Microrna-18a-5p djeluje kao onkogen izravnim ciljanjem irf2 u karcinomu pluća | stanična smrt i bolest

Microrna-18a-5p djeluje kao onkogen izravnim ciljanjem irf2 u karcinomu pluća | stanična smrt i bolest

Anonim

teme

  • autophagy
  • Stanična signalizacija
  • miRNAs
  • Ne-stanični karcinom pluća

Sažetak

Rak pluća je glavni oblik raka koji rezultira smrtnošću povezanom s rakom širom svijeta. MikroRNA su endogene male nekodirane jednolančane RNA koje se mogu uključiti u regulaciju ekspresije gena. U ovom istraživanju miR-18a-5p značajno je reguliran u tkivima nemalnih karcinoma pluća (NSCLC) i stanicama NSCLC, što sugerira onkogenu funkciju u karcinomu pluća. Uz to, miR-18a-5p može promovirati karcinogenezu izravnim ciljanjem na interferonski regulatorni faktor 2 (IRF2). Daljnji eksperimenti pokazali su da IRF2 može povećati staničnu apoptozu, inhibirati staničnu proliferaciju i sposobnost migracije. Naše istraživanje pokazuje da miR-18a-5p potiče autofagiju u NSCLC. Kolektivno, ovi rezultati pokazuju da miR-18a-5p ne može samo promovirati NSCLC suzbijanjem IRF2, već će biti i obećavajući cilj u skoroj budućnosti.

Glavni

Rak pluća jedan je od najčešćih malignih tumora, novi slučajevi čine 13% ukupnog karcinoma i vodeći su uzrok smrti od raka. 1 Ne-stanični karcinom pluća (NSCLC) doprinosi gotovo 80% karcinoma pluća, a njegova ukupna 5-godišnja stopa preživljavanja je niska, dok stopa recidiva ostaje visoka. 2 Za ove čimbenike potrebno je daljnje razumijevanje mehanizama koji sudjeluju u tumorigenezi NSCLC-a i napora na otkrivanju i promicanju potencijalnih terapijskih ciljeva za napredovanje u liječenju ove prevladavajuće bolesti.

MikroRNA (miRNA) su endogene male nekodirane jednolančane RNA, koje reguliraju ekspresiju gena vezanjem na 3'-netransliranu regiju (3'-UTR) mRNA. 3, 4 Na biološke procese, uključujući rast, diferencijaciju, apoptozu, pokretljivost i malignu transformaciju duboko utječu miRNA. 5 Nekoliko studija pokazalo je ektopičnu ekspresiju miR-18a-5p kod karcinoma kao što su karcinom dojke, hepatocelularni karcinom, rak prostate i drugi karcinomi. 6, 7, 8, 9

Porodica proteina interferona (IRF) je ključni faktor adaptivnog imuniteta i moduliranog staničnog odgovora koji sudjeluje u tumorigenezi. 10, 11 IRF2 je član IRF obitelji koja ima mogućnost provođenja anti-onkogenih aktivnosti. Kao što je gore opisano, povišena razina ekspresije IRF2 dovela je do smanjene PD-L1 ekspresije i povezana sa smanjenim proliferativnim potencijalom. 12 U skladu s tim, prekomjerna ekspresija IRF2 dovela je do dramatičnog odgovora smrtne stanice apoptozom u hepatocelularnom karcinomu. 13

U ovom istraživanju istražili smo potencijalne mehanizme miR-18a-5p u NSCLC. Istovremeno, naši eksperimentalni podaci otkrili su da miR-18a-5p značajno potiče rast i migraciju tumora NSCLC putem ciljanog IRF2. Naši rezultati pružili su novi potencijalni smjer za dijagnozu NSCLC i terapijsku intervenciju.

Rezultati

MiR-18a-5p je reguliran u NSCLC

Da bi se istražila uloga miR-18a-5p u karcinogenezi pluća, razina njegove ekspresije otkrivena je u 63 slučaja bolesnika s NSCLC. Podaci pokazuju da je u usporedbi s odgovarajućim ne-tumorskim plućnim tkivima, miR-18a-5p reguliran (Slika 1a). U tim bolesničkim tkivima povišena razina ekspresije IRF2 vjerojatno je povezana s veličinom tumora ( P = 0.052383, slika 1b), ali nije povezana s spolom (slika 1c) i patološkim stadijom (slika 1d). Ispitana je i ekspresija miR-18a-5p u NSCLC staničnim linijama, kontrolirana je BEAS-2B stanična linija. Vidljivo je reguliran u stanicama A549, H1299, H23 i H1650 (Slika 1e). Ovi rezultati pokazuju da miR-18a-5p može promovirati karcinogenezu NSCLC.

Image

MiR-18a-5p je reguliran u NSCLC tkivima i staničnim linijama ( a ) Razina relativne ekspresije dobivena iz rezultata qRT-PCR miR-18a-5p u tumorskim tkivima (T) i odgovarajućim netumorskim tkivima (NT). U6 je korišten za normalizaciju. ( b - d ) Izražavanje miR-18a-5p vezano za veličinu tumora, spol i patološki stadij. ( e ) Relativna razina ekspresije miR-18a-5p u staničnoj liniji raka pluća i BEAS-2B stanicama (kontrola) izmjerena je qRT-PCR ( n = 3 neovisna eksperimenta). Stupci pogreške predstavljaju srednju vrijednost ± SEM * P <0, 05, ** P <0, 01, *** P <0, 001

Slika pune veličine

MiR-18a-5p potiče staničnu proliferaciju i migraciju NSCLC

Da bi se proučio učinak miR-18a-5p na staničnu proliferaciju NSCLC, stanice H23, H1299 i A549 transficirane su miR-18a-5p mimikom / inhibitorom i podvrgnute kvantitativnoj PCR (qRT-PCR) analizi u stvarnom vremenu, rezultati iz koji je potvrdio da transfekcija miR-18a-5p mimikom / inhibitorom povećava / smanjuje njegovu razinu u tri stanične linije (dopunska slika S1). Proliferacija NSCLC stanica je procijenjena pomoću Kit-8 (CCK-8) za brojanje stanica (Slike 2a i b). Podaci stanične proliferacije pokazali su da transfekcija miR-18a-5p mimikom pokazuje značajno povećanje rasta stanica nakon 72 sata, dok inhibitor miR-18a-5p značajno smanjuje staničnu proliferaciju u istim uvjetima kulture. Nadalje, Flow Cytometry procjenjuje da je stopa apoptoze u tri stanične stanice, transficirane mimikom / inhibitorom miR-18a-5p, vidljivo smanjena (povećana (Slike 2c i d)). Uz to, 48 sati nakon transfekcije miR-18a-5p mimikom, rezultati zacjeljivanja rana i Transwell pokazuju da je migracijska sposobnost stanica izrazito povećana (Slike 2e i f). Ovi rezultati pokazali su da miR-18a-5p može promicati sposobnost proliferacije i migracije, inhibirati apoptozu NSCLC stanica.

Image

MiR-18a-5p može promovirati staničnu proliferaciju i migraciju NSCLC staničnih linija. ( a, b ) Stanice H23, H1299 i A549 transficirane su s NC ili miR-18a-5p mimikom / NC ili miR-18a-5p inhibitorom, a stanična proliferacija je određena CCK-8. ( c, d ) Distribucije apoptoze stanica H23, H1299 i A549 transficirane su NC ili miR-18a-5p mimikom / NC ili miR-18a-5p inhibitorom u trajanju od 48 sati, a zatim su otkrivene protočnom citometrijom. ( e, f ) 48 sati nakon infekcije s mimikom / NC ili miR-18a-5p mimikom / NC ili miR-18a-5p, rezultati ispitivanja zacjeljivanja rana i Transwell testova u stanicama H23, H1299 i A549. n = 3–4 neovisna eksperimenta, trake pogrešaka predstavljaju srednju vrijednost ± SEM * P <0, 05, ** P <0, 01, *** P <0, 001

Slika pune veličine

MiR-18a-5p izravno cilja IRF2

Koristeći programe predviđanja TargetScan (www.targetscan.org), IRF2 odabran je kao potencijalni cilj miR-18a-5p. Da bi se provjerilo je li IRF2 izravna meta miR-18a-5p ili ne, IRF2 divlji tip 3'-UTR (IRF2 WT 3'-UTR) kloniran je u vektor pGL3 (pGL3-IRF2 WT 3'-UTR), nizvodno od otvorenog okvira za čitanje luciferaze. Da bismo potvrdili ciljanu specifičnost, mutirali smo mjesta vezanja miR-18a-5p (slika 3a) i proveli mutagenezu usmjerenu prema mjestu za IRF2 WT 3'-UTR koristeći QuikChange mutagenesis kit. Rezultati su pokazali značajno, više od 30% smanjenje relativne aktivnosti luciferaze reporter-gena u stanicama HEK293T kofeficirane pim3-IRF2 WT 3'-UTR i miR-18a-5p mimikom. Suprotno tome, ko-transfekcija miR-18a-5p pGL3-IRF2 mut 3'-UTR rezultirala je neprimetnom promjenom aktivnosti luciferaze, što sugerira specifičnost miRNA cilja 3'-UTR (Slika 3b). Nadalje, primijetili smo da miR-18a-5p smanjuje ekspresiju IRF2 u stanicama (slika 3c).

Image

IRF2 je izravna meta miR-18a-5p. ( a ) IRF2 WT 3'-UTR sadrži predviđena mjesta vezivanja miR-18a-5p. Slika prikazuje poravnavanje miR-18a-5p s IRF2 WT 3'-UTR, a strelice ukazuju na nukleotide mutageneze. ( b ) Dvostruki test izvješća luciferaze. Stanice HEK293T kofeficirane su reporter konstruktima luciferaze koji sadrže pGL3-IRF2 WT 3'-UTR (IRF2 WT) i pGL3-IRF2 mut 3'-UTR (IRF2 mut) sa miR-18a-5p mimikom ili NC mimikom. Prikazana je relativna ekspresija luciferaze krijesnica, normalizirana u izrazu Renilla luciferaze, n = 3 neovisna eksperimenta. ( c ) Imunoblontska analiza razina IRF2 u stanicama H23, H1299 i A549 transfektirane mimikom NC mimic / miR-18a-5p ili NC inhibitorom / miR-18a-5p za 48 sati. ( d ) Relativna ekspresija IRF2 mRNA iz qRT-PCR odgovarajućeg ne-tumorskog tkiva (NT) i tumorskog tkiva (T). Za normalizaciju je korišteno 18 S. ( npr. ) Izražavanje IRF2 vezano za veličinu tumora, spol i patološki stadij. ( h ) Relativna ekspresija IRF2 mRNA u staničnoj liniji raka pluća ili u staničnoj liniji plućnog epitela, n = 3 neovisna eksperimenta. ( i ) Učinak razine ekspresije IRF2 na ukupni opstanak 1926. oboljelih od karcinoma pluća (internetska baza podataka Kaplan-Meier Plotter) analiziran je, a ploče Kaplana-Meiera generirane su pomoću katera Kaplana-Meiera (//www.kmplot.com), ( j ) MiR-18a-5p imao je negativnu korelaciju s IRF2 prema Pearsonovom koeficijentu korelacije. Stupci pogreške predstavljaju srednju vrijednost ± SEM * P <0, 05, ** P <0, 01, *** P <0, 001

Slika pune veličine

Da bi se utvrdilo je li ekspresija IRF2 povezana s miR-18a-5p u NSCLC ili ne, ekspresija IRF2 istraživana je u istim parovima tkiva. Rezultati su pokazali da je ekspresija IRF2 u tumorskim tkivima smanjena (Slika 3d) i vjerojatno se odnosila na veličinu tumora ( P = 0, 080892, Slika 3e), ali negativnu povezanost sa spolom i patološkim stadijem (slike 3f i g). Tada je razina ekspresije IRF2 mRNA izmjerena u nekoliko NSCLC staničnih linija i otkrila je da je ekspresija IRF2 u NSCLC stanicama mnogo niža od BEAS-2B kontrolnih stanica (Slika 3h). Stoga smo, prema rezultatima analize primjenom Pearsonovog koeficijenta korelacije, pretpostavili da je miR-18a-5p negativno koreliran s IRF2 (slika 3j).

Da bismo analizirali učinak IRF2 ekspresije na pacijente s karcinomom pluća, koristili smo internetsku bazu podataka Kaplana-Meierovog crtača (www.kmplot.com/analysis) za generiranje krivulje preživljavanja NSCLC bolesnika s niskom ili visokom ekspresijom IRF2 (Slika 3i ). Od 1926 slučajeva, otkrili smo da su NSCLC bolesnici sa niskom ekspresijom IRF2 imali niži postotak preživljavanja.

IRF2 funkcionira za suzbijanje NSCLC

Da bi se utvrdilo da li su biološki učinci IRF2 i miR-18a-5p jednaki ili ne, IRF2 je oboren pomoću siRNA i tada su detektirani proliferacija stanica, apoptoza i sposobnost migracije. Nakon 48 h, ekspresija IRF2 mRNA i proteina smanjila se za 50% u stanicama koje su bile transficirane siIRF2 (dopunske slike S2A i S2B). Nadalje, rezultati ispitivanja CCK-8 pokazali su da se sposobnost proliferacije NSCLC stanica značajno povećala nakon tretiranja siIRF2 (slika 4a). U skladu s tim, stopa apoptoze je inhibirana (slika 4b). Rezultati su također pokazali da je sposobnost migracije stanica poboljšana 48 sati nakon rušenja IRF2 (Slike 4c i d).

Image

IRF2 funkcionira za suzbijanje NSCLC. ( a ) Stanice H23, H1299 i A549 su transficirane s siNC ili siIRF2, a stanična proliferacija je određena CCK-8. ( b ) Distribucije apoptoze stanica H23, H1299 i A549 transficirane su siNC ili siIRF2 tokom 48 sati, a potom su detektirane protočnom citometrijom. ( c, d ) 48 h nakon transfekcije siNC ili siIRF2, rezultati ispitivanja zacjeljivanja rana i Transwell testova u stanicama H23, H1299 i A549. ( e, f ). Stanice H1299 i A549 kofeficirane su mimikom miR-18a-5p i pcDNA3.1 / pcDNA3.1-IRF2, a zatim staničnom migracijom podložnom ispitivanju transwell migracije i invazije, a stanična apoptoza otkrivena je 48 h kasnije analizom protočne citometrije., n = 3–4 neovisna eksperimenta, trake pogreške predstavljaju srednju vrijednost ± SEM * P <0, 05, ** P <0, 01, *** P <0, 001

Slika pune veličine

Da bismo istražili da li su učinci miR-18a-5p posredovani putem IRF2, transfektirali smo negativnu kontrolu (pcDNA3.1) ili ekspresijski vektor IRF2 (pcDNA3.1-IRF2) u stanice A549 ili H1299, koje su prekomjerno izražene miR-18a-5p. Ekspresija proteina IRF2 povećana je nakon transfekcije u stanicama A549 ili H1299 (dopunska slika S2C). Analizirani su i učinci prekomjernog ekspresije IRF2 na staničnu apoptozu i sposobnost migracije. Rezultati su pokazali dramatično da IRF2 preokreće funkciju prekomjerne ekspresije miR-18a-5p, što potiskuje apoptozu i potiče sposobnost migracije u stanicama A549 i H1299 (Slike 4e i f). Zaključno, ovi podaci sugeriraju da učinci IRF2 suzbijaju NSCLC promovirajući staničnu apoptozu, inhibirajući staničnu proliferaciju i sposobnost migracije.

MiR-18a-5p promiče autofagiju u NSCLC

Autofagija ima dvostrani učinak kod tumora. 14 To je razlog zbog kojeg smo istraživali učinak miR-18a na autofagiju. Kao što je prikazano na slici 5a, prekomjerna ekspresija miR-18a-5p značajno je izazvala nakupljanje točaka GFP / mRFP-LC3. Značajno je pojačana lipidna konjugacija slobodnog LC3-I s LC3-II povezanom s autofagičnom membranom i povećana BECN1 u ekstraktima stanica nakon prekomjerne ekspresije miR-18a (Slika 5b). Suprotno tome, razina ekspresije SQSTM1 je smanjena (Slika 5b). Autofagiju in vivo smo također otkrili imunohistokemijom koja je ukazivala da je LC-3B-II u tumorskim tkivima ksenografta povišen (Slika 6e). Da bi se utvrdilo da li miR-18a-5p regulira stvaranje autofagosoma ili protok autofagije, u pokusima je korišten Bafilomicin A1 (Baf A1), koji je poznati inhibitor posljednjih stupnjeva autofagije. Zanimljivo je da je učinak miR-18a-5p na autofagiju manje očit (slike 5a i b). Posljedično, takvi nalazi pokazuju da miR-18a povećava ne samo autofagosomsku formaciju, već i autofagijski tok.

Image

MiR-18a-5p promiče autofagiju u NSCLC. ( a ) MiR-18a-5p pojačao akumulaciju točaka GFP / mRFP-LC3 u stanicama A549. No, Baf A1 inhibirao je funkciju MiR-18a-5p. Stanice su transficirane mimikom NC ili miR-18a-5p i tretirane sa 100 n M Baf Al u trajanju od 24 h ( b ) Imunobloting analiza proteina razine miR-18a-stabilno prekomjerne ekspresije stanica A549 tretirane za 100 nM Baf A1 za 24 h. n = 3 neovisna eksperimenta, trake pogreške predstavljaju srednju vrijednost ± SEM * P <0, 05, ** P <0, 01, *** P <0, 001

Slika pune veličine

Image

MiR-18a-5p povećava rast tumora i metastaze in vivo . ( ac ) MiR-18a-stabilno prekomjerno eksprimirajuće A549 stanice (pLenti-miR-18a) i kontrolne stanice (pLenti) ubrizgavaju se u gole miševe. Krivulja rasta tumora prikazana je na slici 6a. Tumori ksenografta na golim miševima prikazani su na slici 6b, a težina tumora prikazana na slici 6c. ( d ) Ekspresija miR-18a-5p je otkrivena qRT-PCR u miR-18a stabilno prekomjerno eksprimirajući A549 stanice i negativne kontrolne stanice. ( e ) Ekspresija Ki67, E-kadherina, LC3B-II i EGFR u tumorskim tkivima izmjerena je imunohistokemijom. ( e ) Izraz IRF2 u tumorskim tkivima ocijenjen je western blotom. ( gi ) pluća miševa s metastaznim čvorovima prikazana su na slici 6g. Težina pluća i metastaza prikazani su na slikama 6h i i. ( j ) Histopatologija metastaza izazvanih mišjim plućnim tkivima bojenjem hematoksilinom i eozinom. Stupci pogreške predstavljaju srednju vrijednost ± SEM * P <0, 05, ** P <0, 01, *** P <0, 001

Slika pune veličine

MiR-18a-5p povećava rast tumora i metastaze in vivo

Na temelju uloge miR-18a-5p u NSCLC stanicama, njegove funkcije su također ispitivane in vivo . Goli miševi ubrizgani su subkutano stanicama A549 (5 × 106) koje su stabilno prekomjerno eksprimirale miR-18a (pLenti-miR-18a) ili kontrolirali (pLenti) 7 tjedana kasnije, nakon čega su analizirani sljedeći tumori. Rezultati su pokazali da su ksenografti A549 značajno porasli u rastu tumora. Prekomjerne ekspresije stanica miR-18a-5p također su povećale veličinu i težinu tumora nakon 7 tjedana nakon implantacije (Slike 6a i c). Nadalje, uočena je vidljiva regulacija u ekspresiji miR-18a-5p (slika 6d) i smanjena razina ekspresije IRF2 (slika 6f) u tumorskim tkivima iz skupine pLenti-miR-18a. Ekspresija Ki67, E-kadherina i receptora epidermalnog faktora rasta (EGFR) u tkivima tumora ksenografta mjerena je koristeći imunohistokemiju. Rezultati su pokazali značajnu regulaciju Ki67 i EGFR-a u tkivima tumora koji su prekomjerno eksprimirali miR-18a, praćeno smanjenjem ekspresije E-kadherina (Slika 6e).

Da bi istražili kako miR-18a djeluje na metastaze tumora in vivo , stanice su ubrizgane u repnu venu golih miševa. Nakon 7 tjedana ubrizgavanja repne vene, primijetili smo da su skupine prekomjerne ekspresije koje stvaraju masivne i zbijene metastatske čvorove, kontrolna skupina stvorila sitne i raspršene metastatske čvorove (Slike 6f-h). Bojenje hematoksilinom i eozinom pokazalo je da su gnijezda tumora izvedena iz skupina prekomjerne ekspresije izložena velikom području uništavanja i / ili nekroze plućnog tkiva, dok je kontrolna skupina formirala manje i manje gnijezda tumora (slika 6i). Ovi podaci pokazuju da miR-18a-5p može pospješiti rast tumora, metastaze i autofagiju.

Rasprava

MikroRNA igraju važnu ulogu u staničnoj proliferaciji i karcinogenezi. Neki mikroRNA djeluju kao onkogeni, dok drugi kao supresorski geni. Naš laboratorij potvrdio je da miR-34a, 15 miR-32 16 i miR-486-5p 17 mogu biti geni za supresiju tumora, dok miR-150 18 može biti onkogen. Oni su uključeni u mnogo složeniju regulacijsku mrežu u tumorigenezi raka pluća.

U ovom istraživanju potvrdili smo da miR-18a-5p potiče proliferaciju stanica i smanjuje migraciju izravno ciljajući IRF2. Budući da je disregulacija signala za put IRF-a jedna od najčešćih promjena koje se nalaze kod karcinoma i bolesti kod ljudi, uključujući 20 NSCLC. IRF2 smatra se jednim od najpoželjnijih meta terapije raka. 21, 22, 23

Nedavno se navodi da autofagija uglavnom igra ključnu ulogu u različitim ljudskim bolestima, posebice u raku. 24, 25 Kao vrlo važan fiziološki proces stanica raka, autofagija je uključena u stanični ciklus, rast stanica, invaziju stanica i metastaze. 26, 27, 28, 29 Otkrili smo da je miR-18a-5p kao autofagija uzrokovana onkogenom u NSCLC. Bolje potvrđena autofagija u vezi s karcinomom može otkriti nove strategije za terapiju tumora. EGFR je važan čimbenik koji sudjeluje u napredovanju NSCLC-a. 30, 31 EGFR utječe na brojne sustave uključene u onkogenezu. 32 Predložen je kao atraktivan i obećavajući cilj za liječenje protiv raka. 33 U našim slučajevima, prekomjerna ekspresija miR-18a bila je povišena autofhagija i pozitivna korelacija s ekspresijom EGFR-a in vivo .

Ukratko, naša se studija usredotočila na mehanizam miRNA-18a-5p i njegov potencijal kao dijagnostički biomarker u NSCLC. 34 Naši podaci podržali su hipotezu da miR-18a-5p može promovirati kancerogenezu da anti-miRNA može biti potencijalno novo liječenje NSCLC-a. Odvojena studija izvijestila je da miR-18a-5p povećava rast stanica tumora, 35, 36, 37 što potvrđuje koncept da miR-18a-5p može biti manje specifičan za tumor od ostalih miRNA, što ga čini pouzdanijom terapijskom strategijom. 38

Općenito, na temelju ovih rezultata zaključili smo da miR-18a-5p može upravljati rakom izravno ciljajući IRF2 (slika 7), a također može imati usku povezanost između signalnog puta p53 i NF- κ B (dopunska slika S3). 39, 40, 41 Naši nalazi pružili su potencijalno razumijevanje mehanizma kako miRNA utječu na onkogenezu karcinoma pluća, koja bi se u budućnosti mogla koristiti kao meta lijekova za dijagnostiku i terapijski tretman.

Image

Model koji prikazuje učinak miR-18a-5p u NSCLC. MiR-18a-5p potiče onkogenu funkciju u NSCLC kroz smanjivanje IRF2. Prekomjerna ekspresija miR-18a-5p značajno je inducirala autofagiju i pozitivnu povezanost s razinama EGFR-a

Slika pune veličine

Materijali i metode

Stanična kultura

Ljudska stanična linija epitela pluća BEAS-2B i humana NSCLC stanična linija A549 dobiveni su od Cell Bank, China Academy of Sciences (Shanghai, Kina). Stanične linije H23, H1299 i H1650 dobivene su iz Američke kolekcije tipičnih kultura (ATCC, Manassas, VA, USA). Sve stanice A549 uzgajane su u mediju DMEM (Corning Cellgro, Manassas, VA, SAD) uz dodatak 10% fetalnog goveđeg seruma (FBS, Gibco, Gaithersburg, MD, SAD). Stanice H23, H1299 i H1650 kultivirane su u mediju RPMI 1640 (Corning Cellgro) uz dodatak 10% FBS (Gibco). BEAS-2B stanice su kultivirane u LHC mediju (Gibco) uz dodatak 10% FBS (Gibco). Uvjeti kulture za sve stanice bili su na 37 ° C u vlažnoj atmosferi 5% C02.

Uzorci tkiva

Šezdeset i tri para humanih NSCLC uzoraka dobiveno je iz šangajske bolnice na prsima koja je povezana sa šangajskim sveučilištem Jiao Tong i uz odobrenje etičkog povjerenstva šangajske bolnice. Pojedinosti svih uzoraka korištenih u ovom radu navedene su u Dodatnoj tablici S1.

Transfekcija

Stanice H23, H1299 i A549 su prolazno transficirane mimikom miR-18a-5p, mimikom negativne kontrole (NC), miR-18a-5p inhibitorom, IRF2 siRNA (siIRF2) ili negativnom kontrolom siRNA (siNC) (RIBOBIO, Guangzhou, Kina ) upotrebom Invitrogen ™ Lipofectamine 2000 (Life Technologies, New York, SAD), u skladu s preporukama proizvođača. Nakon 24–48 h nakon transfekcije, stanice su korištene za naknadne eksperimente, uključujući ispitivanja za proliferaciju i analizu staničnog ciklusa.

Izolacija RNA, obrnuta transkripcija i kvantitativni PCR u stvarnom vremenu

Ukupna RNA izolirana je koristeći Trizol reagens (Sangon Biotech, Šangaj, Kina), a sinteza cDNA izvedena je s SYBR PrimeScript miRNA RT-PCR Kit i PrimeScript RT Master Mix (Takara Biotech, Otsu, Japan), slijedeći upute proizvođača za svaki reagens ili kit. Analiza miRNA i mRNA pomoću qRT-PCR pomoću SYBR GreenII (Takara Biotech) izvedena je prema protokolu proizvođača, sa sustavom CFX96 TM u stvarnom vremenu (Bio-Rad, Kalifornija, SAD). Relativna kvantifikacija miR-18a-5p dobivena je normalizacijom do nivoa ekspresije U6, a relativno kvantitativno određivanje IRF2 dobiveno je normalizacijom do 18 nivoa ekspresije S rRNA. Razine ekspresije mRNA i miRNA određene su metodom 2 -ΔΔCt za relativno kvantificiranje ekspresije gena. ΔCt i ΔΔCt izračunati su pomoću sljedećih formula: ΔCt = Ct miR-18a-5p - Ct U6 ili Ct IRF2 - Ct 18S i ΔΔCt = ΔCt slučaj - ΔCt kontrola .

Izgradnja vektora rekombinantne ekspresije

Ukratko, pri-miR-18a slijed je digestiran s BamH I i Xhol I, zatim je kloniran u pLenti vektor (Invitrogen, Carlsbad, CA, SAD) i nazvan pLenti-miR-18a. CDS sekvence IRF2 kloniraju se u pcDNA3.1 (-) plazmid, formirajući pcDNA3.1-IRF2. Sekvence primera korištene u ovom istraživanju prikazane su u Dodatnoj tablici 2.

Analiza stanične proliferacije

Stanična proliferacija mjerena je testnim kitom CCK-8 (Dojindo, Tokio, Japan). Šest sati nakon transfekcije, stanice su stavljene u mikroploču s 96 jažica (Corning Incorporated, New York, USA) i inkubirane na 37 ° C u 5% CO2. Svaka podatkovna točka predstavlja mjerenje triju ponovljenih jažica. Nakon 24, 48 i 72 h kulture, 8 μl otopine CCK-8 je dodano u svaku jažicu sa 100 μl medija bez seruma i zatim je inkubiran 90 min. Konačno, apsorbancija je izmjerena na 450 nm korištenjem multifunkcijskog enzimski povezanog analizatora FLx8 (BioTek, Vermont, SAD).

Test stanične apoptoze

Nakon 48 sati transfekcije, stanice H23, H1299 i A549 prikupljene su za ispitivanje. Prilog za detekciju apoptoze V-fluoresceina izotiocijanata (FITC) (BD Pharmingen, San Diego, Kalifornija, SAD) upotrijebljen je prema uputama proizvođača da bi se utvrdila razina apoptoze stanica. Apoptotičke stanice analizirane su korištenjem MoFlo XDP protočnog citometra (Beckman Coulter, Inc., Brea, CA, USA).

Test stanične migracije

Migracija stanica H23, H1299 i A549 in vitro testirana je korištenjem Transwell komore (Corning Incorporated, New York, USA) s polikarbonskom membranom (veličina pora 8 µm). Nakon 24 sata transfekcije, 1 × 105 stanica dodano je u gornju komoru sa 100 μl medija bez seruma, a 600 μl medija sa 10% FBS je dodano u donju komoru. Stanice su kultivirane 24 sata na 37 ° C. Tada su komore dvaput isprane od PBS-a. Na kraju, prebrojite broj ćelije nakon bojenja s kristalno ljubičastom bojom.

Za ispitivanje zacjeljivanja rana, zagađene stanice su zasijane u 24 jažice i kultivirane do 100%. Potom je sterilnim vrhom pipete napravljen ranu s jednom ogrebotinom u sredini jažice. Stanične krhotine uklonjene su ispiranjem s PBS-om i stanicama je ostavljeno da rastu u mediju bez seruma. Udaljenost migracije stanica procijenjena je i fotografirana 24 sata mikroskopom (Nikon, Tokio, Japan).

Dvostruki test izvješća luciferaze

Konstrukcija luciferaze IRF2 WT 3'-UTR krijesnica (pGL3-IRF2 WT 3'-UTR) generirana je umetanjem fragmenta od 1502 bp do 1775 bp ljudskog IRF2 3'-UTR u Xba I / Eco RI mjesta pGL3 vektor izvještaja luciferaze. Konstrukcija pGL3-IRF2 mut 3'-UTR nastala je mutacijom komplementarnog slijeda sjemena miR-18a-5p veznog područja. Stanice HEK293T kofeficirane su sa 150 ng pGL3-IRF2 WT 3'-UTR ili pGL3-IRF2 mut 3'-UTR luciferaze reporter, i 15 ng renilla luciferaze reporter (pRL), i konačna koncentracija 100 n M miRNA NC ili miR-18a-5p oponaša korištenje Invitrogen ™ Lipofectamine 2000 (Life Technologies). Stanice se inkubiraju tokom 48 sati, a aktivnost luciferaze testira se s Orion II iluminometrom za mikroploče (Titertek-Berthold, Južni San Francisco, Kalifornija, SAD) prema uputama proizvođača. Jedinice luciferaze Firefly su normalizirane u odnosu na jedinice luciferaze Renilla da bi se kontrolirala učinkovitost transfekcije. Relativne aktivnosti izražene su kao promjena promjene aktivnosti luciferaze.

Western blot analiza

Ukupni protein ekstrahiran je pomoću RIPA pufera za lizu (CWBIO, Peking, Kina) i kvantificiran Bradford testom. 42 Jednake količine proteina iz svakog uzorka podvrgnute su SDS-PAGE elektroforezi i prenesene na polivinililiden fluoridnu membranu (Millipore Corporation, Billerica, MA, SAD). Membrana je zatim natopljena fiziološkom otopinom puniranom trisom s Tween-20 (TBST, 150 m M NaCl, 20 m M Tris-HCl pH 8, 0, 0, 05% Tween-20) koji je sadržavao 5% goveđeg serumskog albumina 1 sat na sobnoj temperaturi, nakon čega slijedi lagano mućkanje i naknadna inkubacija sa specifičnim antitijelima protiv IRF2 ili P- aktina (1: 1000, Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA) na 4 ° C preko noći. Nakon toga, membrana se ispere i inkubira 1 sat na sobnoj temperaturi sa sekundarnim antitijelom povezano s hromom peroksidazom (HRP) (1: 10000, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, Kalifornija, SAD). Trake proteina detektirane su pomoću hemiluminiscentnog HRP supstrata (Millipore Corporation) i analizirane programom Image Lab za analizu (Bio-Rad). IRF2 je normaliziran u p- aktin i izrazio je u postotku od kontrole.

Izgradnja i infekcija lentivirusa

pLenti-miR-18a ili pLenti vektor je kofeficiran u HEK293T s psPAX2 i pMD2G. Virusne čestice su sakupljene 48 h i 72 h kasnije, centrifugirane su ih pri 4000 o / min tijekom 5 minuta na 4 °, zatim filtrirane kroz 0, 45 μm filtera. Stanice su transficirane s pLenti-miR-18a ili pLenti i sortirane za zelenu fluorescenciju protočnom citometrijom.

Analize autofagije konfokalnom mikroskopijom

Četrdeset osam sati nakon transfekcije miR-18a-5p mimikom i pGTLV-EGFP-mRFP-LC3 virusom prebrojao je ukupni broj transficiranih stanica GFP-LC3. Stanice promatrane pod konverzalnom mikroskopijom za lasersko skeniranje (Occult International Ltd, Njemačka) brojale su broj bodova pozitivnih GFP-LC3.

Testiranje ksenograftta tumora / metastatski test in vivo

Šest tjedana starije gole miševi kupljeni su u laboratorijskom centru za životinje SLRC (Šangaj, Kina). Životinje su smještene nasumično u dvije skupine i svaki je goli mišev ubrizgan supkutano u desni bok s 1 milijun A549 stanica koje stabilno prekomjerno eksprimiraju miR-18a (pLenti-miR-18a) ili kontrolu (pLenti) u 100 µl DMEM medija za uspostavljanje model ksenografta potkožnog tumora. Tumori su mjereni tjedno kalibarima, a količina tumora izračunata je po formuli: volumen = dužina × širina 2/2. Milion stanica u 100 µl DMEM medija ubrizgano je u repnu venu, a 7 tjedana kasnije miševi su ubijeni i izolirana su plućna tkiva. Procjena težine plućnog tkiva korištena je za utvrđivanje metastaza. Tkiva pluća podvrgnuta su serijskom presjeku, a zatim bojenjem hematoksilinom i eozinom. Patološke promjene primijećene su pod svjetlosnim mikroskopom (Nikon, Tokio, Japan). Sve eksperimentalne protokole odobrio je Odbor za institucionalnu njegu i uporabu životinja Sveučilišta u Šangaju (Shanghai, Kina). Životinje korištene u ovom istraživanju su humano tretirane.

imunohistokemija

Rast tumora procijenjen je imunohistokemijskim bojenjem Ki-67, E-kadherina i LC3-II. Biopsije tumora su fiksirane formalinom, ugrađene u parafin i izrezane na dijelove od oko 4 μm. Zatim su uzorci deparafinizirani i dehidrirani s ksilonom i stupnjevanim alkoholima, te naknadno rehidrirani demineraliziranom vodom. Imunohistohemija je izvedena korištenjem mikrovalne pećnice za prethodno liječenje dijapozitiva za dobivanje antigena. Primijenjena su primarna antitijela protiv Ki-67, E-kadherina i LC3-II (1: 500, tehnologija staničnog signalizacije), zajedno s protutijelama konjugiranim kozjim HRP-om protiv zeca, a proteini su vizualizirani in situ s 3, 3'- diaminobenzidinska reakcijska otopina.

Statistička analiza

Statističke analize provedene su korištenjem softvera SPSS v.19.0, a prezentacije grafova završene su pomoću GraphPad Prism 5 softvera. Rezultati su prikazani kao srednja vrijednost ± SEM, a razlika između dvije eksperimentalne skupine procijenjena je korištenjem Student-ovog t- testa, sa statističkom značajnošću definiranom kao P <0, 05.

Dodatna informacija

Word dokumenti

  1. 1.

    Dopunske slikovne legende

  2. 2.

    Dopunska tablica 1

  3. 3.

    Dopunska tablica 2

Datoteke slika

  1. 1.

    Dopunska slika 1

  2. 2.

    Dopunska slika 2

  3. 3.

    Dopunska slika 3

    Dodatne informacije nalaze se u ovom radu na web stranici Cell Death and Disease (//www.nature.com/cddis)