Magnezij izaziva apoptozu neurona potiskujući ekscitabilnost | stanična smrt i bolest

Magnezij izaziva apoptozu neurona potiskujući ekscitabilnost | stanična smrt i bolest

Anonim

teme

  • apoptoza
  • razdražljivost
  • Magnezij
  • neurodegeneracija

Sažetak

U kliničkoj porodici primjena magnezijevog sulfata (MgSO 4 ) je raširena, ali učinci na razvoj mozga nisu poznati. Mnoga sredstva koja smanjuju neuronsku ekscitabilnost povećavaju razvojnu neuroapoptozu. U ovom istraživanju koristili smo disocirane kulture hipokampusa glodavaca da bismo ispitali učinke Mg ++ na ekscitabilnost i preživljavanje. Mg ++ -inducirani gubitak stanica povezanih s kaspazom-3 ​​u klinički relevantnim koncentracijama. Tehnike patch-clamp cijelih stanica mjereno su učinci Mg ++ na prag akcijskog potencijala, amplituda vršnog djelovanja, broj šiljaka i promjene potencijala membrane u mirovanju. Mg ++ prag depolariziranog akcijskog potencijala, vjerojatno zbog efekta probira površinskog naboja na natrijske kanale sa naponom. Mg ++ je također smanjio broj akcijskih potencijala kao odgovor na ubrizgavanje fiksne struje bez utjecaja na amplitudu vršnog djelovanja. Iznenađujuće, Mg ++ je također depolarizirao potencijal mirovanja neurona na način ovisan o koncentraciji, s +5, 2 mV pomakom na 10 mM. Napon rampe sugerirao je da Mg ++ blokira provodljivost kalija pridonoseći potencijalu mirovanja. Unatoč ovom depolarizacijskom učinku Mg ++, neto inhibicijski učinak Mg ++ gotovo je u potpunosti prigušio aktivnost neuronske mreže izmjeren snimkama s višeelektronskim nizom. Zaključujemo da iako Mg ++ ima složene učinke na staničnu ekscitabilnost, ukupni inhibitorni utjecaj Mg ++ smanjuje preživljavanje neurona. Uzeti zajedno s nedavnim in vivo dokazima, naši rezultati sugeriraju da može biti opravdana oprez u primjeni Mg ++ u kliničkoj akušerstvu i neonatologiji.

Glavni

Magnezijev sulfat (MgSO 4 ) koristi se u kliničkoj porodici već više od 70 godina za liječenje preeklampsije / eklampsije i prijevremenog porođaja, stanja koja u SAD-u otežavaju otprilike 3 i 12, 4% svake godine. 1 Trenutno je MgSO 4 standard skrbi za sprečavanje i liječenje eklampsijskih napada, a iako je njegova sigurnost i djelotvornost kao tokolitik kontroverzna, 2, 3, procjenjuje se da preko 150 000 žena u Sjedinjenim Državama prima tokoliznu terapiju na ili prije 34 tjedna trudnoće godišnje, s MgSO 4 koji se koristi u prvom redu liječenja u većini slučajeva. 4, 5 Iako je MgSO 4 općenito prihvaćen kao siguran bez štetnih učinaka na novorođenčad, nijedna studija nije razmotrila da li izloženost normalnog mozga u razvoju visokim koncentracijama Mg ++ ima štetne učinke ili posljedice.

Suprotno tome, Mg ++ je intenzivno proučavan kao potencijalni neuroprotektant za sprečavanje ili poboljšanje ishoda ozljeda mozga kao posljedice perinatalne hipoksije / ishemije, poput encefalopatije, intraventrikularnog krvarenja, periventrikularne leukomalacije i cerebralne paralize. 6, 7 Međutim, sigurnost i neuroprotektivna učinkovitost Mg ++ za prerano rizične novorođenče ostaje kontroverzna. 8 Nedavnim pregledima u kojima se ocjenjuje uporaba MgSO 4 u neuroprotekciji fetusa ili upotreba tokolitika kod žena u riziku za prijevremeni porođaj zaključeno je da neuroprotektivni učinci nisu utvrđeni; MgSO 4 nije učinkovit u odgađanju ili sprečavanju prijevremenog rođenja i može zapravo povećati neonatalni morbiditet i smrtnost. 2, 9

Magnezij je drugi tek po kaliju u izobilju kao unutarćelijski kation u ljudskom tijelu, a Mg ++ sudjeluje u mnogim staničnim funkcijama, uključujući proizvodnju energije, sinaptičku neurotransmisiju i unutarćelijsku signalizaciju. Mg ++ blokira ionske kanale receptora glutamatnih receptora N- metil-D-aspartata (NMDA), sprječavajući protok jona u tipičnim potencijalima neuronskog mirovanja. 10 Dvovalentni kationi, uključujući Mg ++ u mM koncentracijama, smanjuju aktivaciju naponskih kanala kroz efekte probira površinskog naboja, 11, 12, 13, 14, smanjujući tako ekscitabilnost neurona. Mg ++ u visokim izvanstaničnim koncentracijama također blokira priliv Ca ++ i smanjuje sinaptički prijenos. 15 Tokolitička djelovanja očigledno su rezultat smanjene kontraktilnosti miometrija kroz izvan- i unutarćelijske Mg ++ akcije. 16 Međutim, suprafiziološki Mg ++ također blokira kalijumske provodljivosti i receptore γ -aminobuterne kiseline (GABA) A. 17, 18, 19 Nedavni dokazi sugeriraju da oslobađanje od dugotrajne inhibicije Mg ++ može rezultirati homeostatskim povećanjem dugotrajnog potenciranja i plastičnosti. Stoga, u suprafiziološkim koncentracijama, Mg ++ može imati složene akcije na neuronsku ekscitabilnost i nije jasno hoće li neto ekscitacija ili inhibicija prevladati tijekom dugotrajne inkubacije.

Spojevi koji inhibiraju aktivnost neurona, uključujući antagoniste NMDA i blokatore kalcijevih kanala, pokreću široku apoptotsku neurodegeneraciju u mozgu u razvoju tijekom prozora ranjivosti (miševi i štakori 0-14 dana postnaralno). 21, 22, 23 Kod glodavaca ovo kritično razdoblje otprilike odgovara trećem tromjesečju ljudskog razvoja, kada se izloženost MgSO 4 obično događa kod ljudi. 24 Ako Mg ++ dovoljno inhibira neurone, primjena Mg ++ mladim životinjama može povećati razvojnu neuroapoptozu. Doista smo pokazali da in vivo MgSO 4 inducira široku neuroapoptozu središnjeg živčanog sustava u postnatalnom 3. i 7. danu, ali ne i postnatalni 14. dan. 25 Ovaj rad nije eksplicitno istražio je li Mg ++ djelovao izravno ili neizravno na osjetljive ciljne neurone, pitanje na koje su posebno prikladni in vitro preparati.

S obzirom na gore navedena složena stanična djelovanja Mg ++ na ekscitabilnost i pitanja o tome da li Mg ++ direktno uzrokuje smrt neurona, ispitali smo preživljavanje in vitro , zajedno s eletrofiziološkim istraživanjima kako bismo testirali učinke Mg ++ na ekscitabilnost neurona. Za ove mehaničke studije iskoristili smo pripravak primarne kulture neurona hipokampalnih glodavaca.

Rezultati

Efekti preživljavanja / aktivirani neuroni kaspaze-3

Otkrili smo da i MgSO 4 i MgCl2 u koncentraciji od 5 i 10 mM izazivaju smrt hipokampalnih neurona u odnosu na kontrolne kulture (Slike 1a i b). U tretiranim kulturama opaženo je manje neurona u odnosu na kontrole, a stanični profili umirućih neurona često su vidljivi i karakterizirani su kondenziranim, fragmentiranim jezgrama, što je često povezano s apoptotskom staničnom smrću. 21 MgSO 4 i MgCl2 imali su snažne negativne učinke na preživljavanje pri 5 mM i pri 10 mM dodali Mg ++ (Slika 1b). Time se koncentracija u kojoj Mg ++ ubija neurone u rasponu u kojem ima važne učinke na ionske kanale i klinički je značajna. 26 Na temelju značajnog stupnja ćelijske smrti proizvedene u koncentraciji od 5 i 10 mM MgS04, ispitali smo preživljavanje u studiji koncentracije-reakcija uspoređujući 1, 2, 5 i 5 mM. U tim se studijama (slika 1c) dogodio trend gubitka neurona s koncentracijama koje su bile samo 1 mM dodanog MgS04 ( P = 0, 07). Ovaj je trend postao statistički značajan na 2, 5 i 5 mM iznad kontrolnih uvjeta (slika 1c).

Image

Mg ++ smanjuje preživljavanje neurona u primarnim kulturama hipokampa. ( a ) Fazno-kontrastni fotomikrograf koji prikazuje zdrave neurone (primjeri označeni strelicama) koji se koriste u brojanju stanica. ( b ) Sažetak brojeva iz nasumično odabranih polja iz posuđa tretiranih s MgSO 4 ili MgCl2 u naznačenim koncentracijama. Broj se normalizirao u brojeve iz kontrolnih kultura braće (braća i sestre) ( n = 5 pokusa na neovisnim rasadima). Tretman Mg ++ bio je od dana in vitro 5 do dana in vitro 10. ( c ) Sažetak ispitivanja nižih koncentracija MgSO4 na postotak preživljavanja u odnosu na kontrolu. Iako je ovaj skup kultura bio malo manje osjetljiv na učinke od 5 mM Mg ++ u usporedbi s kulturama iz ( a ), koncentracije niže od 1 mM iznad kontrole rezultirale su značajnim padom preživljavanja u usporedbi s kontrolom. Šipke predstavljaju sredstvo ± SEM ( n = 6). * P <0, 05; *** P <0, 001

Slika pune veličine

MgSO 4 inducira val apoptotske neurodegeneracije u mozgu neonatalnog miša, 25 koji je dijelom određen aktiviranjem kaspaze-3, efektorskom kaspazom u mnogim vrstama aponalne neurone. 27 Da bismo utvrdili da li su izloženi Mg ++ neuroni in vitro podvrgnuti apoptotskim promjenama i da bismo pozitivno identificirali umiruće neurone, imunostainirali smo kulturama hipokamp za aktiviranu kaspazu-3. Imunološko bojenje za aktiviranu kaspazu-3 ima prednosti u odnosu na druge mjere aktivnosti kaspaze, jer identificira stanični tip koji sadrži aktivirani enzim (u našem slučaju hipokampalne neurone). Identifikacija tipa ćelije korisna je značajka u našoj miješanoj kulturi astrocita i neurona. Imunostanirane stanice pod kontrolnim uvjetima i kulture tretirane s 5 i 10 mM dodatnim MgS04 tijekom 3 dana počevši od 6 dana in vitro . Apoptoza kao odgovor na blokadu aktivnosti in vitro pokazuje značajno povećavanje bojenja kaspaze-3 u osjetljivim stanicama, a Mg ++ dovodi do povećanja postotka imunoreaktivnih neurona u kulturama ovisnim o koncentraciji (Slika 2), slično raznim tretmanima koji inhibiraju aktivnost neurona. 28, 29 Apsolutni srednji broj zdravih stanica u kontrolnoj skupini u odnosu na tretirane skupine bio je sličan (68, 8 ± 22, 8 stanica po kontroli; 64, 1 ± 20, 5 stanica po 5 mM; i 64, 4 ± 26, 7 stanica na 10 mM). Ova sličnost rezultat je rane procjene kultura 3 dana nakon tretmana MgSO4 (slika 2) u odnosu na 6 dana nakon evaluacije liječenja na Slici 1 (vidi također Moulder i sur. 28 ). Obje skupine od 5 i 10 mM MgS04 pokazale su značajno veće postotke pozitivnih stanica kaspaza-3 u odnosu na kontrole braća (slike 2c i d). Niski apsolutni postoci imunoreaktivnih neurona kaspaze-3 odražavaju spor ukupni gubitak neurona, u kombinaciji s prolaznom imunoreaktivnošću kaspaze-3 u pojedinim neuronima. Kratki prikaz imunoreaktivnosti kaspaze-3 u bilo kojem trenutku tijekom progresivnog gubitka neurona stvara samo manjinu pozitivnih stanica. 28, 29

Image

Više neurona pokazuje imunoreaktivnost kaspazu-3 u kulturama tretiranim Mg ++ . ( a ) Kontrolno polje koje pokazuje zdrave neurone negativne na aktiviranu imunoreaktivnost kaspaze-3. ( b ) Polje iz kulture koja je tretirana od segmenta Mg ++ pokazuje neuron pozitivan na aktiviranu kaspazu-3 (strelica). ( c ) Vrijednosni grafikoni rezimiraju postotak stanica pozitivnih na kaspazu-3 u odnosu na zdrave stanice iz istih polja. Obje koncentracije MgSO4 (5 i 10 mM) značajno su povećale postotak apoptotičkih neurona u odnosu na kontrolu ( n = 5 pokusa). ( d ) Sažetak dodatnih pokusa namijenjenih ispitivanju zaštite inkubacijom KCl. Sam KCl pokazao je trend zaštite od atrijskog gubitka neurona i smanjio je postotak imunoreaktivnosti na kontrolne razine zajedno s izloženošću Mg ++ ( n = 5). * P <0, 05; ** P <0, 01

Slika pune veličine

Pokazalo se da je kronična inkubacija neurona s povišenim koncentracijama KCl u mediju kulture da zaštiti neurone od apoptotske ćelijske smrti koja je posljedica prekomjerne inhibicije i nedostatka neurotrofičnih faktora. Smatra se da depolarizacija KCl 23, 28, 29, 30, 31 sprječava apoptozu umjereno povećanjem unutarćelijske koncentracije Ca 2+ . 30 Ako Mg ++ djeluje smanjenjem aktivnosti neurona, pretpostavljali bismo da bi liječenje KCl moglo spriječiti učinak Mg ++ . Suprotno tome, ako bi Mg ++ djelovao na druge mehanizme, poput prekomjerne ekscitacije, možemo očekivati ​​da bi depolarizacija KCl trebala pogoršati smrt. Stoga, kako bismo dodatno razjasnili prirodu Mg ++ -inducirane smrti neurona in vitro , testirali smo učinak 30 mM KCl na staničnu smrt povezanu s kaspazom, induciranu Mg ++ . Otkrili smo da je KCl značajno zaštićen kako od spontane smrti neurona, tako i od stanične smrti uzrokovane MgSO 4 (slika 2d). Kao što je prikazano u prethodnim eksperimentima, usporedba kontrole u odnosu na MgS04 pokazala je značajno povećanu prisutnost aktivirane kaspaze-3. Usporedba slika 2c i d pokazuje značajnu varijabilnost u količini apoptoze povezane s oštećenjem među kontrolnim kulturama različitih plodova (∼ 8% na slici 2c u odnosu na ∼ 2% na slici 2d). Iako svi čimbenici koji sudjeluju u razini pozadinske apoptoze nisu potpuno razumljivi, porast imunoreaktivnosti kaspaze-3, izazvan Mg ++, bio je snažan u kontekstu manjih i viših gubitaka.

Elektrofiziologiia

Da bi se odredio učinci Mg ++ na ekscitabilnost neurona hipokampala, izvedeni su elektrofiziološki eksperimenti s istim koncentracijama MgCl2 kao eksperimenti preživljavanja (2, 5, 5 i 10 mM). U elektrofiziološkim eksperimentima korišten je MgCl2, a ne MgSO4, jer se kloridne soli rutinski koriste u elektrofiziologiji kulture. Kako smo predviđali neto smanjenje ekscitabilnosti pomoću Mg ++ na temelju naših studija preživljavanja, uspoređivali smo učinke eskalirajućih koncentracija tetrodotoksina (TTX), visoko selektivnog antagonista natrijevih kanala sa naponom uz dobro definirane učinke na ekscitabilnost. 32 TTX ušutkivanje ubija neurone u hipokampalnoj kulturi kroz apoptozu kroz sličan vremenski tijek kao i Mg ++, 28, 29, pa je poslužilo kao relevantni komparator.

U načinu strujnog stezanja, za pokretanje akcijskih potencijala korišten je 20 ms trenutni impuls od +70 do +220 pA. Sadašnje amplitude koje su mnogo iznad reobase ćelije korištene su kako bi se osiguralo da šiljak nastaje fiksnom strujom amplitude, usprkos smanjenoj ekscitabilnosti koja se predviđa primjenom Mg ++ i TTX. Zabilježeni su i analizirani tragovi praga akcijskog potencijala, amplitude vršnog djelovanja, broja šiljaka i promjena membranskog potencijala u mirovanju ( V m ).

Slika 3 pokazuje da je došlo do povećanja praga djelovanja potencijalno o koncentraciji s tretmanom Mg ++ (slike 3a i b), što je rezultiralo smanjenjem ekscitabilnosti, mjereno brojem uboda izazvanih ubrizgavanjem fiksne struje (slika 3c ). Učinak na inicijaciju šiljaka postao je toliko jak pri 10 mM Mg ++ da u dvije stanice nismo bili u stanju da evociramo akcijske potencijale u ovoj koncentraciji. TTX (30 nM) također je značajno depolariziran prag (slika 4a). Kvantitativno, učinak 30 nM TTX na prag akcijskog potencijala bio je sličan učinku 2, 5 i 5 mM Mg ++, s jačim učincima od 60 nM i 90 nM TTX ( P <0, 001) u usporedbi s 30 nM.

Image

Mg ++ povećava prag napona za pokretanje akcijskog potencijala i smanjuje broj šiljaka kao odgovor na ubrizgavanje dugotrajne struje. ( a ) Reprezentativni primjeri akcijskih potencijala izazvanih ubrizgavanjem fiksne amplitude struje (+120 pA) u zapisima zakrpama u cijeloj ćeliji. Akcijski pragovi daju se za svaki trag, koji predstavlja slijeva nadesno: 1 (osnovna crta), 2, 5, 5 i 10 mM dodatni MgCl2. Pogledajte sliku 4 za sažetke podataka. ( b ) Prvi tragovi izvedenih iz primjera prikazanih u ( a ). Mg ++ je smanjio maksimalni nagib akcijskih potencijala (vršna amplituda prvog derivata), u skladu s smanjenjem dostupnosti Na + kanala. ( c ) Učinci Mg ++ na broj akcijskih potencijala dobivenih kao reakcija na injekciju fiksne struje. Primjeri su iz istih snimaka kao na pločama ( a ) i ( b ). Pogledajte sliku 4 za sažetke podataka

Slika pune veličine

Image

Sažetak kumulativnih podataka iz zakrpa-zakrpa cijelih ćelija. ( a ) Lijeva ploča: suzbijanje praga djelovanja ovisilo je o koncentraciji Mg ++ . Desna ploča: TTX učinci na prag akcijskog potencijala bili su usporedivi s učincima Mg ++ . ( b ) Mg ++ smanjio je broj uboda po trenutnoj injekciji. Trend ovisan o koncentraciji dostigao je statistički značaj s najvišom koncentracijom Mg ++ . TTX je ponovno približio učinak Mg ++ . ( c ) Mg ++ nije utjecao na maksimalnu amplitudu akcijskog potencijala, ali je značajno smanjen TTX-om. ( n = 13 za stanice tretirane Mg ++ i 11 za stanice tretirane TTX). ** P <0, 01; *** P <0, 001

Slika pune veličine

Mg ++ nije značajno utjecao na vršku amplitudu akcijskih potencijala, osim pri najvišoj koncentraciji (10 mM). Međutim, promjena maksimalnog nagiba i amplitude vrha prvog derivata akcijskog potencijala (slike 3b i 4) u skladu je s smanjenom dostupnošću i aktivacijom Na + kanala i naknadnim pomakom u pragu. 33 Za razliku od toga, TTX u koncentracijama od 30 nM ( P <0, 01) i višim ( P <0, 001) značajno je smanjio amplitudu akcijskih potencijala (Slika 4c). To se očekivalo zbog izravne blokade natrijevih kanala od strane TTX-a. Mg ++ je također inducirao smanjenje o koncentracijskom smanjenju broja akcijskih potencijala izazvanih ubrizgavanjem fiksne amplitudne struje (Slika 4b). Poput Mg ++, TTX pri 30, 60 i 90 nM smanjio je broj uboda u odnosu na početnu vrijednost (Slika 4).

Unatoč ovim inhibicijskim učincima Mg ++, također smo primijetili nepredviđeni ekscitacijski učinak Mg ++ . Mg ++ depolarizirani neuronal koji odmara V m na način ovisan o koncentraciji (Slike 5a i b). Taj je učinak bio povezan s povećanim ulaznim otporom na stanici (Slika 5c). Da bismo definirali približni reverzni potencijal struje koja je uključena, postavili smo stezne stanice i izveli protokole naponske rampe (slika 5c). Promjena nagiba strujnog odziva na naponsku rampu naglašava smanjenje vodljivosti membrane kao odgovor na primjenu Mg ++ . Digitalno oduzimanje osnovnog odgovora od odgovora u prisutnosti Mg ++ sugeriralo je snažno negativan preokretni potencijal za Mg ++ -osjetljivu struju (-84, 8 ± 14, 3 mV, n = 6 stanica). U jednoj ćeliji potvrdili smo da porast koncentracije pipetnog klorida na 140 mM (povratni potencijal klorida (E Cl− ) = 0 mV) nije utjecao na preokret. U većini stanica, Mg ++- osjetljiva struja pokazala je prividnu unutarnju ispravljanju (vidi primjer na slici 5c). To bi moglo sugerirati da Mg ++ blokira unutarnju ispravljajuću struju, ali ne možemo isključiti blok omske provodljivosti ovisan o naponu. Kao što se očekivalo, TTX nije proizveo nikakvu konzistentnu promjenu u mirovanju V m (-63, 4 ± 2, 4 mV nasuprot 30 nM TTX: -63, 7 ± 3, 7 mV). Ukratko, ovi eksperimenti sugeriraju da Mg ++ utječe na potencijal odmora prvenstveno blokirajući kalijunsku kondukciju otvorenu u mirovanju, moguće unutarnju ispravljajuću provodljivost.

Image

Mg ++ depolarizira potencijal mirovanja neurona. ( a ) Reprezentativni primjer promjene V mirovanja u mirovanju neposredno prije trenutnog ubrizgavanja (strelica) s porastom koncentracije Mg ++ . Svako povećanje koncentracije Mg ++ izazvalo je depolarizaciju od približno 2 mV u mirovanju od V m . ( b ) Stvarni graf predstavlja kumulativnu promjenu V m iz svih staničnih snimaka ( n = 13). Otprilike je +5.2 mV pomak u srednjem Vm u odnosu na visoku Mg ++ skupinu (ukupno 11 mM) * P <0, 05; *** P <0, 001. ( c ) Primjeri naponske rampe izvedene u početnim uvjetima i uz prisustvo 10 mM dodano je Mg ++ (ukupno 11 mM). Rampa je bila od –140 do –40 mV preko 20 ms. Oduzimanje odgovora u prisutnosti Mg ++ iz kontrolnog zamaha proizvelo je Mg ++- osjetljivu struju s reverznim potencijalom od -84, 8 mV u ovoj ćeliji

Slika pune veličine

U kontekstu naših trenutno stegnutih stanica okupanih antagonistima receptura receptora, čini se da inhibicijski učinci Mg ++ dominiraju pobudni učinak na potencijal odmora. Međutim, mješoviti učinci Mg ++ postavljaju pitanje koji bi efekti prevladavali u spontano aktivnoj mreži, poput naše studije preživljavanja. Da bismo odgovorili na ovo pitanje, okrenuli smo se snimcima s multielektronskih nizova (MEA) iz naših kultura (slika 6). Koristili smo 30 nM TTX kao komparator jer je aproksimirao povećani prag djelovanja i smanjenu ekscitabilnost uočenu s intermedijarnom koncentracijom Mg ++ . Kad su se MEA kulture okupale u fiziološkoj otopini koja je sadržavala dodatnih 2, 5 ili 5 mM Mg ++, uočeno je gotovo potpuno prigušivanje neuronske mreže (Slika 6). TTX pri 30 nM, slično depresirana mrežna aktivnost, s gotovo potpunim potiskivanjem aktivnosti (Slika 6). U svim slučajevima, učinci liječenja uspoređivani su s prosječnom aktivnošću iz uvjeta kontrole i ispiranja kako bi se uzeo u obzir potencijalni gubitak aktivnosti zbog oštećenja neurona u ponovljenim izmjenama otopina. Razine aktivnosti u Mg ++ 2, 5 mM, Mg ++ 5 mM i TTX 30 nM nisu se značajno razlikovale jedna od druge i sve je snažno i gotovo u potpunosti potisnulo mrežnu aktivnost. Ovi rezultati jasno sugeriraju da je inhibicija prevladavajući učinak povišenog izvanstanične Mg ++ u netaknutoj mreži.

Image

Mg ++ suzbija mrežne aktivnosti. ( a - c ) Rasterske ploče snimanja MEA iz kontrole ( a ), Mg ++ 2, 5 mM ( b ) i ispiranja ( c ). Snimanje ispiranja izvedeno je nakon što su snimljeni kulturi podvrgnuti snimcima u uvjetima obrade Mg ++ 2, 5 mM, Mg ++ 5 mM i TTX 30 nM. Iako aktivnost nije bila tako snažna u snimcima ispiranja, bila je značajno veća nego u bilo kojem od uvjeta liječenja. Pad aktivnosti između početne vrijednosti i ispiranja vjerojatno je posljedica nepotpunog uklanjanja TTX-a i učinaka opetovanih ispiranja. Pojedinačne razmjene rješenja u isti medij nisu imale utjecaja na stope otkrivanja šiljaka u cijelom nizu (ASDR). ( d ) Sažetak razina aktivnosti u liječenim skupinama pokazao se kao dio ASDR-a, izražen u odnosu na prosjek stope ASDR-a koji se nalazio na početku i nakon ispadanja. U svim eksperimentalnim tretmanima primijećeno je gotovo potpuno prigušivanje neuronske mreže. ( n = 3 neovisna eksperimenta). ** P <0, 01

Slika pune veličine

Rasprava

Iako Mg ++ ima složene učinke na staničnu ekscitabilnost, uključujući i ekscitacijske i inhibicijske utjecaje, naši podaci pokazuju da ukupni inhibitorni utjecaj Mg ++ uzrokuje smanjenu preživljavanje neurona s produljenom izloženošću. Unatoč iznenađujućoj depolarizaciji potencijala odmora, neto učinak Mg ++ je inhibicijski, što pokazuju i snimci mrežne aktivnosti. Smanjena ekscitabilnost pokreće smrt neurona, a depolarizacija kalijem štiti od smrti. Ovi nalazi sugeriraju da Mg ++ -inducirana neuronska apoptoza in vivo 25 vjerovatno proizlazi izravno iz učinaka Mg ++ na osjetljive neurone, a ne kroz sekundarne posljedice sistemskog davanja Mg ++ životinjama. U kliničkoj porodici primjena Mg ++ se obično titrira radi održavanja razine majke u serumu od približno 4–8 mg u 100 ml (1, 6–3, 3 mM). Te su koncentracije blizu najnižih koncentracija koje su u našim eksperimentima potaknule značajnu toksičnost za neurone.

Naša današnja zapažanja u skladu su s prethodnim in vitro istraživanjima koja pokazuju da depresija spontane aktivnosti neurona hipokampala in vitro proizvodi gubitak apoptotičkih stanica. 28, 29 Iako je model kulture bio koristan i općenito dobro kovertira s in vivo rezultatima, postoji barem jedna razlika s in vivo neonatalnim studijama koje zaslužuje spomen. Gubitak stanica in vitro ovisan o aktivnosti ima karakteristično sporiji vremenski tijek nego što je primijećeno in vivo . Gubitak in vitro traje> 3 dana, dok se markeri apoptoze in vivo primjećuju u roku od nekoliko sati nakon liječenja. 34, 35 Ipak, in vitro model je koristan za identificiranje i proučavanje mehaničkih detalja apoptoze izazvane sredstvima koja suzbijaju živčanu ekscitabilnost in vivo . 28, 29

Endogeni magnezij održava staničnu funkciju, integritet i proizvodnju energije, a izvanstanični Mg ++ modulira različite kanale i receptore iona, uključujući NMDA receptore, 10 Ca ++ kanala, 36 GABA A receptora 17 i naponske kanale. 11, 12, 32 Pokazalo se da manipulacije svake od tih vrsta kanala utječu na preživljavanje stanica tijekom razvojne sinaptogeneze, kada mnogi neuroni prolaze fiziološku staničnu smrt. 31, 34 Zajednička tema apoptotskih neuroaktivnih sredstava, uključujući Mg ++, je da je aktivnost neurona snažno potisnuta. U osjetljivim, suzbijanje aktivnosti neurona aktivira apoptotski „okidač“. Ovim uobičajenim okidačem može se smanjiti unutarćelijski Ca ++, 30, ali na zadaću vrijednost okidača mogu utjecati čimbenici okoliša. 29

Unatoč raznolikosti ciljeva osjetljivih na Mg ++ koji bi mogli biti relevantni za učinke na preživljavanje, naši rezultati sugeriraju da su promijenjeni akcijski potencijal pokretanja i stvaranje natrijevih kanala vjerojatno ključni za objašnjenje učinaka preživljavanja. Naše usporedbe sa selektivnim blokatorom natrijevih kanala TTX su osnova za ovaj zaključak. Prethodno smo pokazali da je TTX prigušivanje neurona dovoljno da izazove apoptozu tijekom sličnog vremenskog tijeka kao u Mg ++ . Kako Mg ++ podiže prag akcijskog potencijala na vrijednosti slične onima postignutim TTX-om, a obje imaju slične učinke na mrežnu ekscitabilnost u snimcima MEA, razumno je zaključiti da učinci na grickanje Na + kanala i prag akcijskog potencijala prvenstveno objašnjavaju Mg ++ učinci na ekscitabilnost i preživljavanje, s malo potrebe za pozivanjem na mehanička objašnjenja koja uključuju druge kanale (npr. NMDA receptore ili Ca2 + kanale). Ako ćelije rijetko dosegnu prag akcijskog potencijala zbog promijenjenog kanala na izlazu napona, Ca ++ kanali sa naponom neće se otvoriti. Slično tome, izravni učinak Mg ++ na NMDA receptore bit će uglavnom irelevantan u nedostatku akcijskih potencijala za pokretanje oslobađanja glutamata. Međutim, doprinosi ovih drugih inhibicijskih mehanizama ne mogu se u potpunosti isključiti.

Učinci na prag akcijskog potencijala i ekscitabilnost mreže gotovo sigurno proizlaze iz klasično opisanih učinaka dvovalentnih kationa na kanalima sa naponom. Efekti površinskog naboja pomoću Mg ++ i ostalih dvovalentnih kationa opisani su u brojnim postavkama. 11, 12, 13, 14, 32 Ovaj učinak vjerojatno nastaje vezanjem izvanstaničnih dvovalentnih kationa na fiksne negativne naboje na staničnoj membrani. 32 Ovo učinkovito smanjuje površinski potencijal i stvara lokalni hiperpolarizacijski utjecaj na naponsko osjetljive domene kanala. Taj efekt probira punjenja detektira se kao depolarizirajući pomak u aktiviranju i inaktivaciji kanala ovisnog o naponu. Klasični rad opisao je utjecaj mnoštva dvovalentnih kationa na ekscitabilnost u čvorovima Ranvieja mijeliniziranih živčanih vlakana žaba; desetostruko povećanje koncentracije iona pomiče prag paljenja do +25 mV, ovisno o ionu. 12 Naime, porast Mg ++ s 1 na 10 mM pomiče aktiviranje Na + kanala za otprilike +15 mV, podudarajući se s približno +13 mV pragom praga akcijskog potencijala primijećenim u našim eksperimentima.

Također smo identificirali potencijalni pobudni učinak Mg ++ na počivanje V m . Povećanje koncentracije Mg ++ s 1 na 10 mM depolariziralo je V m mirovanje za 5, 2 mV. Koliko znamo, takav učinak Mg ++ nije ranije zabilježen. Kandidatni mehanizmi temeljeni na reverznom potencijalu Mg ++ osjetljive struje uključuju blok različitih 'curenja' kanala kao što su unutarnji ispravljajući K + kanali i 2-pora domena K + kanala, poput Kir2.1 i TREK-1 K + kanala, respektivno. 18, 19 Iako bi depolarizacija izazvana Mg ++, po nominalnoj vrijednosti mogla povećati staničnu ekscitabilnost, gore opisani efekti probira površinskog naboja spriječili bi značajne funkcionalne učinke depolarizacije na ekscitabilnost. Depolarizacija u mirovanju bila je manja (+5, 2 mV) od očekivanog pomaka u mlazu i inaktivacije u ustaljenom stanju (+13 mV) od utjecaja površinskog naboja (vidi gore). Utjecaj Mg ++ na odmorište V m zaslužuje daljnje istraživanje i mogao bi pružiti daljnje razumijevanje doprinosa 'curenja' kanala u staničnoj mirovanju V m .

Upotreba Mg ++ u kliničkoj porodici i neonatologiji kao antikonvulziv, tokolitički i neuroprotektant je raširena, ali studije koje podupiru njegovu kliničku učinkovitost su kontroverzne i nijedna studija nije ispitala ili utvrdila sigurnost njegovih učinaka na normalne mozgove u razvoju. Uzeti zajedno s nedavnom in vivo studijom, 25 naših rezultata sugerira da razvoj neurona i neuronskih mreža zahtijeva odgovarajuću razinu aktivnog unosa za pravilan razvoj i preživljavanje. Klinički relevantne koncentracije Mg ++ ubijaju neurone u ovoj fazi prigušivanjem ekscitabilnosti i povećanjem apoptoze. U našim prethodnim in vivo studijama opazili smo smrt apoptotske stanice inducirane Mg ++, a to su podržali i sadašnji in vitro eksperimenti. Naši eksperimenti pomažu u povezivanju Mg ++ s drugim neuro-depresivnim agensima koji potiču apoptozu u mladim neuronima. Potrebne su daljnje studije za procjenu dugoročnog učinka prenatalne izloženosti Mg ++ na pravilan neurokognitivni i intelektualni razvoj.

Reference

  1. 1.

    Martin Jr JN, Thigpen BD, Moore RC, Rose CH, Cushman J, May W. Moždani udar i jaka preeklampsija i eklampsija: pomak paradigme usredotočen na sistolički krvni tlak. Obstet Gynecol 2005; 105 : 246–254.

      • PubMed
      • Članak
      • Google znalca
  2. 2.

    Crowther CA, Hiller JE, Doyle LW. Magnezijev sulfat za sprečavanje prijevremenog porođaja kod ugroženih prijevremenog porođaja. Cochrane baza podataka Syst Rev 2002 Art. br .: CD001060.

      • Google znalca
  3. 3.

    Lyell DJ, Pullen K, Campbell L, Ching S, Druzin ML, Chitkara U i sur . Magnezijev sulfat u usporedbi s nifedipinom za akutnu tokolizu prijevremenog porođaja: randomizirano kontrolirano ispitivanje. Obstet Gynecol 2007; 110 : 61–67.

      • PubMed
      • Članak
      • Google znalca
  4. 4.

    Mittendorf R, Pryde PG. Pregled uloge magnezijevog sulfata u prijevremenom porođaju. BJOG 2005; 112 (Supl. 1): 84–88.

      • Google znalca
  5. 5.

    Grimes DA, Nanda K. Tokoliza magnezijevog sulfata: vrijeme za prekid. Obstet Gynecol 2006; 108 : 986–989.

      • CAS
      • PubMed
      • Članak
      • Google znalca
  6. 6.

    Ichiba H, Yokoi T, Tamai H, Ueda T, Kim TJ, Yamano T. Neurorazvojni ishod dojenčadi s rođenom asfiksijom liječenih magnezijevim sulfatom. Pediatr Int 2006; 48 : 70–75.

      • PubMed
      • Članak
      • Google znalca
  7. 7.

    Perlman JM. Intervencijske strategije za neonatalnu hipoksično-ishemijsku ozljedu mozga. Clin Ther 2006; 28 : 1353–1365.

      • CAS
      • PubMed
      • Članak
      • Google znalca
  8. 8.

    Doyle LW, Crowther CA, Middleton P, Marret S. Antenatalni magnezijev sulfat i neurološki ishod u nedonoščadi: sustavni pregled. Obstet Gynecol 2009; 113 : 1327–1333.

      • PubMed
      • Google znalca
  9. 9.

    Pryde PG, Mittendorf R. Suvremena primjena akušerskog magnezijevog sulfata: indikacija, kontraindikacija i relevantnost doze. Obstet Gynecol 2009; 114 : 669–673.

      • PubMed
      • Članak
      • Google znalca
  10. 10.

    Mayer ML, Westbrook GL Prodiranje i blokiranje recepcijskih kanala N-metil-D-asparaginske kiseline dvovalentnim kationima u mišjim kulturiranim centralnim neuronima. J Physiol 1987; 394 : 501–527.

      • CAS
      • PubMed
      • Google znalca
  11. 11.

    Frankenhaeuser B, Meves H. Učinak magnezija i kalcija na mielinizirana živčana vlakna žabe. J Physiol 1958; 142 : 360–365.

      • Google znalca
  12. 12.

    Hille B, Woodhull AM, Shapiro BI. Negativni površinski naboj u blizini natrijevih kanala živaca: dvovalentni ioni, monovalentni ioni i pH. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci 1975; 270 : 301–318.

      • Google znalca
  13. 13.

    Hahin R, Campbell DT. Jednostavni pomaci u ovisnosti o naponu osipanja natrijevih kanala uzrokovani dvovalentnim kationima. J Gen Physiol 1983; 82 : 785–805.

      • Google znalca
  14. 14.

    Frankenhaeuser B, Hodgkin AL. Djelovanje kalcija na električna svojstva aksona lignje. J Physiol 1957; 137 : 218–244.

      • CAS
      • PubMed
      • Članak
      • Google znalca
  15. 15.

    Dodge Jr FA, Rahamimoff R. Kooperativno djelovanje kalcijevih iona u oslobađanju predajnika na neuromuskularnom spajanju. J Physiol 1967; 193 : 419–432.

      • CAS
      • PubMed
      • Google znalca
  16. 16.

    Fomin VP, Gibbs SG, Vanam R, Morimiya A, Hurd WW. Učinak magnezijevog sulfata na kontraktilnu silu i unutarćelijsku koncentraciju kalcija u miometriju trudnica. Am J Obstet Gynecol 2006; 194 : 1384–1390.

      • Google znalca
  17. 17.

    Moykkynen T, Uusi-Oukari M, Heikkila J, Lovinger DM, Luddens H, Korpi ER . Magnesium potentiation of the function of native and recombinant GABA A receptors. Neuroreport 2001; 12 : 2175–2179.

      • Google znalca
  18. 18.

    Maingret F, Honore E, Lazdunski M, Patel AJ . Molecular basis of the voltage-dependent gating of TREK-1, a mechano-sensitive K + channel. Biochem Biophys Res Commun 2002; 292 : 339–346.

      • CAS
      • PubMed
      • Članak
      • Google znalca
  19. 19.

    Murata Y, Fujiwara Y, Kubo Y . Identification of a site involved in the block by extracellular Mg 2+ and Ba 2+ as well as permeation of K + in the Kir2.1 K + channel. J Physiol 2002; 544 (Pt 3): 665–677.

      • CAS
      • PubMed
      • Članak
      • Google znalca
  20. 20.

    Slutsky I, Abumaria N, Wu LJ, Huang C, Zhang L, Li B et al . Enhancement of learning and memory by elevating brain magnesium. Neuron 2010; 65 : 165–177.

      • CAS
      • PubMed
      • Članak
      • Google znalca
  21. 21.

    Ikonomidou C, Bosch F, Miksa M, Bittigau P, Vockler J, Dikranian K et al . Blockade of NMDA receptors and apoptotic neurodegeneration in the developing brain. Znanost 1999 .; 283 : 70–74.

      • CAS
      • PubMed
      • Članak
      • Google znalca
  22. 22.

    Jevtovic-Todorovic V, Hartman RE, Izumi Y, Benshoff ND, Dikranian K, Zorumski CF et al . Early exposure to common anesthetic agents causes widespread neurodegeneration in the developing rat brain and persistent learning deficits. J Neurosci 2003; 23 : 876–882.

      • CAS
      • PubMed
      • Google znalca
  23. 23.

    Turner CP, Miller R, Smith C, Brown L, Blackstone K, Dunham SR et al . Widespread neonatal brain damage following calcium channel blockade. Dev Neurosci 2007; 29 : 213–231.

      • CAS
      • PubMed
      • Članak
      • Google znalca
  24. 24.

    Dobbing J, Sands J . Comparative aspects of the brain growth spurt. Early Hum Dev 1979; 3 : 79–83.

      • CAS
      • PubMed
      • Članak
      • Google znalca
  25. 25.

    Dribben WH, Creeley CE, Wang HH, Smith DJ, Farber NB, Olney JW . High dose magnesium sulfate exposure induces apoptotic cell death in the developing neonatal mouse brain. Neonatology 2009; 96 : 23–32.

      • Google znalca
  26. 26.

    Mittendorf R, Covert R, Elin R, Pryde PG, Khoshnood B, Lee K . Umbilical cord serum ionized magnesium level and total pediatric mortality. Obstet Gynecol 2001; 98 : 75–78.

      • CAS
      • PubMed
      • Članak
      • Google znalca
  27. 27.

    Young C, Tenkova T, Dikranian K, Olney JW . Excitotoxic versus apoptotic mechanisms of neuronal cell death in perinatal hypoxia/ischemia. Curr Mol Med 2004; 4 : 77–85.

      • CAS
      • PubMed
      • Članak
      • Google znalca
  28. 28.

    Moulder KL, Fu T, Melbostad H, Cormier RJ, Isenberg KE, Zorumski CF et al . Ethanol-induced death of postnatal hippocampal neurons. Neurobiol Dis 2002; 10 : 396–409.

      • CAS
      • PubMed
      • Članak
      • Google znalca
  29. 29.

    Shute AA, Cormier RJ, Moulder KL, Benz A, Isenberg KE, Zorumski CF et al . Astrocytes exert a pro-apoptotic effect on neurons in postnatal hippocampal cultures. Neuroscience 2005; 131 : 349–358.

      • Google znalca
  30. 30.

    Franklin JL, Johnson Jr EM . Suppression of programmed neuronal death by sustained elevation of cytoplasmic calcium. Trends Neurosci 1992; 15 : 501–508.

      • Google znalca
  31. 31.

    Heck N, Golbs A, Riedemann T, Sun JJ, Lessmann V, Luhmann HJ . Activity-dependent regulation of neuronal apoptosis in neonatal mouse cerebral cortex. Cereb Cortex 2008; 18 : 1335–1349.

      • PubMed
      • Članak
      • Google znalca
  32. 32.

    Hille B . Ion Channels of Excitable Membranes . 3rd edn Sinauer: Sunderland, MA, 2001. xviii, 814 p.pp.

      • Google znalca
  33. 33.

    Meeks JP, Mennerick S . Action potential initiation and propagation in CA3 pyramidal axons. J Neurophysiol 2007; 97 : 3460–3472.

      • PubMed
      • Članak
      • Google znalca
  34. 34.

    Olney JW, Wozniak DF, Jevtovic-Todorovic V, Farber NB, Bittigau P, Ikonomidou C . Drug-induced apoptotic neurodegeneration in the developing brain. Brain Pathol 2002; 12 : 488–498.

      • CAS
      • PubMed
      • Članak
      • Google znalca
  35. 35.

    Xu W, Cormier R, Fu T, Covey DF, Isenberg KE, Zorumski CF et al . Slow death of postnatal hippocampal neurons by GABA A receptor overactivation. J Neurosci 2000; 20 : 3147–3156.

      • CAS
      • PubMed
      • Google znalca
  36. 36.

    Hagiwara S, Takahashi K . Surface density of calcium ions and calcium spikes in the barnacle muscle fiber membrane. J Gen Physiol 1967; 50 : 583–601.

      • CAS
      • PubMed
      • Članak
      • Google znalca
  37. 37.

    Mennerick S, Que J, Benz A, Zorumski CF . Passive and synaptic properties of hippocampal neurons grown in microcultures and in mass cultures. J Neurophysiol 1995; 73 : 320–332.

      • CAS
      • PubMed
      • Google znalca
  38. 38.

    Zorumski CF, Thio LL, Clark GD, Clifford DB . Blockade of desensitization augments quisqualate excitotoxicity in hippocampal neurons. Neuron 1990; 5 : 61–66.

      • CAS
      • PubMed
      • Članak
      • Google znalca
  39. 39.

    Potter SM, DeMarse TB . A new approach to neural cell culture for long-term studies. J Neurosci Methods 2001; 110 : 17–24.

      • CAS
      • PubMed
      • Članak
      • Google znalca
  40. 40.

    Wagenaar DA, Pine J, Potter SM . An extremely rich repertoire of bursting patterns during the development of cortical cultures. BMC Neurosci 2006; 7 : 11.

      • PubMed
      • Članak
      • Google znalca

Preuzmite reference

Zahvale

We thank A Taylor and A Benz for technical help and laboratory members for advice and discussion. This work was supported by US National Institutes of Health grants 5K08NS048113–04 (WHD), NS44041 (LNE), NS54174 and MH78823 (SM), a grant from the Epilepsy Foundation of America (LNE), and an NIH Neuroscience Blueprint Core Grant P30NS057105 to Washington University.

Glosar

AMPA

α -amino-3-hydroxyl-5-methyl-4-isoxazole-propionate

GABA

γ -aminobutyric acid

ANOVA

analysis of variance

ASDR

array-wide spike detection rate

V m

membrane potential

MEA

multielectrode array

NMDA

N -methyl- D -aspartate

∣ TTX

tetrodotoxin

Author Contributions: WHD, LNE and SM all participated in the conception and design of the experiments, in collection, analysis and interpretation of data and in writing and revising the paper.