusa na kromosomu 5q31, LRES lokusi su sada identificirani u tumorima koji potječu od dojke (Novak i sur., 2008), glave i vrata (Smith i sur., 2006), pluća (Rauch i sur., 2007 ), prostate (Coolen i sur., 2010) i debelog crijeva (Frigola i sur., 2006 .; Hitchins i sur., 2007; Javierre i sur., 2011), sugerirajući da su događaji koji dovode do LRES-a prožimaju tijekom tumorigeneze; u stvari, nedavna sveobuhvatna studija o karcinomu prostate integrirala je modifikaciju histona koja se širi na cijelom genomu, metilaciju DNK i podatke transkripta kako bi karakterizirala 47 novih LRES regija u karcinomu prostate, a pokazala je da su one značajno povezane i sa supresorskim tumorom i sa lokusima genskih klastera (Coolen i sur ., 2010).

Uz to što su neke regije LRES-a specifične za tipove raka, vidljiv je i stupanj specifičnosti tkiva pojedinih PCDH gena koji prolaze epigenetsko prigušivanje; u Wilmsovim tumorima nije pronađeno da PCDHGC3 metilira, što ukazuje da je PCDHGC3 protein neophodan za bubrežne stanice. Čini se da PCDHGC3 također izbjegava metilaciju u raku prostate (Kobayashi i sur., 2011). U karcinomu dojke, PCDHGC3 prolazi hipermetilaciju, a stanični modeli koji oponašaju napredovanje karcinoma dojke pokazali su da je PCDHGC3 , za razliku od ostalih PCDH-ova , stekao metilaciju samo u staničnoj liniji raka, za razliku od staničnih ili immortaliziranih staničnih linija (Novak i sur., 2009), Stoga, slično kolorektalnom karcinomu, gubitak funkcije PCDHGC3 može biti sastavni dio progresije raka karcinoma dojke, iako do danas nisu provedena funkcionalna ispitivanja PCDH-a kod raka dojke. Nedavno je pokazano da je prekomjerna ekspresija metiltransferaze 3B DNA povezana s sekvencijalnom metilacijom u progresiji kolorektalnog karcinoma (Ibrahim i sur., 2011), a ugulacija DNK metiltransferaza najizraženija je na prijelazu adenoma - karcinoma (Schmidt i sur., 2007). Takve promjene naglašavaju važnost epigenetskih promjena u progresiji kolorektalnog karcinoma, a PCDHGC3 kao mogući ključni cilj.

Pokazalo se da je za nekoliko članova superfamije protocadherina došlo do hipermetilacije specifične za tumor, uključujući PCDH10 kod kolorektalnog karcinoma (Ying i sur., 2006). Međutim, do danas se relativno malo zna o funkcionalnim posljedicama promijenjene ekspresije PCDH na onkogene mehanizme. Uzeto zajedno s prethodnom studijom Wilmsovog tumora, ovo istraživanje sugerira da PCDH mogu utjecati na Wnt signalizaciju u različitim staničnim kontekstima i stoga se PCDH epigenetsko prigušivanje može dodati drugim molekulama Wnt inhibitora koje se potiskuju tijekom karcinogeneze (Baylin i Ohm, 2006). Iako se Wnt staza rano aktivira mutacijom APC-a u karcinomu debelog crijeva, predložen je dvostupanjski model pokretanja i napredovanja raka izazvanog APC-om, koji zahtijeva dodatne lezije / onkogene aktivnosti (Phelps i sur., 2009). Predlažemo da epigenetski događaji poput prigušivanja PCDHGC3 mogu potaknuti napredovanje raka daljnjim povišenjem Wnt signalizacije, kao i drugim onkogenim aktivnostima kao što je mTOR staza, za koju su naša istraživanja pokazala da inhibira PCDHGC3 (Slika 6). Iako mehanizmi kojima PCDHGC3 utječe na mTOR i dalje nisu jasni, čini se da zahtijevaju protein cijele duljine, jer domena C-terminala nije utjecala na razine mTOR-a kada se transficira u stanice SW480. S obzirom na dokumentirane nuklearne transkripcijske funkcije koje se pripisuju protokaderinima (Haas i sur., 2005; Hambsch i sur., 2005.), zajedno s nekonvencionalnim unutarćelijskim ulogama (Fernandez-Monreal i sur., 2009; Hanson i sur., 2010; O 'Leary i sur., 2011) i opsežne proteomske interakcije protokaderina s staničnim signalnim faktorima (Han i sur., 2010), bit će od velikog interesa za provođenje integriranih transkriptomskih i proteomskih analiza tumorskih stanica s različitim PCDH epigenetskim profilima kako bi se razgraničila složeni mehanizmi pomoću kojih protokaderini utječu na biologiju tumorskih stanica.

Image

Model PCDH efekata u kolorektalnoj tumorigenezi. Rane lezije na PCDH LRES području mogu pridonijeti transkripcijskoj deregulaciji putem Wnt / β-kateninskog puta i poremećaju aktivnosti membrane i intracelule; prijelaz adenoma - karcinom zahtijeva daljnje epigenetsko utišavanje gena kao što je PCDHGC3 , što također doprinosi post-transkripcijskoj deregulaciji ovisnoj o mTOR-u.

Slika pune veličine

Napokon, predlažemo da PCDH LRES može imati veliku korisnost u pružanju biomarkera za mnoge vrste raka. Visoka gustoća epigenetski dereguliranih gena u relativno malom lokusu može biti osobito korisna u usporedbi s primjenom biomarker ploča koje se sastoje od gena iz više genetskih lokusa (Lind i sur., 2011), jer se genetska heterozigotičnost može lako provjeriti i epigenetska ' barkod 'za regiju pružit će markere i za rane i za kasne događaje u tumorigenezi.

Dodatna informacija

Datoteke slika

  1. 1.

    Dopunska slika 1

  2. 2.

    Dopunska slika 2

  3. 3.

    Dopunska slika 3

Word dokumenti

  1. 1.

    Dopunske slikovne legende

Excel datoteke

  1. 1.

    Dopunska tablica 1

  2. 2.

    Dopunska tablica 2

  3. 3.

    Dopunska tablica 3

  4. 4.

    Dopunska tablica 4

  5. 5.

    Dopunska tablica 5

    Dodatne informacije prate rad na web stranici Oncogene (//www.nature.com/onc)