Mir455 je povezan sa signalizacijom hipoksije i dereguliran je u preeklampsiji | stanična smrt i bolest

Mir455 je povezan sa signalizacijom hipoksije i dereguliran je u preeklampsiji | stanična smrt i bolest

Anonim

teme

  • Biomarkeri
  • Stanična signalizacija
  • miRNAs
  • Preeklampsija

Sažetak

Preeklampsija je teški poremećaj povezan s trudnoćom i vodeći uzrok smrtnosti majki i ploda u svijetu. Stoga je rana identifikacija bolesnika s povećanim rizikom za preeklampsiju jedan od najvažnijih ciljeva u akušerstvu. Ovdje identificiramo dva povezana ljudska mikroRNA kao potencijalni biomarker za otkrivanje trudnoće u riziku. Pokazujemo da su miR455-3P i miR455-5P značajno smanjeni u placenti kod pacijenata s preeklampsijom, dok ostali mikroRNA specifični za placentu ostaju netaknuti. predviđanje i validacija mikroRNA otkrili su potencijalnu vezu miR455-3P sa signalizacijom hipoksije. Zajedno s našim opažanjem da su razine ekspresije miR455-3P i miR455-5P regulirane tijekom diferencijacije trofoblasta, naši rezultati sugeriraju model u kojem miR455-3P potiskuje odgovor hipoksije koji bi u suprotnom mogao spriječiti diferencijaciju citotrofoblasta od sinctiotrofoblasta. Ukratko, naš rad otkriva signalizaciju aberantne hipoksije u preeklampsiji koja se može objasniti dereguliranom ekspresijom miR455. Kako je pronađeno miR455 u cirkulirajućoj krvi, moguće je razviti neinvazivne prenatalne testove koji omogućuju ranu dijagnozu preeklampsije.

Glavni

Posteljica povezuje plod u razvoju s stijenkom maternice i omogućava razmjenu plina, unos hranjivih tvari i uklanjanje otpadnih proizvoda putem majčine opskrbe krvlju. Štoviše, posteljica ima endokrino djelovanje, proizvodeći različite hormone povezane s trudnoćom i faktori rasta koji reguliraju rast fetusa i majčin odgovor na trudnoću. 1 Aberantna funkcija ili razvoj placente povezan je s mnogim komplikacijama trudnoće, uključujući preeklampsiju (PE). PE je multisistemski poremećaj povezan s trudnoćom s incidencijom od 2 do 5%, što je glavni uzrok smrtnosti i smrtnosti majki i fetusa. 2 Iako točna etiologija PE ostaje neuhvatljiva, placenta ima središnju ulogu. 3 U prvom i drugom tromjesečju lokalne nestalne imunološke interakcije na feto-majku unutar stijenke maternice dovode do oštećenja invazije arterijskih zidova od strane stanica trofoblasta. To dovodi do neuspjele transformacije spiralnih arterija maternice i kasnije smanjene placente perfuzije. 3 Kronična hipoksija ili alternativni periodi hipoksije / reoksigenacije unutar intervilloznog prostora pokreću oksidativni stres tkiva i povećavaju apoptozu i nekrozu posteljice. 4 Nakon toga, krhotine posteljice i abberantna ekspresija protuupalnih, antiangiogenih i angiogenih čimbenika dovode do sistemske disfunkcije endotelnih stanica i do pretjeranog upalnog odgovora. 5, 6, 7, 8, 9 Zanimljivo je da se čestice koje prolijevaju na površini posteljice puštaju u majčinu cirkulaciju, a njihov sadržaj, DNK, kao i mikroRNA (miRNA), mogu poslužiti kao neinvazivni biomarkeri za poremećaje povezane s trudnoćom. 10, 11

MikroRNA su velika obitelj post-transkripcijskih regulatora ekspresije gena, duljine oko 21 nukleotida (nt), koji kontroliraju mnoge razvojne i stanične procese u eukariotskim organizmima. MikroRNA se obrađuju iz molekula prekursora (pri-miRNA), koje su ili prepisane iz neovisnih gena miRNA ili predstavljaju introne gena koji kodiraju proteine. Pri-mikroRNA se presavijaju u čepove za kosu koje se nuklearnim enzimom RNAse III obrađuje Drosha u pre-miRNA od ∼ 70 nt. Nakon izvoza u citoplazmu, pre-miRNA se dalje pomoću Dicer-a obrađuje u dupleks sa 21-bp miRNA / miRNA *. Jedan lanac ovog dupleksa, koji predstavlja zrelu miRNA, tada je ugrađen u miRNA-inducirani prigušivački kompleks (miRISC). 12 Za mnoge miRNA gene, jedna zrela miRNA izvedena iz 5 ′ ili 3 ′ kraka pre-miRNA ukosnica poželjno je uključena u miRISC. Međutim, oko 10-15% miRNA gena izražava obje zrele miRNA. Označavaju se pomoću sufiksa -5p i -3p. 13, 14, 15

Kao dio miRISC-a, zreli par miRNAs bazira s nizovima u 3'-UTR ciljnih mRNA i usmjerava njihovu translacijsku represiju i / ili mrtvicelaciju i degradaciju mRNA. 12 mikroRNA također se preporučuje da ciljaju kodirajuću sekvencu nekih mRNA kao i 5'UTR mRNA koja kodira protein proteinima, što dovodi do inhibicije ili aktiviranja ciljeva. 16, 17 Većina životinjskih miRNA nesavršeno baziranih parova s ​​ciljanim mRNA. Ipak, učinkovito ciljanje mRNA zahtijeva kontinuirano bazno uparivanje sekvence miRNA „sjeme“ (nt 2–8). 18 Budući da je komplementarnost opsežnija od sparivanja sjemena kod životinja neobična, predviđanje računanja mRNA za miRNA ostalo je izazov. Bez obzira na to, razvijeno je nekoliko računalnih alata za predviđanje potencijalnih ciljeva miRNA. 18

Profiliranje ekspresije miRNA otkrilo je da su neke miRNA izražene univerzalno, a druge specifično. 19 Akumulirani dokazi pokazuju da su miRNA često deregulirane u ljudskim zloćudama i da mogu djelovati kao onkogeni ili geni za supresor tumora. 20, 21 U ljudskoj posteljici dva velika klastera miRNA gena kodirana su na kromosomu 14 (C14MC) i kromosomu 19 (C19MC). 22, 23 Zanimljivo je da se ekspresija određenih miRNA specifičnih za placentu deregulira u tkivima raka, mada su njihove funkcionalne uloge ostale nedostižne. 23, 24 Nekoliko mirita specifičnih za placentu povezane su sa placentarnim poremećajima kao što je PE. 25 Na primjer, nekoliko studija otkrilo je povećanje pacijenta s mikroskopom miRNA miR210 u placenti kod pacijenata s PE. 26, 27, 28, 29, 30 Međutim, većina ovih studija bila je ograničena nedostatkom uzoraka placente potrebnim za ekspresiju miRNA, njihovom heterogenošću i / ili malim brojem proučenih miRNA. 26, 30 Dakle, nije jasno u kojoj se mjeri miRNA osim miR210 različito izražavaju u PE pacijenata.

Trofoblasti su specijalizirane stanice posteljice koje imaju važnu ulogu u implantaciji embrija i interakciji s majčinom maternicom. Dva različita puta diferencijacije trofoblasta dovode do razvoja placente. 31 Ekvivalentnim putem stanice se diferenciraju ili u intersticijske ekstraliološke trofoblaste koji upadaju u decidua i dio miometrija, ili u endovaskularne ekvivalentne trofoblaste koji preuređuju matične žile. Vilusnim stazama stanice citotrofoblasta (CT) spajaju se u višejedrni sloj sinctiotrofoblasta (SCT) koji pokriva cijelu površinu placente. 31 Ovaj sincicij je u izravnom kontaktu s majčinom krvlju i na taj način olakšava razmjenu hranjivih tvari, otpada i plinova između sustava majke i fetusa. Predloženo je da u etiologiji PE sudjeluje diferencirana CT-SCT diferencijacija. 32

Da bismo proučili ekspresiju miRNA tijekom diferencijacije villasnog trofoblasta, upotrijebili smo uspostavljeni in vitro model koji rekapitulira diferencijaciju CT stanica u SCT i profiliranu ekspresiju miRNA sljedećom generacijskom sekvencijom male generacije. Ova analiza otkrila je dva povezana miRNA (miR455-5P / -3P) koja su reproduktivno regulirana nakon diferencijacije CT-om i SCT-om. Rezultati analiza predviđanja i validacijske analize sugeriraju da miR455-3P obuzdava hipoksijski odgovor koji bi u suprotnom spriječio diferencijaciju CT-a i SCT-a. Ono što je važno, otkrili smo da je ekspresija miR455 značajno smanjena u 15 slučajeva PE u usporedbi s 14 zdravih davalaca, dok razine ostalih miRNA specifičnih za placentu ostaju neizmijenjene. Stoga su miRNA miR455 potencijalni biomarkeri za ranu dijagnostiku trudnoće u riziku.

Rezultati

In vitro rekonstitucija citotrofoblasta do diferencijacije sincitirotroblablasta

Budući da je placenta složen i heterogen organ, detaljno molekularno proučavanje mehanizama koji stoje u osnovi biologije placente vrlo je izazovno, ako ne i nemoguće. Zbog toga je upotreba odgovarajućih mobilnih modela povoljna. Da bismo proučavali miRNA tijekom diferencijacije staničnih trofoblasta vilioze, iskoristili smo uspostavljenu staničnu liniju sličnu CT-u (BeWo). Pokazalo se da su BeWo stanice sincintetizirane nakon liječenja forskolinom (FSK), aktivatorom adenilata ciklaze i cikličkim induktorom AMP (slika 1a). 33 Zaista, bojenje kontrolno tretiranih stanica s DAPI zajedno s antitijelom koje prepoznaje marker plazma membrane E-kadherin potvrdilo je da su BeWo stanice mononulirane. Međutim, liječenje s 10 µM FSK potaknulo je stvaranje višejedričastih stanica, pokazujući tako formiranje SCT-a (slika 1b).

Image

miR455 se inducira in vitro sincitijalizacijom. ( a ) Shematski dijagram diferencijacije cito- (CT) do sinctiotrofoblasta (SCT). ( b ) Fuzija BeWo stanica nakon tretmana FSK-om. Stanice su fiksirane i imuno obojene koristeći antitijelo anti-E-kadherin (zeleno). Nuklei su suprotstavljeni DAPI (plavi). Lijeva ploča: BeWo stanice su tretirane nosačem (DMSO) 48 sati i ostale su kao mononulirane (CT) stanice. Desna ploča: stanice su počele da se fuziraju nakon 48 h FSK tretmana, stvarajući višejedrične (SCT) stanice (bijela strelica). Stup skale, 100 µm ( c ) Izražavanje SCT markera. RNA je ekstrahirana u različitim vremenskim točkama nakon FSK tretmana. mRNA razine tri gena specifična za SCT izmjerene su qRT-PCR. Podaci su normalizirani na RPLP0 mRNA i uspoređeni s kontrolnim tretmanima (srednja vrijednost ± SEM za tri neovisna eksperimenta). ( d ) indukcija miR455 u SCT u odnosu na CT. Nakon 48 sati kontrolnog ili FSK tretmana, ekstrahirana je ukupna RNA, a male RNA podvrgnute sekvenciranju s visokom propusnošću. Normalizirane razine miRNA kontrolnih i FSK tretiranih stanica prikazane su u obliku skale log 2 na osi x i y, respektivno. Svaka miRNA predstavljena je križem. Deregulirani miR455 miRNA označeni su crvenim križevima. Prikazan je rezultat jednog reprezentativnog biološkog replika. ( e i f ) indukcija pregiba miR455-3P (E) i -5P (F) nakon 48 h FSK tretmana određena je malim RNA sekvenciranjem ili qRT-PCR (srednja vrijednost ± SEM od četiri i tri neovisna eksperimenta, respektivno), ( g ) Struktura ukosnica prijepisa pre-miR455. ( h ) Analiza ekspresije pri-miR455, miR455 i domaćina gena COL27A1 . RNK se ekstrahirala u naznačenim vremenskim točkama nakon FSK tretmana i analizirala qRT-PCR primjenom TaqMan ispitivanja. Podaci su normalizirani na U6 sNRNA ili RPLP0 mRNA i uspoređeni s kontrolnim tretmanima (srednja vrijednost ± SEM za tri neovisna eksperimenta)

Slika pune veličine

Da bismo dodatno potvrdili tranziciju CT-SCT-a nakon liječenja FSK-om, pratili smo ekspresiju gena izazvanih tijekom sincitizma pomoću kvantitativne RT-PCR. Beta horionski hormon gonadotropin (CGB) je marker stvaranja SCT-a. 34 FSK tretman doveo je do postupnog porasta razine CGB mRNA do maksimuma nakon 60 h. Slično tome, ekspresija ERVFRD-1 i MFSD2A snažno je potaknuta nakon FSK tretmana (slika 1c). ERVFRD-1 je endogeni retrovirusni gen koji kodira za syncytin2 protein, a MFSD2A kodira za syncytin2 receptor. Oba su proteina neophodna za sincitijalizaciju. 33, 35 Ovi rezultati potvrđuju učinkovitu indukciju sincitijalizacije nakon FSK tretmana i validiraju BeWo stanice kao prikladan model za proučavanje diferencijacije CT-SCT.

miR455 se različito izražava za vrijeme sincitilizacije

Da bismo istražili prate li proces sincitijalizacije promjenama u ekspresiji miRNA, izolirali smo male RNA iz četiri neovisna eksperimentacija diferencijacije in vitro i stvorili knjižnice za sekvenciranje Illumina. Nakon obrade podataka o sekvenciranju i filtriranja za miRNA zabilježene u miRBase (//www.mirbase.org/), uspoređivali smo profile ekspresije miRNA za različite biološke replike. Ekspresija mikroRNA bila je visoko povezana između sve četiri biološke replike, za stanice i tretirane kontrolnom i FSK (dopunska slika 1). Potvrđujući trofoblastično podrijetlo BeWo stanične linije, otkrili smo da je 50% svih miRNA, sekvencioniranih ili iz kontrolnih stanica ili s FSK-tretiranim stanicama, izvedeno iz klastera kromosoma-19-miRNA (C19MC) (Dodatna tablica S1). C19MC kodira za 59 miRNA koji se eksprimiraju uglavnom u ljudskoj placenti. 23 Usporedba ekspresije C19MC u stanicama koje su tretirane FSK-om u usporedbi s kontrolom nije pokazala značajnu razliku u ekspresiji ovih miRNA-a specifičnih za placentu (Dopunska tablica S1). Nadalje, ukupni profili ekspresije miRNA bili su nevjerojatno slični u uzorcima tretiranim FSK-om i kontrolnim uzorcima (slika 1d i dopunska slika 1). Međutim, povišene razine miRNA miR455-3P i miR455-5P dosljedno su primijećene u stanicama tretiranim FSK-om. Da bismo potvrdili ovo opažanje, procijenili smo miR455-3P i miR455-5P ekspresiju qRT-PCR primjenom validiranih testova TaqMan. U skladu s podacima o maloj sekvenciranju RNA, razine miR455-3P i miR455-5P poboljšane su cca. peterostruko, kada su stanice 48 sati tretirane FSK-om (slike 1e i f).

Zreli miRNA miR455-3P i miR455-5P potiču od pre-miRNA ukosnice kodirane u intron 10 kolagena gena COL27A1 (slika 1 g i dopunska slika 2). Dakle, povišena razina dviju zrelih miRNA može biti rezultat povećane transkripcije COL27A1 gena domaćina. U skladu s tim, primijetili smo snažan porast razine mRNA COL27A1 nakon FSK tretmana BeWo stanicama. Razina mRNA COL27A1 bila je najviša 24 sata nakon tretmana FSK-om i postepeno je padala (Slika 1h). Važno je da smo primijetili vrlo sličan profil ekspresije za trans-transkript pri-miR455 nakon tretmana FSK-om, iako ne tako visok kao maksimalna razina mRNA COL27A1 (Slika 1h). Nadalje, porast zrelih miRNA5 miR455-3P i miR455-5P dogodio se kasnije od prijepisa pri-miR455. Primijetili smo maksimalno povećanje zrelih miR455 ca. 48 h nakon liječenja FSK-om, istodobno s padom pri-miR455 (Slika 1h). Ovi rezultati pokazuju da tretiranje BeWo stanica s FSK potiče ekspresiju COL27A1 gena i na taj način dovodi do povećane proizvodnje pri-miR455. Stoga, iako se ne može isključiti povećana obrada prekursora ili stabilnost miRNA, opaženo povišenje u zrelom miR455 nakon FSK tretmana BeWo stanicama može se pripisati povećanoj ekspresiji COL27A1 gena.

Deregulacija miR455 u placentama kod pacijenata sa PE

Predloženo je da PE uključuje nepravilno razlikovanje od CT do SCT. 32 Da bismo istražili da li je miR455 izražen u placenti i može li se pogrešno regulirati PE, prikupili smo uzorke placente iz 15 slučajeva PE i 14 zdravih davalaca. Glavne kliničke karakteristike bolesnika prikazane su u tablici 1. Značajno je da se dob majke, indeks tjelesne mase i postotak nulliparnosti nisu značajno razlikovale između dviju skupina bolesnika. Međutim, pacijenti s PE pokazali su tendenciju intrauterinog zastoja rasta, povišenog krvnog tlaka (sistoličkog i dijastoličkog) i proteinurije te su u prosjeku rodili 4 tjedna ranije od kontrolne skupine. Placente su secirane iz stabla vilusa odmah nakon poroda. Da bismo nadoknadili varijabilnost unutar placente, izlučili smo ukupnu RNA iz 3–4 neovisna uzorka po placenti (slika 2a), dajući ukupno najmanje 45 PE i 42 kontrolna RNA uzorka.

Tablica pune veličine

Image

miR455 i miR210 dereguliraju se u placentama preeklampsije (PE). ( a ) Shematski dijagram obrade placente. Oko 3–4 komada (crveni okvir) secirani su iz unutarnjeg dijela svake posteljice (X) radi ograničavanja kontaminacije majki. Ukupna RNA ekstrahirana je iz svakog dijela posteljice (X.1 do Xn), a nivoe ekspresije miRNA mjereno u tri tehničke replike pomoću qRT-PCR primjenom TaqMan ispitivanja. ( b ) ekspresija U6 snRNA u PE i kontrolnim (Ctrl) placentama. Razine U6 snRNA izmjerene su pomoću TaqMan qRT-PCR. Vrijednost praga ciklusa (Ct) dobivena za U6 snRNA prikazana je kao grafički prikaz viskija 5-5. P- vrijednost je izračunata Mann-Whitney testom. ( c ) miRNA izražene u placentama. Ekspresija šest odabranih miRNA je određena TaqMan qRT-PCR u kontrolnim placentama. Za svaku miRNA, ekspresija se normalizirala na U6 snRNA i crtala na log2 skali pomoću dijagrama viskija 5-5. ( d ) MikroRNA koja se ne kontrolišu različito u odnosu na PE placente. ( e ) razine miR-210 veće su u PE u odnosu na kontrolne placente. ( f ) Razine miR-455 su niže u PE u odnosu na kontrolne placente. ( d – f ): P- vrijednosti su izračunate Mann-Whitney testom

Slika pune veličine

qRT-PCR analiza otkrila je da se nivoi ekspresije male male nuklearne RNA (snRNA) U6 ne razlikuju značajno između dvije skupine bolesnika (slika 2b). Dalje validirajući kvalitetu naših uzoraka, otkrili smo miR526B, miR518B i miR517A, tri reprezentativna miRNA kodirana u C19MC specifičnim za placentu, kao i miR210, miRNA za koju je prethodno pokazano da je uregulirana u placenti kod pacijenata s 26, 27, 28 (Slika 2c). Ono što je također važno, otkrili smo i miR455-3P i miR455-5P, koji su u kontrolnim RNA uzorcima obilniji od U6 snRNA i miR210 (Slika 2c).

Usporedba obilja miRNA u uzorcima iz dvije skupine bolesnika nije pokazala značajne razlike u miR526B, miR518B ili miR517A, pokazujući da ekspresija C19MC nije značajnije utjecala na bolesnike s PE (slika 2d). Međutim, miR210 bio je značajno reguliran u placenti kod bolesnika s PE (slika 2e), u skladu s prethodnim izvještajima. 26, 27, 28, 29, 30, 36, 37 Za razliku od toga, razine miR455-3P i miR455-5P bile su značajno niže u PE nego u kontrolnim uzorcima (slika 2f).

Ukratko, zreli miRNA miR455-3P i miR455-5P izraženi su u ljudskoj placenti. Dok na ekspresiju miRNA iz C19MC za placentu nije utjecao, nivo miRNA miR455 bio je značajno niži u placenti u usporedbi s kontrolnim pacijentima. Suprotno tome, miR210 je bio obilniji u uzorcima PE.

miR455 miRNA su dio funkcionalnog miRISC-a

Kao dio miRISC-a, zreli miRNAs bazni par ciljaju mRNA i usmjeravaju njihovu represiju. Budući da su miR455-3P i miR455-5P relativno obilni i u uzorcima stanica BeWo i u posteljici, oni mogu imati važnu ulogu u regulaciji putova relevantnih za fiziologiju placente. Da bismo testirali jesu li miR455-3P i miR455-5P dio funkcionalnog miRISC-a i provjerili predviđene ciljeve miR455, usvojili smo dvostruki test izvjestitelja na osnovi luciferaze. 38 Ovo ispitivanje sadrži ekspresijski vektor sisavaca koji kodira reporterske gene renilla luciferaze (RL) i svjetlosne luciferaze (FLF). RL reporter gen se fuzionira na pretpostavljenu ciljnu sekvencu miRNA i tako nadzire aktivnost miRNA. FL reporter gen se koristi kao normalizacija kontrole (slika 3a).

Image

miR455 je dio funkcionalnog miRISC-a u BeWo stanicama. ( a ) Shema ispitivanja dvostruke luciferaze korištene u ovom istraživanju. Točne komplementarne sekvence miR455-3 P i -5P, ili 3'UTR od osam potencijalnih ciljnih gena miR455, klonirane su 3 'renilla luciferazom (RL) ORF (gornje trake). Navedeni su položaji potencijalnih mjesta vezanja miR455-3P (crvena) ili miR455-5P (plava). BeWo stanice su transficirane i tretirane 48 h bilo s FSK (visoke razine miR455), bilo sa DMSO (niska razina miR455). ( b ) FSK nema utjecaja na ekspresiju renila luciferaze. Vektor bez ciljnih sekvencija kloniranih 3 'renila je transficiran u BeWo stanice. Nakon 48 sati liječenja, stanice su lizirane i izmjerene su RL i FL aktivnosti. Omjer RL / FL izračunao se za stanice tretirane DMSO- i FSK-om. P- vrijednosti su izračunate neparametarskim T- testom. ( c i d ) Vektori s miR455-3P ili -5P ciljne sekvence klonirane 3 'renila su transficirani u BeWo stanice. Omjer RL / FL izračunao se za stanice tretirane DMSO- i FSK-om. P- vrijednosti su izračunate neparametarskim T- testom. ( e i f ) 3'UTR osam potencijalnih miR455 ciljeva klonirano je u plazmid dualne luciferaze. Dan nakon transfekcije, stanice su 48 sati tretirane FSK ili DMSO. Omjer RL / FL izračunao se za stanice tretirane DMSO- i FSK-om. Procentualna represija za odgovarajuće izvjestitelje za miRNA izračunata je normalizacijom omjera RL / FL nakon FSK tretmana u RL / FL dijelove nakon kontrolnog tretmana. P- vrijednosti su izračunate neparametarskim T- testom

Slika pune veličine

Prvo smo transficirali BeWo stanice reporterski plazmidom koji nedostaje miRNA ciljane sekvence. Nakon transfekcije, stanice su tretirane ili DMSO ili FSK da se inducira sincitizacija. Promatrali smo omjer aktivnosti RL / FL koji se nisu značajno razlikovali u stanicama tretiranim kontrolnim i FSK, pokazujući da na aktivnost luciferaze ne utječe proces sincitilizacije ili FSK tretman, sam po sebi , u nedostatku ciljane sekvence miR455 (Slika 3b ). Međutim, RL aktivnost značajno je smanjena FSK tretmanom kada je RL reporter spojen u komplementarnu ciljnu sekvencu miR455-3P (Slika 3c). Slično tome, RL spojen s komplementarnom ciljnom sekvencom miR455-5P potisnut je nakon FSK tretmana (slika 3d). Ovi rezultati pokazuju da su obje miR455 miRNA dio funkcionalnog miRISC-a u BeWo stanicama i da test aktivnosti miRNA pouzdano izvještava o miR455-RISC aktivnosti.

MUC1 mRNA fiziološka je meta miR455-3P

Da bismo identificirali potencijalne miR455 ciljane mRNA, upotrijebili smo softver za predviđanje miRNA miRecords. 39 Sastavljajući popis potencijalnih meta za miR455-3P i -5P, uočili smo najmanje osam gena koji su povezani sa signalizacijom hipoksije (slika 3a). To je potaknulo naše zanimanje jer ekspresiju miR210 potiču faktori koji su inducirani hipoksijom (HIF), 40, 41, 42, što sugerira potencijalnu povezanost hipoksije između tri miRNA za koje smo otkrili da se različito izražavaju u uzorcima PE.

Da bismo potvrdili predviđene miR455-3P i -5P ciljane mRNA, prvo smo izveli reportere dvostruke luciferaze miRNA u BeWo stanicama. Spojili smo kompletne 3'UTR predviđene mRNA s izvještačem RL-a i testirali represiju koja je posredovana miR455 u FSK-u u odnosu na kontrolne uvjete (Slika 3a). Za razliku od izvjestitelja RL spojenog na komplementarno vezivno mjesto miR455 (slike 3c i d), FSK tretman nije rezultirao značajnom represijom RL-a kada je spojen na 3 'UTR bilo CUL3, EID1, SIRT1, ili STEAP3 (Slike 3e i f). Međutim, 3'UTR-ovi EGLN2, MUC1, FIH1 ili ARNT proizveli su značajnu represiju RL-a nakon tretiranja FSK-a (Slike 3e i f). Ovi rezultati potvrđuju predviđena mjesta vezivanja miR455-5P u 3'UTR ARNT i miR455-3P mjesta vezivanja u 3'UTR EGLN2, MUC1 i FIH1.

Da bismo testirali jesu li endogene EGLN2, MUC1, FIH1 i ARNT mRNA pod negativnom kontrolom miRNA5 miR455, procijenili smo razinu mRNA i proteina qRT-PCR odnosno western blotom. Za EGLN2 i ARNT, razina mRNA niti proteina nije se značajno promijenila nakon FSK tretmana BeWo stanicama (Slika 4a i Dodatna slika 3). FIH1 je dosljedno samo malo potisnut (slika 4a i dopunska slika 3). Suprotno tome, MUC1 je bio snažno potisnut i na razini mRNA i proteina (slike 4a i b i dodatna slika 3). Kako bismo potvrdili miR455-3P-posredovanu MUC1 mRNA represiju neovisno o FSK tretmanu, transficirali smo BeWo stanice sintetskim miR455 miRNA. Kao što se očekivalo, razina mRNA i proteina MUC1 smanjena je transfekcijom sintetičkih miR455-3P, ali ne miR455-5P (Slike 3c i d). Dakle, zaključujemo da je MUC1 mRNA dobronamjerna meta miR455-3P koja se snažno potiskuje tijekom FSK-inducirane sincitilizacije BeWo stanica.

Image

MUC1 je vjerna meta od miR455-3P u BeWo ćelijama. ( a ) Izražavanje potencijalnih miR455 ciljnih mRNA u FW-tretiranim stanicama BeWo. Ekspresija naznačenih potencijalnih miR455 ciljanih mRNA je analizirana pomoću qRT-PCR. Vrijednosti su normalizirane na RPLP0 i prikazane u odnosu na stanice tretirane DMSO-om. ( b ) Razina proteina MUC1 smanjuje se FSK tretmanom. Razine proteina MUC1 i TBP analizirane su Western blotom 48 sati nakon tretmana. ( c i d ) MUC1 je potisnut miR455-3P, ali ne miR455-5P. BeWo stanice transficirane su sintetičkim miRNA u dvije koncentracije (5 i 20 nM). Uzorci RNA i proteina prikupljeni su 48 sati nakon transfekcije. Razine MUC1 mRNA i proteina određene su qRT-PCR ( c ) i Western blot ( d ). Jedan Western blot predstavnik transfekcije s 20 nM sintetičkom miRNA predstavljen je u d . TBP je služio kao kontrola utovara

Slika pune veličine

miR455-3P ograničava HIF2A posredovanu signalizaciju hipoksije

MUC1 je pripisan aktiviranju, kao i represivnim aktivnostima u signalizaciji hipoksije. 43, 44 U skladu s izvješćima koja opisuju MUC1 kao aktivator HIF-a, otkrili smo da srušenje MUC1 mRNA posredovano siRNA rezultira smanjenjem razine proteina HIF2A (EPAS1), ali ne i obrnuto , postavljanje aktivnosti MUC1 uzvodno od HIF2A (Slika 5a i Dopunska Slike 4A i B). HIF2A je faktor transkripcije koji inducira ekspresiju ciljanog gena kao odgovor na nisku koncentraciju kisika. 40, 45 Dakle, MUC1 pozitivno utječe na hipoksijske reakcije posredovane HIF2A u stanicama BeWo. Intrigantno je da je miR210 dobro poznati cilj HIF2A 40, 42, pa bi se, očekivano, mogao prilagoditi MUC1 regulaciji. Doista, primijetili smo smanjene razine miR210 ne samo nakon obaranja HIF2A, nego i nakon pada MUC1 (slika 5b). Budući da se MUC1 potiskuje s miR455-3P, miR210 se tako indirektno kontrolira razina miR455-3P (Slika 5c).

Image

MUC1 i HIF2A se dereguliraju u PE placentama. ( a ) MUC1 pozitivno regulira HIF2A. BeWo stanice transficirane su s siRNA protiv HIF2A ili MUC1 mRNA u dvije koncentracije (5 i 20 nM) i siRNA All Star Negative Control. Nakon 48 h nakontransfekcije, stanice su uzete i uzorci proteina analizirani Western blottingom. ( b ) miR210 reguliraju HIF2A i MUC1. Stanice su skupljene 48 h nakon transtrakcije i ekspresija miR210, analizirana TaqMan testima. Vrijednosti su normalizirane u U6 snRNA ekspresiju (srednja vrijednost ± SEM za tri neovisna eksperimenta). ( c ) Shematski prikaz signalnog puta miR455-3 P / miR210. ( d ) Razine proteina MUC1 i HIF2A su regulirane u PE placentama. Proteini su ekstrahirani iz dvije kontrolne i dvije PE placente i analizirani. Western blots testirani su uzastopno antitijelima koja su prepoznala naznačene proteine. Za MUC1 korištena su dva različita antitijela. Antitijela i molekulska težina svake MUCl proteinske izoforme prikazani su s lijeve i desne strane

Slika pune veličine

Gornji rezultati sukladni su s razinama miR210 i miR455 za koje smo ustanovili da su negativno povezani u uzorcima placente PE i kontrolnih bolesnika (slike 2e i f) i sugeriraju da su razine MUC1 i HIF2A više u PE nego u kontrolnim uzorcima. Kao što je ranije objavljeno, otkrili smo da se HIF2A izražava u placenti, ali do znatno viših razina PE u kontrolnim uzorcima (slika 5d). Važno je da smo također otkrili višu razinu proteina MUC1 u placenti PE pacijenata. U skladu s represijom MUC1 mRNA posredovanom miRNA, različite MUC1 proteinske izoforme povećale su se u istoj mjeri (Slika 5d). Zaključno, pacijenti s PE pokazuju aktiviranu HIF2A posredovanu signalizaciju hipoksije u placenti, što može biti uzrokovano dereguliranom ekspresijom miR455-3P.

Rasprava

PE je ozbiljan poremećaj povezan s trudnoćom u 2–5% trudnoća Occident, ali komplicira do 10% trudnoća u zemljama u razvoju, gdje je hitna pomoć često neadekvatna ili joj nedostaje. Prema tome, PE je vodeći uzrok smrtnosti majki i fetusa / novorođenčadi u svijetu. Stoga je rana identifikacija bolesnika s povećanim rizikom za PE jedan od najvažnijih ciljeva u akušerstvu. Ova studija pokazuje da uporaba staničnih modela može uvelike doprinijeti ostvarenju ovog cilja. Na temelju našeg preliminarnog rada u staničnoj liniji kultura trofoblasta tkiva, otkrili smo izmijenjenu ekspresiju triju humanih miRNA i dva proteina u placenti kod pacijenata s PE. Mehaničke studije ovih čimbenika nagovještavaju potencijalno pogrešno signaliziranje hipoksije koje mogu pridonijeti patogenezi PE. U nastavku raspravljamo o značaju naših nalaza za fiziologiju posteljice i za razvoj testova za dijagnozu trudnoće s rizikom.

Prethodne studije kojima je cilj bio identificirati nepravilnu ekspresiju miRNA u placenti kod pacijenata s PE otkrile su povećane razine miR210. 26, 27, 28, 29, 30, 36, 37 Naši rezultati su u skladu s ovim nalazima i stoga potvrđuju miR210 kao robustan biomarker za PE. Pored miR210, miR455 smo identificirali kao daljnju prognostičku miRNA. Važno je da su za razliku od povišene razine miR210, miR455-3P i miR455-5P razine značajno niže u PE placenti nego u kontroli. Takva negativna povezanost mogla bi biti povoljna za razvoj dijagnostičkih testova. Budući testovi koji procjenjuju omjere miR210 / miR455-3P i miR210 / miR455-5P mogu predvidjeti PE s visokom specifičnošću (dopunska slika 5). Korištenje miRNA kao dijagnostičkih markera zanimljivo je iz dva razloga. Prvo se mogu razviti vrlo osjetljivi RT-PCR testovi. Drugo, nukleinske kiseline bez stanica, uključujući miRNA, pronađene su u majčinoj plazmi. 46 Primjećeno je da je prisutno miR455-3P u cirkulacijskoj krvi. 47 Dakle, mjerenje omjera miR210 / miR455 u majčinoj plazmi može ponuditi neinvazivni, visoko specifični i osjetljivi test rizika od PE u ranoj trudnoći.

Za razliku od većine drugih miRNA, pre-miR455 ukosnica stvara dvije zrele miRNA, miR455-3P i miR455-5P. Dokazano je da su miRNA5 miR455 dio funkcionalnog miRISC-a u stanicama BeWo, da su relativno obilni u placenti i da se njihova ekspresija povećava tijekom in vitro sincitilizacije trofoblasta. Dakle, dvije miR455 miRNA vjerojatno će biti uključene u regulatorna kola koja su važna za razvoj i fiziologiju placente.

Malo se zna o mogućim regulatornim aktivnostima miR455. 48, 49, 50, 51 Dok fiziološke ciljne mRNA miR455-5P ostaju nepoznate, identificirali smo MUC1 mRNA kao bona fide miR455-3P cilj. Potvrđujući naše rezultate, nedavno je pokazano da je MUC1 također reguliran miR455-3P u plućnim stanicama. 52 Zanimljivo je da su i plućne i trofoblastne stanice izložene promjenjivom okruženju kisika i na taj način mogu postojati mehanizmi koji djeluju protiv fluktuacija u napetosti kisika. 53 Naše otkriće da miR455-3P uzrokuje smanjenje razine proteina HIF2A neizravno potiskivanjem MUC1 mRNA (slika 5a) snažno sugerira da miR455-3P može pridonijeti takvom puferiranju.

Nedovoljna sincitijalizacija villus CT stanica rezultira suboptimalnom perfuzijom placente i time kroničnom hipoksijom, što je karakteristično za PE. U prvih 10 tjedana gestacije, conceptus se nalazi u relativno hipoksičnoj atmosferi 54, 55 i ograničavanje aktiviranja hipoksije, što bi moglo spriječiti sincitijalizaciju, bilo bi od vitalne važnosti. Stoga je moguće da miR455-3P djeluje kao reostat koji ograničava hipoksijski odgovor koji bi u suprotnom mogao spriječiti diferencijaciju CT-a i SCT-a. Importantly, the reduced miR455 expression in PE samples is unlikely to be simply a consequence of low oxygen tension, because cultivation of BeWo cells under hypoxic conditions did not cause a significant change in miR455 expression (data not shown). Therefore, miR455 expression per se may already be irregular, early in the pregnancy of PE patients and thus contribute to pathogenesis. In this respect, it will be very interesting to further investigate regulation of COL27A1 , the collagen protein-coding gene that hosts the miR455 gene.

In conclusion, although the idea that reduced expression of miR455 is causally linked to the development of PE is intriguing, further experimental evidence to support this model is awaited. Nonetheless, we believe that efforts to develop diagnostics using miRNAs as biomarkers to predict PE should be pursued, irrespective of further mechanistic insight into miR455 function.

Dodatna informacija

Excel datoteke

  1. 1.

    Dopunska tablica 1

  2. 2.

    Dopunska tablica 2

Word dokumenti

  1. 1.

    Dodatni podaci

Glosar

Mirna

mikrornk

PE

preeclampsia

nT

nukleotid

pri-miRNA

primary microRNA

pre-miRNA

precursor microRNA

miRISC

microRNA induced silencing complex

UTR

neprevedena regija

C14MC

chromosome 14 microRNA cluster

C19MC

chromosome 19 microRNA cluster

CT

cytotrophoblast

SCT

syncytiotrophoblast

FSK

forskolin

DMSO

dimethylsulfoxid

DAPI

4′, 6′-diamidino-2-phénylindole

CGB

beta chorionic gonadotropin hormone

snRNA

small nuclear RNA

RL

renilla luciferase

Florida

lufijera lufta

h

sati

HIF

hypoxia inducible factor

TBP

TATA binding protein

Ctrl

kontrolirati

Ct

cycle threshold

RT-PCR

reverse transcription-polymerase chain reaction

Dodatne informacije nalaze se u ovom radu na web stranici Cell Death and Disease (//www.nature.com/cddis)