Mir-34a regulira staničnu proliferaciju, morfologiju i funkciju neurona novorođenčeta što rezultira poboljšanim ishodima u ponašanju | stanična smrt i bolest

Mir-34a regulira staničnu proliferaciju, morfologiju i funkciju neurona novorođenčeta što rezultira poboljšanim ishodima u ponašanju | stanična smrt i bolest

Anonim

teme

  • Kognitivna neuroznanost
  • Učenje i pamćenje
  • miRNAs
  • neurogeneza

Sažetak

miR-34a je uključen u regulaciju sudbine različitih vrsta stanica. Međutim, mehanizam kojim upravlja programom diferencijacije neuronskih stanica ostaje u velikoj mjeri nepoznat. Ovdje smo istražili ulogu miR-34a u neurogenezi i sazrijevanju neurona u razvoju i identificirali Doublecortin kao novi cilj miR-34a. Otkrili smo da prekomjerna ekspresija miR-34a in vitro značajno povećava proliferaciju prekursora i utječe na morfologiju i funkciju neurona u razvoju. Zaista, miR-34a prekompresivni neuroni pokazali su smanjenu ekspresiju nekoliko sinaptičkih proteina i receptorskih podjedinica, smanjenje gustoće struje izazvane NMDA i, što je zanimljivo, efikasniji odgovor na sinaptički poticaj. In vivo , prekomjerna ekspresija miR-34a pokazala je specifične efekte. U neuralnim progenitorima, prekomjerna ekspresija miR-34a pospješila je proliferaciju stanica, u migratornim neuroblastima smanjili su migraciju i u razlikovanju novorođenčetih neurona modulirali rast i složenost procesa. Ono što je također važno, otkrili smo da štakori koji prekomjerno izražavaju miR-34a u mozgu imaju bolje sposobnosti učenja i smanjenu emocionalnost.

Glavni

mikroRNA (miRNA) su male nekodirajuće RNA koje reguliraju post-transkripcijsku ekspresiju gena uključenih u širok spektar razvojnih i patoloških procesa. 1, 2

miR-34 su evolucijsko očuvana obitelj s tri člana u genomu kralježnjaka (miR-34a, miR-34b i miR-34c) i jednim ortolozima u beskralježnjacima. miR-34a, koji je u početku identificiran kao potencijalni supresor tumora u neuroblastomu, 3 se sveprisutno izražava s najvećom ekspresijom u mozgu. 4, 5, 6 U mozgu u razvoju otkriva se u nišama staničnih potomka koji okružuju lateralnu klijetku tijekom kortikalne neurogeneze. 7 Pored toga, pokazalo se da miR-34a negativno regulira in vitro dendritičko razgranavanje kortikalnih neurona koji se razvijaju, mijenjajući ekspresiju većeg broja sinaptičkih proteina. 8, 9 Nadalje, miR-34a regulira diferencijaciju mišjih živčanih matičnih stanica, 10 i ekspresiju gena Arc koji se odnosi na sinaptičku plastičnost u neurona hipokampala štakora. 11 Dakle, sve je više dokaza da je miR-34a uključen u neurogenezu sisavaca, diferencijaciju neurona i sinaptogenezu, iako je do sada relativno malo miR34a / ciljnih interakcija eksperimentalno potvrđeno u živčanom sustavu.

U hipokampusu odraslih sisavaca neurogeneza se javlja tijekom cijelog životnog vijeka osiguravajući opskrbu novostvorenim neuronima koji prolaze procese sazrijevanja, pokazuju pojačanu plastičnost i postaju se sinaptički integriraju u lokalni krug. 12 Ono što je važno, neurogeneza je povezana sa učenjem i pamćenjem, 13 te je dinamično regulirana fiziološkim i patološkim podražajima. 14 Nadalje, promjene u neurogenezi odraslih uobičajena su patološka značajka u nekoliko humanih neurodegenerativnih bolesti. Na primjer, kod Alzheimerove bolesti predloženo je povećanje neurogeneze hipokampusa, 15 a nekoliko studija pokazuje da se tijekom akutne ili kronične neurodegeneracije neurogeneza povećava i čvrsto regulira kako bi zamijenila oštećene neurone na mjestu lezije. 16 Stoga je trenutni cilj postizanje boljeg razumijevanja faktora i signalnih mehanizama koji kontroliraju neurogenezu odraslih i takva znanja pretočiti u osmišljavanje novih terapijskih strategija.

Ovdje smo istražili funkcionalne učinke miR-34a na mozak štakora i pokazali da miR-34a je uključen u kontrolu neurogeneze odraslih i sazrijevanje neurona u razvoju i in vitro i in vivo . Nadalje, prekomjerna ekspresija miR-34a povezana je s učinkovitijim reakcijama neurona na sinaptički poticaj, kognitivnim poboljšanjem i smanjenom emocionalnošću. Nadalje, identificirali smo Doublecortin (DCX) kao novi cilj miR-34a čija silazna regulacija može biti djelomice odgovorna, barem djelomično, za učinke posredovane miR-34a.

Rezultati

prekomjerna ekspresija miR-34a posredovana rAAV-om povećava proliferaciju kortikalnih prekursorskih stanica in vitro

Prvo smo mjerili nivoe ekspresije miR-34a u različitim danima in vitro (DIV) u prekursorima neurona izoliranim iz korteksa embriona štakora E15, koristeći PCR u stvarnom vremenu. Otkrili smo da se razina endogenog miR-34a dramatično povećava u početnim fazama razvoja, a zatim ostaje visoka i stabilna u kasnijim fazama diferencijacije i sazrijevanja (dopunska slika S1a).

Nakon što smo utvrdili da se dinamičke promjene u ekspresiji miRNA-34a događaju tijekom diferencijacije stanica prekursora, istražili smo može li prekomjerna ekspresija nivoa miR-34a utjecati na stvaranje i sazrijevanje neurona. U tu svrhu iskoristili smo rekombinantni sustav davanja gena posredovanog adeno-asociranim (rAAV) da prekomjerno eksprimiramo miR-34a gen (pri-miR-34a) zajedno s EGFP-om, pod dva neovisna konstitutivna promotora i, kao kontrolu, AAV prazni vektor pretjerano eksprimirajući samo EGFP (dopunska slika S1b). rAAV infekcija provedena je na pročišćenim kortikalnim prekursorima ubrzo nakon oplata i pričvršćivanja posuda (DIV 0). Prvo smo potvrdili pomoću PCR-a u stvarnom vremenu da je miR-34a prekomerno izražen nakon infekcije rAAV (dopunska slika S1c). Otkrili smo da je miR-34a dramatično reguliran, u prosjeku 10 puta nakon infekcije, te je potvrdio koekspresiju s markerom EGFP. Slično tome, prekomjerna ekspresija EGFP-a bila je visoka u kulturama zaraženim praznim vektorom (dopunska slika S1c). Povišena razina ekspresije miR-34a dovela nas je do istraživanja može li se miR-34a nalaziti u egzozomskim pripravcima kultura koje prekomjerno eksprimiraju. Zapravo, otkrili smo snažan porast egzoomske pripreme miR-34a, u usporedbi s neinficiranim kulturama (dopunska slika S2), što sugerira da bi njegovi regulatorni učinci mogli biti posredovani i putem staničnog ne-autonomnog mehanizma. 17

Budući da miR-34a ima dobro pokazan učinak na staničnu proliferaciju, 18 analizirali smo može li prekomjerna ekspresija miR-34a utjecati na proliferativno stanje i neuronskih prekursora. Važno je napomenuti da su mire-ekspresionirajuće kulture miR-34a, ispitivane pod fluorescentnim mikroskopom, pokazale suvišnost stanica u usporedbi s kontrolnim kulturama zaraženim praznim vektorom, sugerirajući porast ukupnog broja stanica (slika 1a). Doista, opazili smo da su od prvih dana prekomjerne ekspresije miR-34a, kortikalne kulture imale veći broj prekursora koji se dijele, zajedno s manjim brojem apoptotičkih stanica (slike 1b i c). Stoga smo koristili BrdU označavanje da bismo utvrdili proliferativni učinak miR-34a u prekursorima neurona. Prvo, BrdU je dodan dan nakon infekcije stanica (DIV 1), a zatim su kulture obojene anti-BrdU antitijelom kod različitih DIV. Kao što je prikazano na slici 2a, miR-34a zaražene kulture pokazuju veću primjenu BrdU u usporedbi s stanicama inficiranim praznim vektorima. Zatim smo izvršili eksperimente dvostrukog obilježavanja koristeći neuronski marker MAP2 i glialni marker GFAP. 19 Kao što je prikazano na slikama 2b i c, pojačavanje miR-34a inducira pojačanu ugrađenost BrdU (2, 8 puta) u neurone (slika 2b, gornja ploča) s vrlo malo BrdU + glijalnih stanica (slika 2b, donja ploča), pokazujući tako da miR-34a djeluje kao mitogen za prekurzore koji vrše neuroni.

Image

Prekomjerna ekspresija miR-34a povećava broj mitotičkih prekursora u ranim danima kulture. ( a ) Povećanje male snage trostruko obilježenih konfokalnih slika iz kultura transduciranih s praznim vektorom ili vektorom miR-34a. Prikazane su stanice pozitivne na EGFP (zelena) i MAP2 (crvena). U stanicama transduciranim miR-34a, moguće je primijetiti veću staničnu gustoću, na što ukazuju jezgre obojene DAPI (plava). Imajte na umu da, iako je fluorescencija EGFP u stanicama s NIV 4 niska, to ukazuje da se virusna infekcija pravilno dogodila. Linija skale: 20 µ m. ( b ) Reprezentativne konfokalne slike (DIV 3) pozitivne na EGFP (zelena), imunološko označene za sinaptofizin (crvene boje) i suprotstavljene DNK (plave). U prekomjerno eksprimirajućim kulturama miR-34a, među diferencirajućim stanicama očita je mitotička stanica u metafazi (bijela strelica). Linija mjerila: 10 μ m. ( c ) Kvantifikacija stanica u mitozi (lijevo) i apoptozi (desno) transduciranih kultura kod različitih DIV-a. U ranom DIV-u, miR-34a transducirane kulture pokazuju značajno povećanje proliferacijskih stanica prekursora, što sugerira kašnjenje u početku diferencijacije. Rezultati su izraženi kao postotak otkrivene stanice, podijeljen s ukupnim brojem stanica u svakom polju. Šipke predstavljaju srednje vrijednosti ± SEM ** P <0, 01; * P <0, 05 u usporedbi s kontrolnim vrijednostima

Slika pune veličine

Image

miR-34a inducira proliferaciju prekursora in vitro nakon BrdU označavanja. ( a ) Konfokalne slike većeg uvećanja pozitivne na EGFP (zelena), imunotizirane sa anti-BrdU (crvena) i kontrastirane s DAPI (plava). Prikazane su spojene slike (gornja ploča) i odgovarajuće slike s jednim crvenim kanalom (donja ploča). U kulturama prekomjerne ekspresije miR-34a, više stanica je ugradilo BrdU što ukazuje na veću proliferativnu sposobnost. Linija mjerila: 10 μ m. ( b ) Povećanje male snage dvostruko označenih konfokalnih slika iz kultura transduciranih s praznim vektorom ili vektorom miR-34a. Transduced stanice (DIV 4) pozitivne na anti-BrdU (crvena) imunostanirane su za MAP2 (plava) (gornja ploča) ili GFAP (plava) (donja ploča). Imunološki označavanje za MAP2 potvrđuje da su stanice pozitivne na BrdU uglavnom neuroni i da su ove stanice prisutne u većem broju u miR-34a kulturama prekomjerne ekspresije u usporedbi s kontrolnim kulturama. Malo stanica koje sadrže BrdU rezultira glijom, što pokazuje i bojenje s anti-GFAP antitijelom. Linija mjerila: 10 μ m. ( c ) Kvantitativni podaci su izraženi kratkim porastom BrdU + stanica. prekomjerna ekspresija miR-34 rezultira izrazitim porastom broja BrdU + stanica. Rezultati su izraženi kao promjena puta u odnosu na kontrolne kulture (prazan vektor). Šipke predstavljaju prosjek ± SEM * P <0, 01 u usporedbi s kontrolnim vrijednostima

Slika pune veličine

miR-34a regulira morfologiju neurona

Zatim smo se usredotočili na morfologiju zaraženih neurona u razvoju i analizirali složenost neurita. Zapravo smo otkrili da se miR-34a neuroni koji pretjerano eksprimiraju morfološki razlikuju od neurona zaraženih praznim vektorom. Zanimljivo je da, kao što je prikazano na slici 3a, prazni neuroni inficirani vektorima imaju izraženije neurite koji potječu iz staničnog tijela, čime dobivaju multipolarni aspekt, dok miR-34a neuroni prekomjernog pritiska pokazuju značajno smanjenje složenosti neurita što je potvrđeno i Sholl-ovom analizom (slika 3b ). 20 Suprotno tome, nisu utvrđene značajne razlike u ukupnoj duljini glavnih neurita (neuroni DIV 7, 115, 3 ± 21, 8 µm za miR-34a neurone; 109, 4 ± 14, 3 µm za prazne vektorske neurone). Ovi rezultati zajedno pokazuju da miR-34a ima ulogu u kontroli složenosti neurita.

Image

miR-34a utječe na rast neurita i izaziva elektrofiziološke i biokemijske promjene u sazrijevanju kortikalnih neurona. ( a ) Reprezentativne konfokalne slike razvijanja kortikalnih neurona (DIV 7) pozitivnih na EGFP (zeleno) i obojene DAPI za detekciju jezgara (plavo). Prazni vektorski neuroni pokazuju veći broj neurita koji proizlaze iz staničnog tijela u usporedbi s jednostavnijom neuritskom morfologijom neurona zaraženih miR-34a. Linija mjerila: 10 μ m. ( b ) Sholl analiza provedena na neuronima (DIV 9) potvrđuje nižu kompleksnost neurita što pokazuje značajno smanjenje broja presjeka u rasponu od 10–40 µm od stanice stanice. * P <0, 05 u usporedbi s kontrolnim vrijednostima. ( c ) Reprezentativni odgovor cijelih stanica na NMDA (200 µM ) zabilježen na -60 mV u prisutnosti glicina (3 µm) u dvije vrste stanica. Trake označavaju trajanje NMDA aplikacije. ( d ) Histogram podataka o amplitudi vršne struje normaliziran u kapacitetu ćelije iz praznog vektora i u mir-34a stanicama. Odziv stanica s praznim vektorom bio je značajno veći od stanica s miR-34a ( P <0, 05, Studentov t test). Podaci su dobiveni iz četiri staničnih pripravaka (prazne vektorske stanice n = 28; mir-34a stanice n = 25). ( e ) Analiza Western blot-a na sinaptosomskim membranama pročišćenim od zaraženih kultura potvrđuje smanjenje PSD95, sinaptofizina zajedno s podjedinicom NMDA receptora GluR1, NMDAR1 i NMDAR2A / B, u kulturama miR-34a u usporedbi s kontrolama. P- Aktin je korišten kao kontrola opterećenja. ( f ) analiza Western blot-a na sinaptosomskim membranama pročišćenim od inficiranih neurona, nesimulirani ili nakon kemijske LTP izazvane stimulacijom forskolin / rolipramom. Iako sinaptosomskim membranama neurona zaraženih miR-34a ima niži prag ekspresije podjedinice receptora GluR1, nakon kemijske stimulacije neuroni su sposobni regrutirati NMDA ionske kanale za LTP čak i učinkovitije od kontrola. P- Aktin je korišten kao kontrola opterećenja

Slika pune veličine

miR-34a neuroni koji prekomjerno eksprimiraju pokazuju modificirana fiziološka svojstva

Zatim smo istražili imaju li učinci prekomjerne ekspresije miR-34a na neuritnu morfologiju funkcionalne posljedice, posebice na elektrofiziološkoj razini. Stoga smo analizirali struju kao odgovor na primjenu NMDA (0, 2 mM) u prisutnosti glicina (3 mM) u kontrolnim ćelijama i miR-34a stanicama pomoću cjelovitih ćelija zakrpe-stezaljki pri konstantnom naponu od -60 mV. Primjena NMDA za kupku za 2–10 s inducirane unutarnje struje u svim ispitivanim neuronima, napon stegnut na -60 mV. Pored toga, reakcije obje vrste stanica su u sličnoj mjeri blokirali NMDA antagonist D-2-fosfonopentanske kiseline i na negativne potencijale Mg 2+, koji blokira NMDA kanal (podaci nisu prikazani). Zanimljivo je da je vršna amplituda NMDA struje u stanicama miR-34a bila uvelike potisnuta u usporedbi s kontrolnim neuronima (slike 3c i d) normalizacijom NMDA-inducirane struje u staničnu kapacitivnost (prazne vektorske stanice, 8, 2 ± 5, 3 pA / pF, n = 28; miR-34 A stanice, 5, 4 ± 2, 5 pA / pF n = 25; P <0, 05; sve stanice zabilježene su u 11 DIV).

Analiza Western blot-a na sinaptosomskim membranama iz zaraženih kortikalnih kultura pokazala je da upregulacija miR-34a uzrokuje slabiju ekspresiju nekoliko receptorskih podjedinica, uključujući GluR1 (smanjenje 46%), NMDAR1 (34%), NMDAR2A / B (55%) i nekoliko sinaptičkih proteina takvih kao PSD95 (38%), sinaptofizin (33%) i sinaptotagmin (Slika 3e i podaci nisu prikazani). Ova redukcija natjerala nas je da analiziramo sinaptičku plastičnost i posebno dugoročno potenciranje (LTP), koji ima važnu ulogu u učenju i pamćenju. 21 Da bismo inducirali LTP u kortikalnim kulturama, koristili smo dobro opisani protokol kemijske stimulacije forskolin plus rolipram koji rezultira produženim LTP (kemijski LTP, cLTP). 22 Zatim smo razmotrili isporuku GluRl u sinaptosomske membrane budući da je ugradnja AMPA-receptora koji sadrže GluRl u sinapse glavni mehanizam koji stoji na temelju LTP-a. 23 Otkrili smo da tretiranje kortikalnih kultura forskolinom (50 µM ) i rolipramom (0, 1 µM ) uporno povećava sadržaj glupl sinapstosomske membrane u pribl. 60 i 180% u praznim vektorskim i miR-34a kulturama, respektivno (Slika 3f). Ovi rezultati pokazuju da, iako miR-34a neuroni koji prekomjerno eksprimiraju imaju nižu bazalnu razinu GluR1, oni odgovaraju na sinaptički poticaj učinkovitije od kontrolnih neurona.

Doublecortin je nova meta miR-34a

miR-34a djeluje na različite mRNA poznate ili potencijalno relevantne u neuronskoj funkciji i plastičnosti, uključujući Notch1 i Numb-Like (NumbL). 7, 24 Stoga smo procijenili razine ekspresije tih transkripata pomoću PCR-a u stvarnom vremenu i otkrili značajno smanjenje NumbL-a, ali neočekivano značajno povećanje razina Notch1 (Slika 4a). Međutim, slično pojačavanje mrezhe Notch1 primijetili su Fineberg i sur. , 7 u mišjim živčanim stanicama.

Image

miR-34a smanjuje DCX ekspresiju u kortikalnim neuronskim kulturama. ( a ) PCR u stvarnom vremenu iz RNA izolirane iz kultura kod različitih DIV-a, pretvorenih u prazni vektor ili miR-34a vektor. Histogrami predstavljaju vrijednosti koje su prikazane kao promjena dnevnika (base2) u kontrolu (prazan vektor na istoj DIV). Značajno smanjenje opaženo je za NumbL transkript, dok je regulacija primijećena za Notch1. Zanimljivo je da se opaža značajno smanjenje DCX mRNA u zrelijim neuronskim kulturama (oko 30% kod DIV 7, 70% kod DIV 9). Za svaku normalizaciju uzorka upotrebljena je 18S rRNA ekspresija. Šipke predstavljaju prosjek ± SEM * P <0, 05; ** P <0, 01 u usporedbi s kontrolnim vrijednostima. ( b ) Western blot analiza (vrh) na ekstraktu transducirane kulture (DIV 7 i DIV 9) potvrđuje da se ekspresija DCX proteina smanjuje, što pokazuje normalizirana denzitometrijska analiza (dno). Trake predstavljaju prosjek ± SEM * P <0, 05 u usporedbi s kontrolnim vrijednostima

Slika pune veličine

Zbog uočenog kašnjenja sazrijevanja neurona koji prekomjerno eksprimira miR-34a, slijedeće smo analizirali ekspresiju Doublecortina (DCX), proteina citoskeleta neurona koji je kritičan za sazrijevanje i uspostavljanje morfologije neurona. 25, 26 PCR analiza u realnom vremenu i Western blot ekstraktima iz kultura zaraženih miR-34a, obje su pokazale značajno smanjenje DCX ekspresije (slike 4a i b), koja je dosegla približno. 64% smanjenje razine proteina na 9 DIV (slika 4b), a maksimum je bio 13 DIV (podaci nisu prikazani).

Zatim smo istražili može li smanjenje ekspresije DCX-a izravno uzrokovati miR-34a koji cilja ovaj transkript.

Stoga smo uzeli bioinformatički pristup kako bismo identificirali potencijalna mjesta DCR mRNA kao cilj miR-34a. TargetScan 6.2, PicTar i miRanda korišteni su za identificiranje jednog predviđenog cilja miR-34a u dugoj 3'UTR regiji DCX. Shematski crtež štakora DCX mRNA štakora i mjesto vezanja miR-34a prikazani su na slici 5a. Nadalje, jedinstveno mjesto vezanja miR-34a sačuvano je u DCX-3'UTR od različitih vrsta (slika 5b). Da bismo potvrdili DCX kao potencijalni cilj za miR-34a, izveli smo izvještaj luciferaze u stanicama N2a da bismo procijenili regulaciju transkripta kroz njegov 3'UTR. Prvo smo klonirali 3'UTR DCX koji je sadržavao predviđeno miR-34a ciljno mjesto iz cDNA mozga štakora u reporter konstrukciju luciferaze (R-luc) (Slika 5c). Eksperimenti ko-transfekcije otkrili su da prekomjerna ekspresija miR-34a dovodi do smanjenja R-luc aktivnosti za otprilike. 30% u odnosu na kontrolne razine (slika 5c). Kako bismo dodatno potvrdili interakciju između miR-34a i njegovog ciljanog DCX-3'UTR, mutirali smo sjemensku sekvencu miR-34a koja se nalazi unutar DCX-3'UTR izvjestitelja (Slike 5b i c). Ova mutacija nije značajno promijenila R-luc aktivnost u usporedbi s kontrolom, sugerirajući da je djelovanje miR-34a specifično za sjemensko područje miR-34a unutar DCX-3'UTR.

Image

DCX transkript nova je meta miR-34a. ( a ) Shematski prikaz 3'UTR regije transkripta DCX štakora koji pokazuje prisutnost jednog mjesta vezivanja za miR-34a štakora kako je predviđeno algoritmima miR / target gena predviđanja. ( b ) Pretraživanje baze podataka koje pokazuje mjesto vezanja za sjeme sekvence miR-34a u 3'UTR DCX i visoko je očuvano među nekoliko različitih vrsta. Podaci o predviđanju mjesta vezivanja i stupanj razgovora kod vrsta sisavaca dobiveni su od TargetScan. Divlji tip DCX 3'UTR izgaran štakora miR-34a i odgovarajuće mutirajuće DCX 3'UTR regije su također prikazane. ( c ) (Vrh) Shematski prikaz reporterskih konstrukcija luciferaze u psiCHECK2 za DCX 3'UTR. (Donja strana) Relativna aktivnost gena luciferaze reportera vektora koji sadrži divlji tip 3 ′ UTR štakora DCX mRNA štakora ili mutiranu regiju nizvodno od gena luciferaze u prisustvu vektora miR-34a štakora ili praznog vektora prikazana je na histogramu. Kofekcija plazmida koji eksprimiraju miR-34a ili relativne kontrolne plazmide zajedno s psiCHECK2 vektorom koji nosi divlji tip ili mutirani DCX 3'UTR provedena je na Neuro2A, a aktivnost luciferaze izmjerena je 24 sata nakon transfekcije. Vrijednosti su srednje ± SEM * P <0, 05, u usporedbi s odgovarajućom kontrolom

Slika pune veličine

Kolektivno, ovi rezultati pokazuju da miR-34a djeluje kao regulator tijekom razvoja neurona, dijelom izravno usmjeravajući DCX transkript.

miR-34a regulira progeneraciju progenitora i fenotipsko sazrijevanje novih neurona in vivo u mozgu odraslih štakora

Zatim smo ubrizgali miR-34a i ispraznili vektor koji eksprimira u cerebralne bočne komore štakora kod rođenja (P0). Injekcija virusa u neonatalni mozak nije pokazala znakove upalne reakcije, a u usporedbi s mozgom odraslih, veću penetraciju i učinkovitiju transdukciju neuronskih struktura (suplementarni rezultati; dopunske slike S3 i S4). 27

Ubrizgali smo jednu skupinu životinja ( n = 6 za svaki eksperiment, 5 pokusa) s rAAV vektrom koji eksprimira miR-34a, i drugu grupu s praznim vektorom ( n = 6 za svaki eksperiment). U pet tjedana nakon injekcije (5 wpi), životinje su ubijene, a razdvojene kriške mozga korištene su za morfološku i proliferativnu analizu konfokalnom mikroskopijom. Analizirali smo širenje prekursora u zubnom zubu (DG) i subventrikularnoj zoni (SVZ) iskorištavajući BrdU označavanje koristeći se sljedećim protokolom (slika 6a). Životinje koje su ubrizgavale rAAV primile su puls mitotičkog markera BrdU tokom 3 dana nakon čega su izvađene. Životinje ubrizgane s rAAV-miR-34a imale su povećanu ugrađenost BrdU u usporedbi s kontrolama, a BrdU + stanice su grupirane u male izolirane skupine duž granule granula stanica / hilus (Slika 6b). Štoviše, kvantitativna analiza obilježavanja BrdU unutar subgranularne zone otkrila je 1, 8-puta povećanje mitotičke aktivnosti (slika 6c). Slično tome, opazili smo veći broj stanica obilježenih BrdU u SVZ miR-34a transduciranih životinja u usporedbi s praznim vektorom (Slika 6d).

Image

miR-34a utječe na neurogenezu in vivo i smanjuje migraciju neuroblasta iz SVZ. ( a ) Shematski prikaz eksperimentalnog dizajna i vremenske strukture protokola za ispitivanje proliferacije nakon ubrizgavanja rAAV. Životinje su primile rAAV ventrikularnu injekciju na P0. Tri dana prije analize životinje su primile tri BrdU injekcije. Svaka strelica predstavlja injekciju u 1 danu. Zatim je analiza izvršena 5 tjedana nakon početka eksperimentalnog protokola. ( b ) Trostruko obilježene konfokalne slike DG-a označene za DNK (zelena), anti-BrdU (crvena) i DCX (plava), koje pokazuju porast broja BrdU + stanica u subgranularnoj zoni životinja zaraženih miR-34a. u usporedbi s kontrolnim životinjama koje su ubrizgavale prazne vektore. Često su se BrdU + stanice pojavile grupirane u sitne agregate u DG-u miR-34a ubrizganih životinja. Linija mjerila: 50 μ m. ( c ) Kvantitacija BrdU + stanica pokazuje porast od 1, 8 puta nakon prekomjerne ekspresije miR-34a. Vrijednosti su srednje ± SEM * P <0, 01 u usporedbi s kontrolnim vrijednostima. ( d ) Konfokalne slike neurogenih niša koje okružuju bočne klijetke trostruko obilježene DAPI (zelena), za BrdU (crvena) i DCX (plava). Veći broj BrdU + stanica u SVZ očit je u životinjama ubrizganim miR-34a u usporedbi s kontrolama. Nadalje, manji broj DCX + migrirajućih neuroblasta koji potječu iz SVZ prisutan je u životinjama koje injiciraju miR-34a u usporedbi s kontrolama. Strelice upućuju na DCX + migrirajuće neuroblaste u kontrolnim mozgovima. Dvije kukce pokazuju DCX + neuroblaste s tipičnom morfologijom migracijskih stanica poput malog tijela i vodećeg procesa. ( e ) Konfokalne slike regije koja okružuje bočne klijetke trostruko obilježene DAPI (zelena), DCX (crvena) i GFAP (plava). DCX imunološko obojenje smanjuje se u SVZ miR-34a životinja u usporedbi s kontrolama, uz značajno smanjenje migrirajućih neuroblasta koji eksprimiraju DCX koji potječe iz SVZ i lokalizirano u potkortikalnim regijama mozga. Strelice upućuju na DCX + migrirajuće neuroblaste u kontrolnim mozgovima. Dvije kukce prikazuju DCX + neuroblast s tipičnom morfologijom migracijskih stanica, koji se sastoje od malog jajnog staničnog tijela i dugog vodećeg procesa. Linija mjerila: 50 μ m

Slika pune veličine

Poznato je da u SVZ-u matične stanice i potomci stvaraju pokretne neuroblaste, eksprimirajući DCX, čija migracija ovisi o ovom proteinu povezanom s mikrotubulama. 28 Zanimljivo je da smo otkrili da sekcije prekomjernog ekspresije miR-34a pokazuju značajno smanjenje DCX obilježavanja u stanicama praroditelja smještenih u SVZ regijama (slika 6d) i smanjen broj DCX + migrirajućih neuroblasta (slike 6d i e).

Da bismo odredili dugoročnu sudbinu mitotički aktivnih stanica u DG miR-34a životinja, primijenili smo tri impulsa BrdU počevši od dana ubrizgavanja virusa (P0), a zatim ubili životinje u petom tjednu nakon infekcije (Slika 7a), Koronalni odsjeci mozga obojeni za BrdU i NeuN pokazali su značajan broj BrdU + stanica koje su nakon toga migrirale u stanični sloj granula i diferencirale se u neurone s osobinama zrelih granula (Slika 7b, lijeva ploča). Kvantitativna analiza BrdU + / NeuN + stanica pokazala je 1, 8-puta povećanje broja stanica po odjeljku u DG miR-34a, u usporedbi s životinjama praznih vektora (Slika 7b, desna ploča). Svi ovi rezultati potvrđuju da miR-34a djeluje kao mitogen za prekursore in vivo i in vitro.

Image

miR-34a kontrolira in vivo neuritnu složenost stanica novorođenčadi u granulama DG. ( a ) Shema eksperimentalnog dizajna. Životinje su primile rAAV ventrikularnu injekciju na P0. Istog dana životinje su primile prvu BrdU injekciju, a zatim dvije druge. Svaka strelica predstavlja injekciju u 1 danu. Zatim je analiza izvršena 5 tjedana nakon početka eksperimentalnog protokola. ( b ) Lijeva ploča: konfokalne slike trostruko označene s DAPI (zelena), a za BrdU (crvena) i NeuN (plava) odraslih DG-ova od životinja za kontrolu i miR-34a zaraženih. Kokalizacija lokalizacije BrdU bojom s neuronskim markerom NeuN pokazuje se konfokalnom mikroskopijom u sloju zrncanih stanica (GCL) DG. Zabilježite veći broj neurona u granulama dvostruko pozitivnih na BrdU i NeuN nakon injekcije rAAV-miR-34a. Donja lijeva ploča: konfokalna slika donjeg režnja DG odraslih osoba koja prikazuje zrnce neurona koji su imuno označeni i za NeuN i za anti-BrdU. Linija mjerila: 50 μ m. Desna ploča: usporedba broja BrdU + / NeuN + stanica unutar DG-a pokazuje 1, 8-puta povećanje u odnosu na kontrolne životinje miR-34a-injekcije. Šipke predstavljaju prosjek ± SEM * P <0, 01 u usporedbi s kontrolnim vrijednostima. ( c ) Primjeri konfokalnih slika trostruko označenih s DAPI (zelena), a za DCX (crvena) i GFAP (plava) odraslih DG-a od životinja koje su zaražene od miR-34a. Čini se da se DCX obojenje smanjuje kod životinja koje su ubrizgavale rAAV-miR-34a. Nisu primijećene promjene kod imunološkog bojenja GFAP-om. Linija mjerila: 50 μ m. ( d ) Vizualizacija novostvorenih neurona u odjeljcima DG-a koji su označeni s DCX-om zaraženih životinja. DCX označavanjem identificiraju se stanice neurona i vertikalno orijentirani dendriti sazrijevanja neurona u DG-u. DCX imunostanje se smanjuje i neuriti izgledaju manje složeni i više zatvoreni u GCL. Linija mjerila: 50 μ m. ( e ) Sholl-ova koncentrična analiza sfera provedena na neuronima sazrijevanja granula otkriva izmijenjenu dendritičku morfologiju u usporedbi s kontrolnim neuronima. Kontrolni neuroni imaju više sjecišta što ukazuje na veću složenost neurita. Zanimljivo je da većina ovih kontrolnih neurona ima procese koji se šire dublje u molekularni sloj (ML) DG, što sugerira veći kapacitet dendritičkog izraslina. Graf predstavlja srednje vrijednosti ± SEM * P <0, 05 u usporedbi s kontrolnim vrijednostima

Slika pune veličine

Zatim smo ispitali može li visoka ekspresija miR-34a utjecati na dendritički rast novorođenih neurona imunološkom bojom s DCX. U obje životinjske skupine koje su ubrizgali, otkrili smo da su DCX + stanice izražene u čitavoj DG s njihovim dendritima ispruženim do molekularnog sloja DG (slika 7c). Zanimljivo je da su sekcije životinja miR-34a pokazale smanjenje intenziteta DCX imuno obojenja (smanjenje od 32%) u usporedbi s praznim vektorskim sekcijama. Štoviše, neuroni u mladih odraslih DG miR-34a životinja pokazali su nižu dendritičku složenost i kraću udaljenost dendritičkog stabla do molekularnog sloja DG (maksimalna duljina od soma, 111 ± 22, 5 µm) u usporedbi s kontrole (maksimalna duljina soma, 144 ± 6, 5 µm) (slike 7c i d). Analiza koncentričnog kruga Sholl potvrdila je značajnu promjenu dendritičke morfologije i obrasca rasta novostvorenih neurona (slika 7e).

miR-34a prekomjerna ekspresija in vivo utječe na emocionalnost i kognitivne sposobnosti

Da bi istražili da li su promjene neurogeneze hipokampa i sazrijevanje neurona, izazvane miR-34a, povezane sa specifičnim promjenama kognitivnog i emocionalnog ponašanja, eksperimentalni ispitanici testirani su za učenje i pamćenje u testu prostorne navigacije, Morrisovom labirintu vode (MWM) i zbog socijalne anksioznosti u testu socijalne interakcije (SIT). 29

Što se tiče MWM-a (miR-34a = 10; prazan vektor = 10), nakon uvođenja u bazen, miR-34a štakori su karakterizirani smanjenom tigmotaksijom, što sugerira smanjenu emocionalnost u novom okruženju (bazen) (F (1, 14) ) = 5, 410; P = 0, 0356, slika 8a). Pored toga, i što je još važnije, tijekom faze stjecanja karakteriziralo ih je smanjeno kašnjenje do dostizanja skrivene platforme (F (1, 14) = 4.511; P = 0.0520, slika 8b), što sugerira poboljšane sposobnosti učenja. Kad je platforma uklonjena iz bazena za procjenu zadržavanja memorije, miR-34a štakori su uspjeli potrošiti više od 25% dodijeljenog vremena (razine slučajnosti) pretražujući platformu u ciljanom kvadrantu, dok kontrolni štakori nisu dostigli razinu šanse. pokazujući slabije kognitivne performanse (F (1, 14) = 3, 225; P = 0, 0334; post hoc usporedba: ciljni kvadrant, miR-34a u odnosu na prazan vektor, P <0, 05, slika 8c). Četiri ispitanika odbačena su iz analize (dva prazna vektora i dva štakora tretirana mir-34a) jer nikada nisu dostigli platformu tijekom faze stjecanja.

Image

prekomjerna ekspresija miR-34a, koju in vivo posreduje rAAV, poboljšava kognitivne sposobnosti i smanjuje anksioznost. Provedeni su bihevioralni testovi na odraslim mužjacima zaraženim rAAV-om (stari 5 tjedana). ( Gornja ploča ) Rezultati zadatka prostorne navigacije MWM pokazuju da je za štakora miR-34a karakteristično smanjena tigmotaksija nakon uvođenja u novo okruženje (bazen) i ponašanje koje sugerira smanjenu anksioznost ( a ). Uz to, u usporedbi s kontrolama, pokazali su bolje sposobnosti učenja u fazi stjecanja ( b ) i zadržavanje memorije u probnom ispitivanju ( c ). ( Donja ploča ) Rezultati SIT-a ukazuju na smanjenu emocionalnost, budući da su miR-34a životinje bile aktivnije ( a ) i karakterizirale su ih smanjenim ponašanjem tijekom ispitivanja socijalne interakcije ( b ). Maksimalna dužina društvenih susreta bila je 20 minuta, a svaka sesija bila je podijeljena u 4 vremenska bloka (tb). Podaci pokazuju srednju vrijednost ± SEM (MWM, n = 8 za svaku eksperimentalnu skupinu; SIT, n = 10 za svaku eksperimentalnu skupinu). * P <0, 05: ** P <0, 01

Slika pune veličine

Rezultati SIT-a (miR-34a = 10; prazan vektor = 10), sveukupno su pokazali da su miR-34a štakori bili aktivniji, karakterizirani smanjenom učestalošću napadaja nepokretnosti ( Z = −1.965; P = 0.0494, slika 8a) ; naprotiv, trajanje nepokretnosti nije se razlikovalo između dvije skupine životinja (Z = -1, 512; P = 0, 1306). Pored toga, miR-34a životinje također su izvele smanjenu količinu premještanja (F (1, 18) = 1, 888; P = 1, 888, slika 8b), sugerirajući smanjenu socijalnu anksioznost; trajanje ove kategorije ponašanja nije se razlikovalo između dviju skupina ( Z = -0, 680; P = 0, 4963). Što se tiče preostalih stavki u ponašanju, miR-34a i subjekti tretirani s praznim vektorima nisu se međusobno razlikovali (frekvencije: F (1, 18) = 0, 284; 0, 005; 0, 962; P = 0, 6007; 0, 9423; 0, 3397; trajanje: F (1, 18) = 0.277; 0.029; 1.680; P = 0.6053; 0.8656; 0.2113, respektivno, za pripadnička, istraživačka i igračka izazivačka ponašanja).

Sveukupno, bihevioralna analiza pokazala je da prekomjerna ekspresija miR-34a poboljšava kognitivne sposobnosti u performansama MWM-a i smanjuje anksioznost u socijalnom kontekstu kod odraslih štakora.

Rasprava

Ovdje prvi put pokazujemo da miR-34a ima važnu modulacijsku ulogu u neurogenezi i sazrijevanju novorođenih neurona i in vitro i in vivo . Konkretno, predstavljamo dokaze da prekomjerna ekspresija miR-34a rezultira: (i) povećanom proliferacijom stanica prekursora; (ii) inhibiciju neuritnog grananja i odloženo sazrijevanje stanica neurona u razvoju; (iii) izmijenjena fiziološka obilježja zrelih neurona; (iv) poboljšanje ishoda ponašanja. Važno je da smo identificirali DCX kao novi cilj miR-34a čija bi silazna regulacija dijelom bila odgovorna za učinke posredovane miR-34a u mozgu.

miR-34a je dobro prepoznata kao supresor tumora u mozgu i mnogim drugim tkivima. 30 Međutim, nekoliko studija također ukazuju na funkciju rasta i ističu promjenjive efekte miR-34a ovisno o vrsti stanice. 18 Na primjer, miR-34a nokautirani miševi pokazuju smanjeni broj prekursorskih proliferacijskih stanica u DG-u. 9 Nadalje, miševi s nedostatkom p73, koji pokazuju smanjene razine miR-34a, predstavljaju važne malformacije telencefalona i smanjenu neurogenezu odraslih. 8, 31 U skladu s ovim nalazima, otkrili smo da visoka razina miR-34a ekspresije inducira povećani broj proliferacijskih prekursora in vitro i in vivo, potvrđujući njegove različite učinke na rast ovisno o podražajima i staničnoj situaciji.

Prethodna ispitivanja in vitro pokazala su da miR-34a ima snažne učinke na arborizaciju kortikalnih neurona. 8, 9 Naši podaci potvrđuju i proširuju in vivo opažanje da miR-34a ima važnu ulogu u razvoju neuritske arborizacije i rastu novonastalih neurona. Prema našem saznanju, ovo je prva studija u kojoj su učinci miR-34a koji se pojavljuju u mozgu evaluirani u mozgu i prva demonstracija uloge miR-34a in vivo u kontroli sazrijevanja i morfologije neurona u post-mitotičkoj razvijanje neurona.

Nadalje, valja napomenuti da je miR-34a prisutan u egzozomima koji se oslobađaju u mediju neuronskih kultura, jer može ukazivati ​​na to da miR-34a može utjecati na stanice i autonomno i na stanično-autonomno. Ovo bi odredilo veću difuziju i širenje njegove modulacijske aktivnosti iz stanice koja se eksprimira u susjedne stanice.

Smanjeno dendritičko grananje i odgođeno sazrijevanje koje smo promatrali mogu biti posljedica manjka u mehanizmu neuronskog transporta ili abnormalnosti u strukturama citoskeleta. Zanimljivo je da smo otkrili smanjenu ekspresiju citoskeletnog proteina DCX i in vitro i in vivo . Genovese i sur. Prethodno su predložili vezu između DCX-a i miR-34a . 32 u mreži miR-a u kojima miR-34a djeluje kao glavni regulator.

DCX smo identificirali kao novi cilj miR-34a. Koristeći bioinformatske baze podataka, identificirali smo jedno visoko očuvano mjesto vezanja u 3'UTR DCX-a i luciferaznim testom potvrdili da se miR-34a može vezati na njega i izravno regulirati DCX ekspresiju. Ipak, ne možemo isključiti da drugi faktori mogu posredovati na smanjenju DCX-a za miR-34. Važno je napomenuti da je upečatljiva značajka DCX mRNA 7, 9-kilogramski dugačak 3'UTR, 25 koji sadrži regulatorne elemente bogate AU, koji nadalje upućuju na regulatorne mehanizme post-transkripcije.

DCX je povezan s diferencijacijom neurona i funkcionalno je povezan sa staničnom migracijom i drugim aspektima sazrijevanja, uključujući dendritogenezu i sinaptogenezu. 33 Izmjena nivoa ekspresije DCX-a mijenja arborizaciju dendrita i iscrpljivanje DCX-a usporava razvoj uzgajanih neurona hipokampala, održavajući ih u nezrelom stanju. 33, 34 Druga važna DCX funkcija je kontrola stanične migracije tijekom embrionalnog i postnatalnog razvoja mozga. 35 Zapravo, otkrili smo da prekomjerna ekspresija miR-34a utječe na migraciju neuroblasta neposredno uz SVZ. Budući da je miR-34a uključen u staničnu pokretljivost neuronskih prekursora, 36, moguće je da ovu funkciju posreduje DCX, koji bi zauzvrat kontrolirao citoskeletne preuređenja potrebne za staničnu pokretljivost u mozgu glodavaca. Međutim, ne možemo isključiti da su neki efekti posredovani prekomjernom ekspresijom miR-34a posljedica drugih mobilnih uređaja. Zanimljivo je da smo otkrili da su razine transkripta Notch1 povišene, a razine NumbL smanjene. Notch1 i NumbL su kritični igrači u složenoj regulaciji neurogeneze, uravnoteživanju proliferacije i diferencijacije. 24 Važno je utvrditi da li, ovisno o staničnom kontekstu i obilju i dostupnosti ciljnih transkripata, DCX put postaje dominantan i prevladavajući u ostalim mogućim učincima djelovanja miR-34a.

U skladu s prethodnim istraživanjima, otkrili smo da prekomjerna ekspresija miR-34a u neuronima u razvoju uzrokuje smanjenu ekspresiju nekoliko sinaptičkih proteina, 9 i recepcijskih podjedinica, od kojih neke nisu među predvidljivim ciljevima miR-34a. Zajedno s tim, pokazali smo smanjenje gustoće struje izazvane NMDA, što nadalje sugerira odloženo sazrijevanje miR-34a stanica prekomjerne ekspresije. Iznenađujuće, neuroni s tim značajkama učinkovitije su reagirali na sinaptički poticaj u odnosu na kontrolne neurone. Moguće objašnjenje nalazi se u prethodnim istraživanjima koja pokazuju da nezreli neuroni imaju povećanu unutarnju ekscitabilnost i plastičnost, što ih razlikuje od starije populacije manje plastične. 37 Zbog svoje fiziologije i slabe povezanosti, ti nezreli neuroni reagiraju na širok raspon ulaza. Stoga je u našem stanju moguće da nezreli neuroni miR-34a prekomjernog ekspresije pokazuju pojačanu plastičnost zbog specijaliziranih svojstava membrane i različitih pravila ekspresije LTP-a. Doista, Schmidt-Hieber i sur. 38 sugerira da novo generirani neuroni, koji imaju prag za indukciju LTP niži od kontrolnih neurona, izražavaju jedinstvene mehanizme za olakšavanje sinaptičke plastičnosti koji mogu biti važni za formiranje novih sjećanja. Međutim, ne možemo isključiti, kako predlažu Agostini i sur. , 9 da prekomjerna ekspresija miR-34a može povećati plastičnost neurona također preferirajući ometanje inhibicijskih ulaza.

Novi neuroni se kontinuirano dodaju određenim područjima mozga odraslih kao što je hipokampus, koji su uključeni u učenje / pamćenje i emocionalno ponašanje. 39 U hipokampusu odraslih osoba priraštaj nezrelih mladih stanica može utjecati na funkcioniranje hipokampala. 40 Because of their ability to form new synapses rapidly, newly generated neurons can form a greater number of new connections than resident mature cells thus playing an important role in hippocampal-dependent learning. We found that miR-34a increases in vivo progenitor proliferation and alters phenotypic maturation of new neurons in the DG of adult rats. Moreover, we found that rats overexpressing miR-34a in the brain have better learning abilities in the acquisition phase and memory retention in MWM test and a reduced emotionality in the SIT. Thus, miR-34a could influence learning and anxiety-related behaviours by enhancing production of new neurons and modulating their maturation stage. Consistently, recent reports have implicated miR-34 family in regulating genes that mediate the behavioural changes in response to stress. 41, 42

miR-34 increases with age in C. elegans and D. melanogaster . 43, 44 In mammals miR-34a orthologue also increases with age 5, 45 and is misregulated in degenerative diseases. 45, 46 Moreover, inactivation of miR-34 expression has been recently shown to lead to accelerated neurodegeneration and ageing in D. melanogaster, 44 whereas in vertebrates its elevation has been suggested to be either protective or contribute to age-associated events. 46, 47 In addition, miR-34a expression is upregulated in brain tissue, 48 blood mononuclear cells, 49 and cerebrospinal fluid (CSF), 50 of Alzheimer's disease patients.

On the basis of these observations, it is possible that miR-34a, harbouring cell cycle-related functions in dividing and differentiating cells, may have evolutionary acquired functions to silence genes that promote age-associated decline and age-related diseases. Thus, the modulation of miR-34a levels could be investigated as a potentially useful strategy to counteract aging and neurological disorders.

Materijali i metode

životinje

Adult time-mated female Wistar rats were purchased from Harlan Laboratories (Indianapolis, IN, USA). The authors certify that all the experimental protocols used in the present study were in compliance with the European Guide for the Care and Use of Laboratory Animals and institutional guidelines and with the Italian legislation on animal experimentation (Decreto L.vo 116/92).

Expression constructs

See Supplementary information.

AAV production, transduction and in vivo injection

rAAV (rAAV1/2) mosaic vectors containing a 1 : 1 ratio of AAV1 and AAV2 capsid proteins with AAV2 inverted terminal repeats (ITRs) were generated by crosspackaging as previously described. 51

Briefly, the packaging HEK293 cells were cultured in DMED media (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) supplemented with 10% fetal bovine serum, 1 mM glutamine, 100 Units/ml penicillin and 100 μ g/ml streptomycin. HEK293 cells were transfected with the AAV vector plasmid, the AAV1 and AAV2 helper plasmids and mini-adenovirus helper plasmid by standard calcium phosphate transfection methods. 51 Forty-eight hours after transfection, cells were harvested and the vector purified using heparin affinity columns (Sigma, St. Louis, MO, USA). The purity was assessed by running 10 μ l of the viral purification on a Coomassie protein gel. Genomic titre were determined using quantitative real-time PCR (Stratagene, La Jolla, CA, USA), using primers designed to WPRE. Generally, rAAV purification titre was estimated to vary from 1 to 2 × 10 8 particles/ μ l, as obtained by quantitative real-time PCR.

For in vitro experiments, after 3 h, when cells had attached to the substrate, 1 or 2 μ l of the rAAV viral particles was added into the culture medium, resulting into visual EGFP signal after 3–4 days and almost 100% transduction efficiency.

For in vivo experiments, postnatal day 0 rat pups (P0) were injected as described by Li and Daly. 27 Briefly, pups were cryoanesthetized and injected with 2 μ l purified rAAV stock into each lateral ventricle (1 mm posterior to bregma and 2 mm lateral to the sagittal suture) using a 10- μ l Hamilton syringe. Individual experiments were performed on pups from the same litter and repeated on pups of different litters. Animals were tattooed on the footpads to identify the groups injected with the rAAV-empty vector or rAAV-miR-34a. Behavioural training began at the end of the 4 weeks after vector infusion when transgene protein expression had peaked to remain at stable levels. All tests were conducted by an observer blinded to the treatments.

Primary cortical neuron culture

To obtain embryonic cortical neurons, time-mated Wistar rats were euthanized by CO 2 and cervical dislocation. Cells were were prepared with slight modifications from the protocol proposed by Xu et al. 52 Cortical tissues of rat embryos (E15) were dissected and dissociated by trypsin treatment followed by trituration. After removal of trypsin, neurons were seeded onto 35- or 100-mm-diameter Petri dishes coated with poly-L-lysine (0.5 mg/ml, Sigma), plated at the density of 600 000 cells for imaging experiments or at a density of 800 000 cells in a 35-mm plate for biochemical analysis. For synaptosomal purifications, neurons were plated at a density of 5 × 10 6 cells in 100-mm-diameter plates. The cultures were maintained in Neurobasal supplemented with B27 (Invitrogen), 1 mM sodium pyruvate, 2 mM glutamine and antibiotics in a humidified incubator at 37 °C and 5% CO 2 . At day 5 of culture, 25% of freshly made complete medium was added without Arabinofuranosyl Cytidine (AraC).

For proliferative experiments, 5-bromo-3′-deoxyuridine (BrdU) (1 : 100 solution, Invitrogen), was added to cultures 1 day in vitro (DIV 1) after plating and trasduction (DIV 0). Cultures at different experimental time points were then fixed, processed for immunofluorescence, counterstained with DAPI. For each experimental time point, mitotic cells (identified by chromosome condensation by DAPI), BrdU-labelled cells and apoptotic cells (picnotic nuclei) were counted and the percentage of proliferating and apoptotic cells was calculated.

For chemical LTP stimulations, neuronal cultures (DIV 7 and DIV 9) were first incubated in ACSF (125 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1 mM MgCl 2, 2 mM CaCl 2, 33 mM D-glucose, and 25 mM HEPES pH 7.5) for 30 min at room temperature, followed by stimulation with 50 μ M forskolin (Sigma) and 0.1 μ M rolipram (Calbiochem, San Diego, CA, USA) in ACSF (no MgCl 2 ). After 10 min of stimulation, neurons were replaced in regular ACSF and then subjected to subcellular fractionation.

PCR u stvarnom vremenu

See Supplementary information.

Subcellular fractionation of rat brain tissues and primary cortical neurons

Rat neuronal cultures were subjected to fractionation as previously described, 53 with minor modifications. Dounce homogenates of the pellets in ice-cold TEVP buffer (containing 10 mM Tris-Cl pH 7.5, 320 mM sucrose, proteases inhibitor cocktail, phosphatases inhibitor cocktail) were centrifuged at 1000 × g to remove nuclei and large debris (P1). The supernatant (S1) was centrifuged at 10 000 × g to obtain a crude synaptosomal fraction (P2) and subsequently was lysed hypo-osmotically and centrifuged at 25 000 × g to pellet a synaptosomal membrane fraction (LP1). Protein concentration was determined using microBCA assay (Pierce, Rockford, IL, USA) and 30 μ g of LP1 was subjected to SDS-PAGE.

Protein lysis and western blot

For protein expression analysis, primary cortical neurons transduced with purified rAAV vectors were detached by pipetting and cellular pellets were lysed in RIPA buffer: 150 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, and 1% Triton X-100 and protease inhibitors (Sigma), 1 mM PMSF pH 7.4. Samples were resolved in SDS-PAGE gels with different percentages. Western blot analysis was performed as previously described. 54, 55

The following antibodies were used: mouse anti-alpha-tubulin 1 : 1000 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), mouse anti-beta-actin 1 : 1000 (Sigma); anti-p53 1 : 500 (Santa Cruz Biotechnology); rabbit anti-DCX 1 : 500 (Santa Cruz); rabbit anti-PSD95 1 : 1000 (Cell Signalling, Beverly, MA, USA), rabbit anti-NMDAR1 1 : 100 (Chemicon), rabbit anti-NMDAR2A/B 1 : 500 (Chemicon), mouse anti-synaptophysin 1 : 500 (Synaptic Systems, Goettingen, Germany), rabbit anti-synaptotagmin 1 : 500 (Sigma) anti-GluR1 1 : 1000 (Upstate, Charlottesville, VA, USA). The quantitation of protein expression was determined after normalization to tubulin or actin by measuring the optical density of respective band blots using the Quantity One software (Bio-Rad, Hercules, CA, USA).

Exosome isolation

Medium from 8-day-old primary cultures (4–5 × 10 7 cells) was harvested and cleared of debris by two successive centrifugation steps (2000 × g for 10 min and 20 000 × g for 20 min). Membranes were recovered from the cleared medium by centrifugation for 45 min at 100 000 × g . They were resuspended in Trizol (Invitrogen) for RNA isolation as described in Faure et al. 56

Elektrofiziologiia

Membrane currents were recorded from the cell soma of cortical cells at 8–11 days. The whole-cell configuration of the patch-clamp method was used. Recordings were performed with pipettes pulled from capillary tubes with a Narishige micropipette puller (tip resistances 4–5 MΩ).

All recordings were performed at room temperature (22–24 °C) and obtained using an Axopatch 200B amplifier (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA). pCLAMP 8 software was utilized for the data acquisition system. The signals were filtered at 2–10 KHz and digitized at 20–50 KHz. After the establishment of a gigaseal, the pipette resistance and capacitance were compensated electronically and the cells were accepted for study only if these parameters remained stable. 57 The cells chosen for the electrophysiological recordings looked like pyramidal neurons and represented more than 80% of the neuronal population in the culture. Cell capacitance was measured for each cell from the amplifier and from transient currents produced by 10 mV hyperpolarizing voltage steps. The values of the peak current were normalized to cell capacitance. Different solutions were applied by gravity using small tubes (diameter <1 micron), which were placed at near the patched cell using a fast perfusion system (SF-77B Warner Ins., Hamden, CT, USA). During the experiment, cells were continuously perfused with a control solution. Experiments were carried out in a bath medium that contained 120 mM NaCl, 3 mM KCl, 2 mM CaCl 2, 2 mM MgCl 2, 20 mM glucose and 10 mM HEPES (pH 7.3 with HCl). The whole-cell recording pipette used for recording the membrane currents contained 130 mM CsCl, 20 mM tetraethylammonium chloride, 5 mM EGTA, 10 mM glucose, 10 mM HEPES, 1 mM MgCl 2, 0.24 mM CaCl 2 and 2 mM ATP (pH 7.3 with CsOH). The NMDA (0.2 mM) was dissolved in the bath medium, which was Mg 2+ free and contained 3 μ M of glycine.

imunofluorescencija

Neurons in cultures grown on poly-L-lysine-coated glass coverslips were fixed with 4% paraformaldehyde/phosphate-buffered saline for 20 min at 37 °C, washed for 5 min with phosphate-buffered saline, permeabilized with 0.2% Triton X-100 in phosphate-buffered saline for 3 min and washed three times for 5 min with phosphate-buffered saline. For BrdU labelling, fixed neurons were incubated with 2 N HCl for 30 min at room temperature to denature DNA, followed by 0.1 M sodium tetraborate 5 min and then washed several times in PBS, before proceeding with the primary antibody incubation.

Cells were then processed with primary and secondary antibodies and counterstained with DAPI. The following primary antibodies were used: mouse anti-BrdU (Santa Cruz Biotechnology) diluted 1 : 80; mouse anti-MAP2 (Sigma), diluted 1 : 500; rabbit anti-GFAP (Chemicon) diluted 1 : 1000; anti-NeuN (Millipore, Darmstadt, Germany) diluted 1 : 400; mouse anti-beta-tubulin III (Chemicon) and goat anti-DCX (Santa Cruz Biotechnology) were diluted 1 : 250. All antibodies were diluted in phosphate buffer containing 3% bovine serum albumin and 0.05% Tween-20 and incubated 1 h at at 37 °C. After rinsing, the coverslips were incubated with fluorescently-labelled secondary antibodies (1 : 250) (Jackson Immunoresearch Laboratories, West Grove, PA, USA and Molecular Probes, Eugene, OR, USA) for 30 min at room temperature. After a thorough rinse, coverslips were mounted and analysed by confocal microscope.

Immunofluorescence on brain tissues

Immunofluorescence on brain tissues was performed as previously described. 58 Free-floating sections (35 μ m thickness) for BrdU staining were pretreated with 2 N HCl for 30 min at room temperature to denature DNA, followed by 0.1 M sodium tetraborate 5 min and then washed several times in PBS. Sections were then blocked for 1 h in PBS with 0.2% Triton X-100 containing 10% donkey serum. Primary antibodies were incubated for 24 h at 4 °C. 19 The primary antibodies were used at the following concentrations: goat polyclonal anti-DCX (Santa Cruz, CA, USA), 1 : 200; mouse monoclonal anti-neuronal nuclei NeuN (Millipore), 1 : 400; mouse anti-GFP (Dako, Glostrup, Denmark) diluted 1 : 250; mouse anti-MAP2 (Sigma), diluted 1 : 500; rabbit anti-GFAP (Dako) diluted 1 : 1000; rabbit anti-iba1 (Biocare Medicine, Concord, CA, USA) diluted 1 : 500; mouse anti BrdU (Santa Cruz Biotechnology), mouse monoclonal anti-GFP (Millipore), 1 : 250. Secondary antibodies against appropriate species were incubated for 1 h at 37 °C (1 : 250) (Jackson Immunoresearch Laboratories and Molecular Probes). Fluorescently stained sections were coverslipped with glycerol in PBS containing an anti-fading. Fluorescently immunolabelled sections were analysed on an Olympus (Tokyo, Japan) FV1000 confocal laser scanning microscope. Confocal Z sectioning was performed at 0.8 μ m intervals using a × 60 (NA=1.42) oil-immersion objective for single and double scanning. Images were acquired and a Z-stack was reconstructed using the Olympus software (Tokyo, Japan), cropped, adjusted and optimized in Photoshop 9.0. Other images of fluorescently immunolabelled sections were acquired using a Nikon (Tokyo, Japan) microscope.

In vivo neurogenesis analysis

The thymidine analogue BrdU (Invitrogen) was used in vivo to label proliferating cells. Two different protocols of injections were performed to estimate the proliferation rate, cell fate determination and survival. In one case, rat pups ( n =6 per group) received three daily consecutive sub-dermal injections of BrdU (20 mg/kg) (Invitrogen), once every 12 h, starting from the day of rAAV injection. In a second protocol, young rats ( n =6 per group) after 4 weeks from the rAAV infection, received three consecutive BrdU (80 mg/kg) intraperitoneal injections, once every 12 h. Rats were killed 24 h after the last BrdU administration and perfused for further tissue analysis.

To estimate the number of BrdU-labelled cells present in the SVZ and dentate gyrus, we sampled every three sections throughout the rostrocaudal extent of each structure from the rAAV-empty vector and rAAV-miR-34a stained sections labelled for BrdU. Each of the regions quantified was defined based on anatomical and stereotaxic coordinates. Quantification of BrdU + cells was performed using the ImageJ software (NIH, USA) on confocal images of a specific brain region. For each region, the results were reported as the mean number of BrdU + cells per section. The number of BrdU+ cells was then averaged to represent each brain.

Sholl analysis

Six to nine EGFP + cortical rat neurons were chosen from cell culture and scanned using a FluoView 1000 (Olympus) ( × 40, 1.3 NA or × 60, 1.42 NA). Similarly, for analysis in the DG of infected animals, six to nine cells expressing DCX cells (per animal) with vertical oriented dendrites extending into the dentate molecular layer were traced in their entirety. Images of collapsed z-stacks were imported into NIH ImageJ, and dendritic complexity was analysed from 8-bit images by using the ImageJ Sholl Analysis plug-in (//rsb.info.nih.gov/ij/). Total dendritic length and number of intersections of each individual neuron were analysed. The centre of all concentric circles was defined as the centre of the cell's soma. The parameters used were starting radius (10 μ m), ending radius (300 μ m from the centre) and interval between consecutive radii (10 μ m).

Behavioural tests

Social Interaction Test

The night before the test all subjects (MiR-34a=10; empty vector=10) were placed individually in a holding cage, a procedure known to stimulate social interactions. 59, 60 Experimental subjects were placed in a novel cage, identical to the holding cage, with an unfamiliar conspecific of the same strain, weight and sex that had been previously isolated (standard opponent). The maximum length of social encounters was 20 min; frequency and duration of environmental exploration (sum of crossing, sniffing and rearing), social investigation (sum of body, nose and ano-genital sniffing and follow), affiliative behaviours (allogrooming, social rest and social inactive) and displacement/de-arousal behaviours (sum of digging and self-grooming) were scored. For a complete description of behavioural items, see Circulli et al. 59 and Berry et al. 60

Morris Water Maze

Experimental subjects (miR-34a=10; empty vector=10) underwent a 1-day MWM test. 61 In particular, rats were introduced in a Plexiglas circular pool (180 cm, diameter) ideally subdivided into four quadrants and filled with water (24–26 °C) and underwent six acquisition trials to learn to locate the position of a platform hidden below the water surface. Each trial was spaced from the other by a 45-min interval and had 60-s duration (cutoff time) during which animals freely swam until they found the platform or until cutoff. Ninety minutes following the last training trial a 60-s probe trial memory test was performed by removing the platform from the maze. The following behaviours were scored: thigmotaxis (ie, swimming along the pool border, a behaviour indicative of risk assessment), latency to reach the platform (acquisition phase); time spent in the acquisition quadrant compared with other quadrants (probe trial memory test). Behaviour was analysed with a dedicated software (Ethovision, Noldus, Wageningen, The Netherlands).

Luciferase analysis

To examine the knockdown potencies of miR-34a on the 3′UTR region of rat DCX, we constructed reporter genes with the psiCheck2 vector (Promega, Madison, WI, USA). The 3′ UTR of rat Dcx (a PCR fragment around 1000 bp length) was cloned downstream of the Renilla luciferase gene using the Not1-Xho1 sites of the vector. Neuro2a (N2a), a mouse neuroblastoma cell line, was used for luciferase assay. Briefly, the cells were grown in Dulbecco's modified Eagle's medium (Invitrogen) supplemented with 10% fetal bovine serum (Invitrogen), 100 U/ml penicillin and 100 μ g/ml streptomycin at 37 °C in 5% CO 2 -humidified chamber. The day before transfection, cells were trypsinized, diluted with culture medium without antibiotics, and seeded into 6-well culture plates to reach a 70% confluency. Lipofectamine-2000 transfection reagent (Invitrogen) was performed according to the manufacturer's instructions. For assessment of the knockdown potency of miR-34a, the transfection on N2a was conducted with the following plasmids: 500 ng psiCheck2- 3′UTR plasmid and 2 μ g rAAV-miR-34a or rAAV empty vector. At 24 h after transfection, cells were lysed and analysed for luciferase activity using the Dual-GloTM Luciferase Assay System (Promega). Renilla luciferase values were normalized to control firefly luciferase levels (transcribed from the same vector but not affected by the 3′UTR tested), (Renilla luciferase/firefly luciferase), and averaged across three-well repetitions per condition. Data are the average of three separate transfections performed on different days with different passage numbers of cells.

Statistička analiza

Statistical significance was assessed by unpaired two-tailed Student's t -tests. A probability level of less than 0.05 was accepted as statistical significance. Degrees of statistical significance are presented as * P <0.05 and * P <0.01. Data in the text and figures were generally expressed as means±SEM For electrophysiological experiments, statistical analyses were performed using SPSS 11.0.0 for Windows (SPSS Inc., Chicago, IL, USA). All results were expressed as mean±SD, with n the number of tested cells. The significance of the effect was performed by unpaired two-tailed Student's t -tests. The significance level was set to 0.05. Behavioural data were analysed using parametric analysis of variance (ANOVA) with treatment as between-subjects factor and time blocks as within-subject repeated measures both for SIT and for MWM. Since data did not follow a normal distribution, a Mann and Whitney U test was applied to analyse the immobility behaviour in the SIT. Post hoc comparisons were performed using the Tukey's test.

Dodatna informacija

PDF datoteke

  1. 1.

    Dodatna informacija

Glosar

AAV

adeno-associated virus

BrdU

5-bromo-3′-deoxyuridine

DAPI

4′, 6-diamidino-2-phenylindole

DCX

Doublecortin

DG

dentate gyrus

DIV

day in vitro

EGFP

pojačani zeleni fluorescentni protein

GCL

granule cell layer

GFAP

glialni vlaknasti kiseli protein

GLUR1

glutamate receptor 1

ITRs

inverted terminal repeats

miR-34a

microRNA-34a

ML

molecular layer of the dentate gyrus

MWM

Morris Water Maze

omata

N -methyl-D-aspartate receptor

Notch1

Notch homologue 1 translocation-associated ( Drosophila )

NUMBL

Numb-like protein

PSD95

postsynaptic density protein 95

SIT

social interaction test

SVZ

subventricular zone

3′UTR

3′untranslated region

WPRE

Woodchuck post-transcriptional regulatory element

Dodatne informacije nalaze se u ovom radu na web stranici Cell Death and Disease (//www.nature.com/cddis)