Gubitak rictorta sa starenjem u osteoblastima potiče gubitak kostiju povezan s dobi | stanična smrt i bolest

Gubitak rictorta sa starenjem u osteoblastima potiče gubitak kostiju povezan s dobi | stanična smrt i bolest

Anonim

teme

  • Starenje
  • Stanična signalizacija
  • Osteoporoza
  • terapija

Sažetak

Disfunkcija osteoblasta glavni je uzrok gubitka koštane mase koji je povezan sa starenjem, ali mehanizmi koji stoje na osnovi promjena funkcije osteoblasta sa starenjem nisu dovoljno razumljivi. Ovo istraživanje pokazuje da osteoblasti kod starijih miševa pokazuju izrazito oslabljenu adheziju na površinu formiranja kostiju i smanjenu mineralizaciju in vivo i in vitro . Rictor, specifična komponenta mehaničkog cilja rapamicin kompleksa 2 (mTORC2) koji kontrolira citoskeletnu organizaciju i preživljavanje stanica, reguliran je starenjem u osteoblastima. Mehanički smo otkrili da povećana razina reaktivnih kisikovih vrsta sa starenjem potiče ekspresiju miR-218, što izravno cilja Rictor i smanjuje prianjanje i preživljavanje koštane površine osteoblasta, rezultirajući smanjenim brojem funkcionalnih osteoblasta i ubrzanim gubitkom kostiju kod starijih miševa, Naši nalazi otkrivaju novi funkcionalni put važan za gubitak koštane mase povezan s dobi i podršku za miR-218 i Rictor kao potencijalne mete za terapijsku intervenciju za liječenje osteoporoze povezanu sa dobi.

Glavni

Gubitak kostiju povezan s dobi primarni je uzrok osteoporotskih prijeloma u starijoj populaciji, karakteriziran pretežno smanjenim stvaranjem kostiju pri uspostavljanju trajne koštane resorpcije. 1, 2, 3, 4 Starosna disfunkcija osteoblasta smatra se glavnim uzrokom gubitka koštane mase kod muškaraca i žena nakon petog desetljeća. Međutim, stanični i molekularni mehanizmi koji stoje na osnovi promjena u funkciji osteoblasta sa starenjem nisu dovoljno razumljivi. 5, 6, 7

Osteoblast je jedinstvena stanica koja tvori kosti, izvedena iz matičnih stanica mezenhima koštane srži (BMSC), koje su pluripotentne stanice koje stvaraju različite stanice specifične za tkivo, uključujući osteoblaste, hondrocite i adipocite. 8, 9 Budući da je osteopenija povezana s dobi karakterizirana smanjenom tvorbom kostiju i povećanom akumulacijom koštane srži, pretpostavlja se da je prekomjerno nakupljanje adipocita iz mozga nakon gubitka kostiju uzrokovano neuravnoteženom diferencijacijom BMSC-a u adipocite mozga u višku vrijednosti osteoblasta. 4, 5, 6 Većina prethodnih studija usredotočila se na molekularne mehanizme koji stoje iza prelaska s osteoblasta na diferencijaciju adipocita u BMSC tijekom starenja. 10, 11, 12, 13 Međutim, formiranje kostiju ovisi o broju i aktivnosti pojedinih osteoblasta koji se zapošljavaju na mjestima formiranja kosti, a funkcionalna aktivnost osteoblasta tijekom stvaranja in vivo kosti ne ovisi samo o broju i brzini stvaranja osteoblastike stanice, ali i na njihov funkcionalni životni vijek. 14, 15, 16 Trenutno se ne proučava doprinos gubitka koštanih promjena povezanih sa starenjem promjena migracije, adhezije, mineralizacije i apoptoze osteoblasta. 7, 17 Osim toga, signalni putovi koji upravljaju tim procesima ostaju uglavnom nepoznati.

Evolucijski sačuvani mehanički cilj rapamicina (mTOR) tvori dva funkcionalno različita kompleksa. Prvi, mTOR kompleks 1 (mTORCl), koji se sastoji od mTOR, Raptor i mLST8 (GβL), osjetljiv je na rapamicin i mislilo se da kontrolira autonomni rast stanica kao odgovor na dostupnost hranjivih tvari i faktora rasta. 18, 19, 20 Drugi kompleks, mTORC2, koji sadrži osnovne komponente mTOR, mSIN1, mLST8 i Rictor, u velikoj mjeri je neosjetljiv na rapamicin. mTORC2 otkriven je nedavno, a dostupne su ograničene informacije o njegovoj regulaciji i funkcioniranju. Fosforilacija Akt na mjestu hidrofobnog motiva (Ser473) neophodna je za aktivnost prema nekim (ali ne svim) supstratima i najbolje je karakterizirano očitavanje aktivnosti mTORC2. Dosadašnje studije sugeriraju da mTORC2 posebno osjeća čimbenike rasta za regulaciju proliferacije stanica, organizaciju citoskeleta aktina i preživljavanje stanica. 19, 21, 22, 23

Nekoliko nedavnih studija pokazalo je da brisanje ili smanjivanje regulacije Rictor / mTORC2 u BMSCs rezultira smanjenim kapacitetom diferencijacije osteogena i povećanim potencijalom adipogene diferencijacije. 24, 25, 26 mTORC2 signalizacija regulira rast kostura i odabir loze u MSC-u putem nepoznatih mehanizama. 24, 25, 26 O njegovoj ulozi u gubitku kostiju povezane s godinama te povezanim regulatornim mehanizmima uzvodno i nizvodno nisu prijavljeni naši podaci. U ovom izvješću pokazujemo da su miševi s brisanjem Rictor-a specifičnih za osteoblast pokazali ubrzani gubitak kostiju povezanih s godinama i identificirali novi mehanizam kojim povećana razina reaktivnih vrsta kisika (ROS) sa starenjem potiče ekspresiju miR-218, koja izravno cilja Rictor i smanjuje adheziju i preživljavanje osteoblasta, što rezultira gubitkom kostiju povezanim s dobi.

Rezultati

Adhezija i preživljavanje osteoblasta izrazito su smanjeni, a ekspresija Rictor-a smanjena je starenjem in vitro i in vivo

Fenotipi gubitka koštane mase vezani uz dob karakterizirani su kod miševa. Analiza mikro-računarske tomografije (mikro-CT) distalnog femura pokazala je značajno smanjenje koštane mase u starijih miševa (16 mjeseci) u usporedbi s mladim miševima (star 3 mjeseca), što je dokazano značajnim smanjenjem volumena trabekularne kosti po volumenu tkiva (BV / TV), trabekularnom broju (Tb.N), debljini trabekula (Tb.Th) i gustoći koštane mase (BMD), zajedno s porastom odvajanja trabekula (Tb.Sp) (dopunska slika 1). Histološka i imunohistokemijska analiza femora otkrila je povećani broj većih površina adipocita, karakteriziranih masnim vakuolama u koštanoj srži (dopunska slika 2A), te smanjenim brojem osteokalista pozitivnih osteoklasta (slika 1a) i TRAP-pozitivnih osteoklasta na trabekularnom i površine endostealnih kostiju u starijih miševa (dopunska slika 2B). Akumulacija masti koštane srži i smanjeni broj osteoblasta podrazumijeva da je došlo do prelaska s osteogeneze na adipogenezu u BMSC. Zanimljivo, skeniranje elektroničkim mikroskopom (SEM) analizama otkrilo je grubu trabekularnu površinu kostiju s mnogim pričvršćenim stanicama kod mladih miševa, ali glatku trabekularnu koštanu površinu s malim adhezijom stanica u starijih miševa (slika 1b). Mnoge prazne praznine ili praznine sa zgužvanim stanicama (slika 1b), popraćene smanjenjem stope formiranja kostiju (BFR) (slika 1c), što implicira smanjenje adhezije osteoblasta tijekom gubitka koštane mase koji je povezan sa starenjem.

Image

Adhezija i preživljavanje osteoblasta izrazito su smanjeni, a ekspresija Rictor-a smanjena je starenjem in vitro i in vivo . ( a ) Reprezentativno imunohistokemijsko (IHC) bojenje osteokalcinom (OCN) od 3-mjesečnih i 16-mjesečnih miševa ( n = 6). Strelica, osteoblast; BS, koštana površina; ljestvica, 50 µ m; * P <0, 01 nasuprot 3M. ( b ) SEM slika trabekularnih kostiju femura kod miševa starijih od 16 i 16 mjeseci. Gornja ploča pokazala je manje i tanje kosti trabekule kod 16-mjesečnih miševa. Crna strelica, osteoblasti ili osteociti, ljestvica gornje ploče, 500 μ m; donja traka ljestvice ploče, 50 μm. ( c ) Fotomikrografske fluorescentne obojenosti kalceina 3 i 16 mjeseci starim miševima i kvantifikacija mineralizacije površine / koštane površine (MS / BS), stope apsorpcije minerala (MAR) i MAR / osteoblasta. Strelica: površina stvaranja kostiju; ljestvica ljestvice, 20 μm ( n = 3 * P <0, 01 naspram 3M). ( d ) Analiza stanične adhezije kultura kalvarijalnih osteoblasta 3-6 i 16-mjesečnih miševa s (donjim pločama) ili bez (gornjeg dijela) matrigela u ploči ( n = 3 * P <0, 01 naspram 3M). ( e ) Reprezentativne fotomikrografije formiranja koštanih nodula u MSC kulturama kod miševa sa 3- i 16 mjeseci. Linija mjerila, 400 µm. ( f ) Analiza Western blot-a cijepljene-poli ADP-riboze polimeraze (PARP) u lizatima trabekularne kosti disecirani iz femora 3- i 16-mjesečnih miševa. ( g ) Analiza Western blot ekspresije Rictor-a i P-Akt (S473) u lizatima trabekularne kosti kod 3- i 16-mjesečnih miševa. ( h ) Analiza Western blot ekspresije mTOR, Rictor, Raptor i P-Akt (S473) u lizatima pluća, slezine i bubrega kod miševa koji su bili stari od 3 do 16 mjeseci. ( i ) Analiza Western blot ekspresije Rictor-a, mTOR-a, Raptor-a, osteokalcina (OCN) i P-Akt (S473) u primarnim kalvarijalnim osteoblastima od 3 i 16-mjeseci miševa

Slika pune veličine

Da bi se potvrdila ova fenotipa povezana s dobi in vitro , uzgajani su kalvarijalni osteoblasti trećih i 16 mjeseci starijih miševa. Osteoblasti starih miševa pokazali su značajno smanjeni kapacitet za staničnu adheziju (Slika 1d) i mineralizaciju (Slika 1e), ali su poboljšali apoptozu (Slika 1f). Uzeti zajedno, ovi nalazi sugeriraju da uz prelazak s osteogene diferencijacije na adipogenu diferencijaciju BMSC-a, smanjena adhezija i mineralizacija osteoblasta i pojačana apoptoza mogu imati važnu ulogu u osteopeniji povezanoj sa starenjem.

Pokazano je da Rictor / mTORC2 kontrolira i citoskeletnu organizaciju aktina i preživljavanje stanica. 24, 27, 28 Da bi se istraživao mehanizam odgovoran za smanjeni kapacitet stanične adhezije i preživljavanje kako stare osteoblasti, uzorci kosti trabekularne kosti disekcionirani su iz femura mladih i starijih miševa, a ukupni protein izdvojen je za ispitivanje Rictor-ove ekspresije Western blottingom. Zanimljivo je da su ekspresija Rictor-a i fosforilacija mTORC2 supstrata Akt (S473) značajno smanjeni u trabekularnoj kosti starijih miševa (slika 1 g). Suprotno tome, niti razina mTORC1 (mTOR i Raptor) u kosti, niti razina Rictor-a u drugim organima, uključujući slezenu, bubrege i pluća, nisu pokazali značajne promjene sa starenjem (Slika 1h), što implicira koštanu specifičnu regulaciju Rictor-a. kod starih miševa. Smanjena regulacija Rictor-a, ali ne mTOR-a ili Raptor-a, je dodatno potvrđena u kultiviranim primarnim kalvarijalnim osteoblastima dobivenih miševima (Slika 1i). U skladu s tim, desofosilacija Akt (S473), nizvodno cilja Rictor / mTORC2, dogodila se u osteoblastima starijih miševa (Slike 1 g i i). Stoga smo identificirali specifičnu redukciju regulacije Rictor-a u osteoblastima, koja može imati ulogu u gubitku kostiju povezanom sa starenjem.

Izraz Rictor-a u osteoblastima smanjuje stvaranje kostiju i potiče gubitak kostiju vezan uz dob

Da bismo istražili ulogu Rictor / mTORC2 u osteoblastu i stvaranju kosti, stvorili smo uvjetne knockout miševe s brisanjem Rictor-a ograničenim na osteoblaste križanjem floktovanih Rictor miševa s Osx-GFP-Cre miševima (koji izražavaju GFP-Cre fuzijski protein pod vodstvom promotora Osx1). Usporedili smo Osx -GFP-Cre TG / + s miševima Rictor flox / flox i odabrali ženke miševa s genotipom Osx-GFP-Cre TG / + ; Rictor flox / flox (ovdje nakon OBRictorKO) radi detaljne analize. Ženke Osx-GFP-Cre TG / + ; Rictor + / + mladunci služili su za kontrolu. OBRictorKO miševi rođeni su očekivanom Mendelijevom učestalošću, a rekombinacija i brisanje alela Rictor-a dogodili su se samo u tkivima kostiju (tj. Nogama i lubanji) kako je pokazano alelno specifičnim PCR-om (Dopunska slika 3) i zapadnim mrljama (Slika 2a). Imunohistokemijsko bojenje distalnih dijelova femura pokazalo je dramatično smanjenje P-Akt (S473) u OBRictorKO miševima (slika 2b), što ukazuje da je mTORC2 bio inaktiviran Rictor-ovim poremećajem.

Image

Izraz Rictor-a u osteoblastima smanjuje stvaranje kostiju i potiče gubitak kostiju povezan sa starenjem. ( a ) Western blot analiza Rictor i P-Akt (S473) ekspresije u primarno kultiviranim kalvarijalnim osteoblastima OBRictorKO i divljim miševima. ( b ) reprezentativno IHC obojenje za p-Akt (S473) distalne femore od OBRictorKO i divljih miševa; ljestvica skale, 100 µm. ( c ) Reprezentativno mikro-CT ispitivanje kralježaka s 6-mjesečnog OBRictorKO i divljih miševa. ( d - g ) Promjene vertebralnog trabekularnog BV / TV, BMD, Tb.Sp i Tb.N s dobi u OBRictorKO i divljim miševima ( n = 6, * P <0, 01). ( h ) Reprezentativno IHC obojenje za OCN u distalnoj femori od 6 mjeseci starog OBRictorKO i divljih miševa ( n = 6). Strelica, osteoblast; ljestvica, 50 µ m; * P <0, 01 između genotipova. ( i ) Reprezentativno TRAP bojenje za osteoklaste distalne femore od 6 mjeseci starog OBRictorKO i divljih miševa ( n = 6). NS, nema značajne razlike između genotipova; ljestvica skale, 100 µm. ( j ) Analiza imunogorbenskog testa (ELISA) u serumu nivoa N-terminalnog propeptida (PINP) prokolagena tipa I kod 6-mjesečnog OBRictorKO i divljih miševa ( n = 6). * P <0, 01 u odnosu na WT. ( k ) Reprezentativno bojanje kalceinom i kvantifikacija MS / BS, MAR i MAR / osteoblasta u distalnoj femori od 6 mjeseci starog OBRictorKO i divljih miševa ( n = 3 * P <0, 01 u odnosu na OBRictorKO). ( l ) Izračunano je reprezentativno bojenje udaljenih femora od OBRictorKO i miševa divljeg tipa, adipocita ( n = 6). NS, nema značajne razlike između genotipova; ljestvica, 1 mm

Slika pune veličine

Iako nisu primijećene značajne razlike u tjelesnoj težini i duljini između miševa s manjkom Rictor-a i kontrola legla u bilo kojoj dobi. OBRictorKO miševi razvijali su osteoporozu s porastom dobi (slike 2c-g i dodatna slika S4). Kod OBRictorKO miševa u dobi od 6 mjeseci, BV / TV opako je pao u usporedbi s divljim vrstama legla ( P <0, 001; Slika 2d i Dodatna slika S4). Debljina kortikalne kosti (Ct.Ch) također je značajno smanjena u miševima s brisanjem Rictor-a (dopunska slika S5). Histološka analiza metafizije tibije u 6-mjesečnih miševa pokazala je da je osteoporoza u OBRictorKO miševima povezana s nevjerojatnim smanjenjem broja osteoblasta (OCN-pozitivnih stanica) po jedinici koštane površine (Slika 2h), dok se broj osteoklasta neznatno smanjio (Slika 2i). U skladu s tim promatranjima, serumske razine N-terminalnog propeptida prokolaptika tipa 1 (P1NP), markera koštane tvorbe, smanjene su kod 6-mjesečnih OBRictorKO miševa u usporedbi s divljim miševima (slika 2j). BFR 6-mjesečni OBRictorKO miševi također su smanjeni u usporedbi s kontrolama legla (slika 2k). Pored toga, kod 6-mjesečnih OBRictorKO miševa nije se moglo uočiti nakupljanje adipocita (slika 2l). Ovi podaci pokazuju da je dobna osteoporoza kod miševa OBRictorKO povezana sa smanjenjem stvaranja kostiju usprkos normalnoj aktivnosti osteoklasta, ali ne i sa nakupljanjem masti iz koštane srži.

Rictor je važan za adheziju, mineralizaciju i preživljavanje osteoblasta

Da bismo istražili mehanizme koji stoje na osnovu smanjene koštane formacije u OBRictorKO miševima, prvo smo istražili diferencijaciju osteoblasta i adipocita u MSC kulturama pripremljenim od OBRictorKO i divljih miševa. Iako je objavljeno da je brisanje Rictor-a u MSC-ima izazvalo prelazak s osteoblastogeneze na adipogenezu, 25, 26 BMSC-ova kod miševa OBRictorKO nije pokazalo povećanu efikasnost u adipogenezi (dopunska slika S6). To ukazuje da brisanje Rictor-a u osteoblastima nije utjecalo na diferencijaciju BMSC-a, u skladu s nepromijenjenom masnoćom koštane srži u OBRictorKO miševima. Međutim, BMSC-ovi od OBRictorKO miševa imali su značajno smanjenu sposobnost stvaranja mineraliziranih koštanih čvorova kad su uzgajani u osteogenom mediju, praćeni poremećajem Rictor-a u kasnim fazama diferencijacije (Slike 3a i b). Slični rezultati dobiveni su u kulturama kalvarijalnih osteoblasta (Slika 3c). Ovi rezultati sugeriraju da brisanje Rictor-a u osteoblastima ne smanjuje osteoblastičku diferencijaciju BMSC-a, već inhibira stvaranje kostiju osteoblasta.

Image

Rictor je važan za adheziju, mineralizaciju i preživljavanje osteoblasta. ( a ) Fotomikrografije kalcijevog nodula u MSC izoliranim od divljih vrsta i OBRictorKO miševima nakon osteognenske indukcije tijekom 21 dana. ( b ) Analiza Western blot ekspresije Rictor-a i OCN-a u MSC-ima OBRictorKO-a i divljih miševa koji su podvrgnuti osteogenoj indukciji 14 dana. ( c ) Fotomikrografije stvaranja koštanih nodula u kulturama osteoblasta OBRictorKO i divljih miševa. ( d ) Analiza stanične adhezije primarnih kultura osteoblasta iz OBRictorKO i divljih miševa s (donjim pločama) ili bez (gornjeg dijela) matrigela u ploči ( n = 3). * P <0, 01 u usporedbi s divljim tipom miševa. ( e ) Analiza Western blot ekspresije cijepljenog PARP-a u trabekularnim koštanim lizatima 6-mjesečnog OBRictorKO i divljih miševa. ( f ) Reprezentativne fotomikrografije ekspresije F-aktina (crvena fluorescencija) i p-Paksilina (zelena fluorescencija Y118) u primarnim osteoblastima OBRictorKO i divljim miševima. Strelica, p-Paksilin (Y118); traka zastrašivanja, 5 µm. ( g ) SEM analiza trabekularne kosti 6-mjesečnog OBRictorKO i divljih miševa. Gornja ploča pokazala je manje i tanje trabekule kosti kod OBRictorKO miševa. Crna strelica, osteoblast ili osteocit; gornja šipka ploče, 500 μ m; donja šipka ploče, 50 μm

Slika pune veličine

Da bi se dalje objasnilo smanjen broj osteoblasta na trabekularnoj koštanoj površini miševa OBRictorKO, ispitan je kapacitet stanične adhezije i preživljavanje kultiviranih osteoblasta OBRictorKO i divljih miševa. Osteoblasti OBRictorKO miševa imali su značajno smanjenu sposobnost prianjanja na matricu kulture i povećali cijepljeni PARP (Slike 3d i e). Nadalje, fosforilacija paksilina, niže cilja Rictor-a koji regulira citoskeletnu organizaciju, bila je oslabljena u osteoblastima izbrisanim od strane Rictora (Slika 3f). Najvažnije je da su SEM analize otkrile smanjenu staničnu adheziju na površini trabekularne kosti (slika 3 g), replicirajući fenotipe uočene u osteoblastima starijih miševa. Zajedno, ovi nalazi pokazuju da je Rictor neophodan za adheziju, funkciju i preživljavanje osteoblasta.

Rictor je meta miR-218 u osteoblastima

Dalje smo istražili mehanizam koji stoji u osnovi slabljenja Rictor-ove ekspresije u osteoblastima kod starijih miševa. q-PCR analiza pokazala je da razina mRNA Rictor-a u osteoblastima starijih miševa ostaje nepromijenjena u usporedbi s mladim miševima (dopunska slika S7), sugerirajući da regulacija transkripcije ne doprinosi smanjenju regulacije Rictor-a u osteoblastima.

Za nekoliko mikroRNA, uključujući miR-188, miR-218, prijavljeno je da ciljaju Rictor u stanicama ljudi i miševa. 29, 30, 31, 32, 33 Dakle, napravili smo bioinformatsku analizu potencijalnih miRNA-a koje ciljaju Rictor na miševima (dopunska tablica S2). Kvantitativna PCR analiza u realnom vremenu razine 13 miRNA s visokim rezultatom otkrila je da je miR-218 snažno reguliran u osteoblastima starijih miševa (ekspresija je povećana za 1013% u osteoblastima starijih miševa u usporedbi s onima iz mladih miševa) (Slika 4a). Transfekcija mimike miR-218 izrazito je regulirala Rictor, dok je miR-218 antagomirima regulirana razina proteina Rictor (slika 4b). Prema tome, fosforilacija Akt (S473) i paksilina, dvije mete nizvodno koje posreduju preživljavanjem stanica reguliranim Rictor-om i organizacijom aktina, poboljšane su mimikom miR-218 ili smanjene za miR-218 antagomir (Slika 4b). U Rictor 3 ′ UTR postoje dva miR-218 mjesta (slika 4c).

Image

Rictor je meta miR-218 u osteoblastima. ( a ) PCR analiza u realnom vremenu ekspresije 13 miRNA u kostima trabekularnih miševa starijih od 16 i 16 mjeseci ( n = 6). * P <0, 01 nasuprot 3M. ( b ) Analiza Western blot-a Rictor-a, p-Paxillin (Y118) i P-Akt (S473) ekspresije u osteoblastima koji su transficirani s miR-218 mimikom i miR-218 inhibitorima. ( c ) Pretpostavljeno mjesto vezanja miR-218 u RTR-u 3 'UTR. ( d ) Aktivnost luciferaze u stanicama MC3T3-E1 kofeficirana mimikom miR-218 ili negativnom kontrolom (NC) i naznačenom 3 'UTR-vođenom reporterkom konstrukcijom ( n = 3). * P <0, 01 u odnosu na NC; ** P <0, 05 u odnosu na NC

Slika pune veličine

Da bismo utvrdili da li miR-218 cilja Rictor izravno u osteoblastima, klonirali smo 3 'UTR Rictor-a u konstrukciju luciferaze. Reporterski testovi pomoću osteoblasta koji eksprimiraju miR-218 otkrili su da miR-218 potiskuje UTR-ove Rictor-a (Slika 4d). Mutacije dva pretpostavljena miR-218 mjesta koja su sačuvana od čovjeka u odnosu na miša u Rictor 3 'UTR ukinula je reakciju na miR-218 (Slika 4d). Ovi rezultati sugeriraju da oba predviđena mjesta jednako doprinose smanjenju Rictor-a posredovanog miR-218. Zajedno, ovi rezultati sugeriraju da miR-218 izravno cilja Rictor u osteoblastima.

miR-218 smanjuje adheziju osteoblasta i preživljavanje ciljajući Rictor

Da bi se dodatno definirala uloga miR-218 u osteoblastima, ispitivani su učinci miR-218 mimike i antagomira na staničnu adheziju, apoptozu uzrokovanu stresom u primarnim osteoblastima i staničnu liniju osteoblasta MC3T3-E1. mimika-miR-218 smanjila je staničnu adheziju i pojačala apoptozu izazvanu serumskom gladovanjem, dok antagomeri miR-218 pojačavaju adheziju stanica, ali smanjuju apoptozu u osteoblastima (slike 5a i b).

Image

miR-218 smanjuje adheziju osteoblasta i preživljavanje ciljajući Rictor. ( a ) Adhezijska analiza MC3T3-E1 stanica transfektirana s miR-218 mimikom, miR-218 inhibitorima i NCs ( n = 3). * P <0, 01, ** P <0, 05. ( b ) AneksinV analiza apoptoze u stanicama MC3T3-E1 transficiranim mR-218 mimikom ili miR-218 inhibitorom i 48-satnim gladovanjem u serumu ( n = 3). * P <0, 01, ** P <0, 05. ( c ) Western blot analiza Rictor-a, p-Paxillin (Y118), Runx2 i p-Akt (S473) ekspresija u MC3T3-E1 stanicama transficiranim s miR-218 mimikom. ( d ) Analiza Western blot Rictor-a, p-Paxillin (Y118), Runx2 i p-Akt (S473) ekspresije u MC3T3-E1 stanicama transfektiranim s miR-218 inhibitorom ili NC. ( e ) Analiza Western blot-a Rictor-e, p-Paxillin (Y118) i p-Akt (S473) ekspresije u stanicama MC3T3-E1 transfektirane mimikom miR-218 i / ili vektorima koji eksprimiraju Rictor. ( f ) Analiza adhezije stanica MC3T3-E1 transficirane s miR-218 mimikom i / ili vektorom koji eksprimira Rictor ( n = 3). * P <0, 01, ** P <0, 05. ( g ) AnnexinV analiza apoptoze u stanicama MC3T3-E1 transficiranim s miR-218 mimikom i / ili vektorom koji eksprimira Rictor ( n = 3); * P <0, 01, ** P <0, 05

Slika pune veličine

Dalje smo pitali je li Rictor posreduje u regulaciji osteoblasta putem miR-218. Kao što se očekivalo, miR-218 oponaša silaznu stazu Rictor / mTORC2 i fosforilaciju Akt (S473) i paksilina, dok antagomiri miR-218 poboljšavaju signalni put Rictor / mTORC2 (slike 5c i d). Važno je da je prekomjerna ekspresija Rictor-a spasila smanjenje Akt (S473) i fosforilaciju paksilina i staničnu adheziju te pojačanje apoptoze mimo miR-218 mimikama (slike 5e-g). Zajedno, ovi nalazi pokazuju da miR-218 suzbija adheziju i preživljavanje osteoblasta ciljajući na Rictor.

ROS potiče miR-218 da snizi Rictor u osteoblastima starijih miševa

Manjak estrogena smatra se glavnim mehanizmom osteoporoze i kod žena i kod muškaraca, ali epidemiološki dokazi kod ljudi i nedavna mehanička istraživanja na glodavcima ukazuju na to da su starenje i povezani porast ROS-a proksimalni krivci. 34, 35 Da bismo objasnili povećanje miR-218 povezanog s dobi i smanjenje Rictor-a u osteoblastima, dodatno smo istražili potencijalnu ulogu ROS-a u ovom procesu. Kao što se očekivalo, razine ROS-a značajno su povišene u trabekularnoj kosti i osteoblastu starijih miševa (Slika 6a). Izuzetno, obrada hidrogen peroksidom (H202) povećala je razinu miR-218 za 18 puta u osteoblastima (Slika 6b; Dodatna slika S8). U skladu s tim, smanjena je Rictor-ova ekspresija, P-Akt (S473) i stanična adhezija, dok je apoptozu stimulirala H202 (Slike 6c-e). Ekspresija komponenata mTORC1, mTOR i Raptor nije utjecala (Slika 6c), što ukazuje na specifičnu regulaciju Rictor / mTORC2 od ROS u osteoblastima. Štoviše, prethodna istraživanja pokazala su da se miR-218 nalazi u 4p15.31 i 5q35.1 unutar unutarnjeg dijela Slit2 i Slit3. 36 Otkrili smo da prešutjevanje Slit2 i Slit3 smanjuje ekspresiju miR-218, sugerirajući regulaciju miR-218 od strane njegovih domaćih gena u osteoblastima (dopunska slika S9).

Image

ROS stimulira miR-218 na smanjivanje Rictor-a kod osteoblasta starijih miševa. ( a ) ROS razine u kostima trabekularnih miševa starijih od 16 i 16 mjeseci ( n = 6); * P <0, 01 u usporedbi s miševima starim 3 mjeseca. ( b ) Učinak H202 (1 μM ) na ekspresiju miR-218 u stanicama MC3T3-E1 ( n = 3). * P <0, 01 u odnosu na kontrole. ( c ) Analiza Western blot ekspresije Rictor-a, mTOR-a i Raptor-a u stanicama MC3T3-E1 tretirane s H202 (5, 10 µM ) u trajanju od 48 h. ( d ) Učinak H202 (1 µM tijekom 24 h) na MC3T3-E1 staničnu adheziju ( n = 3). * P <0, 01 u odnosu na kontrole. ( e ) Učinak H202 (10 µM tokom 36 h) i na MC3T3-E1 staničnu apoptozu ( n = 3). * P <0, 01 u odnosu na kontrole

Slika pune veličine

ROS-sredstvo za uklanjanje smanjuje miR-218 i Rictor ekspresiju i gubitak kostiju povezan s starenjem kod miševa

Kako bi potvrdili povezanost ROS-a s miR-218 i Rictor-ovom ekspresijom i gubitkom kostiju povezanim sa starenjem in vivo , stariji miševi su administrirani s ROS-om koji uklanja sredstvo NAC. Budući da je izraženi gubitak kosti započeo od miševa od 9 mjeseci, a značajan gubitak Rictor-a zabilježen je i kod miševa u dobi od 9 mjeseci (slika 7a), liječili smo miševe u 7 mjeseci s NAC-om kako bi se spriječio gubitak kostiju povezan s dobi. Ustanovili smo da je kod miševa tretiranih NAC-om (16 mjeseci) razina ROS-a trabekularne kosti smanjena (slika 7b), dok su BV / TV, trabekularni broj i debljina trabekula povećani u usporedbi s kontrolnim miševima (slike 7c-g; dopunska slika S10). Histološka i IHC analiza femora otkrila je značajan porast broja osteokalcina pozitivnih osteoblasta i neznatno smanjenje broja osteoklasta kod miševa tretiranih NAC-om (slike 7h i i). Važno je da je pored oštećenog gubitka kosti, razina miR-218 (slika 7j) i smanjeni rascjep-PARP, dok su Rictor ekspresija i P-Akt (S473) pojačani kod miševa tretiranih NAC-om (slika 7l). Ovi nalazi sugeriraju da ROS potiče miregulaciju Rictor-a posredovanu miR-218 u osteoblastima starijih miševa.

Image

ROS-sredstvo za uklanjanje smanjuje miR-218 i Rictor ekspresiju i gubitak kostiju povezan s starenjem kod miševa. ( a ) Western blot analiza Rictor, Raptor i P-Akt (S473) ekspresije u trabekularnoj kosti 3-9, 9- i 16-mjesečnih miševa. ( b ) Razine ROS trabekularnih kostiju u miševa starim 9 mjeseci liječenih N-acetil-l-cisteinom (NAC; 2 mg / ml) ili nosačem 7 mjeseci ( n = 10). * P <0, 01 u odnosu na kontrole. ( c ) Reprezentativno mikro-CT ispitivanje kralježaka s miševa opisanim u ( b ). ( d - g ) Trabekularna kost BV / TV, BMD, Tb.Sp i Tb.N kod miševa opisanih u ( c ) ( n = 10); * P <0, 01 u odnosu na kontrole. ( h, i ) Oestocalcin IHC ( h ) ili TRAP ( i ) bojenje distalne femore od miševa opisanih u ( b ). Šipka za skaliranje, 50 μ m; * P <0, 01 u odnosu na kontrole. ( j ) PCR analiza ekspresije miR-218 u mišićima trabekularne kosti u stvarnom vremenu, opisana u ( b ) ( n = 10). * P <0, 01 u odnosu na kontrole. ( k ) Westem analiza vijaka ekspresije c-PARP u trabekularnim kostima miševa opisanih u (b). ( l ) Analiza Western blot ekspresije Rictor, Raptor i P-Akt (S473) u trabekularnim kostima miševa opisanih u ( b ). ( m ) Shematski model koji prikazuje da regulacija miR-218 i gubitak Rictor-a sa starenjem inducira patogenezu gubitka koštane mase koji je povezan sa starenjem

Slika pune veličine

Rasprava

Naše studije pokazuju da smanjivanje regulacije Rictor-a sa starenjem u osteoblastu ima važnu ulogu u patologiji gubitka kostiju povezanog s godinama. Rictor je ključan za stvaranje kostiju kontrolom citoskeletne organizacije osteoblasta, promičući adheziju osteoblasta na koštanu površinu i preživljavanje, te na kraju održavajući dovoljan broj funkcionalnih stanica osteoblasta. Predlažemo novi funkcionalni put važan za gubitak koštane mase vezan za dob neovisan o akumulaciji adipocita u koštanoj srži: nakupljanje ROS-a sa starenjem potiče transkripciju miR-218, što zauzvrat cilja Rictor, smanjujući adheziju osteoblasta na površini kosti i promicanje apoptoze osteoblasta. Posljedično, smanjuje se stvaranje kostiju, što pridonosi gubitku kostiju povezanom s dobi (slika 7m). U međuvremenu, i druge miRNA (miR-152, miR-142, i tako dalje) također bi mogle ciljati na Rictor, a povećani miR-218 može imati druge ciljeve važne za osteoblast kao što je Runx2 u ovom procesu (slika 6c), koji bi svi mogli pridonose gubitku kostiju povezanom s dobi.

Pojačana resorpcija kosti i / ili smanjena formacija kostiju mogu dovesti do gubitka kostiju, a vjeruje se da je adekvazija u stvaranju kosti glavni patogeni mehanizam koji posreduje gubitku kostiju povezanom s dobi. 2, 4, 5 Napad oštećenih kostiju može biti rezultat smanjenja broja osteoblasta povezanih s godinama, a posljedica je mnoštva mehanizama povezanih sa starenjem. 7 Budući da je kod osteopenije povezane s dobi uočena progresivna nakupljanja masti u prostoru koštane srži s povećanjem dobi, a smatra se da adipociti koštane srži i osteoblasti potječu iz uobičajenih BMSC-ova, a smanjenje stvaranja osteoblastične kosti smatra se da potiče od prelaska sa diferencijacija osteoblasta do adipocita u BMSC tijekom starenja. 4, 5, 6 Za mnoge molekule, uključujući Rictor, 24, 25, 26 Id4 (12), Maf, 13 kanabinoidni receptor tip 1 (ref. 11) i miR-188 (ref. 31), pokazalo se da djeluju kao molekularni prekidač u BMSC diferencijaciji. Međutim, formiranje kosti in vivo ne ovisi samo o broju i brzini stvaranja osteoblasta, već i o funkcionalnoj aktivnosti osteoblasta i životnom vijeku zrelih osteoblastičnih stanica. Histomorfometrijska ispitivanja pokazuju da je stanično smanjenje koštane mase kod miševa povezano s povećanom osteoblastičnom i osteocitnom apoptozom. Ovo istraživanje potvrđuje da je u stanicama starijih pojedinaca više stanica bilo apoptotičnih. Zanimljivo je da je sposobnost osteoblasta starijih miševa da se pridržavaju koštane površine znatno smanjena u usporedbi s onim mladih miševa in vitro i in vivo , što je presudno za proces stvaranja kostiju. Ovaj nalaz naglašava važnost disregulacije citoskeletne organizacije osteoblasta u patogenezi gubitka kostiju povezanog sa starenjem. Kolektivno, smanjena adhezija osteoblasta na površini kosti i povećana apoptoza osteoblasta smanjuju broj funkcionalnih osteoblasta tijekom gubitka koštane mase povezanih sa starenjem.

Nedavne studije utvrdile su suštinsku ulogu Rictor / mTORC2 u diferencijaciji BMSC-a, ali rezultati ispitivanja in vitro i in vivo kontroverzni su. 24, 25, 26 Oba primarna miša BMSC s nedostatkom Rictor-a generirana Cre / loxP sustavom ili BMSCs s padom Rictor-a siRNA-om pokazuju smanjeni kapacitet diferencijacije osteogena i povećani potencijal diferencijacije adipogena. 24, 26 BMSC od miševa s Rictor-ovim poremećajem u skeletogenom mezenhimu udova (uključujući BMSC) pomoću Prx1-cre također je pokazalo oslabljenu diferencijaciju osteoblasta in vitro. 25 Ovi rezultati pokazuju da mTORC2 regulira odabir staničnih loza u korist osteoblasta nad adipocitima in vitro . Međutim, iznenađujuće nije smanjen broj osteoblasta, ali je opaženo manje adipocita koštane srži kod miševa sa nedostatkom Rictor-a, što ukazuje na to da je Rictor / mTORC2 potreban za pravilno adipogenezu koštane srži in vivo. 25 Dakle, funkciju Rictor-a u odabiru loze BMSC potrebno je dodatno razjasniti. Značajno, naša ispitivanja in vitro i in vivo pokazuju da je Rictor potreban za organizaciju citoskeleta, adheziju, mineralizaciju i preživljavanje diferenciranih osteoblasta. Naši dokazi upućuju na to da Rictor ima različite uloge u BMSC-ima i osteoblastima. Sukladno tome, gubitak Rictor-a u mezenhimu udova dovodi do kraćih i užih skeletnih elemenata i u embrija i kod postnatalnih miševa. Ti su miševi također imali oštećenje formiranja kostiju, što je rezultiralo tanjim kortikalnim kostima. 25 Međutim, brisanje Rictor-a u osteoblastima u ovoj studiji nije utjecalo na rast kostiju tijekom razvoja, već je ubrzalo gubitak kostiju s porastom dobi zbog nedostatka mineralizacije, adhezije i preživljavanja osteoblasta, što ukazuje na bitnu ulogu Rictor-a u održavanju dovoljnog broja funkcionalni osteoblasti i formiranje kostiju. Važno je da naša studija otkriva uzročno-posljedičnu vezu između gubitka Rictor-a i gubitka koštane mase povezanih s dobi, sugerirajući da deregulacija Rictor-a sa starenjem ima značajnu ulogu u patogenezi osteoporoze povezane s dobi.

Mnoga su istraživanja pokazala da miRNA imaju ključnu ulogu u svim fazama stvaranja kostiju, sugerirajući mogućnost da miRNA mogu biti nove terapijske mete za koštane bolesti. 37 U BMSC-ovima nedavno je pokazano da miRNA-188 regulira prelazak između diferencijacije osteoblasta i adipocita povezanih s dobi, a uregulacija miRNA-188 doprinosi gubitku kostiju povezanom sa starenjem. Značajno da miRNA-188 cilja Rictor i dovodi do njegove smanjene regulacije sa starenjem u BMSC-u. 31 U osteoblastima nismo primijetili značajan porast razine miR-188 kod starijih miševa. Umjesto toga, pojačana ekspresija miR-218 usmjerena na Rictor i čini se da je odgovorna za gubitak Rictor-a sa starenjem u osteoblastima. miR-218 smanjuje adheziju osteoblasta i pojačava apoptozu osteoblasta, što dodatno potvrđuje negativnu ulogu miR-218 u stvaranju kostiju. Stage ovisna regulacija Rictor-a od strane različitih miRNA tijekom diferencijacije osteoblastnih linija naglašava složenost regulacije stanične diferencijacije miRNA-ima. I miR-188 i miR-218 potencijalni su terapijski ciljevi za osteopeniju povezanu s godinama.

Zaključno, ova studija pokazuje da je smanjivanje vrijednosti Rictor-a sa starenjem u osteoblastima važno za patogenezu gubitka kostiju povezanog sa starenjem. Taj je put novi mehanizam neovisan o prebacivanju BMSC-a iz osteoblasta na adipocite i nakupljanje koštane masti. Usmjeravanje ovog puta, koji posreduje s osteoblastičnom disfunkcijom povezanom s godinama, može biti korisno za promicanje stvaranja kostiju i smanjenje gubitka kostiju koji je povezan sa starenjem.

Materijali i metode

materijali

Svi reagensi dobiveni su iz Sigme (Poole Dorset, Velika Britanija), osim ako nije drugačije naznačeno. Pojedinosti o antitijelima za Western blot analizu i imunohistokemiju mogu se naći u Dodatnim informacijama.

Miševi

Svi su eksperimenti izvedeni u skladu s i odobrenim od strane eksperimentalnog odbora za dobrobit životinja i etičke komisije Medicinskog sveučilišta. Miševe kojima je egzon 11 iz Rictor-a bio obrubljen s loxp mestom ( Rictor flox / flox ) ljubazno je pružio profesor Mark A. Magnuson sa Sveučilišta Vanderbilt. 38 Osx-GFP-Cre miševa (mačka # 006361) kupljeni su u Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA). Izvršili smo genotipizaciju upotrebom genomske DNA izolirane iz biopsije repa, a upotrijebljeni primeri su prikazani u Dodatnoj tablici S1. Miševi C57BL / 6 kupljeni su u Laboratorijskom centru za životinje Južnog medicinskog sveučilišta. Devetomjesečni miševi tretirani su NAC (oralno. 2 mg / ml, razrjeđivanje vodom) 7 mjeseci, n = 10. Miševi su žrtvovani dislokacijom vrata maternice kako bi ublažili patnju. Kompletne smjernice dolaska Kontrolni popis nalazi se u Dodatnoj tablici S2. 39

Kultura stanica

Preosteoblastna stanična linija MC3T3-E1 održavana je u alfa-MEM (Gibco BRL, Gaithersburg, MD, SAD) dopunjenom 10% fetalnim goveđim serumom (Gibco), 100 U / ml penicilina i 100 mg / ml streptomicin sulfata. Primarni BMSC i osteoblastične stanice pripremljeni su iz koštane srži ili kalvarije miševa u različitim dobima. Za osteogensku indukciju, 100 mg g / ml askorbinske kiseline (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Njemačka) i 10 mM P -glicerol fosfata (Sigma-Aldrich) dodani su spojenim stanicama. Bojenje alizarin crvenim bojama izvedeno je prema standardnim tehnikama. Adipogeni medij uključuje 0, 5 mM IBMX, 5 µg / ml inzulina i 1 µM deksametazon. Stanice su transficirane s ekspresijskim vektorom Rictor (pRK5-myc-Rictor, addgene, mačka # 1860), ili sa 100 nM miR-218 mimikom, miR-218 inhibitorom ili scramble Control oligo koristeći transfekcijsko sredstvo lipo2000 (Invitrogen, Carlsbad, Kanada ) prema uputama proizvođača.

Konfokalna analiza

Stanice osteoblasta iz OBRictorKO i miševi divljeg tipa uzgajani na staklenim poklopcima u pločama sa šest jažica bili su fiksirani s 4% ledenim paraformaldehidom u fiziološkoj otopini fosfata (PBS) 20 minuta na 4 ° C i permeabilizirani s 0, 2% Triton X- 100 u PBS-u tokom 5 minuta, zatim blokiran 30 minuta u kozjem serumu i inkubiran 1 sat u P-Paksilinu (Y118) (razrjeđivanje 1: 100 sa 1% BSA). Potom su isprani u PBS-u 3x5 min. Stanice su obojene s FICT-konjugiranim faloidinom (pri razrjeđivanju 1: 500 sa 1% BSA) i 488-konjugiranim sekundarnim antitijelima (pri razrjeđivanju 1: 250 s 1% BSA) i inkubirani 1 sat na sobnoj temperaturi. Zatim su ponovo isprani u PBS-u 3x5 min. Ftomikrografije su dobivene uporabom konfiguracije FLOUVIEW konfokalne mikroskopije (Olympus, Tokyo, Japan).

Test stanične adhezije

Primarne stanice osteoblasta i MC3T3-E1 su tripsinizirane i resuspendirane u koncentraciji 5 × 10 4 stanice. Stanice su ostavljene da se prianjaju na PLAGA tanke filmove na 37 ° C 1 sat. Nepripadajuće stanice su uklonjene ispiranjem s PBS tri puta i fiksirane u 70% -tnom etanolu tokom 15 minuta. Otopina kristalno ljubičaste mrlje se inkubira 15 sati sa pripadajućim stanicama na sobnoj temperaturi. Obojene stanice zatim su brojene u hemacitometru pod svjetlosnim mikroskopom.

Analiza ELISA i ROS

Serijski PINP mjeren je korištenjem mišjeg konkurentnog enzima za imunološki test (Elabscience, Šangaj, Kina), a koncentracija ROS u kosti mjerena je prema uputama proizvođača.

Priprema decalcificiranih odjeljaka, histokemije i imunohistokemije (IHC) i histomorfometrijske analize

Femurna tkiva disecirana od miševa fiksirana su korištenjem 4% paraformaldehida u PBS-u na 4 ° C tijekom 24 sata, a zatim dekalcificirana u 15% EDTA (pH 7, 4) na 4 ° C tokom 14 dana. Tkiva su ugrađena u parafin za dobivanje optimalne temperature rezanja (Sakura Finetek, Tokio, Japan), a za histološke analize pripremljeni su sagitalni presjeci sa 2-5 μm. H&E bojanje se rutinski izvodilo. Bojenje fosfataze otporne na tartarat (TRAP) provodi se korištenjem standardnog protokola (Sigma-Aldrich). Za IHC inkubirali smo primarna antitijela koja su preko noći prepoznala mišji osteokalcin na 4 ° C. All sections were observed and photographed on Olympus BX51 microscope (Tokyo, Japan). Immunohistochemical staining was evaluated by cell number counting. Osteoblasts on bone surface were discerned by morphology and calculated by two independent observers blinded to the groups. At least three mice per group were examined.

Real-time PCR

Total RNA was extracted from MC3T3-E1 cells using Trizol reagent (Life Technologies, Waltham, MA, USA). TaqMan probes were used for the detection of miRNA (Applied Biosystems, Life Technologies, Waltham, MA, USA) as described by the manufacturer, by using the small nuclear RNA U6 as an endogenous control. For mRNA-level analysis, cDNA was generated by using reverse transcriptase SuperScript II and poly, dTpremers (Invitrogen). Real-time PCR was performed by SYBR Green Master Mix (Invitrogen) and the ABI7500HT fast real-time PCR System (Applied Biosystems). Primers are described in Supplementary Table S1. U6 was used as an endogenous control. The relative quantification of miRNA expression was performed using the ΔΔCT method.

Vector constructs

The 3′-UTR of Rictor, encompassing the predicted miRNA sequences, was inserted into the multiple cloning site of the reporter vector psiCHECK-2 (Promega, Madison, USA) with Xho I and Not I. The seed-region-mutated reporters contained engineered point mutations of four nucleotides complementary to the 5′-end of the relevant miRNA. The primers used for cloning are listed in Supplementary Table S1. All sequences were confirmed by Sanger sequencing.

Luciferase assays

HEK293 cells were transfected with the indicated psiCHECK-2 luciferase construct. All cells were also transfected with miRNA mimics or negative control. Lysates were collected 36 h after transfection and luciferase activities were measured by using the dual-luciferase reporter assay system (Promega).

miRNA detection

Total RNA, inclusive of the small RNA fraction, was extracted from cultured cells with a Tissue Total RNA Extraction Kit (GenePharma). Reverse transcription reactions were carried out using Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase (M-MLV RT) (Invitrogen). Real-time PCR was performed on an Applied BiosystemStepOnePlus, using SYBR Green I Real-Time PCR kits (GenePharma, Suzhou, China) for miRNA. The relative expression levels of miRNAs in each sample were calculated and quantified using the 2 −total method after normalization for expression of the positive control.

Scanning electron microscopy (SEM)

The surface of the methylmethacrylate (MMA) embedded femurs were polished and acid-etched with 37% phosphoric acid for 2–10 s. After washing for 5 min with 5% sodium hypochlorite they were coated with gold and palladium before examining with SEM (S-3700 N, Hitachi, Tokyo, Japan).

Calcein staining

Three- and nine-month-old mice were given calcein via intraperitoneal injection, 10 and 3 days before killing. Both femur were fixed in 100% ethanol, embedded in polymethyl methacrylate and sectioned using microtome (Leica SM2500S; knife: Leica VMH400, Nussloch, Germany). A total of 10 μ m thick longitudinal section from each femur was analyzed using Olympus microscope. The flourochrome labels were used to assess the bone MARs. We calculated MAR by measuring the mean distance of fluorescent labels, and dividing the distance by the time point at which the labels were administrated. MAR/OB: average thickness of mineral apposition by an osteoblast per day in 1 mm bone surface.

micro-CT analysis

Quantitative analysis was performed in mice femora at 12- μ m resolution on a micro-CT Scanner (Scanco Medical, Bassersdorf, Switzerland). Briefly, scanning was performed at the lower growth plate in the femora and extended proximally for 300 slices. We started morphometric analysis with the first slice in which the femoral condyles were fully merged and extended for 100 slices proximally. The 3D structure and morphometry were constructed and analyzed for BV/TV (%), BMD (mg HA/mm 3 ), Tb.N. (mm –1 ), Tb.Th. (mm) and Tb.Sp. (mm). We also performed micro-CT imaging in the mid-diaphysis of the femur and performed mid-shaft evaluation of 100 slices to quantify the cortical thickness, bone mineral density and outer/inner perimeter of the mid-shaft.

Trabecular bone ROS assay

Trabecular were isolated from femur and ground with liquid nitrogen. The homogenate in PBS was centrifuged to remove debris and the supernatants were incubated in 10 μ M dichorodihydro fuorescein diacetate (DCFH-DA; Molecular Probes, GenePharma, Suzhou, China) for 10 min at room temperature. DCFH-DA oxidation into 2′, 7′-dichlorofluorescein was measured using a spectrofluorometer (Bio-TEK, Vermont, USA, excitation 485 nm and emission 525 nm). Date were expressed as value of optical density (OD).

Western blot

Cells and tissues were lysated by 2% sodium dodecyl sulfate with 2 M urea, 10% glycerol, 10 mM Tris–HCl (pH 6.8), 10 mM dithiothreitol and 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride. The lysates were centrifuged and the supernatants were separated by SDS–PAGE and blotted onto a nitrocellulose (NC) membrane (Bio-Rad Laboratories, Shanghai, China). The membrane was then analyzed using specific antibodies and visualized by enhanced chemiluminescence (ECL Kit, Amersham Biosciences, GE Healthcare, Buckinghamshire, UK).

Preparation of undecalcified histology sections

To label the mineralization fronts, 6-month-old mice were subcutaneously injected with calcin (Sigma, 15 mg/kg body weight) in 2% sodium bicarbonate solution 10 and 3 days before death. After dissection, the femurs were fixed in 4% paraformaldehyde for 24 h. They were then dehydrated through a graded series of ethanol (70–100%) and xylene before being embedded in MMA without prior decalcification. Ten micrometer-thick sections were prepared for double-labeling fluorescent analysis.

statistika

All results are expressed as mean±SEM T-tests were used to calculate P -values. Statistička značajnost definirana je kao P <0, 05.

Dodatna informacija

Word dokumenti

  1. 1.

    Supplementary Informations

Datoteke slika

  1. 1.

    Dopunska slika 1

  2. 2.

    Dopunska slika 2

  3. 3.

    Dopunska slika 3

  4. 4.

    Dopunska slika 4

  5. 5.

    Dopunska slika 5

  6. 6.

    Dopunska slika 6

  7. 7.

    Dopunska slika 7

  8. 8.

    Dopunska slika 8

  9. 9.

    Dopunska slika 9

  10. 10.

    Dopunska slika 10

Glosar

BMD

bone mineral density

BMSCs

bone marrow mesenchymal stem cells

BV/TV

bone volume per tissue volume

MSC

mesenchymal stem cell

mTORC2

mechanistic target of rapamycin complex 2

Tb.N

trabecular number

Tb.Sp

trabecular separation

Tb.Th

trabecular thickness

ZAMKA

tartrate-resistant acid phosphatase

BS

bone furface

NAC

N-acety- l -cysteine

ROS

reaktivne vrste kisika

Supplementary Information accompanies this paper on Cell Death and Disease website (//www.nature.com/cddis)