Mir-29 cilja akt3 za smanjenje proliferacije i olakšavanje diferencijacije myoblasta u razvoju skeletnih mišića | stanična smrt i bolest

Mir-29 cilja akt3 za smanjenje proliferacije i olakšavanje diferencijacije myoblasta u razvoju skeletnih mišića | stanična smrt i bolest

Anonim

teme

  • Stanična proliferacija
  • Diferencijacija
  • miRNAs
  • Skeletni mišić

Sažetak

MikroRNA (miRNA) su vrsta endogenih nekodirajućih malih RNA koja sudjeluju u regulaciji višestrukih bioloških procesa. Nedavno je otkriveno da miR-29 sudjeluje u miogenezi. Međutim, osnovni mehanizmi pomoću kojih miR-29 potiče miogenezu nisu identificirani. Ovdje smo utvrdili da je miR-29 bio značajno reguliran s godinama u postnatalnom mišićnom skeletu i tijekom diferencijacije mišića. Prekomjerna ekspresija miR-29 inhibira proliferaciju mioblasta mišjeg C2C12 i potiče stvaranje miotuba. miR-29 specifično ciljani Akt3 , član porodice serin / treonin protein kinaza koji reagira na stanično signaliziranje faktora rasta, što je rezultiralo njegovom post-transkripcijskom deregulacijom. Nadalje, oborenje Akt3 siRNA značajno inhibira proliferaciju C2C12 stanica, i obrnuto, prekomjerna ekspresija Akt3 suzbija njihovu diferencijaciju. Kolektivno i s obzirom na obrnuti endogeni obrazac ekspresije porasta nivoa miR-29 i smanjenja razine Akt3 proteina s godinama u mišjem skeletnom mišiću, predlažemo novi mehanizam u kojem miR-29 modulira rast i potiče diferencijaciju skeletnog mišića putem post-transkripcijske redukcije iz Akt3 .

Glavni

MikroRNA (miRNA) su endogeni nekodirajući mali RNA koji sadrže 21–23 baznih parova. Slijed miRNA komplementaran je 3 'neprevedenoj regiji (UTR) njegove ciljne mRNA, a rezultirajuće komplementarno vezanje inhibira ekspresiju gena na post-transkripcijskoj razini posredovanjem inhibicije mRNA ili inhibicije prevođenja. Potvrđeno je da je 1, 2 miRNA uključena u više fizioloških i biokemijskih procesa, uključujući tumorigenezu, hematopoezu, neurogenezu, imunitet, staničnu proliferaciju i apoptozu. Pokazalo se da i 3, 4, 5, 6 miRNA sudjeluju u razvoju ili obnavljanju mišića kod miševa, štakora, svinja i ljudi. 7, 8, 9, 10, 11 Prethodne studije identificirale su brojne miRNA povezane mišiće, uključujući miR-1, miR-29, miR-133, miR-206 i miR-214, koji imaju važnu ulogu u regulaciji miogeneze i diferencijacije skeletnog ili srčanog mišića. 12, 13, 14, 15

Obitelj miR-29 ima tri člana, miR-29a, mir-29b i miR-29c. Njihovi nizovi sjemena su identični i imaju slične uzorke i funkcije izražavanja. Funkcionalna ispitivanja pokazala su da miR-29 sudjeluje u različitim fiziološkim procesima. Utvrđuje Tcl ekspresiju i na taj način inhibira kroničnu limfocitnu leukemiju B stanica kod miševa. 16, 17 Prekomjerna ekspresija miR-29a / b / c uzrokuje otpornost na inzulin, što ukazuje na njegovu moguću ulogu u šećernoj bolesti tipa 2. Pokazalo se da 18 miR-29a / b potiče osteogenezu sudjelovanjem u Wnt signalnom krugu ili ciljanim inhibitorima diferencijacije osteoblasta. 19, 20 Međutim, većina se istraživanja usredotočila na ulogu miR-29 kao tumorskog inhibitora. Na primjer, miR-29 obnavlja normalne obrasce metilacije DNA ciljajući DNA metiltransferaza 3A i 3B, čime inhibira tumorigenezu kod raka pluća. 21 miR-29 izravno cilja p85 alfa i CDC42 u HeLa stanicama, suzbija Mcl-1 i Bcl-2 u hepatocelularnom karcinomu i inducira apoptozu na način ovisan o p53 ili putem mitohondrija. 22, 23 Nedavno istraživanje pokazuje da miR-29 djeluje kao supresija tumora u rabdomiosarkomu regulirajući ekspresiju CCND2 i E2F7. 24

Ono što je također važno, otkriveno je da je obitelj miR-29 uključena u razvoj mišića. Propadanje miR-29b in vivo srčane fibroze kod miševa. 15 Represija miR-29a / b poviše regulirala je ekspresiju ADAMTS-7, te je nakon toga izazvala kalcifikaciju vaskularne glatke mišićne stanice (VSMC). 25 Ovi rezultati pokazuju da je miR-29 važan u funkciji srčanog mišića i VSMC-a. Prije smo otkrili da su miR-29a, miR-29b i miR-29c značajno regulirani u duguljastim mišićima odraslih svinja, u usporedbi s 33 - i 65 dana starim fetusima. 26 U miotoničnoj distrofiji tip 1, utvrđeno je da se miR-29b i miR-29c reguliraju. 27 Nadalje, miR-29 je reguliran u Duchenneovoj mišićnoj distrofiji, a obnavljanje njegove ekspresije moglo bi poboljšati distrofiju promicanjem miogene diferencijacije i inhibiranjem fibrogene diferencijacije. 28, 29 Ovi rezultati pružaju dokaz o ulozi miR-29 kao kritičnog regulatora u skeletnom mišiću, ali njegov efektni mehanizam nije jasan. Trenutni dokazi govore da u nediferenciranom mioblastu TGF-beta-Smad3 signalizacija pospješuje regrutovanje kompleksa koji sadrži Yin Yang1 (YY1), Rybp (Ring1 i YY1-vezujući protein) i Polycomb protein (regrutisan od YY1), čime negativno reguliranje ekspresije miR-29. 30, 31 S druge strane, u normalnim uvjetima miogene diferencijacije, miRNA-29 potiče miogenu diferencijaciju stanica C2C12 inhibiranjem Smad3, što zauzvrat inhibira TGF-beta posredovanu regulaciju HDAC4, ili YY1, Rybp, represivno-represivni kompleks, Ezh2, kolageni, Lims1 i Mfap5 (mikrofibrilarni protein 5), čime se sprječava transdiferencijacija C2C12 stanica u miofibroblasti. 28, 30, 32, 33 Ova istraživanja pokazuju da miR-29 posredno potiče miogenezu inhibiranjem pretvorbe mioblasta u miofibroblaste; međutim, nejasno je može li miR-29 igrati izravniju miogenu ulogu ciljajući efektorske gene koji posreduju proliferaciju ili diferencijaciju skeletnih mišićnih stanica.

Obitelj Akt kinaze sastoji se od tri člana: Akt1, Akt2 i Akt3. Akt3 je uglavnom poznat po svojoj ulozi u tumorigenezi. Otkriveno je da povećani Akt3 povezuje s karcinomom dojke i prostate, 34 i stanicama karcinoma jajnika. 35 Mogući temeljni mehanizam je da AKT3 promiče proliferaciju stanica ubrzavanjem faze prijelaza G2-M. 36 Visoka ekspresija Akt3 povezana je i sa zloćudnim melanomima. Knockdown ili inhibicija Akt3, ali ne i Akt1 ili Akt2, inducirala je apoptozu u stanicama melanoma; stoga se signalna kaskada Akt3 smatra terapijskim ciljem u liječenju melanoma. 37, 38, 39 Spuštanje AKT3 pomoću miRNA, poput miR-15a i miR-16-1 ili miR-93, rezultira inhibicijom proliferacije u multiplom mijelomu i matičnim stanicama karcinoma dojke. 40, 41 Nedavne studije otkrile su da Akt3 ima potencijalnu ulogu u promicanju širenja VSMC-a aorte čovjeka i štakora. 42, 43 Nadalje, otkrivena je značajna srčana hipertrofija kod srčano specifičnih Akt3 transgeničnih miševa, što sugerira ulogu Akt3 u razvoju srčanog mišića. 44 Međutim, ne postoje jasni dokazi o funkcionalnoj vezi između Akt3 izoforme i skeletnog mišića ili myoblasta.

Cilj ove studije je razjasniti temeljni mehanizam pomoću kojeg miR-29 modulira proliferaciju i diferencijaciju myoblasta i njegov odnos s Akt3. Pokazali smo da kod starenja mišićnih skeletnih mišića miR-29 nije reguliran, ali je Akt3 ekspresija smanjena. Akt3 je promovirao proliferaciju myoblasta i odgodio diferencijaciju mišića, a miR-29 je smanjen na post-transkripcijskoj razini.

Rezultati

miR-29 bio je značajno reguliran tijekom postnatalnog rasta skeletnih mišića kod miševa

Naša prethodna studija pokazala je da je ekspresija članova obitelji miR-29 značajno veća u mišićima longisimusa odraslih svinja od onih iz 33. i 65. dana ploda, 26 što ukazuje na njegovu potencijalnu ulogu u razvoju skeletnih mišića. Da bismo potvrdili ekspresijski profil miR-29, prikupili smo mišiće stražnjih nogu od postnatalnih Balb / c miševa nakon 2 dana, 2 tjedna, 4 tjedna, 6 tjedana i 12 tjedana, te analizirali ekspresiju miR-29 u ovim uzorcima Q-PCR. Kao što se očekivalo, otkrili smo da je izraz miR-29a, miR-29b i miR-29c reguliran na način ovisan o dobi. Ekspresija miR-29 u skeletnim mišićima miševa starijih od 12 tjedana bila je preko 60 puta veća nego kod 2-dnevnih miševa (Slika 1a). Tri člana miR-29 pokazala su slične uzorke porasta izraza s godinama. Nadalje, sjeverna mrlja potvrdila je povećanje miR-29c tijekom postnatalnog rasta mišića (slika 1b). Zatim smo istražili ekspresijski profil miR-29c in vitro u mioblastima mišje C2C12 i miotubima (Slika 1c). miR-29c je reguliran tijekom diferencijacije C2C12 (Slika 1d). Ovi rezultati ukazuju da je ekspresija miR-29 povećana tijekom postnatalnog rasta skeletnog mišića i diferencijacije mišića.

Image

Povećanje miR-29 u koštanim mišićima miša s godinama. ( a ) Izražavanje miR-29 u stražnjim mišićima postnatalnih Balb / c miševa određeno je Q-PCR. Starost miševa bila je 2 dana, 2 tjedna, 4 tjedna, 6 tjedana i 12 tjedana. Promjena nabora bila je u odnosu na ekspresiju kod dvodnevnih miševa. ( b ) Analiza sjevernog mrljanja miR-29 u mišićima bedara nakon postnatalnih Balb / c miševa. Kao referentni gen korištena je 5s rRNA. ( c ) Imunofluorescentna detekcija brzog skeletnog miozina (boja Alexa Fluor 488, zelena) u C2C12 mioblastima (GM) i miotubama na 4 dana diferencijacije (DM 4d). Stanične jezgre su bile pozitivne na DAPI (plava). Linija mjerila = 100 μ m. ( d ) ekspresija miR-29c u stanicama C2C12 diferencirana je 0, 1, 2, 4 i 6 dana. Promijenite promjenu u odnosu na izraz 0 dana. Ekspresija miR-29 normalizirana je na U6 i prikazana je kao srednja vrijednost ± SEM (od tri neovisne jedinke ili replike po vremenskoj točki)

Slika pune veličine

miR-29 potisnuta proliferacija stanica C2C12

Da bi se otkrili učinci miR-29 na proliferaciju mišića, C2C12 myoblasti transfektirani sintetičkim sjedinjenim miR-29 mimikama (miR-29a / b / c mimike podjednako miješane) ili su usitnjene negativne kontrole (NC) miRNA uzgajane do blizu utoka podvrgnut protočnoj citometriji propidium jodidnog ciklusa (dopunska slika 1). Bio je značajno veći broj stanica u stadijima G0 / G1 i G2 u miR-29-transficiranoj skupini nego u NC skupini (Slika 2a). Ovo sugeriše da bi miR-29 mogao zaustaviti C2C12 stanice u fazi G0 / G1. Indeks proliferacije bio je niži u stanicama koje su bile transficirane miR-29 nego u stanicama koje su bile transficirane NC (Slika 2b). xCELLigence sustavski praćenje proliferacije C2C12 u stvarnom vremenu pokazalo je da miR-29 transficirane stanice pokazuju smanjenu brzinu rasta u usporedbi s odgovarajućim NC miRNA transficiranim stanicama 24 sata nakon transfekcije (Slika 2c). Za provođenje prekomjerne ekspresije miR-29b i miR-29c, 100-bp DNA fragment, koji sadrži primarni transkript mmu-miR-29b-2 i mmu-miR-29c klastera, kloniran je u vektor pEGFP-C1 (miR -29bc-C1). Dvadeset i četiri sata nakon transfekcije rekombinantnim GFP-miR vektorom, Q-PCR je pokazao da su miR-29b i miR-29c uspješno prekomjerno eksprimirani u stanicama C2C12 (Slika 2d). Transficirane stanice miR-29bc-C1 i pEGFP-C1 (kontrola) bile su nuklearno obojene s 5-etinil-2'-deoksiuridinom (EdU) (bojilo koje se umeće samo u replicirajuće molekule DNK) i podvrgnute protočnoj citometriji da bi se identificirale stanične populacije koje bili su dvostruko pozitivni za EdU i GFP. Infektirane stanice miR-29bc-C1 pokazale su značajno manje mitotičke aktivnosti, što je očito vidljivim smanjenjem dvostrukih stanica obilježenih EdU- i GFP (slika 2e). Zbirno, ovi rezultati pokazali su da prekomjerna ekspresija miR-29 inhibira staničnu proliferaciju C2C12.

Image

miR-29 potisnuta proliferacija stanica C2C12. Stanice C2C12 bile su prolazno transficirane sakupljenim miR-29a / b / c mimikama ili kodiranim NC-om, a faza staničnog ciklusa ( a ) i indeks proliferacije ( b ) analizirani su protočnom jodnom protočnom jodom. ( c ) Stanice C2C12 su transficirane sakupljenim miR-29 mimikama ili NC-om na staničnom indeksu koji je dostigao 1, 0, a dinamika rasta stanica kontinuirano je praćena pomoću xCELLigence sustava. ( d ) plazmidi miR-29bc-C1 ili pEGFP-C1 transfektirani su u myoblaste C2C12, a 24 sata kasnije stanice su obrađene za Q-PCR detekciju miR-29 b / c. Ekspresija miR-29c je normalizirana pomoću U6. ( e ) Nakon transfekcije miR-29bc-C1 ili pEGFP-C1, C2C12 stanice obojene su s EdU. Stanice dvostruko pozitivne za EdU i GFP su označene bijelim strelicama (lijevi graf), a postotak dvostrukih pozitivnih stanica određen je protočnom citometrijom (desni graf). Traka skale iznosi 100 µm. Rezultati su predstavljeni kao srednja vrijednost ± SEM (tri neovisne replike po grupi). * P <0, 05; ** P <0, 01; *** P <0, 001

Slika pune veličine

miR-29 promovirao diferencijaciju C2C12 myoblasta

Da bi se utvrdila uključenost miR-29 u diferencijaciji mišićnih stanica, C2C12 myoblasti su transfektirani sintetičkim skupljenim miR-29 mimikama ili NC miRNA. Dvadeset i četiri sata kasnije, medij za rast zamijenjen je medijem za diferencijaciju da se inducira stanična diferencijacija. Imunofluorescentna detekcija brzog skeletnog miozina pokazala je da je više stanica podvrgnuto diferencijaciji i stvaranju miotuba u skupljenoj miR-29 grupi nego u NC skupini u roku od 72 h (Slika 3a). Otkriveno je i nekoliko gena markera diferencijacije myoblasta nakon 48 h diferencijacije pomoću Q-PCR. Zajedno s uspješnom prekomjernom ekspresijom miR-29, ekspresija miogeninskih , MyHC IId i MCK gena bila je značajno regulirana u stanicama koje su transficirane sakupljenim miR-29 mimikama, nego u stanicama koje su bile transficirane s NC miRNA (Slika 3b). Zajedno, ovi rezultati pokazali su da miR-29 potiče diferencijaciju myoblasta.

Image

Promicanje diferencijacije C2C12 stanica pomoću miR-29. ( a ) C2C12 myoblasti transfektirani skupljenim miR-29 mimikama ili NC su diferencirani tijekom 3 dana. Otkrivanje imunofluorescencije s brzim antitijelom na miozin korišteno je za identificiranje miotuba (zeleno). Jezgra su obojena plavo s DAPI. Traka skale iznosi 200 µm. Broj miotuba prikazan je kao srednja vrijednost ± SEM (zabilježeno je 14 slučajnih polja za svaku tretiranu grupu). ( b ) C2C12 myoblasti transfektirani sakupljenim miR-29 mimikama ili NC inducirani su na diferencijaciju u trajanju od 48 h. Naknadna detekcija miR-29c, miogenina , MyHC IId i MCK određena je Q-PCR-om. Rezultati su predstavljeni kao srednja vrijednost ± SEM (tri neovisne replike po grupi). * P <0, 05; *** P <0, 001

Slika pune veličine

miR-29 izravno cilja 3 ′ UTR od Akt3

Kako bismo otkrili mehanizme kojima miR-29 suzbija proliferaciju u myoblastima, ispitali smo potencijalne ciljeve miR-29 koji su uključeni u stanični ciklus. Akt3 je pomoću TargetScan analize identificiran kao glavni cilj, s visoko očuvanim komplementarnim miR-29 veznim mjestom u 3 'UTR preko kralježnjaka od pilića do čovjeka (slike 4a i b).

Image

Akt3 3 ′ UTR kao cilj miR-29. Predviđeno mjesto vezanja miR-29 u 3 ′ UTR Akt3 ( a ) vrlo je očuvano među kralježnjacima ( b ). Akt3 3 'UTR ubačen je u reporterski vektor dual-luciferaze psi-CHECK2 na 3' kraju gena Renilla luciferaze ( hRluc ). Konstitutivni izraz luciferaze krijesnica ( hluc + ) korišten je kao unutarnja kontrola normalizacije ( c ). Konstrukcija Akt3 3 'UTR ili Akt3 3' UTR (koja sadrži supstituciju 2 baze na mjestu vezanja za miR-29) kofeficirana je s miR-29a, miR-29b, miR-29c ili NC, kako je naznačeno, u stanice BHK-21, i određena je normalizirana aktivnost Renilla luciferaze ( d ). Skupljeni mimik-miR-29, miR-29 mut (koji sadrži mutaciju na 2 baze) ili NC je kofeficiran s Akt3 3 'UTR vektorom dvostruke luciferaze, kao što je naznačeno, u stanice BHK-21, i normalizirao aktivnost Renilla luciferaze. testirano ( e ). Ekspresija proteina Akt3 u myoblastima C2C12 otkrivena je 48 sati nakon transfekcije miR-29a / b / c, miR-29 mut, ili NC. Usporedne razine tubulina služile su kao kontrola punjenja u svim ispitivanjima zapadnog mrlja ( f ). ( g ) Otkrivanje proteina članova porodice Akt3 i p85a u C2C12 mioblastima transficiranim sa skupljenim miR-29a / b / c i NC. Rezultati su predstavljeni kao srednja vrijednost ± SEM (tri neovisne replike po grupi). * P <0, 05; ** P <0, 01; *** P <0, 001

Slika pune veličine

Da bi se uspostavila funkcija miR-29 na Akt3 3 'UTR, fragment Akt3 3' UTR koji sadrži mjesto vezivanja miR-29 spojen je na 3'-kraj reporterskog gena luciferaze Renilla u kaseti za ispitivanje dual-luciferaze ( Slika 4c). Ekspresija renila luciferaze značajno je smanjena u stanicama BHK-21 kada je konstrukt bio transfektiran miR-29a, miR-29b ili miR-29c (Slika 4d). Međutim, miR-29 nije imao značajan inhibitorni učinak na mutiranu konstrukciju Akt3 3 'UTR dual-luciferaze (koja sadrži 2-bazne supstitucije na mjestu vezanja miR-29) (Slika 4d). Isto tako, 2-bazna mutacija uvedena u sjemensku sekvencu miR-29 (29mut) ukinula je bilo kakvu inhibiciju konstrukcije Akt3 3 'UTR, iako je značajan supresijski efekt i dalje primijećen u stanicama koje su transficirane sakupljenim mimikom-29 ( Slika 4e). Ovi rezultati pokazali su specifičnu inhibiciju Akt3 ekspresije pomoću miR-29.

Inhibicijski učinak miR-29a / b / c na ekspresiju endogene Akt3 proteina bio je očit u C2C12 myoblastima, iako nije otkrivena značajna inhibicija na razini mRNA (Slika 4f). Utjecaj miR-29 na ekspresiju proteina ostalih članova porodice Akt, te p85a, regulatorne podjedinice fosfatidilinozitol 3-kinaze (PI3K), procijenjen je zapadnim blottingom. Aktl i Akt2 nisu inhibirani u C2C12 myoblastima transfektiranim sakupljenim miR-29 mimikama (Slika 4h). Protein p85 α , za koji se prethodno pokazalo da je meta miR-29 u stanicama HeLa, 22 poput Akt3 proteina, miR-29 je smanjen (Slika 4h). Stoga je ekspresiju proteina Akt3 direktno inhibirao miR-29.

Inverzivni odnos ekspresije između miR-29 i Akt3 proteina in vivo

Ispitan je funkcionalni odnos između miR-29 i Akt3 ekspresije u Balb / c mišjeg skeletnog mišića. Ekspresija mRNA Akt3 u mišjim mišićima pokazala je trend porasta s dobi, od 2-dnevne do životinje od 12 tjedana (Slika 5a). Međutim, ekspresija proteina Akt3 značajno je regulirana s godinama, što je određeno zapadnjačkim blotiranjem (slika 5b). Imunohistokemijsko otkrivanje Akt3 u mišjim dijelovima mišića potkrijepilo je nalaz smanjene ekspresije Akt3 proteina s dobi kroz isti dobni raspon (Slika 5c). Post-transkripcijska (protein) regulacija Akt3 pomoću miR-29 pokazala je, dakle, obrnut odnos ekspresije, tako da se porast miR-29 u skeletnom mišiću s godinama (slike 1a i b) podudarao s odgovarajućim smanjenjem ekspresije proteina Akt3 (Slika 5d).

Image

Inverzivna in vivo ekspresija između miR-29 i Akt3. Povećana mRNA ekspresija Akt3 u bedrnim mišićima postnatalnih Balb / c miševa u dobi od 2 dana, 2 tjedna, 4 tjedna, 6 tjedana i 12 tjedana ( a ). Ekspresija Akt3 normalizirana je na tubulinsku ekspresiju. Smanjenje ekspresije proteina Akt3 u bedrenim mišićima Balb / c miševa s porastom dobi. Imunohistokemijsko otkrivanje proteina Akt3 u Balb / c mišićima bedara različite dobi ( b ). Linija mjerila = 20 μ m. Inverzni odnos s dobi između endogene miR-29a / b / c i Akt3 ekspresije proteina u postnatalnim mišjim mišićima ( c ). Relativna ekspresija Akt3 normalizirana je na razinu tubulina. Ekspresija miR-29 normalizirana je na razine U6 ( d ). Rezultati su predstavljeni kao srednja vrijednost ± SEM (tri neovisne osobe u grupi)

Slika pune veličine

Akt3 je inhibirao miogenu diferencijaciju i pospješio proliferaciju C2C12 stanica

Transfekcija siAkt3 u C2C12 myoblaste značajno je srušila ekspresiju Akt3 mRNA i proteina (slika 6a), što je rezultiralo povećanim zaustavljanjem stanica u fazi G0 / G1 i smanjenjem brzine proliferacije (slike 6b i c, i dodatna slika 2), ishod sličan prekomjernoj ekspresiji miR-29 (slike 2a i b). Prekomjerna ekspresija Akt3 transfekcijom Akt3-3.1, o čemu svjedoči povišena ekspresija Akt3 mRNA i proteina (slika 6d), nije rezultirala vidljivom promjenom staničnog ciklusa (slika 6e). Međutim, došlo je do značajnog smanjenja broja miotuba zaključenih imunofluorescentnom detekcijom brzog ekspresije miozina u skeletu kada je Akt3 prekomjerno izražen (Slika 6f). Geni markera diferencijacije mioblasta također su otkriveni nakon 48 h diferencijacije pomoću Q-PCR. Ekspresije MyHC IId i MCK gena značajno su bile regulirane u stanicama koje su bile transficirane s Akt3-3.1, u odnosu na stanice transficirane pcDNA-3.1 praznim plazmidom (Slika 6g). Zajedno, ovi rezultati pokazuju da je Akt3 promovirao proliferaciju myoblasta na štetu diferencijacije mišića.

Image

Akt3 inhibira diferencijaciju i potiče proliferaciju C2C12 stanica. Transfekcija siAkt3 u C2C12 myoblaste oborila je ekspresiju mRNA Akt3 (lijevo) i proteina (desno), detektirana Q-PCR-om i zapadnim blotmanom ( a ), što je rezultiralo povećanom populacijom stanica u fazi G0 / G1 i smanjenom stanicom populacija u S fazi ( b ), i ukupno smanjenje proliferacije stanica ( c ) kako je određeno protočnom citometrijom. Prekomjerna ekspresija Akt3 transfekcijom vektora ekspresije Akt3-3.1 u C2C12 myoblaste otkrivena je kao povišena razina Akt3 mRNA (lijevo) i protein (desno) ( d ). Prekomjerna ekspresija Akt3 u C2C12 mioblastima nije imala značajan utjecaj na stanični interfazni ciklus (G0 / G1, S i G2), što je određeno protočnom citometrijom ( e ). Detekcija imunofluorescencije brzog skeletnog miozina (zelenih miotuba) u stanicama C2C12, transficiranim plazmidom, ekspresiranim Akt3, nakon 3 dana diferencijacije ( f ). Nuklei su obojeni plavo s DAPI. Linija mjerila = 200 μ m. Broj miotuba grafički predstavljen kao srednja vrijednost ± SEM (desno). Zabilježeno je najmanje devet slučajnih polja u grupi i numerički se kvantificira. Myblasti C2C12, transfektirani Akt3-3.1 ili pcDNA-3.1, inducirani su u diferencijaciji tokom 48 h. Naknadna detekcija RNA miogenina , MyHC IId i MCK određena je Q-PCR, normaliziranom u ekspresiju tubulina ( g ). Svi rezultati Q-PCR i protočne citometrije prikazani su kao srednja vrijednost ± SEM (tri neovisne replike po skupini). * P <0, 05; ** P <0, 01; *** P <0, 001

Slika pune veličine

Akt3 može obnoviti stanični ciklus i blokirati diferencijaciju myoblasta u prekomjernoj ekspresiji miR-29

Budući da se pokazalo da je Akt3 meta miR-29 tijekom staničnog ciklusa i diferencijacije, njegova glavna uloga dodatno je procijenjena njegovom prekomjernom ekspresijom u miblastima C2C12 u prisutnosti transficiranih združenih miR-29, što je rezultiralo povećanim brojem stanica koje su napredovale iz Stadij G0 / G1 do S i M faze (slike 7a i b i dodatna slika 3). Kao što se očekivalo, prisutnost skupljenog miR-29 s kontrolnim praznim plazmidom (pCDNA-3.1) u C2C12 myoblastima dovela je do povećanog zaustavljanja stanica u fazi G0 / G1. Nadalje, porast ekspresije mišićnog gena ( MCK, MyHC IId i miogenin ) kao posljedica miR-29 transfekcije ublažen je koekspresijom Akt3 (Slika 7c). Stoga, prekomjerna ekspresija Akt3 može obnoviti stanični ciklus ili indeks proliferacije, nadjačavajući efekt diferencijacije miR-29.

Image

Prekomjerna ekspresija Akt3 mogla bi prevladati stanični ciklus i efekte diferencijacije miR-29 u stanicama C2C12. C2C12 myoblasti su prolazno kofeficirani skupljenim miR-29 i Akt3 ekspresijskim vektorom bez 3 'UTR miR-29 mjesta prepoznavanja (Akt3-3.1), miR-29 i pCDNA-3.1, ili NC i pCDNA-3.1 kao kontrola, nakon čega slijedi po 3 dana diferencijacije. Faza ( a ) staničnog ciklusa i indeks proliferacije ( b ) analizirani su citometrijom protočnog joda. RNA ekspresija miogenina, MyHC IId i MCK iz odgovarajućih transfekcija kvantificirana je Q-PCR ( c ). Proračun promjena u kratkom hodu odnosio se na kontrolnu transfekciju (NC i pCDNA-3.1). Rezultati su predstavljeni kao srednja vrijednost ± SEM (tri neovisne replike po grupi). * P <0, 05; ** P <0, 01; *** P <0, 001

Slika pune veličine

Rasprava

miRNA su nedavno otkrivene kao klasa regulatora u razvoju skeletnih mišića kod miševa, štakora, svinja i čovjeka. 7, 8, 9, 10, 11 Najistaknutiji miRNA-ti specifični za mišiće su miR-1, -133 i -206. miR-1 je izrazito izražen u mišićima odraslih svinja. miR-133 je umjereno izražen u mišićima odraslih, ali jedva se može primijetiti u mišićima fetusa i novorođenčeta. miR-206 obiluje koštanim mišićima svinja različite dobi, ali slabo se izražava u proliferacijskim satelitskim stanicama. 8 Glavni učinci miRNA su na modulaciju proliferacije i diferencijacije mišićnih stanica. Na primjer, miR-206 potiče diferencijaciju inhibirajući Idl-3 i MyoR, oba su inhibitora miogenih faktora transkripcije. 13 miR-1 potiče miogenezu potiskivanjem HDAC4, dok miR-133 pojačava proliferaciju mioblasta inhibirajući faktor odgovora u serumu. 14 Pored toga, miR-100, -192, -335, -214 i -221/222 također su dokazano sudjelovali u proliferaciji i diferencijaciji mišića. 11, 12, 45 Na temelju tih, miRNA mogu imati terapijsku primjenu. 3

Ranije smo pokazali da je ekspresija miR-29 razvojno regulirana u svinjskim skeletnim mišićima od rasta fetusa do odrasle osobe. 26 Slična razvojna ekspresija miR-29 primijećena je kod miševa i ljudi. 27, 32, 33 Ovi rezultati sugeriraju da je miR-29 transkripcijski reguliran sličnim mehanizmima u skeletnom mišiću kod sisavaca. Pokazano je da aktivirani NF- k B potiče ekspresiju faktora transkripcije YY1 koji se zauzvrat veže na mjesto konsenzusa uzvodno od klastera miR-29b-2 / c, čime inhibira njegovu transkripciju. 33, 46 Uz to, drugi su izvijestili da je izravno transkripcijsko suzbijanje promotora klastera miR-29b-1 / miR-29a od strane NF- κ B. 47 Pokazano je da se aktiviranje NF- κ B smanjuje tijekom mišjih diferencijacija koštanih mišića. 48 Uistinu, aktivacija NF-B B koju signalizira niz upalnih citokina (uključujući slab induktor apoptoze kao faktor nekroze tumora) može inhibirati miogeno diferencijaciju. 49, 50 Suprotno tome, inhibicija NF-B B potiče diferencijaciju i regeneraciju skeletnih mišića, čineći NF-B B potencijalnim terapijskim metom za Duchennovu mišićnu distrofiju i druge poremećaje gubitka mišića. 51, 52, 53 Pored toga, sumnjiva mjesta vezanja MyoD, miogenina i Mef2 prisutna su uzvodno od klastera miR-29b-2 / c, 36 što ukazuje na njihovu moguću ulogu u miogenoj diferencijaciji putem miR-29 regulacije.

miR-29 nadaleko je prepoznat kao aktivator supresije tumora i apoptoze. U biologiji raka, DNMT3A, DNMT3B, p85 alfa, CDC42, Bcl-2, Mcl-1, CCND2 i E2F7 utvrđeni su ciljevi miR-29. 21, 22, 23, 24, 54 Do sada je još uvijek potrebno identificirati efektne ciljeve miR-29 koji posreduju diferencijaciju skeletnih mišića. U ovom istraživanju pokazalo se da miR-29 inhibira proliferaciju myoblasta ciljajući Akt3 . Poznato je da su svi članovi obitelji Akt blisko uključeni u brojne biološke programe, dok je Aform3 izoforma posebno uključena u neke vrste raka poput melanoma. 34, 35, 36, 37, 38, 40 Postoje dokazi za Akt3 u regulaciji rasta stanica u VSMC-u i srcu. 42, 43, 44 Trenutno smo pokazali da Akt3 može promovirati proliferaciju myoblasta i izravni je cilj miR-29. Srušenje ekspresije Akt3 oponašalo je prekomjernu ekspresiju miR-29 u zabrani proliferacije stanica C2C12 (slike 6b i c). Pored toga, p85 α , još jedan cilj miR-29 u supresiji tumora, inhibiran je u miR-29 prekomjerno eksprimiranim myoblastima 22 (Slika 4g). MiR-29 kolektivno inhibira proliferaciju myoblasta ciljajući gene povezane s proliferacijom Akt3 i p85α .

Dosadašnji rad pokazao je da miR-29 cilja kolagen, Mfap5, Lims1, članove skupine polikomba i druge ključne čimbenike poput YY1, HDAC4 i Rybp, da inhibiraju pretvorbu myoblasta u miofibroblaste, promovirajući tako miogenezu na neizravan način. 28, 30, 31, 32, 33 Suprotno tome, smanjenje miR-29 moglo bi suzbiti miogenezu u miševa s kroničnom bolešću bubrega. 10 Ovdje smo pokazali da miR-29 posredovano ušutkivanje Akt3 u myoblastima može odgoditi staničnu proliferaciju i da je prekomjerna ekspresija Akt3 potisnula diferencijaciju myoblasta. Uz to, otkrili smo da se stanični ciklus i efekti diferencijacije miR-29 mogu značajno smanjiti u prisutnosti prekomjerne ekspresije Akt3 (Slika 7). To je izravniji učinak diferencijacije izazvane miR-29, u usporedbi s neizravnim učinkom inhibicije gore spomenutog fibrogenog puta.

Zaključno, naša je studija dala novi uvid u temeljnu ulogu miR-29 u promicanju mišićne diferencijacije, barem djelomično, inhibiranjem Akt3 na post-transkripcijskoj razini da posreduje u njegovim miogenim učincima. miR-29 i njegovi ciljni geni mogu stoga biti potencijalni kandidati za intervenciju usmjerenu na poboljšanje mišićnog rasta kod domaćih životinja, kao i u uvjetima skeletiranja mišića.

Dodatna informacija

PDF datoteke

  1. 1.

    Dopunske brojke

  2. 2.

    Dopunske tablice

Glosar

miRNAs

mikroRNA

UTR

neprevedena regija

VSMC

vaskularna stanica glatkih mišića

YY1

Yin Yang1

Rybp

Protein koji se veže za prsten i YY1

Mfap5

mikrofibrilarni protein 5

Q-PCR

kvantitativna lančana reakcija polimeraze

Edu

5-etinil-2'-deoksiuridin

Dodatne informacije nalaze se u ovom radu na web stranici Cell Death and Disease (//www.nature.com/cddis)