Metastatske stanice sw620 raka debelog crijeva spremaju se za smrt kad se odvoje i mogu se osjetiti na anoikis pomoću bh3-mimetic abt-737 | stanična smrt i bolest

Metastatske stanice sw620 raka debelog crijeva spremaju se za smrt kad se odvoje i mogu se osjetiti na anoikis pomoću bh3-mimetic abt-737 | stanična smrt i bolest

Anonim

teme

  • apoptoza
  • Terapija raka
  • Rak crijeva
  • Metastaza

Sažetak

Anoikis, apoxija ovisna o Baxu, izazvana odvajanjem od izvanćelijskog matriksa, često se inhibira u stanicama metastatskog karcinoma. Upotrebom nekoliko izogenih staničnih linija karcinoma ljudskog raka debelog crijeva koje su izvedene ili iz primarnog tumora (SW480) ili iz metastaze na limfnim čvorovima (SW620), otkrili smo da su samo stanice SW480 osjetljive na anoikis. Uregulacija bima, ali ne Mcl-1 degradacija, utvrđena je kao kritični faktor pokretanja anoikisa u SW480 stanicama. ERK-posredovana fosforilacija cilja Bim za sveprisutnu upotrebu i proteasomsku razgradnju. MEK inhibitor (PD0325901) uspio je povećati Bim ekspresiju u stanicama SW620 i osjetiti te stanice na anoikis. Dakle, u obje stanične linije anoikis je pod kontrolom proteina iz porodice Bcl-2. Ono što je najzanimljivije, otkriveno je da BH3-mimetički ABT-737 ne samo da povećava nivo apoptoze u suspendiranim stanicama SW480, već i da senzibilizira stanice SW620 na anoikis. Prema tome, otkriveno je da su obje stanične kulture uzgajane u suspenziji pripremljene za smrt, što je određeno detekcijom Bcl-2: Bim i Bcl-xL: Bim kompleksa. Suprotno tome, adhezivne stanice SW480 i SW620 bile su rezistentne na ABT-737. To ukazuje da, bez obzira jesu li podvrgnute anoikisu ili ne, stanice karcinoma debelog crijeva koje su se odvojile od izvanćelijskog matriksa mogu proći kroz prijelazno stanje, gdje su osjetljive na mimetike BH3. To bi spojevima poput Navitoclax ili ABT-199 dalo terapeutski prozor u kojem mogu imati antimetastatski potencijal.

Glavni

Anoikis je posebna apoptotska smrt uslijed gubitka odgovarajuće stanične adhezije, 1, 2, 3 i tumorske stanice koje stječu metastatski potencijal razvile su mehanizme za otpor protiv anoikisa. 4, 5 Unatoč svojoj jedinstvenoj definiciji, anoikis je u osnovi apoptotski proces. U skladu s klasičnom apoptozom, anoikis uključuje ili svojstveni put, zbog poremećaja mitohondrijske homeostaze, ili vanjski put koji pokreću receptori stanične smrti. 3, 6

Proteini iz B-stanične leukemije / limfoma 2 (Bcl-2) ključni su arbitri u opredjeljenosti za apoptozu na mitohondriju. 2, 7 Ova obitelj sastoji se od pro-i anti-apoptotičkih članova, koji svi dijele homologiju slijeda u svojim Bcl-2 homolognim (BH) domenama. Anti-apoptotički proteini, uključujući Bcl-2, Bcl-2 srodni gen, dugu izoformu (Bcl-xL), Bcl-w i leekemiju mijeloidnih stanica 1 (Mcl-1) sadrže BH domene 1–4. Obično se nalaze na vanjskoj mitohondrijskoj membrani gdje djeluju na inhibiciju pro-apoptotičnih Bcl-2 proteina. Pro-apoptotički proteini podijeljeni su u multi-domene efektori Bcl-2-pridruženi x protein (Bax), Bak i Bok (koji sadrže domene BH 1-3) ili proteine ​​koji sadrže samo BH3, a koji sadrže samo domenu BH3. Pro-apoptotički proteini s više domena Bax i Bak promiču permeabilizaciju vanjske membrane mitohondrija. 8 Proteini jedini za BH3, poput agonista smrti domene interakcije Bcl-2 (Bid), Bim i PUMA djeluju ili kao direktni aktivatori pro-apoptotičkih Bax-a i Bax-a, ili kao supresori anti-apoptotičkih proteina. 9, 10 Imenovani su aktivatorima. Druga klasa proteina samo za BH3, kao što su Bad, nazvani senzibilizatori, pokreće apoptozu vezanjem na anti-apoptotičke proteine ​​i izmještanjem proteina koji su aktivni samo na BH3.

ABT-737 je racionalno dizajnirana mala molekula koja se s visokim afinitetom veže na Bcl-2 i Bcl-xL, ali ne i na Mcl-1, i usporava njihovu anti-apoptotičku funkciju. 11, 12 Pokazano je da ABT-737 ima preokret stečene rezistencije paklitaksela u staničnim linijama karcinoma dojke. 13 U kombinaciji s rapamicinom, ABT-737 povećava radio osjetljivost ne-staničnih tumora pluća. 14 Kombinacija ABT-737 i MEK inhibitora dovodi do regresije tumora u različitim modelima tumora miša KRAS mutantnih stanica. 15 U staničnoj liniji humane mijeloidne leukemije i ksenograft modelima ABT-737 sinergira s inhibitorima PI3K / AKT / mTOR putanje. 16 Navitoclax (ABT-263), oralno dostupna varijanta ABT-737, trenutno se ocjenjuje u kliničkim ispitivanjima faze 2. Unatoč obećavajućim preliminarnim podacima, trombocitopenija ograničava sposobnost povećanja koncentracije lijeka. Od tada, pokazalo se da ABT-199, selektivni inhibitor Bcl-2 bez djelovanja na Bcl-xL, postiže anti-tumorsko djelovanje kao jedno sredstvo kod kronične limfocitne leukemije, dok štedi trombocite. 17 BH3-mimetički ABT-737 i srodni spojevi djeluju kao pojedinačni agensi koji izazivaju apoptozu samo u stanicama karcinoma koji su za preživljavanje ovisni o Bcl-2 ili Bcl-xL. 18, 19 Čini se da je ta ovisnost u korelaciji sa sekvestracijom proteina koji su aktivatorni BH3 samo anti-apoptotičkim proteinima i takve ćelije su definirane kao "pripremljene za smrt". BH3 mimetici, zamjenom proteina aktivatora BH3 samo iz Bcl-2 ili Bcl-xL, omogućuju njihovu interakciju s i aktiviranje Baxa ili Baka. U stanicama u kojima Bcl-2 i Bcl-xL nisu primati, često se pokazalo da izloženost kemoterapeutskim agensima inducira ekspresiju proteina koji aktiviraju BH3 samo dovodeći do sinergije između ovih sredstava i mimetika BH3.

Zabilježeno je da kada se uzgajaju u suspenziji, neke stanice osjetljive na anoikis induciraju ekspresiju B3 staničnog limfoma 2 proteina koji djeluje samo na BH3 i posrednika stanične smrti (Bim) 20 ili Bmf. 21 Stoga smo zaključili da se može izvesti paralela s učincima kemoterapeutika i ispitati je li, kad se odvoje, osjetljivost stanica na mimetike BH3 promijenjena. U tu svrhu koristili smo par izogenih staničnih linija karcinoma debelog crijeva: SW480 izveden iz primarnog Duke-ovog karcinoma debelog crijeva i SW620 izveden iz metastaze mezenteričnih limfnih čvorova kod istog pacijenta. 22 SW480 stanice su osjetljive na anoikis, dok su SW620 stanice otporne. Otkriveno je da je Bim reguliran u suspenziji u stanicama SW480 i da barem djelomično posreduje njihovu osjetljivost na anoikis. Što je najzanimljivije, obje ćelijske linije uginule su u prisustvu ABT-737 kada su uzgajane u suspenziji, dok su bile otporne na ovaj spoj u adhezivnim uvjetima. Stoga se samostojeće stanice karcinoma debelog crijeva pripremaju za smrt, neovisno o tome jesu li osjetljive na anoikis ili ne, pa spojevi poput ABT-263 ili ABT-199 mogu imati antimatastatska svojstva.

Rezultati

SW480 stanice su osjetljive na anoikis za razliku od SW620 stanica

Razina vremenskih tokova anoikisa uspoređena je u stanicama SW480 i SW620 nakon kulture u suspenziji. Kao što je prikazano na slici 1a, postotak apoptotskih stanica SW480 povećavao se s vremenom. Suprotno tome, apoptozu u SW620 stanicama jedva je bilo otkriti. Da bi se provjerilo da li je smrt stanica SW480 nastala zbog klasične apoptoze, stanice su uzgajane u prisutnosti ili odsutnosti inhibitora pan-kaspaze Q-VD-OPH. Rezultati prikazani na slici 1b pokazuju da je ovaj inhibitor u potpunosti zaštitio stanice SW480 od stanične smrti uslijed odvajanja. Također smo pratili aktivaciju kaspaze-3 u suspendiranim stanicama SW480 otkrivanjem p20 (intermedijara) i p17 (zrelih) fragmenata aktivne kaspaze analizom western blota. Fragment p20 i neki p17 fragment otkriveni su u roku od 24 sata (slika 1c), a kaspaza-3 je 48 sati potpuno zrela. Prisutnost Q-VD-OPH potpuno ukinute aktivacije kaspaze-3 (Slika 1c).

Image

Osjetljivost Anoikisa u stanicama SW480 i SW620. ( a ) Vremenski tijek smrti apoptotske stanice u suspendiranoj staničnoj populaciji SW480 i SW620. ( b ) Vremenski tijek apoptoze u suspendiranim SW480 stanicama kultiviranim bez (ctrl) ili s inhibitorom pan-kaspaze Q-VD-OPH (10 µM ). ( c ) Kinetika aktivacije kaspaze-3 u adhezivnim (A) ili suspendiranim SW480 ćelijama kultiviranim bez (ctrl) ili s Q-VD-OPH (10 µM ) detektiranim Western blotom s anti-cijepljenom kaspazom-3 antitijelo (p20 i p17 fragmenti). Zvezdica označava nespecifični pojas. Za sve grafikone na svim slikama, trake pogreške pokazuju SD najmanje tri neovisna eksperimenta

Slika pune veličine

Anoikis je pripisan unutrašnjem 23 ili vanjskom apoptotskom putu 24, 25 . Stoga smo u kinetikama proučavali cijepanje i aktivaciju kaspaze-8 i kaspaze-9. Kao što se može vidjeti na slici 2a, otkrili smo nejasan pojas cijepanja za obje kaspaze čim je 5 sati kulture suspenzija. Kako bismo dodatno ispitali koja inicijacijska kaspaza je bila na vrhuncu apoptotske signalizacije, upotrijebili smo dva klona SW480 stanica stabilno transfektiranih ekspresijskim plazmidom koji kodira Bcl-2. 26 Oba su klona bila otporna na anoikis (slika 2b), i što je najvažnije, u tim je klonama ukinuta sva kaspaza (slika 2c), što ukazuje da se aktiviranje kaspaze-8, prikazano na slici 2a, događa niz mitohondrijske događaje. Da bi se dalje dokumentiralo da vanjski put nije uključen, SW480 stanice su stabilno transfektirane ekspresijskim plazmidom koji kodira dominantno negativan oblik Fasd-povezane smrti domene (FADD) (FADD-dn) i tri klona (Slika 2d). Svi klonovi pokazali su otpornost na apoptozu izazvanu TRAIL-om, kao što je prikazano na slici 2e za klon 4. Međutim, svi su kloni bili osjetljivi na anoikis, kao što je prikazano na slici 2f za klon 4, koji isključuje vanjski put.

Image

Anoikis u stanicama SW480 pokreće se u mitohondrijama. ( a ) Kinetika aktivacije kaspaze inicijatora u staničnim linijama SW480 i SW620, kultivirana u suspenziji. Otkrivaju se kaspaza-8 cijele duljine (55/54 kD) ili cijepljene (43/41 kD) i cijele dužine (47 kD) ili cijepljene (35 kD) kaspaze-9. ( b ) Postotak anoikisa u praznim vektorima ili Bcl-2-transfektiranim klonovima SW480. ( c ) Nedostatak detekcije aktivacije kaspaze u klon-transfektiranim Bcl-2 tijekom kulture u suspenziji. Nespecifični pojas predstavljen je *. ( d ) Stanični ekstrakti klonova SW480 transficirani s FADD.dn (kloni 1, 4 i 12) ili s praznim vektorom (pcDNA3) izbrisani su kako je opisano u Materijalima i postupcima s anti-FADD antitijelom ( e, f ) SW480 stanice transficirane s praznim vektorom (SW480 pcDNA3) ili s ekspresijom FADD.dn (klon 4) ili su uzgajani u prisutnosti rekombinantnog TRAIL-a (25 ng / ml) ( e ) ili kultivirani u suspenziji ( f ), a apoptoza je kvantificirana u različitim vremenima

Slika pune veličine

Otpornost stanica SW620 na anoikis nije posljedica prijelaza epitela u mezenhim

Epitelijski-mezenhimski prijelaz (EMT) nije samo ključni događaj da epitelne stanice dobiju pokretni fenotip, već omogućuje ćelijama raka da izbjegnu anoikis. 27 Tijekom EMT procesa gubi se ekspresija e-kadherina, dok je izraz N-kadherina reguliran, proces koji se naziva "kadherin prekidač". 28 I gubitak E-kadherina 29 i stjecanje ekspresije N-kadherina 30 čine se važni za stvaranje signala preživljavanja. Stanice SW480 pokazuju morfologiju epitela, dok stanice SW620 imaju morfologiju nalik zaobljenom ili fibroblastu koja podsjeća na stanice koje su prošle EMT. 31 Ekspresija različitih epitelijskih i mezenhimalnih markera proučena je stoga u obje stanične linije. Kao što je prikazano na slici 3, ekspresija E-kadherina je lagano umanjena u stanicama SW620 u usporedbi sa stanicama SW480, ali citokeratin 18, još jedan epitelni marker je značajno porastao u stanicama SW620. Što se tiče mezenhimskih markera, vimentin je bio prisutan u obje stanične linije, ali ni N-kadherin, ni fibronektin nisu izraženi, dok su obojica pronađeni u mišjim mijeloblastima. Stoga se čini da stanice SW620 nisu mezenhimske.

Image

Izražavanje različitih epitelijskih ili mezenhimalnih markera u stanicama SW480 i SW620. Stanični ekstrakti su izbrisani raznim antitijelima koja prepoznaju epitelijske (E-kadherin, Citokeratin 18) ili mezenhimski (vimentin, N-kadherin, fibronektin) biljege. Miševi mieloblasti kod miševa korišteni su kao pozitivna kontrola za mezenhimske stanice

Slika pune veličine

Bim samo B3 protein ima ulogu u smrti stanice SW480 zbog anoikisa

S obzirom da mitohondrijskom apoptozom upravljaju članovi Bcl-2, kinetička ekspresija nekoliko tih proteina je proučavana i u stanicama SW480 i SW620 prateći njihovu kulturu u suspenziji. Kao što je prikazano na slici 4a, anti-apoptotički Bcl-2 i Bcl-xL izraženi su u usporedivim razinama u obje stanične linije i njihova ekspresija nije varirala tijekom kulture u suspenziji. Mcl-1 ekspresija se nije mijenjala tijekom kulture u stanicama SW480 za razliku od nedavnog izvještaja koje je otkrilo značajno smanjenje Mcl-1 ekspresije u NIH3T3 stanicama tijekom anoikisa. 32 Sveukupno, u našem istraživanju stanice SW620 rezistentne na anoikis su izražavale manje Mcl-1 od SW480 ćelija i, iz nepoznatih razloga, čini se da je njegova razina ponekad fluktuirala tokom kulture. Taj bi rezultat mogao biti posljedica vrlo kratkog poluživota Mcl-1 (40 min). 33 Među pro-apoptotičkim proteinima razina Bax i Bid ekspresije je bila stabilna u suspendiranim stanicama. Suprotno tome, ekspresija proteina Bim samo za BH3 uvelike se povećala tijekom kulture u suspenziji SW480 stanica i unutar 5 sati nakon odvajanja stanica. Valja napomenuti činjenica da je uglavnom Bim-EL varijanta 34 otkrivena u ovim stanicama i da se tijekom ispitivanja naziva Bim. Bim ekspresija je pojačana u SW620, ali u manjem stupnju.

Image

Ispitivanje ekspresije Bcl-2 proteinske obitelji u SW480 i SW620 stanicama uzgojenim u suspenziji. ( a ) Analiza vremenskog tijeka ekspresije nekoliko članova proteinske obitelji Bcl-2 analizirana je Western blotom u adhezivnim (A) ili suspendiranim stanicama SW480 i SW620. ( b ) Učinkovitost Bim nokauta u adhezivnim (A) ili suspendiranim SW480 ćelijama tretiranim (siRNA Bim) ili ne (ctrl) sa specifičnom Bim siRNA nadziranom Western blot-om primjenom specifičnog anti-Bim antitijela. ( c ) Postotak apoptoze u staničnoj populaciji SW480, uzgajanoj u suspenziji, bilo netraficirana (ctrl) ili nakon transfekcije specifičnom Bim siRNA (siRNA Bim) ili siRNA do nebitnog cilja (siRNA irr). ( d ) Analiza Bim ekspresije u lizatima cijelih stanica i u citosolnim (cito) ili membranskim / organelarnim (mito) obogaćenim frakcijama u adhezivnim stanicama (A) ili nakon 24 sata suspenzije (S). ( e ) Analiza vremenskog tijeka ekspresije Bima u SW480 prekomjernom pritisku Bcl-2 (SW480 Bcl-2 4, SW480 Bcl-2 14) bilo prianjajućeg (A) ili uzgojenog u suspenziji. ( f ) Bim ekspresija u malignim kolorektalnim stanicama HT-29 i HT-116, uzgojenim u suspenziji

Slika pune veličine

Ukinuli smo Bimovu ekspresiju u SW480 ćelijama sa specifičnom RNA s malim sredstvima. Kao što je prikazano na slici 4b, Bim-ekspresija je u potpunosti inhibirana ovim tretmanom u kulturi u suspenziji. Otkriveno je da nedostatak Bima uvelike, ali ne i potpuno štiti stanice SW480 od anoikisa (Slika 4c). Stoga možemo zaključiti da je Bim uključen u osjetljivost stanica SW480 na anoikis. Bmf je umiješan u smrt zbog anoikisa nekoliko tipova stanica. 21, 35, 36 Međutim, Bmf analizom western blot-a nismo uspjeli otkriti niti u jednoj od dvije stanične linije (nije prikazano).

U zdravim stanicama, Bim-EL se može odvojiti u motorni kompleks povezan s mikrotubulom, vezanjem na LC8. 37 Izvjesni apoptotički podražaji ometaju interakciju između LC8 i dynein motornog kompleksa, oslobađajući Bim i na taj način omogućavajući njegovu translokaciju u mitohondrije. Stoga smo pokušali utvrditi mogu li, osim Bim razine u suspendiranim stanicama, postojati i razlike u njegovoj lokalizaciji u SW480 stanicama u usporedbi sa stanicama SW620. Mikrotubuli se depolimeriziraju u roku od nekoliko minuta na sobnoj temperaturi i na 4 ° C, te ih stoga ne mogu izolirati centrifugiranjem. Koristili smo drugi pristup pomoću "kompleta za frakciju stanica" kako je opisano u Materijalima i metodama. Dobijeni su stanični ekstrakti čisti, budući da se monomerni tubulin nalazio isključivo u frakciji obogaćenoj citosolnim proteinima, dok je AIF, mitohondrijski protein, detektiran isključivo u membrani i frakciji obogaćenoj proteinima proteina (Slika 4d). Zanimljivo je da je Bim u adhezivnim stanicama SW480 pronađen uglavnom u membrani i frakciji obogaćenoj organelarnim proteinima, a u istom frakciji detektiran je ugulirani Bim u suspendiranim stanicama. Stoga je povećana količina Bima koju nalazimo u odvojenim stanicama SW480 uglavnom lokalizirana u mitohondrijama. Suprotno tome, otkriveno je da je Bim ravnomjerno ravnomjerno raspoređivan u citosolnim i membranskim frakcijama obogaćenim proteinima u adhezivnim i suspendiranim stanicama SW620. Ovi rezultati sugeriraju da bi mogla doći do manje učinkovite translokacije Bima u mitohondrije u SW620 stanicama.

Zatim smo testirali dva Bcl-2 eksprimirajuća SW480 klona za koja smo otkrili da su otporni na anoikis. Oba klona su regulirana Bim, uzgojena u suspenziji (slika 4e), istim redoslijedom veličine u usporedbi s roditeljskim stanicama (slika 3a). Dakle, osjetljivost stanica SW480 na anoikis ne diktira samo nivo ekspresije Bim-a, već omjer Bim-a i Bcl-2.

Konačno, koristili smo dvije druge zloćudne kolorektalne stanične linije da provjerimo je li Bim uregulacija u suspendiranim stanicama općenita. Kao što je prikazano na slici 4f Bim ekspresija je povećana i u stanicama HT-29 i HCT-116 tijekom kulture u suspenziji, a to je bilo praćeno značajnom staničnom smrću uslijed anoikisa.

Inhibicija ERK-a u stanicama SW620 vraća Bimnu ekspresiju u odvojenim stanicama i njihovu osjetljivost na anoikis

Izraz Bima kontrolira se i transkripcijskim i posttranskripcijskim mehanizmima. 38 Faktor transkripcije sličan vilici FOXO3a (kutija vilice O3a) ključni je regulator transkripcije Bima i njegova aktivnost se suzbija fosforilacijom pomoću Akt. Kao što je prikazano na slici 5a, blokiranje PI3K / Akt staze nije senzibiliziralo SW620 stanice na anoikis. Nadalje, analiza Western blot-a upotrebom antitijela za fosfo-Akt pokazala je vrlo malu količinu aktiviranog Akt u stanicama SW620 (nije prikazano).

Image

Regulacija ekspresije Bim proteina. ( a ) Postotak apoptoze u suspendiranim stanicama SW480 i SW620, kultiviranim u prisutnosti (Ly294002) ili odsutnosti (ctrl) PI3K inhibitora Ly294002 (10 µM). ( b ) Postotak apoptoze u suspendiranim stanicama SW480 i SW620, kultiviranim u prisutnosti (PD0325901) ili odsutnosti (ctrl) MEK inhibitora PD0325901 (10 μM). ( c ) analiza Western blot ekspresije p-ERK-a, Bim-a i ukupnog ERK-a u adhezivnim (A) ili suspendiranim SW480 (gornja ploča) i SW620 (donja ploča) stanica uzgajanih u prisutnosti (PD0325901) ili odsutnosti (ctrl) PD0325901 (10 μM). Anti-Hsc-70 korišten je kao kontrola opterećenja. ( d ) Analiza Western blot ekspresije Bim-a u stanicama SW620 tretiranim PD0325901 inkubiranim sa ili bez BIM siRNA. ( e ) Vremenski tijek razine anoikisa u stanicama SW620 tretiranim PD0325901, inkubiranim ili ne Bim siRNA

Slika pune veličine

S druge strane, fosforilacija posredovana ERK-om cilja Bim za sveprisutnost i proteasomalnu degradaciju. Inhibitor MEK (PD0325901) bio je vrlo učinkovit u senzibiliziranju SW620 stanica na anoikis, istovremeno povećavajući razinu stanične smrti u SW480 stanicama kultiviranim u suspenziji (Slika 5b). U stanicama SW620 (slika 5c), bazalna aktivnost ERK, procijenjena zapadnom blot analizom fosforiliranog ERK (p-ERK), bila je niska i povećana na kraju kulture, nalaz koji smo opetovano primijetili. MEK inhibitor bio je vrlo učinkovit u ukidanju ERK aktivnosti i to je bilo popraćeno povećanjem Bim ekspresije počevši od 24 sata u korelaciji s anoikisima uočenim u tim vremenskim točkama.

Šutjeli smo ekspresiju Bim-ove interferencije RNA u suspendiranim stanicama SW620, uzgojenim u prisutnosti PD0325901 (slika 5d). Kao što je prikazano na slici 5e, izumiranje Bim ekspresije smanjilo je postotak apoptoze za oko pola pri 72 h liječenja PD0325901 što ukazuje da je Bim uključen u preosjetljivost na anoikis ovim spojem. Ovi podaci također pokazuju da su dodatni mehanizmi odgovorni za preostalu staničnu smrt. Iznenađujuće, aktivnost ERK bila je visoka i održavana u kontrolnim SW480 stanicama kroz kulturu u suspenziji (Slika 5c), ali nije spriječila regulaciju Bim ekspresije u kontrolnim SW480 stanicama počevši od 5 h. Inhibicija MEK-a inducirala je jaču povećanje Bim-ove ekspresije (slika 5c). U tim je uvjetima Bim elektroforetska pokretljivost povećana zbog činjenice da je Bim defosforiliran. Bim nije bio otkriven u kasnim vremenskim točkama, opažanje za koje vjerujemo da je povezano s vrlo visokom stopom smrti, što utječe na kvalitetu staničnih ekstrakata. Isto tako, ukupni Erk i Hsc-70, kontrola opterećenja, umanjeni su u ovim kasnim vremenskim točkama.

ABT-737 senzibilizira i SW480 i SW620 stanice na anoikis

Ponovno reguliranje Bima u SW480 stanicama koje se uzgajaju u suspenziji dovelo nas je do ispitivanja da li je, kao što je pokazano za brojne kemoterapijske lijekove koji se koriste zajedno s Navitoclaxom, 39 pronađena sinergija između suspendiranog stanja i ABT-737. Kao što je prikazano na slici 6a, adhezivne stanice SW480 bile su potpuno otporne na ABT-737 (1 µM ). Međutim, u suspendiranim stanicama, otkriveno je da ABT-737 značajno povećava razinu anoikisa. Ista vrsta eksperimenata izvedena je u stanicama SW620 (Slika 6b). Opet su adhezivne stanice bile rezistentne na ABT-737. Iznenađujuće, stanice SW620 kultivirane u suspenziji, usprkos otpornosti na anoikis, umrle su u značajnom broju u prisutnosti ABT-737. Stoga smo provjerili može li prisutnost ABT-737 modificirati ekspresiju nekih članova Bcl-2 u tim ćelijama. Kao što je prikazano na slici 6c, to nije bio slučaj. Ova su opažanja posebno važna u vezi s Noxom, jer je objavljeno da je ovaj Mcl-1 inhibitor izazvan tretmanom ABT-737 u staničnoj liniji glioma. 40

Image

Analiza osjetljivosti SW480 i SW620 stanica na BH3-mimetički ABT-737. ( a, b ) Postotak apoptoze u adhezivnim ili suspendiranim stanicama SW480 ( a ) ili SW620 ( b ), kultiviranim u prisutnosti (ABT-737) ili u odsutnosti (ctrl) ABT-737 (1 µM ). ( c ) Analiza ekspresije člana Bcl-2 u stanicama SW620 tijekom kulture u suspenziji u prisutnosti ili odsutnosti ABT-737. ( d ) stanice SW480 (gornje ploče) i SW620 (donje ploče) ili adhezivne (Adh) ili suspendirane 24 sata u prisutnosti (Susp + ABT) ili u odsutnosti (Susp) ABT-737 (1 μM ) lizirane su u CHAPS međuspremnik. Očišćeni lizati su ili analizirani izravno (stanični lizat) ili nakon imunoprecipitacije anti-Bim antitijelom (IP Bim) i imunoblotiranim (WB) za Bcl-2 i Bim kako je opisano u Materijalima i postupcima. ( e ) Stanice su tretirane kao u d i analizirane na Bcl-xL ko-imunoprecipitaciju. ( f ) Adherentne stanice SW480, uzgajane u prisustvu ili odsutnosti ABT-737, tokom 24 sata, lizirane su kao u d i analizirane na Mcl-1 ko-imunoprecipitaciju

Slika pune veličine

Stanice osjetljive na ABT-737 trebaju se temeljiti na smrt s Bcl-2 i / ili Bcl-xL složenim u aktivatorski protein BH3. 41 Imunoblots Bim i Bcl-2 ili Bcl-xL provedeni su stoga u lizatima cijelih stanica i u anti-Bim imunoprecipitatima u staničnim linijama SW480 i SW620. Kao što je prikazano na slici 6d, Bcl-2: Bim kompleksi detektirani su u obje stanične linije koje su kultivirane u suspenziji. Nastajanje ovih kompleksa prekinuto je u prisustvu ABT-737, što ukazuje da ovaj spoj izbacuje Bim iz Bcl-2 (slika 6d). Najvažnije je da su Bcl-xL: Bim kompleksi detektirani i u suspendiranim stanicama SW480 i SW620 i premješteni pomoću ABT-737 (Slika 6e). Bcl-2: Bim kompleksi su također pronađeni u adhezivnim SW480 stanicama (slika 6d), unatoč njihovoj osjetljivosti na ABT-737 u ovim uvjetima kulture. Moguće je da, u nedostatku Bimove regulacije, količina takvih kompleksa je preniska da nadoknadi anti-apoptotičku funkciju Mcl-1 42, koja je izrazito izražena u SW480 stanicama (Slika 3a). Izvršili smo imunoprecipitaciju Bima u adhezivnim SW480 ćelijama tretiranim ili ne ABT-737, što je otkrilo prisutnost Bim: Mcl-1 kompleksa u oba stanja (Slika 6f). Stoga smatramo da je, s obzirom da je Bim razina adhezivnih SW480 stanica niska, Mcl-1 sposoban uhvatiti malu količinu proteina iz ABC-737 premještene iz Bcl-2 / Bcl-xL.

Rasprava

Anoikis je u osnovi anti-metastatski proces, a otpornost na ovaj oblik stanične smrti u korelaciji je s agresivnošću raka. 4

U ovom istraživanju koristili smo stanične linije SW480 i SW620 koje su potvrđene kao model napredovanja karcinoma debelog crijeva od primarnog tumora (SW480) do metastatskih stanica (SW620) 31, i pokazuju da su tijekom ove progresije tumorske stanice stekle anoikis -rezistentni fenotip. Pokazalo se da je EMT važan fenomen za sticanje otpornosti na anoikis 43 ; međutim, nismo pronašli nikakve dokaze da se taj proces dogodio u stanicama SW620 usprkos njihovoj sugestivnoj morfologiji nalik fibroblastima. Ostaje moguće da su ove metastatske stanice prolazile prolazno EMT, nakon čega slijedi mezenhimalno-epitelijski prijelaz nakon što su kolonizirali svoje sekundarno mjesto, kao što je sugerirano kod invazivnog karcinoma debelog crijeva. 44

Među testiranim pro-apoptotičkim proteinima, Bim je bio jedini koji je bio visoko reguliran u suspendiranim stanicama SW480. Važno je da je prigušivanje Bimove ekspresije potvrdilo da je ovaj protein jedini za BH3 uključen u smrt stanice SW480 od anoikisa. Međutim, razina apoptoze prešla je s 38% u kontrolnim stanicama do 15% u stanicama liječenim Bim kratkom interferirajućom RNA (siRNA) što ukazuje da bi drugi put mogao biti umiješan u preostalu staničnu smrt. Utvrdili smo da implikacija Bmf nije vjerojatna.

Ono što je najzanimljivije, procjenjen je učinak ABT-737 na suspendirane stanice, otkriveno je da ovaj spoj pojačava anoikis ne samo u stanicama SW480, koje Bim reguliraju suspenzijom, već i u stanicama SW620, koje to pomalo čine. Provedeno je nekoliko studija kako bi se utvrdio način djelovanja ABT-737. Jedna od ovih studija, u akutnoj mijeloidnoj leukemiji, pokazuje da ABT-737 djeluje inducirajući disocijaciju Bcl-2: Bax kompleksa i inducira apoptozu na način ovisan o Baku, ali Bim-neovisan. 45 Međutim, takvi kompleksi nismo uspjeli otkriti ni u staničnoj liniji u adheziji ili u suspenziji (nije prikazano). S druge strane, u obje stanične linije koje su kultivirane u suspenziji, Bcl-2: Bim i Bcl-xL: Bim kompleksi su imunoprecipitirani i ti kompleksi su poremećeni od strane ABT-737. Naši podaci stoga su u skladu s rezultatima dobivenim kod kronične limfocitne leukemije, gdje oslobađanje Bima iz Bcl-2 pomoću ABT-737 dovodi do aktivacije Baxa. 19 Dakle, Bim-ova okupacija Bcl-2 i Bcl-xL u suspendiranim ćelijama natapala je SW480 i SW620 stanice za smrt, a ABT-737 djelovao je oslobađanjem Bima. Bcl-2: Bim ili Bcl-xL: Bim kompleksi jedva su detektirani u adhezivnim SW620 stanicama, vjerojatno objašnjavajući zašto su bili otporni na ABT-737. Suprotno tome, adhezivne ćelije SW480 prikazale su Bcl-2: Bim komplekse, dok ove stanice nisu bile osjetljive na ABT-737. Pokazalo se da je Mcl-1 ključna odrednica otpornosti na ABT-737 45, 46 i SW480 stanice koje pokazuju visoku razinu Mcl-1. Stoga, čak i ako je Bcl-2: Bim kompleksi poremećen od strane ABT-737 u tim prionutim stanicama, McL-1 bi raseljeni Bim mogao biti vezan, održavajući preživljavanje. Doista, mogli bismo otkriti Mcl-1: Bim komplekse u adhezivnim SW480 ćelijama tretiranim ili ne ABT-737. Uregulacija Bima u suspendiranim ćelijama SW480 trebala bi omogućiti formiranje više Bcl-2: Bim kompleksa. U ovom slučaju, količina Bima oslobođena ABT-737 bi subvertirala pufernu sposobnost Mcl-1, čime bi stanice postale osjetljive na BH3-mimetik.

Razina ravnoteže Bim-a regulirana je fosforilacijom ovisnom o ERK1 / 2, koja je usmjerena na razgradnju proteasomom. Pronađeno je da inhibicija MEK-a pojačava Bim ekspresiju u obje stanične linije i senzibilizira SW620 stanice na anoikis. Stoga su stanice SW620 u suspenziji osjetljive na Bim-induciranu apoptozu pod uvjetom da je ovaj protein samo za BH3 prisutan u dovoljnim količinama. No, čini se malo vjerojatnim da je put ERK jedini odgovoran za nedostatak regulacije Bima u suspendiranim ćelijama SW620, jer nismo primijetili strogu negativnu povezanost između p-ERK razine i Bim izraza. Zapravo, aktivnost ERK-a u ovim ćelijama je mala i povećava se tek u kasnijim vremenskim točkama. S obzirom na naše rezultate da put PI3K-Akt također nije uključen, vjerovatno je da će se druga regulacijska staza, koja tek treba identificirati, također igrati u regulaciji Bim izraza.

Razina Mcl-1, visoka i stabilna tijekom kulture u suspenziji SW480 stanica, bila je niža i ponekad je fluktuirala u SW620 stanicama. Zanimljivo je napomenuti da se pokazalo da je degradacija Mcl-1 nužna za indukciju anoikisa kod nekih modela. U SW480 ćelijama to očito nije slučaj. Kratki poluživot Mcl-1 pripisan je njegovoj fosforilaciji GSK-3, nakon čega je uslijedila sveprisutnost i degradacija proteasoma. 48 GSK-3 inhibira put PI3K-Akt. Pronašli smo vrlo malo Akt aktivnosti u SW620 stanicama, pa je GSK-3 možda odgovoran za smanjenu količinu Mcl-1 izraženu od SW620 stanica. U svakom slučaju, očekivalo bi se da će niska razina Mcl-1 osjetiti SW620 stanice na anoikis, a to nije ono što smo promatrali.

Zaključno, jesu li podvrgnute anoikisu, suspendirane stanice karcinoma debelog crijeva su osjetljive na BH3-mimetički ABT-737. To ukazuje da stanice raka koje su se odvojile od izvanćelijskog matriksa mogu proći kroz prolazni prozor, gdje ih mogu ubiti spojevi poput Navitoclax ili ABT-199, koji bi ovim anti-metastatskim svojstvima dali antistastacijska svojstva.

Materijali i metode

Stanične linije i reagensi

SW480 i SW620 stanične linije ljudskog karcinoma debelog crijeva dobivene su iz Američke kolekcije tipičnih kultura (ATCC). Oni su rutinski održavani u Dulbeccovom minimalnom esencijalnom mediju (DMEM) (Gibco, Saint Aubin, Francuska), dopunjenom 10% toplotnim inaktiviranim fetalnim serumom goveda, 1% natrijevim piruvatom, 0, 1 mg / ml streptomicina, 100 U / ml penicilina na 37 ° C u atmosferi s 5% CO 2 - vlagom. Za kulture u suspenziji, 2 jedinice / ml dispaze (Roche, Meylan, Francuska) dodane su kulturi u mediju za dobivanje suspenzija pojedinačnih stanica. Dispaza je bakterijska neutralna proteaza s blagim proteolitičkim djelovanjem, koja se uglavnom koristi za izolaciju i rutinsko propuštanje primarnih stanica. Također može odvojiti adhezivne stanice iz posude 49 kulture vađenjem vanćelijskog matriksa 50 i disocijacijom staničnih agregata. 51 Dispaza ne inaktivira serum i, s obzirom na to da nema toksičnosti, je vrlo učinkovito sredstvo za zadržavanje adhezivnih stanica u jednoćelijskoj suspenziji.

TRAIL osjetljivost klonova SW480 testirana je uzgajanjem stanica u prisutnosti rekombinantnog rekombinantnog TRAIL-a (25 ng / ml) (Alexis Biochemicals, Villeurbanne, Francuska) i antitijela protiv zastave (M2) (Sigma Aldrich, Lyon, Francuska) za različita vremena.

Osnovne otopine Q-VD-OPH (Biovision, Nanterre, Francuska), Ly294002 (Calbiochem, Darmstadt, Njemačka) i PD0325901 (Sigma Aldrich) pripremljene su u DMSO pri 10 mM i korištene u 10 μM krajnje koncentracije. ABT-737 (Selleckchem, Souffelweyersheim, Francuska) je također pripremljen u DMSO pri 10 mM i korišten u konačnoj koncentraciji od 1 μM .

The following antibodies were used: anti-Bax (N-20, Santa Cruz Biotechnology, Inc, Heildelberg, Germany), anti-Bid (R&D Systems, Lille, France), anti- cleaved caspase-3 (Cell Signaling, Saint Quentin en Yvelines, France), anti-Hsc70 (B-6, Santa Cruz Biotechnology, Inc), anti-Mcl-1 (S-19, Santa Cruz Biotechnology, Inc), anti-Bcl-2 (H-100, Santa Cruz Biotechnology, Inc), anti-Bcl-xL (BD Transduction Laboratories, Le Pont de Claix, France), anti-Bim (Cell Signaling), anti-pErk (Cell Signaling), anti-Erk total (Cell Signaling), anti-actin (MBL, Nanterre, France) and anti-FADD (BD Transduction Laboratories).

Analiza protočne citometrije apoptotskih stanica

Suspended cells maintained in culture from 24–72 h were washed in PBS (phosphate-buffered saline), fixed in 70% cold ethanol and stored at −20 °C for at least 12 h. After two washes in PBS, cells were resuspended and stained in 0.5 ml of PBS containing 50 μ g/ml propidium iodide. The fluorescence intensity of propidium iodide was assessed with a FACSCalibur flow cytometer (Becton Dickinson, Le Pont de Claix, France) and analyzed using the CellQuest (Becton Dickinson) software. The percentage of cells with apoptotic nuclei, distinguished by their hypodiploid DNA content (sub-G0/G1 peak), 52 was assessed for each histogram.

Western blotting and immunoprecipitation

Cells were lysed with ice-cold NP40 lysis buffer (30 mM Tris pH 7.5, 150 mM NaCl, 10 mM NaF, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 10% Glycerol, 10 mM NaPP and 1% NP40) containing 1 mM phenylmethylsulfonylfluoride, 1 mM sodium orthovanadate (Na 3 VO 4) and 1/100 protease cocktail inhibitors (Sigma, Lyon, France). All lysates were clarified by centrifugation at 15 000 × g for 15 min at 4 °C. Protein concentrations were assessed using the Bradford assay (BioRad, Hercules, CA, USA). Proteins amounting to 50 μ g were prepared in loading Laemmli's buffer (60 mM Tris-HCL pH 6.8, 0.18 M β -mercaptoethanol, 2% SDS, 10% glycerol and 0.005% bromophénol blue), boiled for 5 min, subjected to sodium dodecyl sulfate–polyacrylamide gel electrophoresis and transferred on ice for 1.5 h to polyvinylidenedifluoride membrane (Amersham Hybond-LFP, GE healthcare, Velizy-Villacoublay, France). After blocking for at least 1 h in Tris-buffered saline supplemented with 5% BSA and 0.5% Tween-20 (TBS-T), membranes were probed with the appropriate primary antibodies in TBS-T overnight. Proteins were visualized by using Lycor secondary antibodies and Odyssey detection material.

For immunoprecipitation experiments, cells were lysed with CHAPS lysis buffer (30 mM Tris pH 7.5, 150 mM NaCl, 10 mM NaF, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 10% Glycerol, 10 mM NaPP and 1% CHAPS) containing 1 mM phenylmethylsulfonylfluoride, 1 mMsodium orthovanadate (Na 3 VO 4 ) and 1/100 protease cocktail inhibitors). Nuclear pellets and debris were removed by centrifugation, at 15 000 × g for 15 mn at 4 °C. Six milligrams of proteins from cell lysates were incubated for 1 h at 4 °C with the anti-Bim antibodies. Protein-G beads were added to the immune complexes for 45 min and washed five times with ice-cold CHAPS lysis buffer. Purified immunoprecipitates, immobilized on protein-G beads, were mixed with an equal volume of Laemmli's buffer 2x, boiled for 5 min and further analyzed by means of western blot for both Bim and Bcl-2 content.

Small-interfering RNA-mediated silencing of Bim

In 3 ml of culture medium, 3 × 10 5 cells were transfected with Bim siRNA or irrelevant siRNA (Ambion Life Technologies, Saint Aubin, France). Each siRNA was used at 20 nM final concentration. INTERFERin (20 μ l, Polyplus transfection, Ozyme, Saint Quentin en Yvelines, France) was incubated with siRNA duplex in 800 μ l of DMEM without serum for 20 min at room temperature. The mixture was then added to the cells, which were transferred to culture plates and incubated at 37 °C. Seventy-two hours after transfection, cells were detached with culture medium containing 2 units/ml of dispase, cultured in this medium for 24, 48 or 72 h and the percentage of apoptotic cells was quantified as described above. Extinction of Bim expression by the Bim siRNA was monitored by means of western blot throughout the culture in suspension.

Stable transfection of FADD.dn in SW480 cells

The pcDNA3/ FADD.dn vector encodes for a truncated form of FADD protein deleted of its two DED domains and thus unable to recruit caspase-8. SW480 cells were transfected 5 μ g of either pcDNA3/FADD.dn or pcDNA3 empty vector with the use of JetPei (Polyplus transfection). Transfected cells were selected with neomycin (400 μ g/ml) and then cloned.

Frakcionacija stanica

We used the 'cell fractionation kit' (catalog no. 9038) from Cell Signaling Technology according to manufacturer's instructions. This methodology is detergent-based 53 and is performed on ice. Cell pellet is resuspended in a first, digitonin-based, buffer for 5 mn followed by a centrifugation at 500 × g . The supernatant is the cytosolic protein-enriched fraction. The pellet is resuspended in a second, triton-based buffer for 5 mn and centrifuged at 8000 × g . The supernatant is the membrane and organellar protein-enriched fraction, which contains, among others, mitochondria-associated proteins. The remaining pellet, which we did not use, contains the actin cytoskeleton and the nuclear proteins. Given that microtubules depolymerize within minutes on ice, tubulin and all associated proteins, including dynein motor complex-bound Bim for our purpose, end up in the cytosolic fraction.

Glosar

Bcl-2

B-cell leukemia/lymphoma 2

Bax

Bcl-2-acssociated x protein

Bcl-XL

Bcl-2-related gene, long isoform

MCL-1

myeloid cell leukemia 1

Ponuda

Bcl-2 agonist smrti domene interakcije

BIM

B-cell lymphoma 2 interacting mediator of cell death

siRNK

kratka interferirajuća RNA

EMT

epithelial–mesenchymal transition

FADD

Fas-associated death domain