Mir-221 potiče razvoj neovisnosti androgena u stanicama karcinoma prostate putem smanjivanja hectd2 i rab1a | onkogena

Mir-221 potiče razvoj neovisnosti androgena u stanicama karcinoma prostate putem smanjivanja hectd2 i rab1a | onkogena

Anonim

teme

  • Terapijska otpornost na rak
  • Hormonski receptori
  • miRNAs
  • Rak prostate

Sažetak

Hormonski osjetljiv rak prostate obično napreduje do kastracijskog karcinoma prostate (CRPC) nakon terapije lišavanjem androgena. Istražili smo utjecaj mikroRNA (miRs) na prelazak raka prostate u CRPC. MiR-221 / -222 bio je izrazito eksponiran u uzorcima tumora metastaziranih CRPC u kostima. Prethodno smo pokazali da prolazna prekomjerna ekspresija miR-221 / -222 u LNCaP potiče razvoj fenotipa CRPC. U trenutnoj studiji, pokazali smo da stabilno prekomjerno eksprimirajući miR-221 omogućava rast stanica stanica androgena (AI) u LNCaP spašavajući stanice LNCaP iz zaustavljanja rasta u fazi G1 zbog nedostatka androgena. Prekomjerno eksprimiranje miR-221 u LNCaP smanjilo je transkripciju podskupine gena koji reagiraju na androgene bez utjecaja na integritet androgenih receptora (AR) ili AR-androgena. Provođenjem sustavnih biokemijskih i bioinformatičkih analiza identificirali smo dva miR-221 cilja, HECTD2 i RAB1A, koji bi mogli posredovati u razvoju fenotipa CRPC u više ćelijskih linija karcinoma prostate. Smanjenje regulacije HECTD2 značajno je utjecalo na transkripciju uzrokovanu androgenom i AR-om, a regulacija HECTD2 ili RAB1A pospješuje rast AI stanica. Kao rezultat povišene ekspresije miR-221, ekspresija mnogih gena staničnog ciklusa je izmijenjena i aktivirani su putovi koji promoviraju epitelijsku mezenhimsku tranziciju / metastazu tumora. Pretpostavljamo da je glavna biološka posljedica pojave miR-221 reprogramiranje AR signalizacije, što zauzvrat može posredovati u prijelazu na CRPC fenotip.

Uvod

Rak prostate (CaP) najčešće je dijagnosticiran rak koji nije u koži kod američkih muškaraca. 1 signalizacija receptora androgena (AR) ima kritičnu ulogu u razvoju i diferencijaciji normalnih stanica prostate i CaP. 2 Terapija lišavanjem androgena predstavlja najučinkovitiju terapiju za bolesnike s CaP-osjetljivim na hormone. Međutim, pacijenti se stalno ponavljaju s agresivnijim karcinomom prostate otpornim na kastraciju (CRPC). 3 Mehanizmi pomoću kojih se androgena signalizacija modificira u CRPC-u uključuju mutacije i pojačavanje AR, intumumorsku proizvodnju androgena, promijenjene izraze koaktivatora / jezgre, AR-varijante spajanja, AR reprogramiranje, mehanizme neovisne o AR / ovisne o AR-u, kao i AR-neovisne mehanizme, 4, 5, 6 Otkrili smo da mikroRNA (miRs) imaju presudnu ulogu u regulaciji funkcije AR-a tijekom razvoja CRPC-a. 7, 8

MiR su skupine prirodnih jednolančanih malih nekodirajućih RNA od 19-25 nt i negativno reguliraju ekspresiju gena. 9 Zreli miR povezan je s proteinskim kompleksom zvanim miRISC (miR-inducirani prigušivački kompleks), koji obično sadrži argonautni protein (AGO) i vrši prigušivanje miR ciljnih gena. 10 Izmijenjene razine miRs ili disfunkcija miR putova utječu na raznolike stanične procese, što dovodi do ljudskih bolesti uključujući rak. 11

Nekoliko izvještaja podrazumijevalo je specifične uzorke ekspresije miR povezanih s tumorigenezom i stupnjem tumora u humanom CaP. 12, 13 Istražili smo molekularne odrednice uključene u transformaciju hormonalno osjetljivog CaP-a u CRPC i identificirali miR potpise u ljudskom CRPC-u. 7, 8 Provodeći sveobuhvatnu analizu izraza miR izraza u staničnoj liniji LNCaP ovisnoj o androgenu i staničnoj liniji nezavisnoj od AN LNCaP-LNCaP-Abl, identificirali smo skup od sedam miR koji su različito izraženi. 7 Među tim miRsima, izraz miR-221 / -222 bio je najdramatičnije reguliran u LNCaP-Abl. Daljnja funkcionalna ispitivanja pokazala su da prolazno povećana ekspresija miR-221 / -222 u LNCaP smanjuje rast stanične inducirane dihidrotestosteronom (DHT) i PSA-posredovanu AR-ekspresiju. 7 Ekspresija miR-221 / -222 također je značajno regulirana u metastatskim uzorcima tumora na ljudskoj kosti. 8 Hipotetirali smo da ekspresija miR-221 / -222 može imati presudnu ulogu u utjecaju na strojeve za signalizaciju AR i reprogramiranje AR-posredovane transkripcije, što rezultira doprinosom AI fenotipa.

Utvrđena je regulacija miR-221 / -222 u različitim ćelijama raka 14, 15 i činilo se da je povezana sa FRAtipom rezistentnim na TRAIL u čovjekovu ne-staničnom karcinomu pluća i s tamoksifenom ili fulvestrantnom rezistencijom u karcinomu dojke. 16, 17, 18, 19 Koji su ciljevi miR-221 / -222 uključeni u razvoj rezistencije na terapiju u različitim bolestima. Trenutno su izvijestili da su p27 / kip1, p57 / kip2, c-kit, Bim, ERα, PTEN, TIMP3, PUMA i sl. Ciljevi miR-221 / -222 koji su uključeni u napredovanje ili razvoj karcinoma. 14, 15, 16, 18, 19, 20, 21 U sustavima ćelijskih modela utvrdili smo da izgleda da ti poznati miR-221 / -222 ciljevi nisu uključeni u fenotip CRPC (dopunska slika S1).

U ovom istraživanju primijenili smo biokemijske i bioinformatičke pristupe za sustavno seciranje ciljnih mreža miR u LNCaP i LNCaP-Abl. Identificirali smo HECTD2 i RAB1A kao miR-221 / -222 ciljeve uključene u izmjenu AR signalizacije i poticanje rasta AI tijekom razvoja CRPC-a.

Rezultati

Prekomjerna ekspresija MiR-221 pospješuje rast AI stanica

Korištenjem ispitivanja prolazne transfekcije, prethodno smo pokazali da prekomjerna ekspresija miR-221 / -222 u LNCaP potiče razvoj fenotipa CRPC. 7 Zatim smo generirali LNCaP stanice stabilno ekspresionirajući miR-221 pomoću pcDNA3.1-miR-221 plazmida za prekomjernu ekspresiju. Transficirane stanice su održavane i odabrane Geneticinom u redovitom mediju koji sadrži serumsku razinu androgena. Dvadeset i pet od 47 izoliranih klonova imalo je 10 puta veću miR-221 ekspresiju od one u roditeljskom LNCaP. Odabrali smo tri klona, ​​označena kao LNCaP-221 # 3, - # 25 i - # 38, koji izražavaju miR-221 na razini koja je usporediva s onom u LNCaP-Abl, za daljnje proučavanje (Slika 1a).

Image

MiR-221 ekspresija potiče androgeni neovisni rast. ( a ) Kvantitativna potvrda PCR ekspresije miR-221 u LNCaP, LNCaP-Abl, LNCaP-miR-221 staničnim linijama (# 3, # 25 i # 38) i LNCaP-pcDNA (LNCaP transfektiran sa kontrola vektora). Razine ekspresije bile su relativne u odnosu na LNCaP, koji je proizvoljno postavljen kao 1.0. ( b ) Krivulja rasta LNCaP (crne čvrste linije), LNCaP-Abl (prekinute crne čvrste linije) i LNCaP-miR-221 stabilne ekspresije staničnih linija (# 3, # 25 i # 38; zelene, crvene i plave linije, respektivno) i LNCaP-pcDNA (žute linije) u mediju sa serumom tretiranim ugljenom (CFBS, lijevo) i redovitim medijem (fetalni goveđi serum, desno) tijekom 5-dnevnog vremenskog trajanja. Svaka točka predstavlja sredinu triju neovisnih vrijednosti sd ( c ) analizom staničnog ciklusa protočnom citometrijom. LNCaP, LNCaP-Abl, LNCaP-miR-221 prekomjerni ekspresori i LNCaP-pcDNA stanične linije zadržani su u mediju tretiranom ugljenom (CFBS, lijevo) 4 dana prije analize ili u redovitom mediju (fetalni goveđi serum, desno). Stupci pogreške pokazuju ± sd, * P <0, 05 po studentskom t- testu. ( d ) Western blot analiza AR, PSA, PLZF, EZH2 i cdc20 u LNCaP, LNCaP-Abl, LNCaP-miR-221 prekomjerno eksprimirajućim staničnim linijama (# 3, # 25 i # 38). Razina β-aktina korištena je kao kontrola opterećenja.

Slika pune veličine

Prvo smo utvrdili da li ove miR-221 stanične ekspresije staničnih linija dobro rastu bez androgena i na taj način očituju rastne karakteristike CRPC-a. Slično kao LNCaP-Abl, LNCaP-221 # 3, # 25 i # 38 uspjeli su rasti u mediju osiromašenom androgenom (slika 1b, lijeva ploča), dok su roditeljski LNCaP i LNCaP transficirani vektorskom kontrolom (LNCaP- pcDNA) slabo je rasla u nedostatku androgena. Sve stanične linije pokazale su sličnu učinkovitost rasta u mediju koji sadrži redoviti serum (slika 1b, desna ploča). LNCaP-miR-221 ćelijske linije prekomjerne ekspresije mogu se održavati i pasirati u mediju sa oštećenim androgenima 25-30 dana. Međutim, produljeni prolazak u odsutnosti androgena na kraju je doveo do smrti.

Jedan model koji bi mogao objasniti rast CRPC-a jest da CRPC stanice aktiviraju putove zaobilazeći zaustavljanje staničnog ciklusa uzrokovano uskraćivanjem androgena. 22 Stoga smo usporedili omjere staničnih populacija u različitim fazama staničnog ciklusa protočnom citometrijom, u prisutnosti ili odsutnosti androgena u različitim staničnim linijama. U regularnom mediju, omjer Gl: S: G2-M u LNCaP bio je 6: 1: 2 (slika 1c, desna ploča); dok je u mediju punjenom androgenom većina stanica LNCaP (> 90%) uhićena u fazi G1. LNCaP-Abl, koji se redovito održava u odsustvu androgena, pokazao je 8: 1: 2 za G1: S: G2-M (slika 1c, lijeva ploča). LNCaP-miR-221 ćelijske linije prekomjerne ekspresije redovito se održavaju u prisutnosti androgena (redoviti medij). Međutim, iscrpljujući androgeni nisu značajno promijenili raspodjelu LNCaP-miR-221 stanica prekomjerne ekspresije u različitim stadijima staničnog ciklusa (G1: S: G2-M = 7-8: 1: 2 prije i nakon uklanjanja androgena, slika 1c). Ovaj rezultat ukazuje da je povišena ekspresija miR-221 spasila LNCaP stanice od zaustavljanja rasta u G1 fazi zbog nedostatka androgena, što je rezultiralo poticanjem rasta AI.

Prethodno smo pokazali da prolazna regulacija ekspresije miR-221 / -222 u LNCaP smanjuje AR-posredovanu PSA ekspresiju. 7 Da bismo dodatno istražili utjecaj prekomjerne ekspresije miR-221 na transkripciju posredovanu AR-om, ispitali smo razinu ekspresije AR-a i nekoliko dobro karakteriziranih gena koji reagiraju na androgene, PSA, PLZF, 23 cdc20 22 i EZH2 24 (Slika 1d). Na razinu ekspresije AR proteina nije značajno utjecao stabilna prekomjerna ekspresija miR-221. Međutim, ekspresija PSA gotovo je ukinuta u tri LNCaP-miR-221 stanično ekspresionirajuće stanične linije, čak i u prisutnosti androgena, slično kao u LNCaP-Abl. Također smo primijetili povišenje EZH2 i cdc20 u miR-221 ćelijskim linijama prekomjernog pritiska, usporedivo s razinom LNCaP-Abl. Iznenađujuće, na ekspresiju ARZ-kontroliranog PLZF-a u staničnim linijama prekompresije LNCaP-miR-221 nije utjecala prekomjerna ekspresija miR-221, dok je ekspresija PLZF-a dramatično smanjena u LNCaP-Abl u usporedbi s LNCaP. Obrazac ekspresije gena koji reagiraju na androgene ukazivao je da su LNCaP-miR-221 stanične prekomjerne ekspresije slične, ali ne baš iste kao LNCaP-Abl.

Ponovno reguliranje miR-221 izmijenilo je obrazac ekspresije mnogih kontrolnih gena staničnog ciklusa

Da bismo temeljito razumjeli utjecaj prekomjerne ekspresije miR-221 na globalnu ekspresiju gena, uspoređivali smo profile ekspresije gena cijelog gena LNCaP i LNCaP-miR-221 prekomjerno eksprimirajuće stanične linije (LNCaP-Abl i LNCaP-221 # 25), a potom slijedi Analiza genske ontologije (GO). U svih 302 regulirana gena (povećani nabor> 2, 0, P <0, 001) u LNCaP-221 # 25 u usporedbi s LNCaP, 'stanični ciklus' i 'M faza' bili su top biološki procesi GO ( P = 1, 0 × 10 -17 ili 1, 4 × 10 - 19, Fisher-ove točne P- vrijednosti, u nastavku, slika 2a). Slično, LNCaP-Abl je također pokazao značajno obogaćenu razinu gena „staničnog ciklusa“ ( P = 2, 2 × 10 −8 ) ili „M-faza“ gena ( P = 3, 2 × 10 −9 ) u svih 363 neregulisanih gena (slika 2b), Uz to, čini se da je većina 81 gena, koji su regulirani i u LNCaP-Abl i u LNCaP-221 # 25, uključeni u "stanični ciklus" (pogrešna stopa otkrivanja (FDR) = 2, 4 × 10 -5 ) i "M faza" (FDR = 9, 2 × 10 -5 ; Slika 2b).

Image

LNCaP-miR-221 prekomjerno izražavanje staničnih linija selektivno je reguliralo skup gena staničnog ciklusa / M faze. ( a ) Usporedba postotaka gena staničnog ciklusa i M-faza u svim reguliranim genima u LNCaP-miR-221 stanično ekspresivnim staničnim linijama (# 25) i LNCaP-Abl. P- vrijednosti su bile od t- testa učenika. ( b ) Vennov dijagram koji prikazuje GO analizu reguliranih gena i u LNCaP-Abl i u LNCaP-221 # 25. ( c ) Toplinska karta normaliziranih razina ekspresije mRNA odabranih gena staničnog ciklusa. Genske grupe su izvađene iz LNCaP, LNCaP-Abl i LNCaP-221 # 25 bez DHT (0) ili s DHT tretmanom 4 h 4 ili 24 h. 24 Prikazani su podaci iz tri neovisna eksperimenta. Crvena i plava boja predstavljaju reguliranje i smanjivanje vrijednosti. ( d ) Potvrda izraza kvantitativnom PCR analizom u realnom vremenu za UBE2C, cdk1, cdc20 i Cyclin B1. Stupci pogreške pokazuju ± sd N = 3.

Slika pune veličine

Naizmjenične ekspresije potpisa svih gena regulatora ključnog staničnog ciklusa ili kontrolne točke dodatno su uspoređene prije i nakon tretmana androgenima i između različitih staničnih linija 25, 26 (Slika 2c). Značajno je da je velik dio gena staničnog ciklusa, koji su uključeni u gene G2 faze i G2 / M fazni prijelaz ili M-fazni stanični ciklus, značajno povišen u LNCaP-Abl i LNCaP-221 # 25 (Slika 2c). Wang i sur. 22 su ranije otkrili da su UBE2C, cdk1, cdc20 i Cyclin B1 bili visoko izraženi u LNCaP-Abl, a smatra se da njihov visoki izraz doprinosi rastu AI. Ti geni su nazvani AR selektivno reguliranim genima staničnog ciklusa M-faze. 27 Otkrili smo da su UBE2C, cdk1, cdc20 i Cyclin B1 također dramatično regulirani u LNCaP-221 # 25, kako je potvrđeno pomoću TaqMan kvantitativnog PCR-a (slika 2d). Hipotetizirali smo da je regulacija miR-221 regulirala neke mir-221 ciljeve, koji su možda sudjelovali u povišenoj ekspresiji skupa ciklina, što dovodi do pojačanog rasta AI stanica.

Prekomjerna ekspresija miR-221 smanjila je transkripciju uzrokovanu androgenom i AR-om bez utjecaja na integritet AR ili AR-androgena

GO analiza 101 gena koji su oboreni u LNCaP-Abl i LNCaP-221 # 25, nasuprot onima u LNCaP (smanjeni ekspresijski nabor> 2, 0, P <0, 001), otkrila je da geni sudjeluju u "adheziji stanica-stanica" (za na primjer, P-kadherin i kadherin sličan, FDR <10 -9 ) i 'hormonski stimulirani odgovori' (na primjer, PSA i TMPRSS2, FDR = 0, 1) bile su gornje dvije široke GO kategorije (slika 3a). Daljnja usporedba uzorka ekspresije svih gena koji reagiraju na androgene pokazala je da je ∼ 50% gena, koji su DHT inducibilni u LNCaP i značajno potisnuti u LNCaP-Abl, smanjeno u LNCaP-221 # 25, uključujući PSA i TMPRSS2 (Slika 3b). 28, 29

Image

Ekspresija MiR-221 utječe na ekspresiju podskupine gena koji reagiraju na androgene. ( a ) Vennov dijagram koji prikazuje GO analizu gena koji su oboreni u LNCaP-Abl i LNCaP-221 # 25. ( b ) Normirana toplotna karta koja uspoređuje razinu ekspresije gena koji reagiraju na androgene u LNCaP, LNCaP-Abl i LNCaP-221 # 25 tretirani bez DHT (0) ili s 10 n M DHT tokom 4 h 4 ili 24 h. 24 Potpis 94 gena sadrži gene izazvane androgenom i represiju. Prikazani su podaci tri neovisna pokusa. Crvena i plava boja predstavljaju reguliranje i smanjivanje vrijednosti. ( c ) Usporedba postotaka smanjenja vrijednosti AR reguliranih gena za potpis u LNCaP-Abl i LNCaP-221 # 25. Značaj je određen studentskim t- testom.

Slika pune veličine

Korištenjem AR-reguliranog potpisa gena definiranog prisutnošću mjesta za vezanje AR-a u blizini genskog lokusa, 30 dodatno smo analizirali regulirane gene u prekomjernim ekspresorima LNCaP-miR-221 (Slika 3c). AR regulirani geni u LNCaP statistički su značajno potisnuti i u LNCaP-Abl i u LNCaP-221 # 25 (sve P- vrijednosti <10 -5 ). Iako su AR uregulirani geni imali veću vjerojatnost da će biti potisnuti u LNCaP-Abl nego u LNCaP-221 # 25 (slika 3c), što ukazuje da je aktivnost AR bila samo djelomično oslabljena u LNCaP-miR-221 stanično ekspresivnim staničnim linijama. Kako je poznato da je LNCaP-Abl pretrpio znatan stupanj epigenetske promjene, pretpostavili smo da veliki dio izmijenjenog programa AR-a u LNCaP-Abl možda neće upravljati miR-221 / -222.

Nadalje smo istražili nekoliko potencijalnih mogućnosti koje mogu utjecati na procese u funkciji AR-a. Prvo smo usporedili transkripcijsku efikasnost vođenu PSA promotorom ili elementima koji prozivaju PSA i reagirajuće na androgene uporabom reportera luciferaze 31 (dopunska slika S2A). U LNCaP-Abl i LNCaP-221 # 25, DHT tretman nije uspio značajno potaknuti transkripcijske aktivnosti iz ovih reporterskih konstrukcija (dopunska slika S2B). Usporedili smo i AR popunjenost na PSA (dopunska slika S2C, gornja ploča, dodatna tablica S2) i TMPRSS2 (dopunska slika S2C, donja ploča, dopunska tablica S2) regulatornih područja promotora u LNCaP, LNCaP-Abl i LNCaP-miR-221 prekomjerno izražavanje staničnih linija pomoću ispitivanja imunoprecipitacije AR kromatina (ChIP). Pokazalo je da u LNCaP-miR-221 staničnim linijama prekomjerne ekspresije, sposobnost AR vezanja na element koji reagira na androgen na PSA ili TMPRSS2 lokusu nije utjecala, a vezanje AR-a pojačano na AD za regije promotora / pojačivača PSA nije olakšalo transkripciju djelotvornost kod gena PSA ili TMPRSS2. Da isključimo mogućnost da na integritet samog AR može utjecati prekomjerna ekspresija miR-221, potvrdili smo da translokacija AR-a u jezgru liječenjem DHT-om i fosforilacija AR-a nisu promijenjeni u LNCaP-miR-221 staničnim linijama prekomjerne ekspresije (dopunske slike S3 i S4). Svi ovi rezultati sugeriraju da prekomjerna ekspresija miR-221 ne može utjecati na AR integritet. Dakle, oslabljena ekspresija podskupina gena reguliranih AR-om uzrokovana povećanjem miR-221 najvjerojatnije nije posljedica oštećenja temeljne funkcije AR-a, već je mogla biti posljedica disfunkcije faktora povezanih s AR-strojevima,

Višestruki ciljni geni miR-221 istovremeno su uključeni u razvoj neovisnosti androgena u LNCaP-miR-221 ćelijskim linijama prekomjerne ekspresije.

MiRs se vežu na 3 'netransliranu regiju (UTR) i smanjuju ekspresiju njihovih ciljnih gena smanjujući stabilnost ciljnih mRNA, što dovodi do smanjene razine stacionarnih mRNA i / ili inhibiranjem efikasnosti prevođenja ciljnih mRNA. 32 Uveli smo dva pristupa za identifikaciju miR-221 / -222 ciljeva uključenih u AI fenotip. Prvi pristup bio je filtriranje i odabir gena čije je obim mRNA smanjen zbog ekspresije miR-221 na visokoj razini u staničnim linijama prekompresije LNCaP-miR-221 i u LNCaP-Abl (potisnuto dvostruko; P- vrijednost <0, 001) od potencijalnih ciljeva miR-221/222 identificiranih pomoću najmanje dva algoritma predviđanja 'miRanda', 'TargetScan' i 'PicTar'. 33, 34, 35 Ovaj pristup identificirao je jednu metu, AMMECR1, koja je gen povezan s Alport sindromom i nalazi se na X kromosomu 36 (Dodatna tablica S1). Daljnje funkcionalne studije pokazale su da razina ekspresije AMMECR1 nije značajno utjecala na AR-posredovanu PSA transkripciju i stanični rast LNCaP (dopunska slika S5).

Drugi je pristup bilo izravno pročišćavanje afiniteta ciljnih mRNA koje su povezane s miR – RISC kompleksom. 32 Koristili smo anti-AGO-RIP-ChIP pristup opisan od strane Wang i sur. , 37 koji koristi anti-AGO za miRNP koji sadrže IP AGO i pridružene mRNA. MiRNP-ovi u ukupnim staničnim lizatima LNCaP-miR-221 ili -222 prolaznih stanično ekspresivnih staničnih linija su istovremeno imunoprecipitirani anti-AGO i profilisani. Kao kontrole, paralelno su provedeni LNCaP transficirani kontroverznom kontrolom prekursora miR i IP-ed sa neimunim serumom. Poznati cilj miR-221 / -222, p27 / kip1, korišten je za optimizaciju učinkovitosti AGO-RIP-ChIP miR-221RNP (vidi dodatnu sliku S6). Ukupno je 315 jedinstvenih genskih transkripata obogaćeno za> 2, 0 puta u anti-AGO-RIP-ChIP od LNCaP-miR-221 / -222 prekomjernog ekspresije staničnih linija (biološki trostruki eksperimenti, P <0, 001; Slika 4a). Ti 315 anti-AGO-down-down geni dodatno su filtrirani za miR-221 / -222 ciljeve predviđene programima "miRanda", "TargetScan" i "PicTar" 33, 34, 35 (slika 4a). Identificirali smo 16 potencijalnih ciljeva (slika 4b) i dodatno procijenili jesu li oni uistinu služili kao miR-221 / -222 ciljevi određivanjem može li se njihova razina proteina smanjiti miR-221 / -222.

Image

Identifikacija miR-221 / -222 ciljeva uključenih u CRPC. ( a ) Venn-dijagram koji prikazuje brojeve preklapanih ciljeva miR-221 / -222 između onih identificiranih anti-AGO-RIP-ChIP i onih predviđenih pomoću programa predviđanja ciljanja od tri miR (TargetScan, PicTar i miRanda). ( b ) Putativni ciljevi miR-221 / -222 identificirani u LNCaP. Bogati pregib označava opseg obogaćivanja transkripta u anti-AGO-padajućim materijalima. Kvačice (x) označavaju one koje su predviđene za svaki od ciljnih programa predviđanja. ( c ) analiza Western blotta nivoa ekspresije HECTD2 i RAB1A. Ukupni proteinski ekstrakti (svaki 50 μg) izolirani su iz stabilnih staničnih linija LNCaP, LNCaP-Abl i LNCaP-miR-221. Lijeva ploča: LNCaP i LNCaP-Abl stanice prolazno su transficirane prekursorima miR-221 ili anti-sense miR-221 i tretirane sa ili bez DHT. Desna ploča: LNCaP, LNCaP-Abl, LNCaP-miR-221 prekomjerno izražavanje staničnih linija # 3, # 25 i # 38, i linija upravljačke ćelije, LNCaP-pcDNA. ( d ) Relativne razine ekspresije miR-221 / -222 (gornja ploča) i pretpostavljeni cilj HECTD2 i RAB1A (donja ploča) u pet CaP staničnih linija, LNCaP, LAPC-4, PC-3 Du145 i 22Rv1. Razine ekspresije miRs bile su u odnosu na vrijednosti miR-221 u LNCaP, koji je proizvoljno postavljen kao 1.0. Razine ekspresije MiR se normaliziralo pomoću U6. Razina β-aktina korištena je kao kontrola opterećenja. ( e ) Western blots analize razine ekspresije HECTD2 (desna ploča) i RAB1A (srednja ploča). Ukupni proteinski ekstrakti (svaki od 50 μg) izolirani su iz staničnih linija LNCaP, LAPC-4, Du145 i 22Rv1, koji su prolazno transfektirani prekursorima miR-221 ili miR-222.

Slika pune veličine

Čini se da su razine proteina od dva potencijalna cilja miR-221, HECTD2 i RAB1A, značajno smanjene u LNCaP, što prolazno ili stabilno prekomjerno izražava miR-221 i LNCaP-Abl (slika 4c, desna ploča). Nadalje, obaranje miR-221 u LNCaP-Abl povećalo je razinu ekspresije HECTD2 i RAB1A (Slika 4c lijeva ploča). Inverzna korelacija razine ekspresije endogenog HECTD2, RAB1A s razinama ekspresije miR-221 / -222 također je primijećena u nekoliko drugih CaP staničnih linija, uključujući LAPC-4, PC-3, Du145 i 22Rv1 (Slika 4d). PC-3, koji je imao najvišu razinu ekspresije miR-221 / -222, pokazao je najnižu razinu ekspresije HECTD2 i RAB1A među svim ispitivanim staničnim linijama. Suprotno tome, 22Rv1, koji je imao najnižu razinu ekspresije miR-221 / -222, imao je najvišu endogenu razinu HECTD2 i RAB1A ekspresije (Slika 4d). Pored toga, slično opažanju u LNCaP, prolazna prekomjerna ekspresija miR-221 / -222 u LAPC-4, 22Rv1 ili Du145 staničnim linijama smanjila je razinu ekspresije HECTD2 ili RAB1A (Slika 4e). Ovi rezultati sugeriraju da miR-221 / -222 negativno regulira ekspresiju proteina HECTD2 i RAB1A u ovim stanicama CaP.

Razine proteina CDKN1B (p27 / kip1) i PHF2 mogu se smanjiti prolaznim prekomjernim pritiskom miR-221 u LNCaP, iako je njihova razina ekspresije ostala nepromijenjena u stabilnim LNCaP-miR-221 prekomjernim pritiscima staničnih linija i LNCaP-Abl (dopunska slika S7). Razine proteina OSTM1, CEPB3, CASP8AP2, EIF5A2, RBM24, PDCD10 i RFX3 nisu bile pod utjecajem prolazne ili stabilne prekomjerne ekspresije miR-221 (dopunska slika S7). PTEN protein nije prepoznatljiv u LNCaP (PTEN-negativna stanična linija). Razine ekspresije MED1 i UBE2J1 neznatno su smanjene u miR-221 stabilnim stanično ekspresivnim staničnim linijama. Međutim, promjena MED1 ili UBE2J1 ekspresije nema utjecaja na rast AI LNCaP. Nadalje, nedavno istraživanje pokazalo je da aktiviranje MED1, umjesto smanjivanja regulacije, potiče razvoj CRPC-a. 38 Dakle, malo je vjerojatno da su ti ciljevi mir-221/222 uključeni u razvoj CRPC-a.

Da bismo potvrdili da su HECTD2 ili RAB1A istinske mete miR-221 / -222, testirali smo da li bi ekspresija reporterskih konstrukcija luciferaze koja sadrži 3'-UTR HECTD2 ili RAB1A, (koja sadrži sekvence miR-221 / -222) biti reguliran prekomjernom ekspresijom miR-221 / -222 (slika 5a). Kako bismo pokazali da je interakcija miR-221 / -222 s ciljanim mjestima predviđenim u 3'-UTR HECTD2 i RAB1A ključna za funkciju miR-221 / -222, testirali smo i luciferazne izvještače konstrukcije koji sadrže 3'- UTR HECTD2 ili RAB1A s mutiranim sekvencijama za mutanje miR-221 / -222 (Slika 5a). Prekomjerna ekspresija miR-221 ili -222 mogla bi značajno smanjiti aktivnost luciferaznih reporterskih gena koji sadrže netaknuti 3'-UTR HECTD2 ili RAB1A na način ovisan o dozi (Slika 5b), mutacije na mjestu miR-221 / -222-sjetve sekvence u 3'-UTR HECTD2 ili RAB1A potpuno su ukinule odgovor na miR-221 / -222 prekomjernu ekspresiju (Slika 5b). Na aktivnosti kontrolnog luciferaznog gena reportera PSA 3'-UTR i vektora luciferaze bez umetanja nije utjecala prekomjerna ekspresija miR-221 / -222 (slika5b). Prekomjerna ekspresija kontrolnih miR prekursora nije utjecala na aktivnost svih konstrukata (Slika 5b). Ovi rezultati pokazuju da su HECTD2 ili RAB1A pravi miR-221 / -222 ciljevi.

Image

Validacija HECTD2 i RAB1A kao miR-221 / -222 ciljeva. ( a ) Divlje vrste i mutirane sekvence pretpostavljenog mjesta za vezanje miR-221 / -222 u 3'-UTR HECTD2 (NM_182765) i RAB1A (NM_016021). Crveni nukleotidi označavaju mutacije usmjerene na mjesto. ( b ) Aktivnosti luciferaze izvedene iz konstrukcija koje sadrže različite 3'-UTR kako je naznačeno na vrhu svake ploče. Svaki je konstrukt bio transfektiran različitim količinama (0, 10, 30 i 100 nM) Pre-miR-221 ili Pre-miR-222 ili miR-scramble RNA (negativna kontrola) u LNCaP. Podaci su srednja ± sd tri neovisna pokusa.

Slika pune veličine

Smanjenje RAB1A i HECTD2 promoviralo je CRPC fenotip

Da bismo odredili ulogu miR-221 ciljeva u razvoju CRPC-a, istraživali smo utjecaj njihovih razina ekspresije na rast stanica i PSA ekspresiju kao odgovor na DHT tretman. Prvo smo utvrdili može li pad HECTD2 ili RAB1A u LNCaP utjecati na rast stanica. Učinkovitost svake male interferirajuće RNA (siRNA) prikazana je na slici 6a. Srušavanje HECTD2 nije imalo značajnog utjecaja na rast stanica u prisutnosti androgena, iako je značajno pojačalo rast stanica u nedostatku androgena (Slika 6b). Zanimljivo je da je oboreni RAB1A povećao rast LNCaP ili u prisutnosti ili u odsutnosti androgena (Slika 6c). Nadalje, prekomjerno eksprimiranje RAB1A ili HECTD2, koje su potisnute ekspresijom miR-221 u stanicama LNCaP-221 # 25, ili obaranje miR-221 ekspresije, moglo bi ukinuti prethodno utvrđeni rast AI u stanicama LNCaP-221 # 25 (Slika 6c). Kao kontrole, izvedene su ko-transfekcije ekspresijske konstrukcije i siRNA svakog ciljanog gena kako bi se pokazala specifičnost siRNA efekata (dopunska slika S8). Studija rasta sugerirala je da silazna regulacija HECTD2 i RAB1A miR-221 / -222 može održati rast AI stanica.

Image

Utjecaj HECTD2 i RAB1A na androgeni neovisni rast i DHT-induciranu transkripciju. ( a ) Razine ekspresije HECTD2 i RAB1A mjerene Western blotom nakon obaranja siRNA u LNCaP ili prekomjernog ekspresije u LNCaP-221 # 25. Relativne razine ekspresije naznačene su u pojedinačnim slikama gela. Sve razine ekspresije proteina su normalizirane s nivoom β-aktina, i uspoređene sa LNCaP transfektiranim s kontrolnom siRNA. ( b, c ) Rast krivulje rasta LNCaP ( b ) ili LNCaP-221 # 25 ( c ) u mediju bez androgena (CFBS), nakon što se sruši siRNA ili pretjerano eksprimira RAB1A (crvene linije), HECTD2 (plave linije) ili transfektirano kontrolom transfekcije (crne linije) tijekom 5-dnevnog vremenskog trajanja. MiR-221 je također srušen u LNCaP-221 # 25 (desna ploča, zelena linija). Svaka točka sa šipkom predstavlja sredinu trostruke ± sem. ( d ) Utjecaj razina ekspresije HECTD2 i RAB1A na ekspresiju potpisnih gena koji reagiraju na androgene, PSA, TMPRSS2, cdc20 i PLZF u LNCaP ili LNCaP-221 # 25. Dvadeset i četiri sata nakon transfekcije siRNA ili ekspresionim konstruktima, LNCaP ili LNCaP-221 # 25 tretirani su sa ili bez DHT tijekom 24 sata. ( e ) Razine ekspresije HECTD2 i RAB1A izmjerene su od zapadne mrlje nakon što su srušile siRNA ili prekomjerno eksprimiranje miR-221 u LAPC-4. Razina β-aktina korištena je kao kontrola opterećenja. ( f ) Krivulja rasta LAPC-4 u CFBS medijumu nakon rušenja RAB1A (crvena linija), HECTD2 (plava linija) ili prekomjernog pritiska miR-221 (zelena linija) ili transfektiranog s kontrolom siRNA (siCon, crne linije). ( g ) Utjecaj razina ekspresije HECTD2 i RAB1A na ekspresiju PSA u LAPC-4. Dvadeset i četiri sata nakon transfekcije siRNA ili prekursorima miR-221, LAPC-4 stanice su tretirane sa ili bez DHT tijekom 24 sata. Razine mRNA različitih gena u svakoj staničnoj liniji analizirane su pomoću TaqMan kvantitativnog PCR-a u stvarnom vremenu. Relativna razina ekspresije svakog gena normalizirana je s nivoom gliceraldehid 3-fosfat dehidrogenaze i uspoređena sa stanicama transfektirala je negativnu kontrolnu siRNA, koja je proizvoljno postavljena na 1.0 (prosjek ( N = 3) ± sd). * P- vrijednost jednosmjerne ANOVA <0, 05.

Slika pune veličine

Nadalje smo procijenili ulogu navodnih miR-221 / -222 meta u transkripciji posredovanoj AR-om. Svaki od ciljnih gena bio je prolazno prekomjerno ekspresioniran u LNCaP-221 # 25 (slika 6a) ili je prolazno srušen siRNA u LNCaP (slika 6a). Nakon liječenja s DHT-om, ispitali smo utjecaj razine ekspresije mRNA odabranih AR-posredovanih gena, uključujući PSA, TMPRSS2 i PLZF ovisnog o ligandu, a posredovanim od AR i cdc20 posredovanog AR-om. Kao što je gore opisano, PSA, TMPRSS2 i PLZF su DHT inducibilni u LNCaP i sniženi u LNCaP-Abl. U LNCaP-221 # 25, PSA, TMPRSS2 su dramatično smanjeni, dok PLZF ekspresija nije izmijenjena. Promjena razine ekspresije RAB1A nije utjecala na mRNA ekspresiju svih analiziranih gena (Slika 6d). Na ekspresiju PLZF-a nije utjecala promijenjena ekspresija ova dva miR-221 / -222 meta (slika 6d). Srušivanje HECTD2, što je ubikvitin E3 ligaza, značajno je smanjilo PSA i TMPRSS2-inducirane DHT i povećalo ekspresiju cdc20 u LNCaP (Slika 6d). Prekomjerno eksprimiranje HECTD2 lagano je spasilo PSA i TMPRSS2 ekspresiju i značajno smanjilo ekspresiju cdc20 u LNCaP-221 # 25 (slika 6d). Ovi rezultati pokazali su da mijenjanje razine ekspresije HECTD2 modificira ekspresiju nekih gena AR-posredovanih kao odgovor na DHT tretman. Učinak promjena nivoa ekspresije RAB1A, HECTD2 na transkripciju PSA ili rast AI stanica također je pokazan na LAPC-4 staničnoj liniji (slike 6e-g). Ukratko, pokazali smo da je razina ekspresije dvaju miR-221 / -222 ciljnih gena, HECTD2 i RAB1A, važna za razvoj fenotipa CRPC.

Uregulacija miR-221 / -222 aktivira staze uključene u metastazu ili epitelijski u mezenhimski prijelaz

GO analize gena koje su regulirane povišenom ekspresijom miR-221 također su otkrile da je ekspresija gena u procesu 'adhezija stanica-stanica' smanjena (FDR <10 -8 ; slika 3a), što ukazuje da su putevi uključeni u metastazu ili epitela u mezenhimski prijelaz (EMT) može se aktivirati u stanicama prekomjerne ekspresije LNCaP-miR-221. The analysis of EMT pathway genes revealed that expression of several important EMT or tumor metastasis regulators, including GSK3β, EZH2, Wnt5A and RAS, JAGG1/Notch1/Notch2 were upregulated both in LNCaP-Abl and LNCaP-221#25 (Figure 7a). Expression of cadherin (CDH3 or CDH1), ERBB2, MAPK1 and beta-2-adrenergic receptor (ADRB2) were downregulated in LNCaP-Abl and/or LNCaP-221#25. The relative expression level of selected genes in EMT pathways was further confirmed by quantitative real-time–PCR, shown in Figure 7b. We hypothesized that downregulation of miR-221/-222 target molecules in LNCaP-Abl and/or LNCaP-221#25 may have activated the EZH2, WNT, GSK3β, RAS and Notch pathways, and downregulated the β-adrenergic pathway, as a result promoting cell proliferation, cell transformation and cell invasion. The detailed relationship among these pathways in CaP or CRPC remains to be further characterized.

Image

The impact of miR-221/-222 expression on genes involved in EMT pathways. ( a ) Heat map of the expression of EMT signature genes in LNCaP, LNCaP-Abl and LNCaP-221#25. Data from three independent experiments is presented. Red and blue color represents upregulation and downregulation, respectively. ( b ) Quantitative real-time–PCR confirmation of JAG1, NOTCH1, NOTCH2, EZH2, HRAS, KRAS, WNT5A, GSK3B, CTNNB1, CDH3, CDH1, ERBB1, MAPK1 and ADRB2 mRNA expression in LNCaP (LN, white bars), LNCaP-221#25 (LN-miR-221, gray bars) and LNCaP-Abl (Abl, black bars). Relative expression levels were normalized with that of glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase, and compared with LNCaP, which was arbitrarily set as 1.0 (mean ( N =3)±sd). ( c ) A model for miR-221/-222-mediated pathways in CaP cells. Expression of miR-221/-222 downregulates multiple target genes expression, including HECTD2, RAB1A and perhaps unidentified factors (?). HECTD2 are essential factors required for AR-mediated and androgen-dependent transcription, that is, PSA and TMPRSS2 expression. HECTD2 is also involved in ligand independent AR-mediated transcription that is, cdc20 expression. As results of AR reprogramming, pathways involved in EMT/tumor metastasis, other signal cascades, and androgen independent growth are promoted. Downregulation of RAB1A-enhanced androgen independent growth, although molecular mechanisms involved remained to be determined.

Slika pune veličine

Rasprava

Taken together with our prior work, we demonstrated that increased miR-221/-222 expression is associated with CRPC (Figure 7c). Using unbiased approaches, we identified miR-221/-222 targets, HECTD2 and RAB1A that are potentially involved in the development of the CRPC phenotype (Figure 7c). The reduced HECTD2 expression level significantly decreased androgen-induced and AR-mediated transcription, potentially serving roles in modifying the AR signaling pathways. Downregulation of HECTD2 and RAB1A contributed to AI cell growth. Our expression profiling data revealed that accompanying with the development of CRPC, expression of a set of cyclins was activated to sustain the AI cell growth. We hypothesized that upregulation of miR-221/-222 downregulated HECTD2 and RAB1A, which subsequently resulted in reprogramming of AR pathways and activation of new cyclins, leading to the development of the CRPC phenotype. In particular, elevation of cdc20, an AR-controlled G2-M-phase cell cycle regulator, was induced by downregulation of HECTD2, which may contribute to AI cell growth. The possibility that we might have missed some miR-221/-222 target molecules involved in CRPC, due to the stringency of pull-down methods or due to the capacity of target predicting algorithms cannot be excluded (Figure 7c).

Currently, it is not yet completely clear about the exact mechanisms by which HECTD2 and RAB1A mediate the miR-221/-222-induced phenotype-CRPC. Very little information is available for the role of HECTD2 and RAB1A in the AR-mediated pathways and cell cycle controls. HECTD2, is a HECT domain containing ubiquitin E3 ligase, had a significant effect on the androgen-induced PSA transcription and on AI cell growth. Recently, investigators found that ubiquitin-mediated degradation of crucial tumor suppressor molecules was catalyzed by HECT-type E3, indicating that various HECT family members could be essential contributors to cancer development through crucial signaling pathways. 39 We hypothesized that HECTD2 may post-translationally control the stability or abundance of specific AR machinery-associated factors and/or cell cycle proteins essential for the development of CRPC. RAB1A is a member of the Ras superfamily of GTPases, cycling between inactive GDP-bound and active GTP-bound forms. 40 It has been shown that this specific GTPase controls vesicle traffic from the endoplasmic reticulum to the Golgi apparatus. 40 Multiple alternatively spliced transcript variants encoding different protein isoforms have been identified for RAB1A. 41 It is not known whether RAB1A potentially might also be involved in the RAS/RAF pathway, which could contribute to the activation of EMT and the development of aggressive cancer types.

The connection between miR-221/-222 expression and EMT was also found in the context of breast cancer. Stinson et al. 42 found that TRPS1 targeting by miR-221/222 promoted EMT. However, TRPS1 is not a miR-221/222 target in LNCaP and LNCaP-derived AI cell lines. Recent evidence indicated that the Notch pathway is often recruited to stimulate growth or reprogramming tumor cells via EMT. 43 It has been shown that EZH2 elevation repressed the expression of multiple tumor-suppressors and increased tumor aggressiveness. 44 Based on our data, we think that the upregulation of the JAGGED1/NOTCH pathway and EZH2-mediated pathways due to the high expression of miR-221/222 may have a significant impact on promoting EMT/metastasis in CaP. 44, 45 Whether EMT promotion is a direct result of the AR pathway reprogramming or a consequence of the downregulation of identified miR-221/222 targets remains to be determined.

In summary, we demonstrated the involvement of miR-221/-222 in the promotion of the development of the CRPC phenotype. We are currently applying bioinformatics and biochemical approaches to delineate the molecular components and mechanisms by which HECTD2 and RAB1A operate during the transition to CRPC. New insights into the role of miR-221/222-mediated pathways during the CaP progression from hormone-sensitive CaP to CRPC may provide new therapeutic target designs.

Dodatna informacija

PDF datoteke

  1. 1.

    Dodatna informacija

    Dodatne informacije prate ovaj rad na web mjestu Oncogene (//www.nature.com/onc)