Mangana superoksid dismutaza promiče otpornost na anoikis i metastaze tumora | stanična smrt i bolest

Mangana superoksid dismutaza promiče otpornost na anoikis i metastaze tumora | stanična smrt i bolest

Anonim

teme

  • apoptoza
  • Rak dojke
  • Metabolizam raka
  • Metastaza

Sažetak

Normalnim stanicama za preživljavanje je potrebna adhezija na izvanćelijski matriks. Odvajanje stanica uzrokuje drastično povećanje vrsta reaktivnih kisika (ROS) koji promiču anoikis. U ovom istraživanju opazili smo da nakon odvajanja od matriksa stanice epitela ljudskog mlijeka snažno reguliraju mangan superoksid dismutazu (MnSOD ili SOD2), glavni mitohondrijski antioksidativni enzim koji detoksificira ROS dismutacijom superoksida. Indukcija MnSOD odvajanjem stanica ovisi o faktoru transkripcije NF κ B. Odvajanje ćelija epitela mliječnih proizvoda snažno povećava razinu mitohondrijalnog superoksida, koji se dodatno povisuje iscrpljivanjem MnSOD-a u suspendiranim stanicama. Posljedično, stanice osiromašene od MnSOD preosjetljive su na odvajanje matriksa i pokazuju povećan anoikis. Ovi rezultati sugeriraju da odvajanje uzrokovano odvajanjem MnSOD suzbija nakupljanje mitohondrijalnog superoksida i daje otpornost na anoikis. Uzeto s našim prethodnim nalazom da odvojene stanice izbjegavaju prekomjernu produkciju ROS-a slabljenjem oksidacijskog metabolizma glukoze, zaključujemo da stanice epitela mlijeka koordiniraju svoje reakcije na odvajanje povećavanjem MnSOD i smanjenjem stvaranja ROS-a iz oksidacije mitohondrijalne glukoze, ublažavajući tako anoikis. Anoikis je prepreka metastazama tumora. Doista, ekspresija MnSOD je povišena u metastazama raka dojke kod ljudi u usporedbi s primarnim tumorima. Ekspresija MnSOD korelira s histološkim ocjenama tumora u karcinomu čovjeka i pridonosi otpornosti stanica raka na anoikis. Naša studija sugerira da inhibicija detoksikacije ROS-om zajedno s stimulacijom metabolizma oksidacije glukoze može biti učinkovita strategija za poboljšanje anoikisa i blokiranje metastaza.

Glavni

U normalnim tkivima, adhezija na komponente izvanćelijskog matriksa (ECM) aktivira unutarstanični signalni put za preživljavanje. Prekid ovog kontakta sa staničnom matricom inducira vrstu apoptoze nazvanu anoikis. 1 Mitohondriji imaju središnju ulogu u indukciji anoikisa. Mitohondrijski inter-membranski prostor (IMS) sadrži niz ključnih pro-apoptotičkih čimbenika, poput citohroma c, koji pokreću apoptozu ako se pusti u citosol. Odvajanje stanica uzrokuje ugulaciju i translokaciju nekoliko proteina samo za BH3 (npr. BMF i BIM) u mitohondrije, gdje aktiviraju pro-apoptotične članove obitelji BCL-2 BAK i BAX kako bi stimulirali propadanje mitohondrija vanjske membrane (MOMP) oslobađanje IMS apoptogenih čimbenika. Osim toga, stanice odvojene od matriksa značajno povećavaju količinu reaktivnih kisikovih vrsta (ROS) u mitohondrijama. 3 Iako niska razina ROS-a aktivira različite signalne putove, pretjerani ROS može nepovratno oštetiti stanične makromolekule i uzrokovati staničnu smrt (uključujući apoptozu). ROS može djelomično aktivirati svojstveni mitohondrijski apoptotski put dijelom peroksidacijom lipida. Citokrom c normalno se zadržava na unutarnjoj membrani mitohondrija zbog njegove povezanosti s kardiolipinom, anionskim fosfolipidom specifičnim za mitohondrije. ROS peroksidat kardiolipin, što rezultira disocijacijom i oslobađanjem citokroma c, 4 koji tada može slobodno difundirati kroz poroznu vanjsku membranu mitohondrija (kao posljedica MOMP). Zbog toga, odvajanje matrice dovodi do učinkovitog oslobađanja pro-apoptotičkih faktora iz mitohondrijskog IMS-a u citosolu i, posljedično, aktiviranja kaskade kaspaze i apoptoze.

U skladu s pro-anoikis aktivnošću ROS-a, tretman raznim antioksidansima suzbija anoikis, 3, 5 podržava rast / preživljavanje neovisnih o usidrenju u mekom agaru i usporava luminalni klirens tijekom akinarne morfogeneze in vitro . 6 Međutim, uloga ROS-a u održivosti stanica bila je kontroverzna. Objavljeno je da kada se suspendirane stanice priklone ECM-u, proces adhezije inducira prolazni prasak ROS-a, koji zauzvrat aktivira signalne putove koji inhibiraju apoptozu. 7 Stoga se sugeriralo da ROS umjesto toga može pružiti aktivnost preživljavanja i otpornost na anoikise. 7 Iako se odstupanje vjerojatno pripisuje različitim staničnim kontekstima korištenim u ovim studijama (npr. Odvojenost nasuprot vezanosti), stanični učinak oksidativnog stresa ovisi o razini ROS-a i sposobnosti stanice da reagira i može se nositi s ROS-om.

Mitohondriji su glavni izvor unutarćelijskog ROS-a. U fiziološkim uvjetima, ROS se neprestano stvara kao nusproizvodi aerobnog metabolizma u mitohondrijama. 8 Tijekom mitohondrijskog disanja, ciklus trikarboksilne kiseline (TCA) stvara redukcijske ekvivalente koji su izvor elektrona. Prijenos elektrona između mitohondrijskih kompleksa za transport elektrona uspostavlja gradijent protona za sintezu ATP-a. Međutim, elektroni mogu pobjeći iz lanca prijenosa elektrona i reagirati s molekulom kisika kako bi formirali superoksidni anion, prvi član u mnoštvu ROS-a. Otprilike 1–5% ukupnog kisika potrošenog tijekom normalnog disanja pretvara se u superoksidne radikale. Superoksid je vrlo reaktivan i toksičan. Superoksid također može reagirati s dušikovim oksidom, drugim slobodnim radikalom koji nastaje mitohondrijskom dušikovom oksid sintazom, čime se stvara visoko reaktivni peroksinitrit. Ovi ROS mogu nanijeti ozbiljna oštećenja mitohondrijskim lipidima, proteinima i nukleinskim kiselinama. Kako bi suzbile štetni učinak ROS-a, stanice su opremljene antioksidacijskim sustavima za detoksikaciju ROS-a i sprječavanje nakupljanja u visokim koncentracijama. 9 Mangan superoksid dismutaza smještena u mitohondrijama (MnSOD ili SOD2) učinkovito pretvara superoksid u manje reaktivni vodikov peroksid koji se može razgraditi dalje u vodu i dioksigen pomoću drugih enzimskih i neenzimskih antioksidansa. 9 Općenito, ravnoteža između proizvodnje i eliminacije ROS dovodi do homeostaze. Budući da superoksid prvenstveno proizlazi iz mitohondrija, mitohondrijski MnSOD ima ključnu ulogu u detoksikaciji ROS-a.

Nedavno smo otkrili da, nakon odvajanja matriksa, netransformisane stanice epitela ljudske mliječne žlijezde snažno reguliraju piruvat dehidrogenazu (PDH) kinazu 4 (PDK4) da inhibiraju PDH i smanjuju protok glikolitičkog ugljika u ciklusu TCA. Nadalje, pokazali smo da ovaj metabolički odgovor smanjuje stvaranje ROS-a povezano s mitohondrijskim disanjem. Gubitak PDK4 ili prisilna aktivacija PDH povećava potrošnju kisika i proizvodnju ROS u suspendiranim stanicama, što dovodi do povećanja anoikisa. 5 Stoga odvojene stanice reprogramiraju metabolizam glukoze kako bi izbjegle prekomjernu proizvodnju ROS-a i tako ublažile anoikis. Nalazi ilustriraju metaboličku modulaciju anoikisa i pojačavaju vitalnu ulogu oksidativnog stresa u anoikisu.

Budući da je MnSOD glavni antioksidativni enzim koji detoksificira mitohondrijski ROS, ovdje smo ispitali njegovu potencijalnu uključenost u anoikis. Otkrili smo da su odvojene od matriksa, epitelne stanice ljudskog mlijeka snažno reguliraju MnSOD putem faktora transkripcije NF κ B kako bi se smanjio oksidativni stres i stekli otpornost na anoikis. Iscrpljivanje MnSOD dovodi do povećanog nakupljanja mitohondrijalnog superoksida u suspendiranim stanicama epitela mlijeka i pojačava anoikis. Stoga, kao odgovor na odvajanje matriksa, stanice aktiviraju dva paralelna programa: (1) prigušivanje oksidativnog metabolizma glukoze radi smanjenja proizvodnje mitohondrija ROS-a 5 i (2) povećanje antioksidacijskog kapaciteta za detoksikaciju ROS-a, što im omogućava da smanje oksidativni stres i produže opstanak u suspenziji. Povišena ekspresija MnSOD povezana je s naprednim stupnjevima tumora i metastazama karcinoma dojke, podupirući njegovu ulogu u otpornosti na anoikis i progresiju tumora.

Rezultati

Indukcija MnSOD odvajanjem matrice u stanicama epitela mliječnih ćelija

S obzirom na važnost mitohondrijalnog ROS-a u anoikisu i MnSOD u detoksikaciji ROS-om, odlučili smo ispitati potencijalni značaj MnSOD-a u stanicama odvojenim od matriksa. Usporedili smo ekspresiju MnSOD u stanicama pod uvjetima priključene i suspenzijske kulture. Obe primarne stanice epitela mliječnih mlijeka (HMEC) i MCF10A stanična linija epitela mliječnih mlijeka izrazito su regulirane razine MnSOD RNA nakon odvajanja (Slika 1a). Indukcija MnSOD bila je očita 12 i 6 h nakon suspenzije HMECs i MCF10A stanica (Slike 1b i c). Na temelju ovog vremenskog tijeka, čini se da se MnSOD indukuje brže od PDK4 nakon odvajanja stanica. 5 Ova opažanja pokazuju da stanice epitela mliječnih mlijeka povećavaju ekspresiju enzima antioksidansa MnSOD kao odgovor na odvajanje matriksa.

Image

Odvajanje matrice inducira MnSOD u stanicama epitela mliječnih proizvoda. ( a ) Kvantitativni RT-PCR za MnSOD u stanicama HMEC i MCF10A pod priloženim (Att) i suspendiranim (Susp) uvjetima nakon inkubacije preko noći, ( b ) vremenski tijek indukcije MnSOD mjeren kvantitativnim RT-PCR u HMEC suspendiranim stanicama i ( c ) indukcija MnSOD u MCF10A suspendiranim stanicama u naznačenim vremenskim točkama

Slika pune veličine

NF κ B je neophodan za indukciju MnSOD nakon odvajanja stanica od ECM

Mehanizam aktiviranja MnSOD u suspendiranim stanicama bio je nepoznat. Budući da smo prethodno identificirali receptor vezan za estrogen (ERR γ ) kao glavni aktivirajući faktor snažne indukcije PDK4 odvajanjem matrice, 5 testirali smo da li indukcija MnSOD također ovisi o ERR γ . U stanicama MCF10A orijentiranih ERR- y , MnSOD je još uvijek snažno induciran nakon odvajanja stanica (dopunska slika S1A), što je u suprotnosti s PDK4 (ref. 5). Zapravo, indukcija MnSOD bila je još snažnija u stanicama oštećenim ERR γ od onih u kontrolnim stanicama (dopunska slika S1A). Slična indukcija MnSOD primijećena je u stanicama iscrpljenim PDK4 (nije prikazano), što sugerira da indukcija MnSOD odvajanjem ECM ne ovisi o aktiviranju osi ERR γ -PDK4.

Poznato je da transkripciju MnSOD izravno aktivira nekoliko faktora transkripcije u konstitutivnim ili stresnim uvjetima. 11 Faktor transkripcije domene forkhead FOXO3a može se vezati za promotorsko područje MnSOD i aktivirati njegovu ekspresiju. 12 Matrični dodatak aktivira put PI3 kinaze, 1 koji inhibira FOXO3a. Zbog toga će se FOXO3a vjerojatno aktivirati odvajanjem stanica. Međutim, primijetili smo da indukcija MnSOD nakon odvajanja nije oslabljena u stanicama iscrpljenim FOXO3a (dopunska slika S1B), što sugerira da FOXO3a nije potreban za aktivaciju MnSOD u suspendiranim stanicama.

Obitelj NF κ B faktora transkripcije dobro su uspostavljeni transkripcijski regulatori MnSOD. 11 Nadalje, pokazalo se da se NF κ B aktivirao nakon odvajanja stanica: odvajanje matrice uzrokovalo je fosforilaciju i degradaciju I κ B α (negativni regulator NF κ B), te posljedično nuklearnu translokaciju p65 (također poznat kao RelA) i kasnije transkripcijska aktivacija nizvodnih ciljnih gena. 13 Ispitali smo da li je NF κ B odgovoran za indukciju MnSOD u odvojenim stanicama. MCF10A stanice transducirane su lentivirusnom RNA kratkom dlakom (shRNA) ciljanom na p65. Kvantitativni RT-PCR potvrdio je djelotvorno oborenje p65 u prikačenim i suspendiranim stanicama (Slika 2a), iako je neočekivano, p65 je također reguliran kada su MCF10A stanice uzgojene u suspenziji (Slika 2a). Zatim smo ispitali učinak rušenja p65 na indukciju MnSOD odvajanjem matrice. U adherentnim stanicama, iscrpljivanje p65 nije utjecalo na bazalnu razinu MnSOD RNA (slika 2b), što implicira da NF κ B vjerojatno nije aktiviran u stanicama MCF10A pod priloženim stanjem. Kad su se stanice odvojile, indukcija MnSOD u stanicama iscrpljenim p65 značajno je oslabljena u usporedbi s kontrolnim stanicama (Slika 2b). Ovaj rezultat sugerira da je NF κ B, koji se aktivira odvajanjem stanica, primarni aktivator koji pokreće MnSOD ekspresiju u suspendiranim stanicama.

Image

Iscrpljivanje NF κ B podriva indukciju MnSOD u suspendiranim MCF10A stanicama. MCF10A stanice transducirane su s lentivirusnim praznim vektorom (EV) ili shRNA ciljajući p65 (shp65) i uzgajane u priloženim (Att) i suspendovanim (Susp) uvjetima 24 h. ( a ) Kvantitativno RT-PCR mjerenje za p65 u MCF10A ćelijama u uvjetima priključenih (Att) i suspendiranih (Susp) i ( b ) kvantitativnih RT-PCR mjerenja za MnSOD u MCF10A ćelijama u uvjetima priključenih (Att) i suspendiranih (Susp). Trake pogrešaka predstavljaju standardno odstupanje

Slika pune veličine

Iscrpljivanje MnSOD senzibilizira epitelne stanice mlijeka na anoikis

Neophodno je razjasniti značaj regulacije MnSOD kao odgovor na odvajanje stanica. MnSOD je osiromašen u MCF10A stanicama pomoću retrovirusne šRNA, a destrukcija je potvrđena zapadnim blotiranjem. U skladu s indukcijom MnSOD RNA (Slika 1), razina MnSOD proteina povećavala se kada su se stanice odvojile (Slika 3a). ShRNA je učinkovito smanjila razinu proteina MnSOD u stanicama pod prikačenim i odvojenim uvjetima (Slika 3a).

Image

Iscrpljivanje MnSOD pojačava anoikis u MCF10A stanicama. MCF10A stanice transducirane su retrovirusnim vektorom (EV) ili shRNA ciljajući MnSOD (shMnSOD) i kultivirane u priloženim (Att) i suspendovanim (Susp) uvjetima 24 h. ( a ) Western blotment iscrpljivanja MnSOD u stanicama MCF10A pod priloženim i suspendiranim uvjetima. α-Tubulin korišten je kao kontrola opterećenja. ( b ) Test isključenja pokušaja plave boje u stanicama kontrole i MCF10A-osiromašene stanice s MnSOD, pod prikačenim i suspendiranim uvjetima. ( c ) Mjerenje aktivnosti kaspaze 3/7 u kontrolnim i MFSOD-iscrpljenim MCF10A stanicama. ( d ) Analiza razvrstavanja stanica aktiviranim fluorescencijom, bojenja iz Anexin V / 7-AAD u kontrolnim i MCF10A stanicama iscrpljenim od MnSOD. X-osi prikazuju boje u prilogu V, a Y-osi 7-AAD bojenje. ( e ) Statistika ukupnih apoptotičkih stanica na temelju analize Annexin V / 7-AAD. Trake pogrešaka predstavljaju standardna odstupanja

Slika pune veličine

Zatim smo istražili učinak iscrpljivanja MnSOD na anoikis. Ukupna održivost stanica određena je testom isključenja Trypan Blue-a. Iako je iscrpljivanje MnSOD malo utjecalo na staničnu vitalnost u prikačenim stanicama (Slika 3b), uzrokovalo je značajno više stanične smrti kada su stanice bile u uvjetima suspenzije (Slika 3b). Da bismo provjerili je li povećana smrt stanica pripisana apoptozi, izmjerili smo aktivnost kaspaze 3/7 i izveli analizu bojenja fikoeritrina (PE) v Dodatku V / 7-AAD. Pod priloženim uvjetima, i kontrolne stanice i stanice s osiromašenim MnSOD pokazale su nisku aktivnost kaspaze 3/7 (Slika 3c). Kad su se odvojile, kontrolne stanice su pokazale snažnu indukciju aktivnosti kaspaze, a iscrpljivanje MnSOD još je više pojačalo ovu indukciju (Slika 3c). U analizi Annexin V, u usporedbi s kontrolnim stanicama, stanice s osiromašenim MnSOD pokazale su povišenu apoptozu kad su se odvojile od matriksa (Slike 3d i e). Nije primijećeno značajno povećanje apoptoze u MCF10A-iscrpljenim stanicama s iscrpljenim MnSOD-om pod uvjetima adhezivne kulture. Stoga, iscrpljivanje MnSOD pojačava anoikis. Kolektivno, ovi nalazi sugeriraju da indukcija MnSOD kao odgovor na odvajanje matriksa štiti suspendirane stanice od apoptoze.

Iscrpljivanje MnSOD dovodi do nakupljanja mitohondrijskog superoksida u odvojenim stanicama

MnSOD katalizira pretvorbu visoko reaktivnog i nestabilnog aniona superoksida u mitohondrijama u manje reaktivan i stabilniji vodikov peroksid, što je kritični korak u detoksifikaciji ROS-a. Budući da iscrpljivanje MnSOD-a pojačava anoikis, očekujemo da će vjerojatno doći do povećanog nakupljanja mitohondrijskog superoksida. Da bismo potvrdili ovu ideju, mjerili smo razine mitohondrijalnog superoksida pomoću MitoSOX-a.

Kad su se stanice MCF10A odvojile, došlo je do značajnog povećanja količine mitohondrijalnog superoksida (Slike 4a i b). U usporedbi s kontrolnim stanicama, stanice s osiromašenim MnSOD lagano su povećavale razinu superoksida u priloženim uvjetima, ali akumulirale su značajno više superoksida u mitohondrijama kada su se odvojile (Slike 4a i b). Ovo opažanje potvrđuje da MnSOD-om izazvan odvajanjem matrice smanjuje nivo mitohondrijalnog superoksida nastalog postupkom odvajanja.

Image

Iscrpljivanje MnSOD ili p65 eskalira nakupljanje mitohondrijalnog superoksida u suspendiranim stanicama MCF10A. Prazni vektor (EV), shRNA ciljanje MnSOD (shMnSOD) i shRNA ciljanje p65 (shp65) kultiviraju se u priloženim (Att) ili suspendovanim (Susp) uvjetima 24 h, inkubiraju se 5 min M Mitosox crvene boje 30 min na 37 ° C inkubator, tripsiniziran, ispran s PBS-om i ispušten uzorak na protočnoj citometriji uz uzbunu od 488 nm za mjerenje oksidiranog Mitosox crvenog u kanalima FL2 i FL3. Prikupljeno je 10.000 događaja po uzorku. ( a ) Mjerenje mitosox crvene boje u EV, shMnSOD i shp65, i ( b ) statistika srednjeg intenziteta Mitosox crvene boje na temelju analize

Slika pune veličine

U skladu s ključnom ulogom NF κ B u aktiviranju MnSOD nakon odvajanja stanica (Slika 2), stanice s iscrpljenim p65 također su pokazale više razine mitohondrijalnog superoksida od kontrolnih stanica u uvjetima suspenzijske kulture (Slike 4a i b). Zajedno, ovi nalazi sugeriraju da kao odgovor na odvajanje matrice, stanice aktiviraju NF κ B-MnSOD osi kako bi detoksificirale mitohondrijski ROS koji je induciran odvajanjem (Slika 5a). Iscrpljivanje MnSOD ili NF κ B povećava toksični superoksidni slobodni radikal u suspendiranim stanicama i na taj način senzibilizira stanice na anoikis.

Image

Odvajanje matrice aktivira NF κ B- i ERR y- ovisne programe transkripcije da induciraju MnSOD i inhibiraju mitohondrijski oksidativni metabolizam glukoze. ( a ) Shema metaboličkog reprogramiranja aktiviranjem ERR γ -PDK4 i antioksidacijskom modulacijom aktiviranjem puta NF κ B-MnSOD u netransformiranim epitelijskim stanicama mlijeka nakon odvajanja matriksa. ( b ) Gubitak MnSOD i inhibicija PDK zajedno pojačava anoikis u MCF10A stanicama. MCF10A stanice transducirane s praznim vektorom (EV) ili shRNA ciljanom MnSOD (shMnSOD) uzgajaju se sa ili bez 5 mM DCA pod priloženim i suspendiranim uvjetima 24 sata nakon čega slijedi test isključenja Trypan plavim stanjem i mjerenje aktivnosti kaspaze 3/7

Slika pune veličine

Iscrpljivanje MnSOD-a i inhibicija PDK-a kolaborativno pojačavaju anoikis

Pored aktivacije NF κ B-MnSOD nakon odvajanja stanica, nedavno smo primijetili da odvojene stanice epitela mlijeka povećavaju put ERR γ -PDK4 kako bi se poboljšala aktivnost PDH-a i oksidativni metabolizam piruvata dobivenog glikolizom. 5 Ovaj metabolički odgovor omogućuje suspendiranim stanicama da izbjegnu pretjerano stvaranje ROS-a i steknu otpornost na anoikis. 5 Stoga odvojene stanice uspijevaju zadržati razinu ROS smanjujući proizvodnju ROS mitohondrija i istodobno povećavajući antioksidacijsku sposobnost detoksikacije ROS-a (Slika 5a). Ovi odgovori obnavljaju stanice s produženom sposobnošću suspenzije.

Pitali smo može li istodobni prekid ova dva puta dovesti do sinergističkog učinka na anoikis. Dikloroacetat (DCA) je slab inhibitor PDK-a i može skromno prebaciti metabolizam piruvata iz laktata u acetil-CoA aktiviranjem PDH. 14, 15 Ova radnja dovodi do povećane potrošnje kisika i praćenja stvaranja ROS-a. Samo DCA liječenje imalo je ograničen utjecaj na anoikis u stanicama MCF10A, međutim, snažno je stimuliralo anoikis u stanicama iscrpljenim od MnSOD (Slika 5b). Stoga ovi rezultati sugeriraju da pojačani oksidativni metabolizam glukoze i smanjena antioksidacijska sposobnost zajedno ubrzavaju anoikis u stanicama epitela mliječne žlijezde.

MnSOD u progresiji ljudskog karcinoma

Otpornost na anoikis preduvjet je metastaziranja. S obzirom na anti-anoikis aktivnost MnSOD-a, imunohistokemijom smo ispitali njegovu ekspresiju u uzorcima raka dojke kod čovjeka kako bismo istražili njegovu potencijalnu implikaciju na progresiju tumora. Primijetili smo da izolirane, migrirajuće stanice raka na invazivnom prednjem dijelu primarnog tumora pokazuju veću ekspresiju MnSOD od one unutar tumorske mase (slika 6a). Zatim smo uspoređivali razinu MnSOD u primarnim tumorima i podudarnim metastazama na limfnim čvorovima. I mikrometastaza i utvrđene makrometastatske stanice tumora pokazale su povišene razine MnSOD u usporedbi s njihovim odgovarajućim primarnim tumorima (Slike 6b i c, respektivno). Nadalje, metastaze su pokazale veći postotak pozitivnosti na MnSOD u odnosu na primarne tumore dojke (dopunska slika S2).

Image

Izražavanje MnSOD u karcinomu dojke kod ljudi. ( a ) Migracijske stanice karcinoma (označene strelicama) pokazuju jače obojenje MnSOD od tumorskih stanica u primarnoj tumorskoj masi (gornji lijevi ugao). ( b ) Mali nakupina tumorskih stanica (mikrometastaza) u limfnom čvoru (desno) pokazuje veću ekspresiju MnSOD u odnosu na stanice u primarnom tumoru koji se podudara (lijevo). ( c ) Tumorske stanice u prikazanom makrometastazi limfnih čvorova (desno) povećavaju ekspresiju MnSOD u usporedbi s onima u podudarnom primarnom tumoru (lijevo)

Slika pune veličine

Nadalje smo analizirali mikroračunske setove gena za ekspresiju koji obično sadrže mnogo više uzoraka raka. Skup podataka GSE3494 obuhvatio je primarne uzorke tumora dojke iz skupine 315 žena s kliničko-patološkim karakteristikama, poput stupnja tumora, p53 mutacije i statusa receptora nuklearnog hormona. 16 Otkrili smo da je visoka ekspresija MnSOD očigledno u korelaciji s naprednom vrstom tumora, a preklapala se s drugim lošim prognostičkim markerima kao što su mutacija p53, kao i s negativnim statusom receptora za estrogen (ER) i receptora za progesteron (PgR) (Slika 7a). Da bismo utvrdili može li MnSOD imati prognostičku vrijednost, uspoređivali smo ekspresiju MnSOD i preživljavanje pacijenta univarijantnom analizom. Pacijenti grupirani u tertil visoke ekspresije imali su značajno kraći opstanak specifičan za bolest od skupine s niskom ekspresijom (Slika 7b). Ovi rezultati sugeriraju da je MnSOD povezan s progresijom tumora i prediktor je loše prognoze.

Image

Izraz i funkcija MnSOD u karcinomu čovjeka. ( a ) Povišena ekspresija MnSOD (visoka: crvena; niska: zelena) povezana je s visokim Elston-Ellisovim stupnjevima tumora (visoka: crvena; srednja: ružičasta; niska: plava), negativnim statusom receptora za progesteron (PgR) i estrogeni receptor (ER) (negativno: žuto) i p53 mutacija (mutacija: žuta). Podaci mikrorasta GSE3494 preuzeti su iz omnibusa Gene Expression Omnibus. Razine MnSOD RNA detektirane su s dvije naznačene cDNA sonde. ( b ) MnSOD obrnuto je u korelaciji s 10-godišnjim preživljavanjem bolesnika. ( c ) Iscrpljivanje MnSOD-a u stanicama ljudskog karcinoma MDA-MB-435 vraća njihovu osjetljivost na odvajanje matriksa

Slika pune veličine

Da bismo potvrdili da MnSOD doprinosi otpornosti na anoikis u stanicama karcinoma, iscrpili smo MnSOD u stanicama karcinoma MDA-MB-435 koji izražavaju relativno visoke razine MnSOD. Iscrpljivanje MnSOD nije imalo značajnog utjecaja na stanice u priloženom stanju. Za razliku od kontrolnih stanica na čije životne sposobnosti nije utjecalo odvajanje matriksa, stanice karcinoma osiromašene MnSOD pokazale su povećanu staničnu smrt kad se odvoje (Slika 7c), što sugerira da je otpornost stanica raka na anoikis dijelom pripisana MnSOD. Samo DCA liječenje obnavljalo je neke anoikise u stanicama karcinoma i uzrokovalo veću smrt odvojenih stanica u kombinaciji s iscrpljivanjem MnSOD (Slika 7c).

Rasprava

Normalne stanice ovise o adheziji na odgovarajući ECM za preživljavanje i gubitak ove adhezije inducira anoikis. 1 Odvajanje matrice povećava oksidativni stres koji ima kritičnu ulogu u indukciji anoikisa. 3 U ovom istraživanju pokazujemo da nakon odvajanja stanica, netransformisane stanice epitela ljudskog mlijeka povećavaju MnSOD, ključni enzim za detoksikaciju mitohondrijalnog ROS-a. Indukcija MnSOD odvajanjem omogućava stanicama da uklone mitohondrijski superoksid i opstanu duže u suspenziji. Iscrpljivanje MnSOD senzibilizira stanice na anoikis. Stoga, MnSOD djeluje kao negativni modulator anoikisa. ROS se obično proizvodi u mitohondrijama tijekom aerobnog metabolizma zbog neučinkovitog prijenosa elektrona. Nedavno smo otkrili da odvojene stanice smanjuju oksidativni metabolizam glukoze da bi smanjile nastajanje ROS-a. 5 Uzeto zajedno, kao odgovor na odvajanje matriksa, stanice aktiviraju najmanje dva paralelna programa - povećavajući sposobnost uklanjanja ROS-a i smanjujući oksidativni metabolizam mitohondrija - kako bi se suprotstavili staničnom oksidativnom stresu nastalom odvajanjem i tako odgodili anoikis (Slika 5a).

Otkrili smo da regulacija MnSOD-a u odvojenim stanicama ovisi o NF κ B, koji se aktivira odvajanjem matrice13, iako temeljni mehanizam nije u potpunosti razumljiv. Zna se da NF κ B aktivira ROS. 17 Budući da odvajanje matrice snažno povećava razinu ROS mitohondrija u endotelijskim ćelijama 3 i u epitelnim stanicama mlijeka (slika 4), vjerojatni scenarij je da odvajanje matrice povećava staničnu razinu ROS, što dovodi do aktiviranja NF κ B putanje, što zauzvrat inducira MnSOD izraz za pročišćavanje ROS. Stoga, aktiviranje NF κ B-MnSOD funkcionira kao inducibilni, negativni povratni mehanizam za kontrolu razine ROS u suspendiranim stanicama. NF κ B ima dobro uspostavljenu aktivnost preživljavanja. Inhibicija NF κ B rezultira ubrzanom apoptozom u suspendiranim stanicama. 13 Slično, iscrpljivanje MnSOD pojačava anoikis (Slika 3), sugerirajući da MnSOD može biti osnovni posrednik aktivnosti pro-preživljavanja NF κ B u suspendiranim stanicama.

Otpornost anoikisa je bitna za metastaze tumora. 18 Otpornost na anoikis omogućava adhezijskim stanicama da prežive u stanju suspenzije i na izvanmateričnim mjestima na kojima su komponente matriksa različite od onih koje stanice izvorno dodiruju. Anti-anoikis aktivnost implicira MnSOD u metastatskom napredovanju tumora. Iako ekspresija MnSOD može varirati tijekom razvoja karcinoma (ovisno o vrsti i stadijumu), nakupljanje dokaza pokazuje da razina MnSOD u karcinomu čovjeka često korelira sa stupnjem malignosti. 19 U našoj analizi karcinoma dojke kod ljudi, opažena je povišena ekspresija MnSOD u invazivnim i metastatskim tumorskim stanicama (Slika 6) u usporedbi s primarnim tumorima koji se podudaraju i značajno je povezana s naprednim histološkim ocjenama, negativnim statusom hormonskih receptora, mutiranim p53, kao i loša prognoza (slike 7a i b). Učinak proživljavanja MnSOD može također promovirati otpornost na kemoterapije i zračenje koji djelomično djeluju na citotoksične efekte inducirajući oksidacijska oštećenja. 20, 21

Za rakovana tkiva prijavljeno je da proizvode povećane količine ROS-a. 22 Niske razine ROS-a aktiviraju signalne molekule / putove (uključujući Src, PI3K, NF κ B i HIF) koje mogu povećati proliferaciju stanica i opstanak u blagim oksidacijskim uvjetima i pridonijeti staničnoj transformaciji. 23 Suprotno tome, visoki sadržaj ROS iznad potrebnog za signalizaciju može prouzrokovati velike oksidativne štete koje mogu kulminirati starenjem ili smrću u normalnim stanicama i stanicama raka. Zapravo, uobičajene terapije protiv raka mogu ubiti stanice karcinoma promičući oksidativni stres. 9 Da bi se mogle nositi s visokim oksidativnim stresom, stanice raka razvijaju poboljšani antioksidativni sustav. 9, 24 Promaligni potencijal antioksidanata sve se više prepoznaje. Osim MnSOD-a, u nekim stanicama raka reguliraju se i drugi važni stanični antioksidanti (npr. Tioredoksin, glutaredoksin i peroksireoksin). 25 antioksidacijski program ovisan o transkripcijskom faktoru Nrf2 često se aktivira u karcinomu čovjeka zbog somatskih mutacija i ključan je za tumorigenezu in vivo . 26, 27 Zaista smo ustanovili da poput MnSOD, NRF2 također daje otpornost na anoikise (dopunska slika S3). U skladu s ovim opažanjima, ako se koriste kao dodaci prehrani, antioksidanti djeluju štetno na učestalost raka 28 i štite tumorske stanice od terapije. 29

Pored povećanog antioksidacijskog kapaciteta, većina karcinoma pokazuje izmijenjeni metabolizam glukoze, preferirajući aerobnu glikolizu (poznatu kao Warburgov efekt). 30 Mnoge maligne stanice metaboliziraju glukozu preko piruvata, preferirano laktatom, umjesto CO 2 i H20 preko mitohondrijskog oksidacijskog metabolizma, čak i u prisutnosti kisika. Nedavno smo pokazali da metabolički fenotip Warburg-a omogućava stanicama raka da izbjegnu prekomjerno stvaranje ROS-a povezano s disanjem mitohondrija i steknu prednost u preživljavanju kad se odvoje, pridonoseći rezistenciji na anoikis. 5 Nakon ovih otkrića, kombinirani tretman za farmakološki ciljanu sposobnost stanica detoksikacije 9, 31 i ROS-a i normalizaciju metabolizma glukoze (npr. Aktivacija PDH-a) može maksimalno izazvati oksidativni stres u stanicama karcinoma, što može predstavljati učinkovitu strategiju za smanjenje prag za apoptozu, vraćanje osjetljivosti na anoikis i smanjenje otpornosti na metastaze i terapiju.

Materijali i metode

Stanice i reagensi

MCF10A (stanična linija ljudskog epitela mliječnih mlijeka) i HMECs uzgajani su u Dulbecco 'modificiranom medu orao (DMEM) / F-12 medij (Cellgro, Manassas, VA, SAD) uz 5% konjskog seruma (Sigma, St Louis, MO, SAD) ), 20 ng / ml faktora rasta epiderme (EGF; Sigma), 10 µg / ml inzulina (Sigma), i 0, 5 µg / ml hidrokortizona (Sigma). Sva ispitivanja u netransformisanim stanicama i HMEC-ima provedena su 24 sata nakon inkubacije u priloženim i suspendiranim uvjetima, osim ako nije drugačije navedeno. DCA je kupljen od Sigme.

Izolacija RNA i kvantitativni RT-PCR

Ukupna izolacija RNA iz stanica uzgojenih u uvjetima vezanim i suspendiranim je provedena s TRIzol (Invitrogen, Grand Island, NY, USA), prema protokolu proizvođača. Za kvantitativnu lančanu reakciju reverzne transkripcije i polimeraze (RT-PCR), cDNA je sintetizirana primjenom reverzne transkriptaze moloney virusa mišje leukemije (M-MuLV) sa slučajnim primerima. PCR u stvarnom vremenu izveden je sa SYBR zelenim PCR miksom (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Uvjeti za PCR biciklizam bili su sljedeći: 40 ciklusa od 30 s na 95 ° C, 30 s na 60 ° C i 30 s na 72 ° C. P- Aktin je korišten za normalizaciju. Trake pogrešaka predstavljaju standardna odstupanja ( n = 3). PDK ekspresija u priloženim uvjetima postavljena je kao 1.

Primeri korišteni za MnSOD, p65, ERR y , FOXO3a i p- aktin bili su slijedeći MnSOD, naprijed, 5′-TACGTGAACAACCTGAAC-3 ′ i natrag, 5′-TATCTGGGCTGTAACATCT-3 ′; ERR γ , naprijed, 5′-TCTTGCTAATTCAGACTCCAT-3 ′ i natrag, 5′-GCAGTGTCATCAGCATCTTG-3 ′; FOXO3a, naprijed, 5′-CTGAACTCCCTACGCCAGTC-3 ′ i natrag, 5′-GAGTCCGAAGTGAGCAGGTC-3 ′ (ref. 32); p- aktin, naprijed, 5′-AGAAAATCTGGCACCACACC-3 ′ i natrag, 5′-AGAGG CGTACAGGGATAGCA-3 ′.

Iscrpljivanje MnSOD, p65, ERR γ , FOXO3a i NRF2 retrovirusnom i lentivirusnom transkripcijom šRNA

MnSOD gen je potrošen u MCF10A retrovirusnom transdukcijom koristeći vektor MSCV-LMP (OpenBiosystems, Waltham, MA, SAD). ShRNA ciljani niz za MnSOD bio je 22 mer 5 '-AAGGAACAACAGGCCTTATTCC-3' (ref. 33). Lentivirusne shRNA koje ciljaju ERR y , FOXO3a, NRF2 i p65 dobivene su iz OpenBiosystemsa. ERR γ shRNA ciljni niz bio je 5'-CAGTGGGAGAGTTAGAGT CA-3 '(ref. 34).

Probavno plavo ispitivanje isključenja i kaspaza 3/7 ispitivanja aktivnosti

Stanična vitalnost određena je primjenom 0, 4% Trypan plave boje u hemacometru. Mrtve stanice obojene su plavo. Analiza kaspaze 3/7 provedena je korištenjem kompleta za ispitivanje Caspase 3/7 Glo iz Promega, Madison, WI, USA. Stanice su lizirane u hipertoničnom puferu (HTB; 10 mM HEPES (pH 7, 9), 1, 5 mM MgCl2, 10 mM KCl, dodajući 0, 2 mM fenilmetilsulfonil fluorida (PMSF); 0, 5 M DTT, svježe dodan prije upotrebe). Koncentracija proteina u uzorcima izmjerena je korištenjem BCA kompleta (Pierce, Rockford, IL, SAD). Alikvoti proteina od 75–100 µg učitani su u svaku mikroplatnu od 96 jažica, a test kaspaze 3/7 izvršen je prema uputama proizvođača.

ANEKSIN V / 7-AAD analiza

Aneksin V / 7-AAD izvršen je kao što je prethodno opisano. 5 Ukupno 1 × 105 stanica dvaput je isprano s PBS-om, nakon čega je obojeno s PE -nexinom V i 7-AAD tijekom 15 minuta na sobnoj temperaturi, prema uputama proizvođača. Stanice su analizirane unutar jednog sata koristeći Becton Dickson-ov aparat Facsort (Franklin Lakes, NJ, USA). CellQuest softver (BD Biosciences, San Jose, Kalifornija, SAD) korišten je za analizu podataka kao dvodimenzionalni dijagram skale [FL2H, FL3H].

MitoSOX crvena analiza

Stanice su uzgajane u uvjetima vezanim i suspendiranim kulturama. Nakon 24 sata inkubacije, stanice se 30 minuta inkubiraju s 5 µM mitosox crvene boje na inkubatoru 37 ° C, izbjegavajući izlaganje svjetlu. Kasnije su stanice bile tripsinizirane, isprane s PBS-om i resuspendirane u 1 × 10 7 stanica po ml. Stanice su stavljene u FACS epruvetu u koncentraciji 5 × 106 stanica na 100 μl i razrijeđene do konačnog volumena od 500 μl s FACS vezanjem puferom. Korištenjem 488 nm ekscitacije, uzorci su vođeni protočnom citometrijom za mjerenje oksidiranog Mitosox Reda u kanalima FL 2 i FL 3 . Svaki je uzorak prikupljen pomoću 10 000 događaja.

imunohistokemija

Odjeljci humanog karcinoma dojke fiksirani formalinom parafinirani su, rehidrirani i obojeni primarnim antitijelima (1: 500, anti-MnSOD2 sc-30080; Santa Cruz, Dallas, TX, SAD). Nakon inkubacije sa specifičnim HRP-konjugiranim sekundarnim antitijelom, DAB se aplicira na tkivo. Sekcije su bile suprotstavljene hematoksilinom. Pozitivno obojene ćelije brojene su u tri polja velike snage (× 100 uronjenja ulja) u svaki odjeljak dojke. Nije opaženo bojenje u tkivima inkubiranim PBS-om kao negativna kontrola. Za statistiku je bio zaposlen upareni T- test.

Dodatna informacija

Word dokumenti

  1. 1.

    Dodatna informacija

Glosar

DCA

dikloroacetat

ECM

izvanstanični matriks

ER

estrogeni receptor

ERR

estrogenski receptor

HMECs

stanice epitela čovjeka

IMS

međuprostorni prostor

MnSOD

mangan superoksid dismutaza

MOMP

permeabilizacija vanjske membrane mitohondrija

PDH

piruvat dehidrogenaza

PDK

piruvat dehidrogenazna kinaza

PgR

receptor progesterona

ROS

reaktivne vrste kisika

RT-PCR

reverzna transkripcija-polimerazna lančana reakcija

shRNA

RNA s kratkom kosom

TCA

ciklus trikarboksilne kiseline

Dodatne informacije prate rad na web stranici Cell Cell and Disease (//www.nature.com/cddis)