Mirna-210 modulira promjene ćelijskog energetskog metabolizma uzrokovane niklom potiskujući proteine ​​sklopa grozda i sumpora iscu1 / 2 u stanicama neuro-2a | stanična smrt i bolest

Mirna-210 modulira promjene ćelijskog energetskog metabolizma uzrokovane niklom potiskujući proteine ​​sklopa grozda i sumpora iscu1 / 2 u stanicama neuro-2a | stanična smrt i bolest

Anonim

teme

  • Metabolizam energije
  • miRNAs
  • Sindromi neurotoksičnosti

Sažetak

Pomak staničnog energetskog metabolizma, karakteriziran inhibicijom oksidativne fosforilacije (OXPHOS) i pojačavanjem glikolize, uključen je u neurotoksičnost uzrokovanu niklom. MikroRNA-210 (miR-210) regulira se hipoksijom-inducirajućim transkripcijskim faktorom-1 α (HIF-1 α ) pod hipoksičnim uvjetima i kontrolira metabolizam mitohondrije energije potiskivanjem proteina sklopa klastera željezo-sumpor (ISCU1 / 2). ISCU1 / 2 olakšava skupljanje željeznih i sumpornih klastera (ISC), protetskih skupina koje su ključne za reakcije redukcije mitohondrijske oksidacije. Ovo istraživanje imalo je za cilj istražiti da li miR-210 modulira promjene u energetskom metabolizmu nakon izlaganja niklu kroz suzbijanje ISCU1 / 2 i inaktiviranje metaboličkih enzima koji sadrže ISC. Utvrdili smo da izloženost NiCl2 dovodi do značajnijeg nakupljanja HIF-1 α , umjesto HIF-1 β , u stanicama Neuro-2a. Prekomjerna ekspresija miR-210 i snižavanje vrijednosti ISCU1 / 2 uočeni su na način ovisan o dozi i vremenu. Testovi dobivanja funkcija i gubitka disfunkcije otkrili su da miR-210 posredovao suzbijanjem ISCU1 / 2, izmjenama energetskog metabolizma i inaktivacijom metaboličkih enzima koji sadrže ISC nakon izlaganja niklu. Pored toga, utjecaj miR-210 na metaboličke enzime koji sadrže ISC bio je neovisan o staničnoj regulaciji željeza. Sveukupno, ovi podaci sugeriraju da potiskivanje miR-210 na ISCU1 / 2 može pridonijeti HIF-1 α- potaknutim izmjenama u energetskom metabolizmu nakon izlaganja niklu. Bolje razumijevanje kako nikal utječe na stanični metabolizam energije može olakšati pojašnjenje mehanizama pomoću kojih nikal utječe na ljudsko zdravlje.

Glavni

Nikelovi (Ni) spojevi su široko rasprostranjeni zagađivači okoliša i opasni su za javno zdravlje. 1 Iako je točan mehanizam toksičnosti uzrokovane Niom nepoznat, sve veći dokazi ukazuju da hipoksije-mimički odgovori, koji su uglavnom posredovani stabilizacijom faktora- α α (HIF-1 α ) inducirane hipoksijom, mogu pridonijeti štetnim učincima Ni na ljudskom tijelu. 2, 3 Aktivacija ciljnih gena HIF-1 α , uključujući inhibitor aktivatora plazminogena (PAI-1), vaskularni endotelni faktor rasta (VEGF) i CXC hemokin, uključeni su u Ni fibrotičke bolesti pluća izazvane prašinom. 4, 5 HIF-1 α- ovisna regulacija IL-6 u ljudskim primarnim endotelnim stanicama javlja se u Ni kontaktnim alergijskim reakcijama. 6 Nadalje, angiogeneza regulisana HIF-1 α i prigušivanje gena mogu pridonijeti kancerogenezi izazvanoj Ni. 2 Dodatna ispitivanja Ni-inducirane hipoksije-mimičnih odgovora mogu razjasniti mehanizme Ni toksičnosti kod ljudi.

Promjene energetskog metabolizma, karakterizirane potiskivanjem ciklusa trikarboksilne kiseline (TCA), mitohondrijskim transportom elektrona i oksidativnom fosforilacijom (OXPHOS), ali pojačanjem glikolize, tipični su adaptivni odgovori pod stresom izazvanim hipoksijom. 7 Zanimljivo je da su ove promjene ovisne o HIF-1 α i nastaju u normoksičnim uvjetima ako je stanični HIF-1 α stabiliziran kemijskim agensima. 8, 9 Iako metabolički pomak pogoduje otpornosti i preživljavanju stanica u hipoksičnim uvjetima, 10 ovaj pomak doprinosi štetnim učincima Ni. Chen i Costa 11 izvijestili su da Ni smanjuje aktivnost enzima koji sadrže željezo, inhibira OXPHOS i povećava staničnu glikoliznu aktivnost. Inducibilna prilagodljivost stanica u hipoksičnim uvjetima olakšava njihovu malignu transformaciju nakon kronične izloženosti Ni. 2 Pored toga, smanjenje opskrbe energijom dovodi do disfunkcije tkiva s velikom potražnjom energije, uključujući živčani sustav. U našem prethodnom istraživanju, gutanje topljivih Ni spojeva u miševa rezultiralo je poremećajem aerobnog metabolizma praćenim neurobehevioralnim promjenama. 12 Stoga je ispitivanje veze između stabilizacije HIF-1 α i promjene metabolizma energije idealna strategija za rasvjetljavanje mehanizma otrovnosti Ni.

Endogene molekule mikroRNA (miRNA) važni su posrednici brojnih staničnih procesa, uključujući odgovor na hipoksiju. 13 MikroRNA-210 (miR-210), koju inducira HIF-1 α tijekom hipoksije, jedan je od najosjetljivijih na hipoksiju osjetljivih miRNA i idealan je faktor koji modulira hipoksijski odgovor. 14 Najnovija istraživanja istražuju suzbijanje miR-210 na proteine ​​sklopa gvožđe-sumpor (ISC), ISCU1 i ISCU2, za koje se predviđa da 3 'neprevedena regija (UTR) sadrži visoko konzervirano mjesto vezanja za miR-210. 15, 16 U stanicama sisavaca ISCU1 se nalazi u citosolu, dok se ISCU2 nalazi u mitohondrijama. ISCU1 / 2 je ključni kaperon za sastavljanje staničnih ISC-a i transport enzima koji su odgovorni za disanje i proizvodnju energije mitohondrija. 17 Ti enzimi uključuju akonitazu, koja je sastavni dio TCA ciklusa, i mitohondrijske respiratorne komplekse (kompleksi I, II i III), koji posreduju mitohondrijski transport elektrona. Stoga supresija ISCU1 / 2 dovodi do inaktivacije enzima koji sadrže ISC metaboličkim poremećajem ISC-a i na kraju inhibira disanje mitohondrija. Regulacijska os koja sadrži HIF-1 α , miR-210 i ISCU1 / 2 posreduje u procesima metabolizma mitohondrija koji reagiraju na hipoksiju u različitim tipovima stanica. 18, 19, 20, 21 U usporedbi s hipoksijom, izlaganje Ni može poremetiti staničnu homeostazu željeza koja je ključna za metabolizam ISC-a. 22 Procjena je li modifikacija staničnog stanja željeza uključena u metaboličke događaje posredovane od Ni.

Stoga je ovo istraživanje imalo za cilj istražiti da li represija miRNA-210 na ISCU1 / 2 podliježe promjeni metabolizma izazvane Ni-jem. Ni-posredovana regulacija miR-210 suzbila je ekspresiju ISCU1 / 2, inhibirala tipične ISC enzime i prebacivala mitohondrijski metabolizam nizvodno. Naši rezultati pokazuju da je miR-210 neophodan i dovoljan da modulira promjene staničnog energetskog metabolizma izazvane Ni.

Rezultati

Ni inducira HIF-1 α stabilizaciju i ekspresiju miR-210

Ekspresije HIF i miR-210 izazvane tretmanom NiCl2 ispitivane su u stanicama Neuro-2a. Stanice su bile izložene različitim koncentracijama NiCl2 (0, 0, 25, 0, 5 i 1 mM) 4 h ili 1 mM NiCl2 za različita vremenska razdoblja (0, 2, 4 i 8 h). Western blot analiza pokazala je da je tretman Ni rezultirao očiglednom stabilizacijom HIF-1 α, ali nije promijenio ekspresiju HIF-1 β (slike 1a i b). Ni-inducirana prekomjerna ekspresija miR-210, identificirana qRT-PCR analizom, primijećena je na načinima ovisnim o dozi i vremenu (Slike 1c i d). Osim toga, etablirana sredstva koja su stabilizirala HIF-l α , deferoksamin (DFX) i CoCl2, povećala su ekspresiju miR-210 nakon 4 sata liječenja u Neuro-2a stanicama, kao što je prikazano na slici 1e.

Image

Nikal inducira HIF-1 α stabilizaciju i miR-210 ekspresiju. ( a i b ) Razine proteina HIF-1 α i HIF-1 β otkrile su Western blot nakon različitih NiCl2 tretmana. Nikal-inducirane stabilizacije HIF-1 α naznačene su kvantifikacijom intenziteta western blot pojasa i tipičnim slikama. ( c i d ) Ekspresija miR-210 nakon različitih NiCl2 tretmana analizirana je qRT-PCR. Nikla-inducirana regulacija miR-210 ovisi i o dozi i o vremenu. ( e ) Dobro uspostavljeni agensi koji su stabilizirali stanični HIF-1 α , DFX i CoCl2, također su povećali ekspresiju miR-210 nakon 4 sata liječenja. Traka pogreške odražava SEM najmanje tri neovisna eksperimenta. * P <0, 05 u usporedbi s kontrolom

Slika pune veličine

Ni-inducirana miR-210 ekspresija suzbija razine ISCU1 / 2 proteina

Ispitane su razine proteina i transkripta ISCU1 / 2 u stanicama s različitim tretmanima NiCl2. Razina proteina ISCU1 / 2 smanjila se na način ovisan o dozi i vremenu u stanicama koje su bile izložene NiCl 2 (slike 2a i b). Ni-inducirana aktivacija HIF-1 α / miR210 / ISCU regulacijske osi, koja je utjelovljena kao stabilizacija HIF-1 α , prekomjerna ekspresija miR210 i represija ISCU, identificirana je u različitim stanicama (Dopuna slike 1, 2 i 3). Razine transkripta ISCU1 / 2 nisu se značajno razlikovale među stanicama s različitim tretmanima NiCl2 (Slike 2c i d). Da bi se utvrdilo je li ISCU1 / 2 regulirao miR-210, divlji tip i mutant (71–77 ACGCACA mutiran na AGCGAGA) oblika predviđenog ciljnog mjesta u 3'-UTR ISCU1 / 2 (//www.targetscan .org / mmu_61 /) klonirani su u genske vektore luciferaza reporter. Transfekcija miR-210 mimikom potisnula je aktivnost luciferaze koja je djelovala s predviđenim ciljanim mjestom divljeg tipa miR-210. Međutim, miR-210-mimicna transfekcija nije promijenila aktivnost luciferaze koja je djelovala s mutiranim ciljnim mjestom (Slika 2e). Ovi su rezultati potvrdili da miR-210 regulira ekspresiju ISCU1 / 2 vezanjem na predviđeno ciljno mjesto u 3'-UTR ISCU1 / 2. Analiza razine proteina u stanicama koje su bile transficirane miR-210 mimikom ili inhibitorom provedena je kako bi se dalje utvrdilo da je ISCU1 / 2 bila niži cilj miR-210. U uvjetima izlaganja ne-Ni, transfekcija miR-210 mimikom (označenom kao M) suzbila je nivo proteina ISCU1 / 2 u usporedbi s onom mimic-kontrole (MC). Nadalje, pod uvjetima izloženosti Ni (1 mM u trajanju od 4 h), transfekcija miR-210 inhibitora (I) je oslabila Ni-induciranu ISCU1 / 2 snižavanje regulacije u usporedbi s onom kontrole inhibitora (IC, slika 2f).

Image

NiR-inducirana miR-210 ekspresija smanjuje nivo ISCU1 / 2 proteina. ( a i b ) Razine proteina ISCU1 / 2 smanjile su se nakon različitih tretmana NiCl 2 . ( c i d ) Razine transkripta ISCU1 / 2 ne mijenjaju se ni pod kakvim uvjetima izlaganja niklu. ( e ) Učinak miR-210 na ISCU1 / 2 procijenjen je korištenjem testa luciferazne reportere. Pad aktivnosti luciferaze u stanicama koje su kofeficirane divljim tipom ISCU1 / 2 3'-UTR koji sadrži konstrukte i miR-210 oponašao je da je ISCU1 / 2 ciljni gen miR-210. ( f ) Western blot otkrilo je učinke miR-210 mimičke ili inhibitorske transfekcije na razine proteina ISCU1 / 2. ISCU1 / 2 potiskuje se miR-210 mimikom u usporedbi s mimičnom kontrolom (lijeve dvije trake). Tijekom izloženosti niklu, inhibicija miR-210 bolje čuva razinu ISCU1 / 2 u usporedbi s kontrolom inhibitora (srednje dvije trake). Učinak nikla na razinu ISCU1 / 2 također je ocijenjen u netransficiranim stanicama (desne dvije trake). Skraćenice M, MC, I i IC označavaju transfekciju miR-210 mimikom, mimičnom kontrolom, miR-210 inhibitorom i kontrolom inhibitora. Znak '+' označava tretiranje 1 mM NiCl2 tijekom 4 sata, a znak '-' označava odgovarajući lažni tretman. Traka pogreške odražava SEM najmanje tri neovisna eksperimenta. * P <0, 05 u usporedbi s kontrolom

Slika pune veličine

Ni-inducirana miR-210 ekspresija modulira pomak energetskog metabolizma

Ni-inducirani pomak energetskog metabolizma, karakteriziran inhibicijom OXPHOS-a i povećanjem glikolize, igra važnu ulogu u Ni-posredovanoj neurotoksičnosti i kancerogenezi. U našem istraživanju, održivost Neuro-2a stanica koje su tretirane s 1 mM NiCl2, 10 mM 2-dezoksi-D-glukozom (2-DG), ili 25 µM bromopirovičnom kiselinom (BrPA) bila je ekvivalentna kontrolnim razinama. Međutim, izloženost Ni u kombinaciji s 2-DG ili BrPA, koja su oba inhibitora glikolize, rezultirala je značajnom citotoksičnošću u stanicama Neuro-2a (Slika 3a). Stanice izložene 1 mM NiCl2 tijekom 4 sata također su očitovale nisku potrošnju kisika (OCR) (slika 3b). Da bismo potvrdili da je Ni-inducirani pomak energetskog metabolizma moduliran ekspresijom miR-210, istraživali smo stanja energetskog metabolizma stanica koje su transficirane miR-210 mimikom ili inhibitorima i tretirane s NiCl 2 . Kvantifikacija OCR otkrila je da je inhibirana potrošnja kisika u stanicama koje su transficirane miR-210 mimikom ili tretirane s NiCl2. Transfekcija miR-210 inhibitorom olakšala je suzbijanje Ni na potrošnju kisika (Slika 3c). Transfekcija miR-210 mimikom smanjila je koncentraciju staničnog adenosin-5'-trifosfata (ATP) pod ne-Ni uvjetima, dok je inhibicija miR-210 umanjila ATP iscrpljivanje uzrokovano Ni (slika 3d). Hekokinaza (HK) je ključni enzim u glikolizi, a porast HK aktivnosti ukazuje na pojačanje glikolize. Transfekcija miR-210 oponaša pojačanu aktivnost HK pod uvjetima koji nisu NiCl2, dok inhibicija miR-210 ublažava porast HK aktivnosti uzrokovan Niom (slika 3e). Transfekcija miR-210 oponaša povećava sadržaj stanične mliječne kiseline, krajnjeg produkta glikolize, dok inhibicija miR-210 smanjuje nakupljanje mliječne kiseline uzrokovanu Niom (Slika 3f).

Image

Izraz miR-210 izazvan niklom modulira pomak energetskog metabolizma. ( a ) Stabilnost ćelija određena je testom CCK8 nakon tretmana niklom. Inhibitori glikolize, 2-DG (10 mM) ili BrPA (25 μM), pogoršavaju citotoksičnost nikla. ( b ) Reprezentativna krivulja potrošnje kisika koja se temelji na detektiranom parcijalnom tlaku kisika (mmHg) koji okružuje stanice u stvarnom vremenu ukazuje na suzbijanje nikla na staničnu potrošnju kisika. ( c ) Transfekcija miR-210 mimikom smanjuje potrošnju kisika (OCR) stanica u uvjetima koji nisu NiCl2, a inhibicija miR-210 olakšava suzbijanje brzine potrošnje kisika uzrokovane izlaganjem nikla. ( d ) Transfekcija miR-210 mimikom smanjuje koncentraciju staničnog ATP-a u uvjetima koji nisu NiCl2, a inhibicija miR-210 smanjuje ATP iscrpljivanje uzrokovano izlaganjem nikla. ( e ) Aktivnost hekokinaze (HK) izmjerena je na temelju spojenih reakcija HK i 6-fosfoglukoze dehidrogenaze i odražena je promjenom optičke gustoće pri 340 nm (ΔmOD 340 / min / mg) mjereći stvaranje NADPH. Transfekcija miR-210 mimikom pojačava aktivnost HK u uvjetima koji nisu NiCl2, a inhibicija miR-210 ublažava porast HK aktivnosti uzrokovan izloženošću niklom. ( f ) Transfekcija miR-210 mimikom povećava sadržaj stanične mliječne kiseline u uvjetima koji nisu NiCl2, a inhibicija miR-210 smanjuje nakupljanje mliječne kiseline uzrokovano izlaganjem nikla. Skraćenice M, MC, I i IC označavaju transfekciju miR-210 mimikom, mimičnom kontrolom, miR-210 inhibitorom i kontrolom inhibitora. Znak '+' označava tretiranje 1 mM NiCl2 tijekom 4 sata, a znak '-' označava odgovarajući lažni tretman. Traka pogreške odražava SEM najmanje tri neovisna eksperimenta. * P <0, 05 u usporedbi s kontrolom

Slika pune veličine

Ni-inducirana miR-210 ekspresija inhibira metaboličke enzime koji sadrže ISC

Izmjereno je djelovanje dvaju tipičnih metaboličkih enzima ovisnih o ISC-u, akonitazi i kompleksu I, u stanicama transficiranim mimikom i inhibitorom miR-210. Transfekcija miR-210 mimikom suzbila je aktivnost ova dva enzima u ne-Ni uvjetima, dok je inhibicija miR-210 oslabila suzbijanje enzima uzrokovanih Ni. Nadalje, transfekcija ili liječenje nisu promijenili razinu proteina reprezentativne komponente akonitaze (ACO2) ili kompleksa I (NDUFA9), kako je prikazano na slikama 4c i d.

Image

Nikal-inducirana miR-210 ekspresija inhibira metaboličke enzime koji sadrže ISC. ( a i b ) Aktivnost akonitaze i složene I stanice koje su transficirane miR-210 mimikom ili inhibitorom mjerene su spektrofotometrijskom metodom i izražene kao ΔmOD 340 / min / mg proteina. ( c i d ) Reprezentativni bendovi pomoću Western blot analize su prikazani kako bi pokazali razinu proteina akonitaza (ACO-2) ili kompleksa I (NDUFA9) nakon odgovarajućeg tretmana. Skraćenice M, MC, I i IC označavaju transfekciju miR-210 mimikom, mimičnom kontrolom, miR-210 inhibitorom i kontrolom inhibitora. Znak '+' označava tretiranje s 1 mM NiCl2 tijekom 4 sata, a znak '-' označava odgovarajući lažni tretman. Traka pogreške odražava SEM najmanje tri neovisna eksperimenta. * P <0, 05 u usporedbi s kontrolom

Slika pune veličine

Tretman s 1 mM NiCl2 tijekom 4 h ne remeti staničnu homeostazu željeza

Da bi se utvrdilo da li se suzbijanje enzima koji sadrži NiC ISC odnosi se na poremećaj homeostaze željeza izazvanog Ni, ispitivana su stanja metabolizma željeza u stanicama izloženim 1 mM NiCl2 različito vrijeme. Značajno smanjenje staničnih iona željeza zabilježeno je samo u skupinama izloženosti od 8 h (slika 5a). Razine ukupnog feritinskog proteina, glavni oblik pohranjenog željeza u stanicama, su analizirane od zapadnog blota nakon tretmana Ni. Izloženost NiCl 2 tijekom 2 ili 4 sata nije smanjila razinu staničnog feritina. Međutim, razina feritina u stanicama koje su bile izložene Ni tijekom 8 sati smanjena je (Slika 5b). Prekomjerna ekspresija receptora za transferin (TfR), važan stanični odgovor u uvjetima nedostatka željeza, primijećena je samo u stanicama izloženim NiCl 2 tijekom 8 sati (Slika 5c).

Image

Tretman niklom koji sadrži 1 mM NiCl2 izložen stanicama tijekom 4 sata ne narušava staničnu homeostazu željeza. ( a ) Stanični ioni željeza (željeza i željeza) izmjereni su Kitom za ispitivanje željeza nakon izlaganja 1 mM NiCl2 za različita vremenska razdoblja (0, 2, 4 i 8 h). Značajno smanjenje staničnih iona željeza nađeno je samo u skupinama izloženosti od 8 h. ( b ) Razine proteina ukupnog feritina u stanicama koje su tretirane s 1 mM NiCl2 za 0, 2, 4 i 8 h analizirane su od Western blot-a. Izloženost 1 mM NiCl2 za 0, 2 ili 4 h ne mijenja razinu staničnog feritina. ( c ) Transkriptne razine receptora transferrina (TfR), TfRl i TfR2 ispitivane su qRT-PCR nakon izlaganja 1 mM NiCl2 u stanicama 0, 2, 4 i 8 h. Prekomjerna ekspresija ova dva gena pronađena je samo u 8 h izloženim skupinama. Trake pogrešaka odražavaju SEM najmanje tri neovisna eksperimenta. * P <0, 05 u usporedbi s kontrolom

Slika pune veličine

Rasprava

U ovom istraživanju, liječenje 1 mM NiCl2 u trajanju od 4 sata izazvalo je stabilizaciju HIF-1 α , prekomjernu ekspresiju miR-210, smanjenje ISCU1 / 2 proteina, promjene energetskog metabolizma i supresiju metaboličkog enzima koji sadrže ISC u stanicama Neuro-2a. Iako razine Ni u našoj studiji vjerojatno neće biti postignute in vivo , takve razine izloženosti Ni obično se primjenjuju u ispitivanju in vitro kako bi se istražio mehanizam toksičnosti za Ni. 23, 24, 25, 26 Naše prethodno istraživanje pokazalo je da je 1 mM izloženosti NiCl2 duže od 12 h uzrokovalo očitu citotoksičnost i mitohondrijsku disfunkciju u stanicama Neuro-2a. Budući da energetski metabolizam igra važnu ulogu u fiziološkim procesima mozga, ispitivanje promjena energetskog metabolizma prije nastupanja stanične smrti može pridonijeti rasvjetljavanju mehanizama neurotoksičnosti izazvane Ni.

Slično kao kod hipoksije, Ni također suzbija aktivnost prolil hidroksilaze i remeti razgradnju HIF-1 α . Nekoliko studija otkrilo je da kratka (2–6 h) izloženost Niu uzrokuje nakupljanje HIF-1 α u različitim tipovima stanica i pokreće HIF-1 α- modulirajuću hipoksijsko-mimičku reakciju. 5, 28, 29 Stoga se dokazi staničnih odgovora na hipoksiju primjenjuju kako bi se objasnili zdravstveni učinci Ni. Razjašnjenje miR-210, HIF-1 a- kontrolirane mikroRNA, značajno razjašnjava prirodu različitih staničnih odgovora na hipoksiju. 9, 30 MiR-210 cilja ligand receptora tirozin kinaze EphrinA3 (EFNA3), povećavajući diferencijaciju endotelnih stanica pupčane vene kod čovjeka i promičući angiogenezu u hipoksiji. 31, 32 Uz to, miR-210 izazvan hipoksijom sudjeluje u regulaciji staničnog ciklusa modulacijom svojih ciljnih gena, MNT, poznatog MYC antagonista i E2F3, ključnog proteina u regulaciji staničnog ciklusa. 33, 34 U uvjetima lišavanja kisika / glukoze, prekomjerno izražen miR-210 potiskuje ekspresiju Bcl-2 i pojačava apoptozu Neuro-2a stanica. 35 U našem istraživanju opaženi su stabiliziranje HIF-1 α i prekomjerna ekspresija miR-210 izazvana NiCl 2 na način ovisan o dozi i vremenu. Štoviše, CoCl2 i DFX, dobro utvrđeni spojevi koji oponašaju hipoksiju, pojačali su ekspresiju miR-210. Stoga miR-210 može doprinijeti reakcijama kemijske hipoksije, uz nizak sadržaj kisika.

Promjena energetskog metabolizma važan je stanični odgovor na hipoksiju. Kad kisika ima u izobilju, stanični ATP nastaje primarno putem OXPHOS koji stvara 1 mola ATP-a iz 1 mola glukoze. U hipoksičnim uvjetima, potiskuje se OXPHOS, a proizvodnja stanične energije prebacuje se na glikolitički put koji iz 1 mola glukoze stvara samo 2 mola ATP-a. Iako glikoliza nije ekonomska za stvaranje ATP-a, ona pruža minimalni dodatak energije za preživljavanje stanica u hipoksičnim uvjetima. 36 Nedavno je otkriveno da energetski metabolički pomak reguliran putem HIF-1 α -miR-210-ISCU1 / 2 sudjeluje u više fizioloških i patoloških procesa povezanih s hipoksijom. 18, 21 U našem istraživanju, izloženost Ni rezultirala je smanjenjem nivoa proteina ISCU1 / 2, što je povezano s promjenama HIF-1 α i miR-210. Rezultati ispitivanja reporterskih gena za predviđeno mjesto vezanja miR-210 na ISCU1 / 2 i analiza zapadnog blota razina proteina ISCU1 / 2 nakon transferacije miR-210 dodatno su potvrdili da je ISCU1 / 2 reguliran miR-210 u izloženosti Ni Uvjeti. Nedostatak promjene razine ISCU1 / 2 mRNA nakon izlaganja Ni pokazao je post-transkripcijske regulatorne učinke miR-210 na ISCU1 / 2. Nadalje, aktiviranje HIF-1 α / miR-210 / ISCU1 / 2 regulacijskog puta bilo je univerzalno za različite stanice tretirane Ni. Efekti ovog regulatornog puta koji slijede mogu biti podložni Ni-posrednom hipoksije-mimičnom odgovoru.

Promjena energetskog metabolizma, karakterizirana pojačavanjem glikolize u normoksičnim uvjetima, smatra se uključenom u toksičnost Ni. U središnjem živčanom sustavu, inhibicija OXPHOS-a posredovana od Ni rezultirala je dodatnim stresom. 12 Inhibicija glikolize sa 2-DG ili BrPA povećala je citotoksičnost NiCl2 u stanicama Neuro-2a u ovoj studiji. Pored toga, stanični fenotip preferencijalne proizvodnje glikolitičke energije, poznat kao Warburg efekt, uključen je u kancerogenezu Ni. 2 Razjašnjenje utjecaja Ni na metabolizam stanične energije može biti važno za proučavanje toksičnosti Ni. Otkrili smo da je miR-210 esencijalni modulator pomaka metabolizma izazvanog Ni, što rezultira smanjenjem potrošnje kisika, ATP deficitom, izmjenom HK aktivnosti i akumulacijom mliječne kiseline. Ključni enzimi za OXPHOS, akonitazu za Krebsov ciklus i kompleks I za mitohondrijski prijenos elektrona suzbijeni su miR-210 bez promjene razine proteina njihovih komponentnih elemenata. To znači da inaktiviranje ovih enzima uzrokuje manjak ISC, a ne inhibiciju ekspresije proteina. Stoga, potiskivanje miR-210 na ISCU1 / 2 i metaboličke enzime ovisne o ISC-u pruža logično objašnjenje stabilizacije HIF-1 α i promjene metabolizma energije, a oba se promatraju u različitim uvjetima izloženosti Ni. 11, 29 Osim toga, nedostatak metaboličkih enzima koji sadrže ISC može se pripisati nastanku reaktivnih kisikovih vrsta (ROS) i disfunkciji mitohondrija, putem kojih je Ni izazvao značajnu citotoksičnost u živčanim stanicama, kao što je ranije izvješteno. 27, 37 Pored Ni, drugi teški metali, uključujući kobalt, mangan i vanadij, potiču stabilizaciju HIF-1 α . 28 Dakle, funkcionalna studija miR-210 može biti korisna za rasvjetljavanje toksičnosti teških metala.

Nasuprot uvjetima s niskim kisikom, hipoksije-mimički odgovor induciran od Ni može biti popraćen izmjenama staničnih razina željeza. Kao što je ranije izviješteno, Ni se može natjecati s željezom za dvovalentni transport metala-1 (DMT1) i poremetiti staničnu homeostazu željeza. 22, 38 Budući da su stanične razine željeza izravno povezane sa sastavljanjem ISC-a i aktivnosti enzima ovisnih o ISC-u, 39 ne treba isključiti utjecaj Ni na razinu staničnog željeza. Međutim, na temelju naših rezultata da stanično izlaganje 1 mM NiCl 2 tijekom 4 sata nije poremetilo staničnu homeostazu željeza, zaključili smo da supresija metaboličkih enzima koji sadrže ISC posredovana miR-210 nije ovisna o staničnoj regulaciji željeza u vremenskom okviru naše Ni tretmane. Costa i kolege 38 izvijestili su o učincima NiCl 2 na regulaciju staničnog željeza. U njihovoj studiji, niz značajnih promjena koje odražavaju aktiviranje stanične regulacije željeza pojavio se u 6–8 sati nakon izlaganja Ni, što je bilo u skladu s rezultatima naše studije. Samo se promjena u sadržaju željeza u stanici nakon 4 h izloženosti Niu razlikovala između dvije studije koje se mogu pripisati korištenju različitih staničnih linija ili metoda određivanja sadržaja željeza. Čini se da je miR-210 modulirao pomak energetskog metabolizma prije neravnoteže staničnog homeostaze željeza. Potrebne su daljnje studije kako bi se utvrdio specifični doprinos ovih mehanizama u toksičnosti Ni.

Ukratko, naša otkrića sugeriraju da je HIF-1 α- kontrolirajući mikroRNA, miR-210, modulirao pomak staničnog energetskog metabolizma potiskujući ISCU1 / 2 nakon izlaganja Ni. Budući da je metabolizam energije kritičan u središnjem živčanom sustavu, naši rezultati daju uvid u razumijevanje Ni-posredovane neurotoksičnosti. Nadalje, sposobnost miR-210 za reguliranje hipoksije-mimičkog odgovora vezanjem na ciljne gene mogla bi se iskoristiti za rasvjetljavanje zdravstvenih učinaka raznih teških metala koji induciraju stabilizaciju HIF-1 α .

Materijali i metode

Stanična kultura i tretmani

Miševi staničnih neuroblastoma miša (Neuro-2a), dobiveni od Instituta za biokemiju i staničnu biologiju (Kineska akademija znanosti, Šangaj, Kina), uzgajani su u Dulbeccovom modificiranom mediju Eagle (DMEM; Invitrogen, Carlsbad, Kalifornija, SAD) sa dodatkom 10% termalno inaktivirani fetalni goveđi serum (FBS, HyClone, Logan, UT, SAD) i 1% v / v penicilin / streptomicin (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, SAD) u atmosferi 5% CO2 -humidified na 37 ° C. Pripremljena je 1 M osnovna otopina Ni klorida (NiCl2.6H20, Sigma-Aldrich) sterilnom H20 i razrijeđena do odgovarajućih koncentracija za stanično liječenje.

Western blot analiza

Iz cjelovitih staničnih ekstrakata 40 µg proteina se razrijedi SDS-PAGE i prenese na membranu od polivinilidena fluorida (Bio-Rad, Hercules, CA, SAD). Membrane su ispitivane za različite bjelančevine s odgovarajućim primarnim antitijelima i vizualizirane s elektrokemiluminiscentnim sustavom (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Trake su snimljene i analizirane pomoću ChemiDoc XRS + System sa Image Lab Software (Bio-Rad).

antitijela

Mišje monoklonsko antitijelo na HIF-1 α kupljeno je od Novus Biologicals (Littleton, CO, USA). Zečja monoklonska antitijela na HIF-1P i FTH1 kupljena su od Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA). Zečja poliklonska antitijela na ISCU1 / 2 kupljena su od Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, Kalifornija, USA). Zečja poliklonska antitijela na Aconitase 2 i mišja monoklonska antitijela na NDUFA9 kupljena su od tvrtke Abcam (Cambridge, Velika Britanija).

Stanična transfekcija

MiRNA mimik (miR10000267) ili inhibitor (miR20000267) za staničnu transfekciju kupljeni su od tvrtke RiboBio (Guangzhou, Kina) i korišteni su prema uputama proizvođača. Ukratko, 24 sata nakon sjetve stanice, medij bez penicilina / streptomicina zamijenjen je transfekcijskim medijem koji sadrži 100 nM miRNA mimik ili inhibitor i 0, 2% v / v lipofektamin 2000 transfekcijski reagens (Invitrogen). Nakon 4 sata, transfekcijski medij zamijenjen je svježim medijima koji nisu bili prisutni penicilinom / streptomicinom. Prolazno transficirane stanice su sakupljene nakon dodatne 24-satne inkubacije za daljnje eksperimente.

qRT-PCR analiza

Ekstrakcija ukupne RNA i kvantifikacija ISCU, TfRl, TfR2 i miR-210 izvedena je prema našem ranije objavljenom protokolu. 27 Grupe prajmira s ispupčenom petljom miRNA qRT-PCR (jedan prajmer za prepisivanje i par kvantitativnih PCR primera za svaki set, MQP-0102 i MQP-0201) dizajnirali su RiboBio. U6 je korišten kao unutarnja kontrola za miRNA, a β- aktin je korišten kao unutarnja kontrola za mRNA. Primeri korišteni u ovom istraživanju su sljedeći: ISCU-naprijed, 5′-CTCTGCCTGCCGCCTGTG-3 ′ i natrag, 5′-CTGCTTCTCTGGCTCCTCCTTC-3 ′; TfR1-naprijed, 5′-GAGACTACTTCCGTGCTACTTC-3 ′ i natrag, 5′-TGGAGATACATAGGGCGACAG-3 ′; TfR2 naprijed, 5 '-AGAGTGGTTGGAGGGCCAC-3' i natrag, 5 '-CAATGAGGCTGACGAGAAGG-3'; β -akktin naprijed, 5′-CCACACCCGCCACCAGTTC-3 ′ i obrnuto, 5′-CCTTCTGACCCATTCCCACCATC-3 ′.

Analiza luciferaze

3'-UTR regije ISCU koja sadrže predviđena mjesta vezivanja za miR-210, divlji ili mutirani (71–77 ACGCACA mutirani na AGCGAGA) klonirani su u pmiR-RB-REPORT vektore (GUR100509 i GUR100510; RiboBio). Nakon ko-transfekcije s vektorima i miR-210 oponaša, aktivnosti krijesnice i luciferaze Renilla mjerene su primjenom Dual-luciferaze Reporter Test (Promega, Madison, WI, USA).

CCK test

Stanice su zasijane u pločicu s 96 jažica i izložene 1 mM NiCl2 tijekom 2 sata. Zatim je u mediju koji sadrži Ni dodan 2-DG (10 mM) ili BrPA (25 μM) i inkubiran dodatna 2 sata. Zatim se medij na pločici s 96 jažica zamijenio svježim medijem koji je sadržavao 10% v / v otopine CCK-8 (Dojindo, Kumamoto, Japan) i inkubirao 2 sata. Optička gustoća (OD) svake jažice određena je na valnoj duljini od 450 nm pomoću beskonačnog čitača mikroploča M200 (Tecan, Männedorf, Švicarska). Stanična održivost se prikazuje kao postotak kontrolne vrijednosti.

ATP test

Sadržaj ATP-a određen je korištenjem ATP kompleta za određivanje (Molekularne sonde, Eugene, OR, SAD). Luminiscencija uzorka mjerena je pomoću beskonačnog čitača mikroploča M200 (Tecan). Utvrđene su standardne krivulje ATP-a, a koncentracije ATP-a izražene su kao nmol / mg proteina.

Stopa potrošnje kisika

Stanice (1x105 po jažici) su bile presađene, transficirane i izložene NiCl2 4 sata prije mjerenja. Brzina promjene kisika u mediju koji okružuje netaknute stanice izmjerena je XF96 analizom izvanstaničnog fluksa (Seahorse Bioscience, Billerica, MA, SAD). OCR jažice je određen kvantificiranjem promjena ovisnih o kisiku u fluorescenciji vlasničkog fluorescentnog kompleksa (pmol / min / jažici).

Analiza HK aktivnosti

Aktivnost HK mjerena je korištenjem Kit za određivanje aktivnosti heksokinaze (Nanjing Jiancheng, Nanjing, Kina) na temelju povezane reakcije HK i 6-fosfoglukozne dehidrogenaze. Aktivnost hekokinaze određena je stvaranjem trifosfopiridin nukleotida (NADPH) i izmjerena kao promjena OD na 340 nm (ΔOD340) na 37 ° C tijekom 3 minute. Aktivnost hekokinaze izražena je kao ΔmOD340 / min / mg proteina (ΔmOD340 = ΔOD340 / 1000).

Laktatni test

Sadržaj unutarćelijskog laktata izmjeren je primjenom Kit za određivanje laktata (Nanjing Jiancheng) u skladu s uputama proizvođača. Utvrđene su standardne krivulje, a koncentracije laktata izražene su u μ mol / mg proteina.

Testovi akonitaze i složene aktivnosti

Nakon odgovarajućeg tretmana, stanice su sakupljene u eppendorfnim epruvetama, resuspendirane u hipotoničnom puferu (120 mM KCl, 20 mM HEPES, 2 mM MgCl2 i 1 mM EGTA, pH 7.4) i poremećene izvođenjem deset 1 s s impulsa -Cell ultrazvučni procesor (Sonics & Materials, Danbury, CT, USA). Naknadne procjene dvaju tipičnih ISC metaboličkih enzima provedene su u skladu s ranije prijavljenim protokolom. 12

Sadržaj željeza u stanici

Ukupni ćelijski ioni željeza (željeza i željeza) izmjereni su primjenom Kit za ispitivanje željeza (Abcam) slijedeći upute proizvođača. Stanice su posijane u pločice sa šest jažica i izložene Ni u različitim vremenskim periodima. Utvrđene su standardne krivulje za ione željeza, a stanični sadržaj željeza izražen je kao nmol po jažici.

Statistička analiza

Vrijednosti su izražene kao prosjek ± SEM i analizirane su pomoću SPSS (V18.0.0, SPSS Inc., Chicago, IL, USA). Usporedbe podataka završene su korištenjem jednosmjerne ANOVA ili uparenim t- testom za usporedbu sredstava različitih skupina liječenja. P <0, 05 se smatra statistički značajnim.

Dodatna informacija

Datoteke slika

  1. 1.

    Dopunska slika 1

  2. 2.

    Dopunska slika 2

  3. 3.

    Dopunska slika 3

Word dokumenti

  1. 1.

    Dopunska legenda

Glosar

OXPHOS

oksidativne fosforilacije

miR-210

mikrornk-210

HIF-1 α

faktor transkripcije-induciran hipoksijom-1 α

ISCU1 / 2

željezo-sumpor skupina proteina

ISC

nakupina željeza i sumpora

ni

nikl

TCA

trikarboksilna kiselina

UTR

neprevedena regija

DFX

deferoksamin

2-DG

2-deoksi-D-glukoza

BrPA

bromopirovična kiselina

HK

heksokinaze

TDR

transferrin receptor

OD

optička gustoća

ROS

reaktivne vrste kisika

Dodatne informacije nalaze se u ovom radu na web stranici Cell Death and Disease (//www.nature.com/cddis)