Muc1 inducira stečenu kemorezistenciju reguliranjem abcb1 na egfr-ovisan način | stanična smrt i bolest

Muc1 inducira stečenu kemorezistenciju reguliranjem abcb1 na egfr-ovisan način | stanična smrt i bolest

Anonim

teme

  • Terapijska otpornost na rak
  • Stanična signalizacija
  • kemoterapija
  • glikoproteini

Sažetak

Kemoresistencija doprinosi relapsu karcinoma i povećanoj smrtnosti kod različitih vrsta karcinoma, povećavajući hitnu potrebu za boljim razumijevanjem temeljnog mehanizma. MUC1 je abnormalno prekomjerno izražen u brojnim karcinomima i povezan je s lošom prognozom. Međutim, funkcionalni značaj MUC1 u kemoresistentnosti nije u potpunosti rasvijetljen. Ovdje smo pokazali da je ekspresija MUC1 značajno inducirana u stanicama koje su stekle kemoresistenciju i na transkripcijskoj i na posttralacijskoj razini. Korištenjem pristupa i gubitka funkcionalnih pristupa, pokazali smo kritičnu ulogu MUC1 u indukciji rezistencije na lijekove. Poticanjem EGFR aktivacije i nuklearne translokacije, MUC1 je povećao ekspresiju ATP-vezujućeg kaseta transportera B1 (ABCB1). Izuzetno je da ciljano suzbijanje EGFR-a ili ABCB1 i shRNA-a i inhibitora efektivno poništava kemoresistenciju. Nadalje, istodobna primjena inhibitora MUC1-EGFR-ABCB1 s paklitakselom značajno je blokirala ne samo rast tumora, već i relaps u modelu miševa s ksenograftom. Naši podaci zajedno podržavaju model u kojem MUC1 inducira stečenu otpornost na kemoterapiju ureguliranjem ABCB1 na način ovisan o EGFR-u, pružajući novu molekularnu osnovu korištenja EGFR inhibitora u MUC1-pozitivnim karcinomima za sprečavanje rezistencije na kemoterapiju.

Glavni

Kemoresistencija je jedan od važnih mehanizama odgovornih za recidiv tumora i lošu prognozu raznih vrsta raka. 1, 2, 2 Paklitaksel (PTX) je lijek koji razgrađuje tubulin u liječenju širokog spektra tumora. 4, 5, 6 Iako su studije otkrile mehanizme otpornosti na PTX u nekoliko malignih oboljenja, ostaje mnogo kritičnih pitanja koja zahtijevaju daljnje istraživanje. Pokazano je da transporteri kaseta za vezanje ATP-a selektivno ispumpavaju citotoksične lijekove iz stanica što rezultira s višestrukom rezistencijom. 7 Humani ABC transporter B1 (ABCB1), također poznat kao p-glikoprotein (Pgp), jedan je od dobro karakteriziranih ABC transportera s najširem specifičnošću supstrata. Mnogi lijekovi za kemoterapiju protiv raka supstrati su za ABCB1, uključujući PTX, vinkristin, doksorubicin i etoposid. 8, 9 ABCB1 je pretjerano izražen kod pacijenata s karcinomom koji imaju slab odgovor na kemoterapiju. 10, 11, 12 Da bi se prevladala kemoresistencija izazvana ABCB1, razvijeno je nekoliko farmakoloških inhibitora, ali s ograničenim uspjehom u klinici zbog toksičnosti, što se prvenstveno pripisuje kritičnim funkcijama ABC transportera u različitim normalnim tkivima u fiziološkom klirensu katabolita i ksenobiotici. 13, 14

Mucin 1 (MUC1) je transmembranski glikoprotein. U normalnim tkivima, MUC1 se raspoređuje na apikalnoj površini luminalnih epitelnih stanica i tvori mucinozni gel s ostalim članovima mucina kako bi zaštitio temeljni epitel. 15, 16 Međutim, MUC1 je aberantno glikoziliran i prekomjerno ekspresioniran u mnogim karcinomima i povezan je s lošim ishodima, 17, 18 uključujući rak grlića maternice 19 i rak pluća. 20 Dosta dokaza pokazuje onkogene funkcije za MUC1, koje (1) potiču aktivaciju receptora tirozin kinaza i signalizaciju nizvodno 21, 22 (2) smanjuje apoptotski odgovor na genotoksični i oksidativni stres 23 i regulira Wnt / β- katenin, 24, 25 p53, 26, 27 matriks metalopeptidaza (MMP13) 28 i NF- κB 29 . Nadalje, nađeno je da prekomjerna ekspresija MUC1 inducira transformaciju u stanicama i transgeničnim modelima miša. Nedavno, sve veći broj dokaza pokazao je glavnu ulogu MUC1 u terapijskoj otpornosti kod određenih vrsta tumora. 30 gena reguliranih MUC1 visoko prediktiraju klinički ishod u bolesnika s karcinomom dojke i pluća. 20, 31 Prekomjerna ekspresija MUC1-C izazvana kemoterapijskom rezistencijom u stanicama karcinoma gušterače povećanjem proteina-1 za višestruko lijek (MRP1, ABCC1). 32 Naše prethodne studije također su pokazale da je MUC1-C povezan s mutacijom ataksije telangiektazije (ATM) i H2AX, zaštićen od ćelijske smrti izazvane IR-om. 33

U ovom istraživanju imali smo za cilj istražiti odnos između MUC1 i PTX rezistencije i disekciju molekularnog mehanizma koji stoji u osnovi kemoresistencije. Otkrili smo da PTX inducira MUC1, koji je tada doprinio kemoresistenciji uregulacijom ABCB1 suradnjom s nuklearnim EGFR-om. Naš rad je otkrio novi mehanizam za MUC1 posredovanu regulaciju ABCB1, noseći važne terapijske implikacije u prevladavanju hemorezistencije MUC1 pozitivnih tumora.

Rezultati

MUC1 ekspresija se inducira tijekom stečene kemoresistencije

Analiza baze podataka ONCOMINE otkrila je prekomjernu ekspresiju MUC1 u raku grlića maternice (dopunska slika S1A) i raku pluća (dopunska slika S1B). S obzirom na povezanost MUC1 s kemoresistencijom, pokušali smo istražiti potencijalnu uključenost MUC1 u kemoresistenciju u karcinomu grlića maternice i plućni mukoepidermoidni karcinom pluća (PMC). Prvo smo uspostavili staničnu liniju otpornu na PTX HeLa229 / TR. Dugotrajno liječenje PTX-om rezultiralo je znatnom indukcijom ekspresije MUC1 na razini mRNA i proteina u stanicama HeLa229 / TR (slika 1a), što je bilo praćeno IC50 vrijednosti otprilike 15 puta u odnosu na roditeljske stanice HeLa229 (dopunska Slika S1C). Slična strategija je korištena i sa PMC staničnom linijom NCI-H292. Rezultati su pokazali da je povećana MUC1 ekspresija PTX tretmanom povezana s indukcijom kemoresistencije (slika 1b i dodatna slika S1D).

Image

MUC1 ekspresija se inducira tijekom stečene kemoresistencije. ( a ) Razine mRNA i proteina MUC1 u roditeljima HeLa229 (P) i HeLa229 / TR (TR) izmjerene su RT-qPCR (lijevo) i western blot (desno). ( b ) Razine mRNA i proteina MUC1 u matičnim (P) i rezistentnim na PTX stanice NCI-H292 / TR (TR) mjerene su RT-qPCR (lijevo) i western blot (desno). ( c ) HeLa229 stanice su tretirane s različitim dozama PTX-a tijekom 48 sati. RT-qPCR je proveden da se identificira mRNA MUCl. ( d ) HeLa229 stanice su transficirane s pGL3-MUC1 promotorom (500 ng) i zatim su tretirane naznačenom dozom PTX-a tijekom 48 sati. Relativni nabori aktivnosti luciferaze izračunati su prema 0 nM PTX tretmanu (linija 1). ( e ) HeLa229 stanice su tretirane s različitim dozama PTX-a tijekom 48 sati. Western blot je proveden da se identificira protein MUC1. ( f ) Stanice HeLa229 transficirane su pIRESpuro2-MUC1-HA (MUC1-HA) ili vektorskim plazmidima. Dvadeset i četiri sata nakon transfekcije, stanice koje eksprimiraju MUC1-HA tretirane su DMSO (0 nM) ili 10 nM PTX još 24 sata, a zatim je provedena Western blot da se identificira nakupljanje egzogene HA označene MUC1-C. ( g ) Stanice HEK293T transficirane su pIRESpuro2-MUC1-HA i odabran je klon stabilne ekspresije. Stanice su liječene naznačenim dozama PTX-a tijekom 48 sati. Western blot je proveden da se identificira izraz MUC1. ( h ) HeLa229 stanice su tretirane sa DMSO (0 nM) ili 10 nM PTX 48 h, a zatim izložene cikloheksimidu (CHX) (50 µg / ml) naznačeno vrijeme. Izvršeno je Western blot, preostalu razinu MUC1-C kvantificirao je Image Studio Lite, verzija 3.1 (Li-Cor, Lincoln, NE, SAD) i zatim uspoređivao s početnom razinom (0 h). Krivulja poluživota bila je prosjek tri neovisna pokusa. Podaci su prikazani u tri neovisna eksperimenta, prosjek ± SD ( n = 3)

Slika pune veličine

Zatim smo ispitali ulogu MUC1 u modulaciji odgovora stanica raka na terapiju praćenjem ekspresije MUC1 u roditeljskim stanicama HeLa229 liječenih PTX-om. RT-qPCR je otkrio da je ekspresija MUC1 mRNA bila značajno inducirana PTX-om (slika 1c), posebno u dozi od 5 nM. Indukcija MUCl od 10 i 15 nM PTX je također bila lako evidentna, ali relativno skromna. Nadalje smo potkrijepili PTX-induciranu transkripciju MUC1 izvođenjem postupka MAK1 temeljenog transaktivacije. Aktivnost transkripcije pokazala je sličan obrazac indukciji mRNA (slika 1d). Rezultati zajedno pokazuju da je PTX transkripcijski regulirana MUC1 ekspresija. Sljedeće smo ispitivali učinak PTX-a na MUC1 na razini proteina. I razina proteina MUC1-N i MUC1-C značajno je povišena na način ovisan o dozi u stanicama tretiranim PTX-om (Slika 1e). Eksperiment vremenskim tokom pokazao je da je liječenje HeLa229 stanica s 5 nM PTX rezultiralo povećanjem proteina MUC1 već u 48 h (dopunska slika S1E). Zanimljivo, otkrili smo da se protein MUC1 počeo povećavati na 5 nM, ali se nije povećao na 15 nM. Podaci sugeriraju mehanizam osim transkripcijske regulacije na PTX-induciranoj razini MUC1. Za testiranje ove mogućnosti, HeLa229 stanice su prolazne transfekcije s MUC1-HA i izložene su 10 nM PTX. Western blot s anti-HA antitijelom ukazivao je da je egzogeno eksprimirani MUC1 također induciran PTX (slika 1f). Slični rezultati su također viđeni u stanicama HEK293T sa stabilno eksprimiranim MUC1-HA (slika 1 g). Rezultati su pokazali mehanizam post-transkripcijske regulacije MUC1 pomoću PTX-a. U skladu s ovim pojmom, ispitivanje poluživota pokazalo je duži poluživot MUC1 u stanicama za liječenje PTX-om (~ 12 h) u odnosu na kontrolne stanice (~ 5 h) (slika 1h i dopunska slika S1F). Rezultati zajedno sugeriraju da je liječenje PTX-om regulirano MUC1 transkripcijski, kao i post-translacijski.

MUC1 modulira kemosenzitivnost u oba raka

Da bismo istražili je li PTX-inducirani MUC1 odgovoran za uočenu otpornost u stanicama raka, utišali smo ekspresiju MUC1 u stanicama HeLa229 / TR. Mjerenje staničnog odgovora na PTX pokazalo je da je otpornost na PTX značajno smanjena prigušivanjem ekspresije MUC1 u HeLa229 / TR (slike 2a i b i dodatna slika S2A), potvrđujući kritičnu ulogu MUC1 u stečenoj PTX otpornosti. Srušenje MUC1 ekspresije u NCI-H292 također je ukazalo na važnu ulogu MUC1 u PTX otporu (slike 2c i d i dodatna slika S2B), slično kao u HeLa229. Da bismo dodatno potvrdili doprinos MUC1 kemosenzitivnosti, koristili smo drugačiji pristup ušutjivanju MUC1 u HeLa229. Western blot potvrdio je da je ekspresija MUC1 učinkovito oslabljena u dva odvojena klona koja eksprimiraju shMUC1-A i shMUC1-B plazmide, respektivno (Slika 2e). Rezultati su pokazali da je prigušivanje MUC1 ekspresije značajno smanjilo preživljavanje u stanicama tretiranim PTX-om (Slika 2f) i IC50 vrijednosti za PTX (dopunska slika S2C). Napominjemo, prigušivanje MUC1 ima malo utjecaja na staničnu održivost i omjer proliferacije HeLa229 / TR (dopunska slika S2D) i HeLa229 stanica (dopunska slika S2E). Nadalje smo potvrdili ulogu MUC1 eksperimentom spašavanja. Uvođenjem MUC1-HA otpornog na MM-1-shMUC1-B (slika 2 g) na HeLa229 / shMUC1-B stanice vratio je otpornost na PTX (slika 2h). Ovi podaci zajedno podržavaju da MUC1 ima važnu ulogu u modulaciji osjetljivosti stanica karcinoma na PTX.

Image

MUC1 modulira kemosenzitivnost u stanicama karcinoma. ( a ) Western blot navedenih proteina u stanicama HeLa229 / TR / shCTL i HeLa229 / TR / shMUC1 s p- aktinom kao kontrolom opterećenja. ( b ) Stanice HeLa229 / TR / shCTL i HeLa229 / TR / shMUC1 zasijane su u pločicu s 96 jažica (6000 stanica po jažici), kultivirane preko noći i potom 48 sati tretirane s različitim koncentracijama PTX. Stanična vitalnost je mjerena CCK8 testom. ( c ) Western blot naznačenih proteina u stanicama NCI-H292 / TR / shCTL i NCI-H292 / TR / shMUC1 s p- aktinom kao kontrolom opterećenja. ( d ) NCI-H292 / TR / shCTL i NCI-H292 / TR / shMUC1 stanice su posijane u pločicu s 96 jažica (10000 stanica po jažici), kultivirane preko noći i potom 48 sati tretirane različitim koncentracijama PTX. Stanična vitalnost je mjerena CCK8 testom. ( e ) HeLa229 stanice su stabilno transficirane pRNAU6.1-shCTL, pRNAU6.1-shMUC1-A ili pRNAU6.1-shMUC1-B plazmidi i podvrgnute zapadnom blotu s naznačenim antitijelima. ( f ) Stanice HeLa229 / shCTL i HeLa229 / shMUC1 tretirane su različitim koncentracijama PTX 48 h. Provedeni su CCK8 testovi za otkrivanje vitalnosti stanica. ( g ) Dijagram divljeg tipa i sinonimne mutirane MUC1 sekvence. ( h ) Stanice HeLa229 / shMUC1-B transficirane su pIRESpuro2-MUC1-HA (MUC1-HA) rezistentnim na pMUC1-B (MUC1-HA) ili vektorskim plazmidima. Western blot je proveden da se identificira izraz MUC1 (lijevo). Stanice su tretirane DMSO (0 nM) ili 5 nM PTX 48 sati. Provedeni su CCK8 testovi za otkrivanje vitalnosti stanica (desno). Podaci su prikazani u tri neovisna eksperimenta, prosjek ± SD ( n = 3)

Slika pune veličine

MUC1 povisuje ABCB1 nakon kemoterapije

Rasprostranjeno je da povećana ekspresija transportera ABC doprinosi multirezistentnoj otpornosti u stanicama karcinoma. 34 Stoga smo pitali mogu li transporteri ABC biti uključeni u hemoresistenciju ovisnu o MUC1. U tu svrhu usporedili smo stanice sa nedostatkom MUC1 sa stručnim stanicama za ekspresiju ABC transportera. Među devet poznatih transportera povezanih s otpornošću na PTX, mRNA (dopunska slika S3A) i razina proteina (dopunska slika S3B) ABCB1 značajno su regulirani u HeLa229 / shMUC1s u usporedbi s HeLa229 / shCTL stanicama. U skladu s regulacijom ekspresije ABCB1 ovisnom o MUC1, PTX je u indukciji stanice HeLa229 / shCTL u značajnoj mjeri inducirao i ABCB1 mRNA (dopunska slika S3C) i protein (slika 3a), a taj učinak PTX je uklonjen u stanicama HeLa229 / shMUC1. Da bismo isključili mogućnost efekta izvan cilja, izveli smo spasilački eksperiment ponovnom ekspresijom MUC1-HA natrag u stanice HeLa229 / shMUC1-B. Podaci su pokazali da ponovna ekspresija MUC1 obnavlja izraz ABCB1 (slika 3b). U skladu s ovim pojmom, razina mRNA (slika 3c lijevo) i protein (slika 3c desno) ABCB1 su regulirani u HeLa229 / TR stanicama u usporedbi s roditeljskim stanicama HeLa229. Ova regulacija ABCB1 ovisna o MUC1 dodatno je podržana time što je utišavanje MUC1 u stanicama HeLa229 / TR rezultiralo smanjenjem i ABCB1 mRNA (Slika 3e lijevo) i razine proteina (Slika 3e desno). Slični rezultati viđeni su u roditeljskim i NCI-H292 / TR stanicama (Slike 3d i f). Skupno, ovi rezultati pokazali su da je MUC1 odgovoran za indukciju ABCB1 od strane PTX-a.

Image

MUC1 pojačava ekspresiju ABCB1 nakon kemoterapije. ( a ) HeLa229 / shCTL i HeLa229 / shMUC1-B su tretirani s 10 nM PTX na određeno vrijeme. Western blot je proveden radi ispitivanja razine proteina ABCB1 i MUC1-C-terminala (MUC1-C) s p- aktinom kao kontrolom opterećenja. ( b ) HeLa229 / shMUC1-B stanice su transficirane s pIRESpuro2-MUC1-HA (MUC1-HA) rezistentnim na pMESl-B ili vektorskim plazmidima. Dvadeset i četiri sata nakon transfekcije, stanice su tretirane 48 h PTX-om (5 nM). Western blot je proveden za prepoznavanje ekspresije proteina ABCB1. ( c i d ) Razine mRNA i proteina ABCB1 u stanicama HeLa229P / TR ( c ) ili NCI-H292P / TR ( d ) detektirane su RT-qPCR (lijevo) i western blot (desno) s β- aktinom kao unutarnjim kontrolirati. Stanične stanice otpornosti na PTX uzgajane su u mediju bez PTX. ( e i f ) Razine mRNA i proteina ABCB1 u HeLa229 / TR / shCTL i HeLa229 / TR / shMUC1s ( e ) ili NCI-H292 / TR / shCTL i NCI-H292 / TR / shMUC1s ( f ) stanice su detektirane od RT-qPCR (lijevo) i western blot (desno) s β- aktinom kao unutarnjom kontrolom. Podaci su prikazani u tri neovisna eksperimenta, prosjek ± SD ( n = 3)

Slika pune veličine

Inhibicija ABCB1 smanjuje kemoresistenciju

Da bismo utvrdili da li je ABCB1 odgovoran za otpornost na PTX ovisnu o MUC1, obnovili smo ekspresiju ABCB1 u stanicama s nedostatkom MUC1. Izražavanje ABCB1 doista je bilo povezano sa značajnim povećanjem otpornosti na PTX (slike 4a i b). Suprotno prigušivanje ABCB1 u HeLa229 / TR ćelijama rezultiralo je značajnim povećanjem osjetljivosti na PTX (slike 4c i d). Kako bismo potvrdili rezultate dobivene genetskim pristupom, koristili smo farmakološku metodu primjenom dvaju specifičnih inhibitora ABCB1, verapamila i zosukvidara. Tretman HeLa229 s ABCB1 inhibitorima također je umanjio otpornost na PTX (dopunske slike S4A i S4B). U skladu s ovim opažanjima, inhibitori ABCB1 su na PTX prenijeli osjetljivost i HeLa229 / TR (slike 4e i f) i NCI-H292 / TR (slike 4g i h). Zanimljivo je da je utišavanje MUC1 ekspresije također senzibiliziralo stanice na druge supstrate ABCB1, uključujući doksorubicin, vinkristin, etopozid i epirubicin (dopunske slike S4C-S4F). Ti su rezultati zajedno pokazali da je ABCB1 odgovoran za kemoresistenciju izazvanu MUC1 u stanicama roditelja i lijeka.

Image

MUC1 posreduje kemoresistenciju putem ABCB1. ( a i b ) Stanice HeLa229 / shMUC1-B su prolazno transficirane ABCB1 plazmidima (ABCB1) ili vektorskim plazmidima (vec), a zatim su tretirane sa PTX 48 h. ( a ) Western blot je korišten za identifikaciju izraza ABCB1. ( b ) Proveden je CCK8 test kako bi se ispitala stanična vitalnost stanica. ( c ) Western blot je upotrijebljen za identificiranje ekspresije ABCB1 u staničnim linijama HeLa229 / TR / shCTL i HeLa229 / TR / shABCB1 s β- aktinom kao kontrolom opterećenja. ( d ) CCK8 je proveden za identificiranje stanične vitalnosti HeLa229 / TR / shABCB1 i njegove kontrolne stanične linije tretirane s PTX-om 48 sati. ( e i f ) CCK8 testovi primijenjeni su za analizu proliferacije HeLa229 / TR stanica liječenih PTX (40 nM) u kombinaciji s verapamilom (25 µg / ml) ( e ) ili zosukvidarom (0, 2 µM) ( f ) za naznačeno dana. ( g i h ) Testovi CCK8 primijenjeni su za analizu proliferacije NCI-H292 / TR stanica u liječenju PTX (20 nM) u kombinaciji s verapamilom (20 µg / ml) ( g ) ili zosukvidarom (2 µM) ( h ) na navedene dane. Podaci su prikazani u tri neovisna eksperimenta, prosjek ± SD ( n = 3)

Slika pune veličine

MUC1 pojačava nuklearnu translokaciju EGFR-a i povećava ABCB1

Dalje smo istražili kako je MUC1 regulirao ABCB1. S obzirom na povezanost MUC1 s EGFR stazom 35, 36 i onom u regulaciji ekspresije ABCB1, 37, 38, postavili smo pitanje da li je MUC1-inducirana ABCB1 ekspresija posredovana EGFR stazom. Ovu smo hipotezu testirali liječeći stanice s PTX-om u kombinaciji s erlotinibom, inhibitorom EGFR-a. Erlotinib je učinkovito blokirao EGFR fosforilaciju i PTX-induciranu ABCB1 ekspresiju u HeLa229 / shCTL stanicama (Slika 5a). U skladu s ovim rezultatima, blokiranje EGFR fosforilacije erlotinibom u stanicama HeLa229 / TR i NCI-H292 / TR bilo je povezano s izraženim smanjenjem broja MUC1 kao i ABCB1 (slike 5b i c). Kvantifikacija razine transkripta pokazala je da erlotinib ometa PTX-inducirano povećanje ABCB1 mRNA u stanicama HeLa229 (dopunska slika S5A) i HeLa229 / TR stanicama (slika 5d), kao i NCI-H292 / TR ćelijama (slika 5e). Pored toga, prigušivanje EGFR-a u stanicama HeLa229 / TR također je umanjilo ABCB1 (dopunska slika S5B) i kemoresistenciju (dopunska slika S5C). Ovi rezultati sugeriraju da, iako sam EGFR ima malo učinka, on je modulirao ekspresiju ABCB1, izazvanu MUC1. U prilog važnosti EGFR / MUC1 u transkripcijskoj regulaciji ABCB1, erlotinib je značajno senzibilizirao HeLa229 (slika 5f) i HeLa229 / TR (slika 5g) na inhibiciju rasta izazvanu PTX-om, kao i NCI-H292 / TR stanice (slika 5h ). Sveukupno, rezultati su pokazali da je MUC1 / EGFR uključen u obogaćivanje PTC-om ABCB1.

Image

Inhibicija EGFR-a blokira indukciju ABCB1 i rezistenciju na lijek . ( a ) Stanice HeLa229 / shCTL i HeLa229 / shMUC1 tretirane su PTX (10 nM) u odsutnosti ili prisutnosti inhibitora erlotiniba inhibitora EGFR (5 μM ) u trajanju od 72 h. Western blot je proveden za otkrivanje ekspresije naznačenih proteina s p- aktinom kao kontrolom opterećenja. ( b ) HeLa229 / TR stanice su kultivirane u mediju s 25 nM PTX tijekom 24 sata, a zatim su obrađene s erlotinibom (20 µM ) (TR / E) 48 h. Western blot je proveden za otkrivanje ekspresije naznačenih proteina. ( c ) NCI-H292 / TR stanice su kultivirane u mediju s 10 nM PTX tijekom 24 sata, a potom su obrađivane erlotinibom (10 µM ) (TR / E) 48 h. Western blot je proveden za otkrivanje naznačenih proteina. ( d i e ) RT-qPCR je proveden da se identificira razina mRNA ABCB1 u stanicama HeLa229 ( d ) i NCI-H292 ( e ). ( f ) Učinak kombinacije erlotiniba (5 µM) i PTX (10 nM) u stanicama HeLa229 / shCTL i HeLa229 / shMUC1 analiziran je u 48 sati CCK8 testom. ( g ) stanice HeLa229 (P) i HeLa229 / TR (TR) tretirane su s PTX (10 nM) u kombinaciji s erlotinibom (Erl, 20 μM ); ( h ) NCI-H292 (P) i NCI-H292 / TR (TR) stanice su tretirane s PTX (20 nM) u kombinaciji s erlotinibom (Erl, 10 μM ). CCK8 test korišten je za analizu stanične vitalnosti u toku 48 sati. Podaci su prikazani u tri neovisna eksperimenta, prosjek ± SD ( n = 3)

Slika pune veličine

Da bismo razumjeli kako EGFR može utjecati na regulaciju ABCB1 posredovanu MUC1, ispitali smo može li EGFR komunicirati s MUC1 prvo izvodeći eksperiment frakcije frakcije stanice. Rezultat je otkrio da je liječenje PTX-om povezano s povećanjem MUC1 i EGFR-a u jezgri, ali s manjom promjenom citoplazme (dopunska slika S5D). Izvršili smo imunofluorescentno bojenje kako bismo potvrdili rezultat eksperimenata stanične frakcije. Doista, PTX tretman nije samo potaknuo povećanu nuklearnu raspodjelu, već i kolokalizaciju MUC1 i EGFR (slika 6a). Treba napomenuti da je nuklearna kolokalizacija MUC1 i EGFR-a izazvana PTX-om učinkovito blokirana inhibicijom EGFR-a (slika 6a). Inhibicijski učinak erlotiniba na nuklearnu raspodjelu MUC1 i EGFR-induciranu PTX-om dalje je potvrđen testom frakcije frakcije (Slika 6b). Imunoprecipitacija otkrila je da se vezanje MUC1 i fosforiliranog EGFR-a značajno povećalo PTX tretmanom i učinkovito blokiralo erlotinibom (dopunska slika S5E). S obzirom na to da su višestruke studije uključivale MUCl 26, 28, 39 i EGFR 40 u regulaciju transkripcije kao koaktivatore, zatim smo istražili može li PTX-inducirana interakcija između MUC1 i EGFR u jezgri doprinijeti transkripciji ABCB1. U tu svrhu, provedeno je ChIP ispitivanje u stanicama HeLa229 i HeLa229 / TR. Rezultat je pokazao da se MUC1 uglavnom vezuje za tri regije promotora ABCB1: −400 do +200, −1150 do −1400 i −1650 do –1900, koje su unutar istih sekvenci kao i mjesta koja vežu EGFR (dopunske slike S5F i S5G). Web mjesto H3K27Ac-binging označava regiju koja se aktivira transkripcijom. U skladu s prethodnim rezultatima, tretman erlotinibom značajno je smanjio vezanje MUC1 i EGFR na promotor ABCB1, posebno u području od +1 do +200 (slika 6c). Da bismo potvrdili transkripcijsku regulaciju ABCB1 pomoću MUC1 / EGFR, izveli smo test luciferazom transfektiranjem stanica HeLa229 / shMUC1-B stanicama MUC1-HA plazmidom, zajedno s izvjestiteljima luciferazama vođenim od promotora ABCB1. MUC1 ekspresija stimulirala je aktivnost luciferaze, koju je dodatno pojačao PTX tretmanom. U skladu s nalazom u eksperimentu ChIP, ovaj je učinak posredovan posebno u području od -200 do + 200bp (slika 6d). Pored toga, tišina MUC1 ili EGFR oslabila je transkripciju ABCB1, što dalje otkriva važnu ulogu MUC1 / EGFR u regulaciji ABCB1 (Slika 6e). Ti podaci kolektivno sugeriraju da MUC1 aktivira EGFR i inducira transkripciju ABCB1 u HeLa229 i NCI-H292 stanice.

Image

MUC1 pojačava nuklearnu translokaciju EGFR-a i povećava ABCB1 nakon PTX tretmana. ( a ) HeLa229 stanice su tretirane s PTX (10 nM) u odsutnosti ili prisutnosti erlotiniba (Erl, 5 μM ) 12 h. MUC1-C (zelena) i EGFR (crvena) detektirani su imunofluorescencijom. Nuklei su obojeni DAPI (plavi). ( b ) Stanice HeLa229 / shCTL i HeLa229 / shMUC1 tretirane su 10 nM PTX u odsutnosti ili prisutnosti erlotiniba (5 μM ) 12 h, zatim su pročišćeni nuklearni i citoplazmatski proteini. Western blot je proveden za otkrivanje ekspresije naznačenih proteina, a Lamin B i I κ B- α korišteni su kao kontrola opterećenja odvojeno za nuklearni i citoplazmatski protein. ( c ) Stanice HeLa229 (P) i HeLa229 / TR tretirane su (TR / E) ili bez (TR) erlotinibom (20 μM ) 48 sati, a zatim je obavljen ChIP test sa anti-MUC1-C, EGFR i histonom Protutijela na H3 (acetil K27, H3K27Ac). Izveden je RT-qPCR za otkrivanje potencijalne sekvence vezanja u promotoru gena ABCB1. Za pozitivnu kontrolu upotrijebljen je H3K27Ac-ChIP. Studentov t- test izveden je između P i TR ili TR i TR / E grupa, * P <0, 05, ** P <0, 01 i *** P <0, 001. ( d ) HeLa229 / shMUC1-B stanice su transficirane pGL3-ABCB1 promotorom ili pGL3-bazičnim plazmidima (500 ng) s pIRESpuro2-MUC1-HA (MUC1-HA) rezistentnim plazmidima ili vektorskim plazmidima (400 ng), zatim 24 sata nakon transfekcije, stanice su tretirane sa PTX (10 nM) 12 h. Otkrivena je aktivnost luciferaze. ( e ) HeLa229 / TR / shCTL ili HeLa229 / TR / shMUC1 ili HeLa229 / TR / shEGFR stanice su transfektirane pGL3-ABCB1 promotorom ili pGL3-bazičnim plazmidima (500 ng), a aktivnost luciferaze izmjerena je 36 h nakon transfekcije. Relativni nabori aktivnosti luciferaze izračunani su u usporedbi s pGL3-bazičnim plazmidima. Podaci su prikazani u tri neovisna eksperimenta, prosjek ± SD ( n = 3)

Slika pune veličine

Istodobna primjena osi MUC1-EGFR-ABCB1 i PTX sprječava recidiv tumora

Da bismo istražili doprinos MUC1 kemoresistenciji in vivo , stvorili smo modele miša ksenografta. Tumori dobiveni HeLa229 / shCTL bili su u početku osjetljivi na PTX liječenje, što se odrazilo na zaustavljeni rast. Međutim, tumori su nastavili rast na dan 21 nakon završetka PTX tretmana (slika 7a), što je u skladu s stečenom PTX rezistencijom. Kritična uloga MUC1 u ovoj kemoresistenciji dokazana je otkrićem da iscrpljivanje MUC1 nije povezano samo sa smanjenjem rasta tumora, već i s potpunom sprječavanjem relapsa tumora nakon završetka PTX liječenja (slike 7a i b). U skladu s našim in vitro podacima, PTX tretman izazvao je povišene razine ekspresije MUC1, ABCB1 i značajno povećanje lokalizacije EGFR nuklearnog tkiva u tumorskim tkivima (slika 7c). Treba napomenuti da su ti učinci bili vidljivi samo u HeLa229 / shCTL tumoru, ali ne i u HeLa229 / shMUC1 tumoru (Slika 7c), podržavajući ovisnost o MUC1. Bojenje TUNEL-om otkrilo je da PTX liječenje inducira više apoptoze u HeLa229 / shMUC1 tumorima nego one u HeLa229 / shCTL tumorima (Slika 7d). Da bismo ispitali doprinos osi MUC1 / EGFR-ABCB1 kemoresistenciji tumora, tretirali smo miševe koji nose tumor HeLa229 / shCTL sa PTX u kombinaciji s verapamilom ili erlotinibom. Slično senzibilizirajućem učinku shMUC1, verapamil ili erlotinib bitno su povećali PTX-induciranu inhibiciju rasta tumora (Slika 7e, Dopunske slike S6A i S6B). Treba napomenuti da je mala razlika u tjelesnoj težini miševa unutar skupina samog lijeka i kombiniranog liječenja (dopunska slika S6C), što ukazuje da tretmani ne uzrokuju značajnu toksičnost. Ovi podaci zajedno podržavaju kritičnu ulogu osi MUC1 / EGFR-ABCB1 u stečenoj hemorezistenciji stanica HeLa229, a osim toga ako ciljanje ove osi može učinkovito prevladati kemoresistenciju.

Image

Istodobna primjena inhibitora osi MUC1-EGFR-ABCB1 i PTX sprječava recidivu tumora. ( a i b ) Ženke BALB / c golih miševa šest tjedana supkutano su injicirane s 2, 5 × 106 6LeLa229 / shCTL stanice ili HeLa229 / shMUC1 stanicama u ventralnim bočnim dijelovima. Kad je tumor dostigao približno 4 mm × 4 mm, miševima su ubrizgani intraperitonealno PTX u 40 mg / kg svaka tri dana tijekom 15 dana. Veličine tumora mjerene su svaka 3 dana nakon PTX tretmana. Volumen tumora izračunat je prema formuli: V = dužina × širina 2/2. Navedeni podaci znače sa SEM od šest miševa u svakoj skupini. ( b ) U 45. danu, svi su miševi ubijeni, a tumori su izrezani i fotografirani. ( c i d ) Obavljeno je obojenje IHC ( c ) ili TUNEL test ( d ) presjeka tumorskog tkiva. ( e ) 2, 5 × 10 6 HeLa229 / shCTL stanice ili HeLa229 / shMUC1 stanice supkutano su ubrizgane u ventralne bokove 6-tjednih ženskih BALB / c golih miševa. Kada je tumor dosegao 4 mm × 4 mm, miševe smo slijepo raspodijelili u šest skupina i ubrizgali PTX (40 mg / kg) u kombinaciji s verapamilom (20 mg / kg) ili erlotinibom (50 mg / kg) intraperitonealno svaka 3 dana na 15 dana. U 36. danu, svi su miševi ubijeni, a tumori su izrezani i fotografirani

Slika pune veličine

Rasprava

Rak grlića maternice je drugi najčešći zloćudni oblik koji pogađa žene širom svijeta s visokom smrtnošću. 41 PMC je rijetka histološka vrsta malignih bolesti pluća. 42 PTX je važan lijek za prvu liniju liječenja obaju karcinoma. Funkcionalna karakterizacija MUC1 u ova dva karcinoma pokazuje da MUC1 posreduje u razvoju stečene kemoresistencije stanica karcinoma. Liječenje stanica raka kemoterapijskim lijekovima izaziva ekspresiju MUC1, koja potiče aktivaciju i nuklearnu distribuciju EGFR-a. Zajedno, EGFR i MUC1 transkripcijski reguliraju ABCB1 doprinoseći stjecanju kemoresistencije. Podupirući kritičnu ulogu za osi MUC1 / EGFR-ABCB1 u kemoresistenciji, ciljano inhibiranje EGFR-a shRNA i erlotinibom senzibilizira stanice raka na kemoterapiju in vitro i in vivo . Naš rad ne samo da otkriva novi uvid u stečenu kemoresistenciju kod raka grlića maternice i PMC-a, već ima i važne terapijske implikacije.

Prevelika ekspresija MUC1 u karcinomu i njegova povezanost s lošom prognozom kod pacijenata s karcinomom naveli su nas da istražimo potencijalnu ulogu ovog onkoproteina u progresiji raka. 19, 20 Koristeći kombinaciju pristupa gubitku i dobitku funkcije, pružili smo i in vitro i in vivo dokaze koji izravno povezuju MUC1 s stečenom kemoresistencijom. MUC1 je induciran u stanicama raka nakon liječenja kemoterapijskim lijekovima. Posebno je zanimljivo otkriće da je ekspresija MUC1 bila znatno regulirana u stanicama karcinoma koje su stekle hemorezistenciju nakon dugotrajnog PTX liječenja. U skladu s našim opažanjima, MUC1 je ranije izvještio da povezuje s terapijskom rezistencijom u nekoliko drugih vrsta raka, kao što su rak dojke 31 i rak gušterače. 32 Valja napomenuti da je ekspresija MUC1 bila relativno niska u netretiranim ili naivnim tumorima, ali značajno inducirana PTX-om, posebno dugotrajnim liječenjem. Naši rezultati pokazuju da PTX tretman pojačava MUC1 transkripcijski, kao i post-translacijski. MUC1 promotor može se regulirati epigenetskim mehanizmom, 43 ili cis-djelujućim elementima, poput Spl, AP-1-4, NF-1 i NF- κ B. 44 Također su izvijestili da proupalni citokini podižu MUC1. 45 PTX može povećati transkripciju MUC1 aktivnim NF- κ B 46 ili protuupalnim citokinima. 47 Za razliku od transkripcijske regulacije MUC1, mnogo se manje zna o post-translacijskoj regulaciji MUC1. Daljnje studije bit će potrebne kako bi se istražilo na koji način kemoterapijski lijekovi nakon translacijsko povećavaju ekspresiju MUC1.

MUC1 je uključen u moduliranje stanične osjetljivosti na terapiju. Ranije je objavljeno da je MUC1 dodijelio kemoresistenciju stanicama karcinoma gušterače reguliranjem MRP1. 32 Identificirali smo ABCB1 kao važan faktor koji posreduje u hemoresistenciji ovisnoj o MUC1 kod raka vrata maternice i PMC-a. Proteini obitelji ABC često su uključeni u multirezistentnost na rak. 34 Među devet ABC-a povezanih s PTX-om, otkrili smo da je ABCB1 protein jedini koji je selektivno induciran MUC1, mada je razina mRNA ABCC1 i ABCC5 povišena i od MUC1. Doista, inhibicija ABCB1 s komplementarnim farmakološkim i genetskim pristupima značajno je umanjila kemoresistenciju stanica karcinoma. Rezultati ne samo da otkrivaju novi mehanizam hemoresistencije izazvane MUC1, već i impliciraju ABCB1 kao potencijalni terapeutski cilj u stanicama karcinoma.

Kako bismo rasvijetlili mehanizam kako MUC1 regulira ABCB1, usmjerili smo našu pažnju na put EGFR-a, jer ovaj posljednji slučaj nije uključen samo u propise ABCB1 37, 38, već je povezan i s MUC1. 35, 36 Nedavna ispitivanja pokazala su da je EGFR bio uključen u kemoresistenciju u mnogim rakovima reguliranjem ABCB1 i ABCG2. 37, 38, 48, 49 Dinamična interakcija između MUC1-C i EGFR-a zabilježena je u različitim kontekstima s općim trendom međusobnog funkcionalnog povećanja. MUC1 pospješuje aktiviranje ovisnog o EGFR-u PI3K-AKT staze, 22, 50 i regulira lokalizaciju EGFR-a do jezgre, 36 kao i stimulira EGFR ekspresiju vezanjem na EGFR promotor. U skladu s objavljenim radom, otkrili smo da je povećana ekspresija MUC1 u stanicama raka vrata maternice povezana s povećanom fosforilacijom i ukupnom razinom EGFR-a (slike 5a i 6b). Tretmanom PTX-om stimulirana je aktivnost i nuklearna lokalizacija i MUC1 i EGFR-a. Važno je da je supresija EGFR-a inhibitorom značajno potisnula PTC-induciranu ABCB1 ekspresiju i preokrenuo MUC1-posredovani otpor PTX-u (Slika 5f). Pored toga, prigušivanje ili MUC1 ili EGFR u stanicama HeLa229 / TR povuklo je ABCB1 i kemoresistenciju (Slika 3e, Dodatne slike S2B, S5B i S5C). Formiranje MUC1 / EGFR kompleksa dodatno je potvrđeno co-IP testom (dopunska slika S5E). Ovi podaci podržavaju model MUC1 / EGFR-ABCB1 osi u MUC1-induciranoj kemoresistenciji. Valja napomenuti da je erlotinib također značajno smanjio PTX-induciranu nuklearnu raspodjelu MUC1 i EGFR, što bi spriječilo njihovu transkripcijsku aktivnost. Zapravo, analiza ChIP-a otkrila je da je liječenje erlotinibom značajno smanjilo vezanje MUC1 i EGFR-a na promotor ABCB1, pružajući važan molekularni uvid u kemoresistenciju posredovanu MUC1. Najviše obogaćivanje aktivnosti luciferaze pronađeno je u području od -200 do +200, koja je uključivala mjesta vezivanja za mnoge važne faktore transkripcije, poput STAT3 (+64 do +72), FOXO3a (-181 do +68), p53 (- 49 do -40; -72 do -62), InvMED (-106 do -100), NFR1 / 2 (−123 do -115), C / EBP (−147 do −135), NF- κ B (−167 do −158), AP-1 (−122 do −116) i β- katenin (−228 do +31). Identifikacija mjesta vezivanja za MUC1 / EGFR u promotoru ABCB1 je od velike važnosti za rasvjetljavanje mehanizma kojim taj MUC1 / EGFR regulira aktivaciju transkripcije ABCB1. 51

Pokazali smo da kombinirana uporaba EGFR inhibitora s ABCB1 supstratom može predstavljati obećavajuću strategiju preokretanja kemoresistencije posredovane ABCB1. FDA je odobrila nekoliko malih molekularnih inhibitora tirozin kinaze (TKI), kao što su gefitinib, 52, 53 erlotinib 54, 55 i lapatinib, 56 za liječenje NSCLC gdje se EGFR često aktivira amplifikacijom ili mutacijom. 57 Zanimljivo je da je zabilježeno da je stečena rezistencija na PTX u stanicama karcinoma jajnika povezana i s povećanom osjetljivošću na inhibitore HER1 / EGFR, što je u korelaciji s povećanom ekspresijom HER1 / EGFR. 58 U skladu s ovim nalazom, otkrili smo da je EGFR u početku neprimjetan u tumoru grlića maternice, ali induciran PTX tretmanom (slika 7c), što je praćeno povećanom MUC1 / ABCB1 ekspresijom i terapijskom otpornošću. Naši podaci sugeriraju usku povezanost između kemoresistencije i aktiviranja EGFR-a kod tumora vrata maternice i PMC-a. U skladu s ovim pojmom su naši podaci koji pokazuju da je EGFR aktivirao MUC1 u stanicama karcinoma otpornih na PTX i što je još važnije, inhibicija MUC1 rezultirala je smanjenom aktivnošću EGFR-a i smanjenom ekspresijom ABCB1 što dovodi do preokreta PTX rezistencije. U našem modelu miša s ksenograftom karcinoma vrata maternice, istodobna primjena PTX-a s EGFR inhibitorom erlotinibom značajno je spriječila rast i relaps tumora, što je bilo povezano sa smanjenom ekspresijom MUC1 i ABCB1, te smanjenjem aktivnosti EGFR-a. Naši podaci impliciraju da se EGFR inhibitori uz kombinaciju s PTX-om mogu koristiti za prevladavanje stečene rezistencije na kemoterapiju kod MUC1-pozitivnog karcinoma.

Zabilježeno je da su mnogi putovi regulirali ekspresiju ABCB1. Na primjer, inhibicija p38 / MAPK smanjila je aktivnost aktivatora protein-1 (AP-1) i ABCB1. 59 Aktivacija JNK / c-Jun / AP-1 smanjuje ABCB1 mRNA ekspresiju. 60, 61 Naši podaci pokazali su da inhibitori EGFR-a nisu u potpunosti inhibirali interakciju MUC1 i ABCB1 promotora, što sugerira mogući učinak MUC1 na drugi put pored EGFR-a.

Naši nalazi također imaju posljedice u liječenju drugih karcinoma, jer se pokazalo da se MUC1 regulira u mnogim PTX-rezistentnim tumorima, uključujući rak jajnika i želudac (Dopunska slika S7) na temelju ONCOMINE baze podataka. Bit će potrebne daljnje studije kako bismo istražili mogu li se naši nalazi u ovoj studiji prevesti na druge vrste raka kod kojih su MUC1 i ABCB1 pozitivni.

Materijali i metode

Stanična kultura

HeLa229, HEK293T i NCI-H292 osigurali su Cell Bank, Zbirka kultura tipa, Kineska akademija znanosti (Šangaj, Kina) i Fu Heng Biology Company (Šangaj, Kina). Stanice HeLa229 i NCI-H292 uzgajane su u RPMI1640 (Corning, NY, USA) sa 10% fetalnim goveđim serumom (Gibco, Grand Island, NY, USA), a HEK293T je uzgojen u DMEM uz dodatak 10% fetalnog goveđeg seruma (Gibco). sa 100 U / ml penicilina i 100 μg / ml streptomicina, i održavano u vlažnoj atmosferi od 5% C02 na 37 ° C. Sve stanične linije rutinski su testirane i bez mikoplazme.

Stvaranje PTX otpornih staničnih linija

Za stvaranje PTX-rezistentnih HeLa229 / TR stanica, HeLa229 stanice su bile postupno izložene 5, 10, 15, 20 i 25 nM PTX, a svaki tretman je trajao 9 dana. PTX-rezistentne NCI-H292 / TR stanice su nastale postupnim izlaganjem 2, 5, 5, 10 nM PTX.

Plazmidi i transfekcija

HeLa229 / shCTL ili HeLa229 / shMUC1-A / B stanice realizirane su transfektiranjem HeLa229 stanica pRNAU6.1-shCTL ili pRNAU6.1-shMUC1-A / B pomoću X-treme GENE HP DNA transfekcijskog reagensa (Roche Applied Science, Basel, Švicarska) i odabrano 500 μg / ml G418. Dvije ciljne sekvence za MUC1 prikazane su kako slijedi: shMUC1-A: 5′-AAGGTACCATCAATGTCCACG-3 ′, i shMUC1-B: 5′-AAGTTCAGTGCCCAGCTCTAC-3 ′. Kontrolni slijed shRNA (shCTL) je 5'-CGCTTACCGATTCAGAATGG-3 '. PGTZ-puromicinski lentivirusni plazmidi bili su iz knjižnice Thermo Scientific Biosystems GIPZ Lentiviral shRNAmir (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, SAD). Ciljne sekvence su bile sljedeće: shMUC1-1: 5′-CCAGCACCGACTACTACCA-3 ′; shMUC1-2: 5′-GAAATGTTTTTGCAGATTT-3 ′; shABCB1-1: 5′-CAGATAATATTAAGGGAAA-3 ′; shABCB1-2: 5′-AGATGATGTCTCCAAGATT-3 ′; shEGFR-1: 5′- AGGAACTGGATATTCTGAA-3 ′; ShEGFR-2: 5′-AGATCAGAAGACTACAAAAA-3 ′. Kontrolni slijed gluposti je 5'-CTCGCTTGGGCGAGAGTAA-3 '. ShRNA plazmidi i ambalažni plazmidi (PM2G i PSPAX2) kofeficirani su u stanice HEK293T. Virusni supernatanti su sakupljeni 48 sati nakon transfekcije. Stanice HeLa229 / TR i NCI-H292 / TR bile su zaražene shMUC1 (shMUC1-1 / shMUC1-2), shABCB1 (shABCB1-1 / shABCB1-2), shEGFR (shEGFR-1 / shEGFR-2) i shCTL lentivirusom sa medijum koji sadrži 1 μg / ml polibrena (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, Kalifornija, SAD). Nakon 48 h, stanice su odabrane sa 3 μg / ml puromicina (HeLa229 / TR) ili 1, 5 μg / ml puromicina (NCI-H292 / TR). Za izgradnju MUCl-ekspresionirajućeg plazmida, puna dužina MUC1 s HA ​​oznakom na C-terminalu klonirana je u pIRESpuro2 vektor. Za konstrukciju plazmida koji eksprimira MUC1-HA-ekspresionirajući MUC1-HA plazmid pIRESpuro2-MUC1-HA (MUC1-HA) ciljni slijed shMUC1-B bio je sinonim za mutiranje iz 5 '-aagttcagtgcccagctctac-3' u 5 '-aagCtcCgcgggcccccccccc, Ekspresijski plazmid pHa-MDRwt (ABCB1 plazmid) bio je poklon dr. Michaela Gottesmana (Addgene, Cambridge, MA, SAD; plazmid).

Prolazne transfekcije provedene su s reagensom Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, SAD) ili X-treme GENE HP Transfection reagensom (Roche Applied Science, Basel, Švicarska) prema uputama proizvođača.

Test stanične proliferacije / vitalnosti i IC50 vrijednosti

Stabilnost ćelije određena je korištenjem kita za brojanje stanica 8 (CCK8) prema protokolu proizvođača (Dojindo Molecular Technologies, Kumamoto, Japan). Ukratko, 6000–10000 stanica po jažici je posijano u pločice s 96 jažica, uzgajano preko noći i zatim obrađeno različitim lijekovima. Nakon relevantnog tretmana, dodan je CCK8 i inkubiran dodatna 2 sata, zatim je apsorbancija na valnoj dužini od 450 nm izmjerena Synergy H4 Hybred Reader (BioTek Instruments, Winooski, VT, USA). Vrijednosti relativne inhibicije rasta i vrijednosti polumaksimalne inhibicijske koncentracije (IC50) izračunate su nelinearnom regresijskom analizom pomoću GraphPad Prism 6.0 softvera (GraphPad Software, Inc. La Jolla, CA, USA). Svaki eksperiment je ponovljen tri puta s trostrukim uzorcima.

Lijekovi i antitijela

U našim pokusima korišteni su sljedeći lijekovi i antitijela: PTX, vinkristin, doksorubicin i verapamil, cikloheksimid, etopozid (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, SAD), zosukvidar, erlotinib i AG-1478 (Selleck Chemicals, Houston, TX, USA), anti-MUC1-C antitijelo (Thermo Scientific, Hudson, NH, USA), anti-MUC1-N antitijelo, 17 anti-HA-tag, anti-ABCB1, anti-fosfo-EGFR 1068 antitijela (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, SAD), anti-ABCBG2 antitijelo (GeneTex, Irvine, CA, USA), anti-ABCC1 antitijelo (Bioworld Technology, Inc., Louis Park, MN, USA), anti-ABCC2 i anti-EGFR antitijela ( Proteintech Group, Chicago, IL, SAD), anti-ABCC3 i anti-ABCC5 (Cusabio Biotech, Wuhan, Kina), anti-Lamin B i anti-I κ B-α protutijela (Santa Cruz Biotechnology), anti-histon H3 ( protutijela na acetil K27) (Abcam, Cambridge, MA, USA), sekundarno antitijelo vezano uz hren peroksidazu (HRP) i antitijelo na anti- p- aktin (Merck Millipore Billerica, MA, SAD).

Western blot

Stanice su sakupljene trippsinizacijom i lizirane u NETN 150 lizijskom puferu (0, 5% NP-40, 20 mM Tris (pH 8, 0), 150 mM NaCl, 6 mM EDTA). Bradford je količinski utvrdio proteine. Dvadeset mikrogramskog proteina odvojeno je pomoću SDS-PAGE i preneseno na nitroceluloznu membranu (Axygen, Tewksbury, MA, USA). Nakon blokiranja u 5% nemasnog mlijeka 1 sat na sobnoj temperaturi, membrana se inkubirala s primarnim antitijelima preko noći na 4 ° C, a zatim s HRP-om povezanim sekundarnim antitijelom. Za otkrivanje korišten je ImportlonTM Western Chemiluminescent HRP komplet supstrata (Millipore Corporation, Billerica, MA, SAD).

Kvantitativni PCR u stvarnom vremenu (RT-qPCR)

Ukupna RNA ekstrahirana je pomoću TriPure Isolation Reagent-a u skladu s protokolom proizvođača (Roche). Komplementarna DNA sintetizirana je korištenjem kit za sintezu M-MLV reverzne transkriptaze (Promega, Madison, WI, USA). RT-qPCR je proveden s Power SYBR Green PCR Master mix kitom prema uputama proizvođača (Applied Biosystems, Warrington, UK). Pojačanja su izvedena u ABI PRISM 7500 sustavu detekcije slijeda (primijenjeni biosustavi). Relativne količine transkripta izračunate su korištenjem metode ΔΔCt s β- aktinom kao endogenim referentnim genom. Svaki je rezultat ponovljen tri puta. Primeri su iz PrimerBanka.

Niz sekvence za RT-qPCR:

Image

Nuklearna i citoplazmatska ekstrakcija

Nuklearni i citoplazmatski proteini pročišćeni su upotrebom NE-PER nuklearnih i citoplazmatskih ekstrakcijskih reagensa (Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL, SAD) prema uputama proizvođača. Nuklearne i citoplazmatske proteine ​​je Bradford kvantificirao te ih dalje analizirao Western blot.

Imunofluorescentno bojenje

Kultivirane stanice isprane su PBS-om sobne temperature jednom, fiksirane hladnim 4% formaldehidom 30 minuta i isprane s PBS-om tri puta. Stanice su permeabilizirane hladnim metanolom tijekom 20 minuta i inkubirane su s primarnim antitijelima preko noći na 4 ° C nakon 5% blokiranja BSA. Stanice su inkubirane s fluorescentnim sekundarnim antitijelima (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA, USA) u 5% BSA u trajanju od 1 sata na 37 ° C. Nuklei su obojeni pomoću DAPI (Vector Laboratories, Burlingame, CA, SAD). Konfokalni mikroskop (Nikon, Tokio, Japan) korišten je za promatranje svih obojenih kriški.

Kromatinske imunoprecipitacije

Stanice HeLa229 i HeLa229 / TR zasijane su na posudama s kulturama od 150 mm. Stanice su isprane sa PBS sobne temperature i fiksirane s 1% formaldehida u PBS 10 min na 37 ° C. Zatim su stanice isprane ledenim PBS-om i uzele je centrifugiranjem. Stanične pelete resuspendiraju u puferu za lizu (1% SDS, 5 mM EDTA, 50 mM Tris.HCl (pH 8, 0) sa inhibitorom proteaze) i ultrazvučno. Izvršite imunokleriranje inkubiranjem kromatina s odrezanom DNK sperme lososa, pre imunološkim serumom i zrncima sefaroze proteina A u trajanju od 2 sata na 4 ° C. Supernatant je podvrgnut imunoprecipitaciji s MUCl, EGFR ili histon H3 (acetil K27) antitijelima tijekom 6 sati na 4 ° C, nakon čega je slijedilo dodavanje zrnca proteina A sefaroze, DNA sperme lososa tokom 1 sata. Kuglice sefaroze su skupljene i isprane sukcesivno u TSEI (0, 1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris.HCl (pH 8, 0), 150 mM NaCl), TSEII (0, 1% SDS 1% Triton X- 100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris.HCl (pH 8, 0), 500 mM NaCl), pufer III (0, 25 M LiCl, 1% NP-40, 1% deoksiholat, 1 mM EDTA, 10 mM Tris.HCl (pH 8, 0 )) i TE pufer. DNA se eluira iz kuglica sa puferom za ispiranje (1% SDS, 0, 1 M NaHC03). Elucija je zagrijavana na 65 ° C preko noći da bi se preokrenula formaldehidna poprečna veza, te pročišćena QIAquick PCR kompletom za pročišćavanje (QIAGEN GmbH, Hilden, Njemačka).

Negativni prajmeri smješteni na 167 kb uzvodno od ABCB1. Primeri za ChIP:

Image

Ko-imunoprecipitacijski test

Stanice HeLa229 i HeLa229 / TR lizirane su u NETN 150 puferu za lizu s 1 mM PMSF i 20 mM koktel tabletama inhibitora fosfataze (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Njemačka). Stanični lizat je prethodno očišćen sa 30 μl proteina A / G plus agarozom (Santa Cruz Biotechnology) na 4 ° C tijekom 2 sata. Supernatant je inkubiran s MUC1-C-terminalnim antitijelom i protutijelom IgG hrčka (Santa Cruz Biotechnology) preko noći na 4 ° C s rotacijom. Sveukupno, 20 μl proteina A / G plus agaroza dodan je staničnom lizatu i inkubiran 2 sata na 4 ° C s rotacijom. Imunoprecipitati su sakupljeni centrifugiranjem i tri puta isprani s NETN 150 puferom.

Analiza luciferaze

Stanice HeLa229 transficirane su reporterima plazmidima luciferaze pGL3-MUC1-promotor (500 ng) ili pGL3-ABCB1-promotor (500 ng) zajedno s pGL3-SV40-Renilla (10 ng). Trideset šest sati kasnije, stanice su sakupljene i analizirane sustavom ispitivanja dualnog luciferaze (Promega) prema uputama proizvođača.

pGL3-MUC1-promotor luciferazni reporter plazmid velikodušno je pružio dr. Donald Kufe na Dana-Farber Institute of Cancer Harvard Medical School u Bostonu, MA, SAD.

Ljudski promotor ABCB1 (-2500 do +700) pojačan je s primerima (gore: 5′-GGGGTACCGCAAGGGGACCAGGTAGGTTTCATC-3 ′, dolje: 5′-CTAGCTAGCCTAGTTACCTTTTTTTTTTTT-3 ′), dok je humani ABCB200 pomnožen (AMF200 s prajmerima (gore: 5′-CTAGCTAGCAGGAAATCTGAAAGCCTGAC-3 ′, dolje: 5′-GGGGTACCCCCTTTCTAGAGAGGGTGCA-3 ′), a zatim kloniran u vektor pGL3-basic (Promega) kako bi se konstruirao pGL3-ABCB1-promoter (7) izvjestitelja i pGL3-ABCB1-promotora (−200 do +200) luciferaza izvještača.

TUNEL test

Da bi se otkrile apoptotske stanice u tumorskom tkivu, uzorci su odmah fiksirani u 4% paraformaldehidu, a presjeci tumorskog tkiva obojeni su TUNEL kitom (Promega) u skladu s uputama proizvođača. Fluorescentni signali snimljeni su na Confocal mikroskopu (Nikon).

Histološko i imunohistokemijsko bojenje (IHC)

Tumorsko tkivo je fiksirano u 4% paraformaldehidu, a zatim dehidrirano prije ugradnje u parafin. Sve je rezano i obojeno 6 μm tkiva u skladu sa standardnim postupkom s eozinom i hematoksilinom. Tumorima koji su ugrađeni parafinom dva puta se defafiniralo ksilonom u trajanju od 5 minuta, a zatim obrađivalo s gradijentnim etanolom u trajanju od 3 minute za svaki put. Odjeljci tkiva su zatim zagrijavani na 92–98 ° C u 10 mM citratnom puferu (pH 6, 0) tokom 35 minuta za traženje antigena. Da bi se povećala propusnost tkiva, dijelovi tkiva su tretirani u PBST (0, 2% Triton X-100) 10 min. Odjeljci tkiva su tretirani s 3% -tnom vodikovom peroksidazom u metilnom alkoholu u trajanju od 10 minuta, a zatim su inkubirani 1 h sa blokirnim serumom na sobnoj temperaturi. Odjeljci tkiva inkubiraju se s primarnim antitijelom na 4 ° C preko noći. Bojenje IHC-a izvedeno je s ABCB1 i MUC1-C, EGFR antitijelima. Postupak bojenja slijedio je upute proizvođača za ABC sustav bojenja (Santa Cruz Biotechnology).

Pokusi na životinjama

Sa svim se životinjama postupalo u skladu s Vodičem za njegu i uporabu laboratorijskih životinja 'i Načelima za upotrebu i njegu kralješnjaka'. Svi pokusi na životinjama konzultirali su smjernice ARRIVE za životinje. 62 Istraživanje je odobrilo Odbor za institucionalnu njegu i upotrebu životinja na Medicinskom fakultetu Sveučilišta u Šangaju Jiaotong. Istražitelji su bili zaslijepljeni zbog rasporeda grupa.

Stanice tumora injicirane su supkutano u ventralne bokove 6-tjednih ženskih BALB / c golih miševa. Kad su tumori dostigli približno 4 mm × 4 mm, miševima koji nose tumor bili su nasumično dodijeljeni ( n = 6 po skupini) i tretirani s različitim lijekovima.

Miševi kojima je ubrizgan 2, 5 × 106 HeLa229 / shCTL ili HeLa229 / shMUC1 stanice slijepo su raspoređeni u dvije skupine za eksperimente otpornosti na lijek sa šest miševa za svaku skupinu: miševi iz grupe 1 tretirani su s PBS-om kao kontrolom, a miševi u skupini 2 tretirani s PTX (40 mg / kg). PTX (Taxol; Bristol-Myers Squibb, Princeton, NJ, SAD) je prikladno razrijeđen u PBS-u prije tretmana. Lijekovi su ubrizgani intraperitonealno svaka 3 dana. Ukupno razdoblje liječenja bilo je 15 dana, 30 dana nakon konačne primjene, miševi su ubijeni.

Miševi kojima je ubrizgan 2, 5 × 106 HeLa229 / shCTL slijepo su dodijeljeni u šest skupina za eksperimente kombinirane otpornosti na lijek sa šest miševa za svaku skupinu: grupe 1 i skupina 2 su tretirane kao gore, skupina 3 tretirane su verapamilom (20 mg / kg), skupina 4 tretirane su verapamilom i PTX-om, grupa 5 tretirane su erlotinibom (50 mg / kg), a skupina 6 tretirane su erlotinibom i PTX-om. Miševi ubrizgani s 2, 5 × 106 HeLa229 / shMUCl raspoređeni su u dvije skupine kao gore, sa po šest miševa za svaku skupinu. Erlotinib i verapamil (Selleck Chemicals) pripremljeni su prema uputama proizvođača, a zatim razrijeđeni u PBS-u. Lijekovi su ubrizgani intraperitonealno svaka 3 dana. Rast tumora praćen je pravilom kalibra svaka 3 dana, a ukupno razdoblje liječenja bilo je 15 dana za kombinirano liječenje. Tri tjedna nakon konačne primjene, miševi su ubijeni. Volumen je izračunat prema formuli: V = dužina × širina 2/2.

Statistička analiza

Sve statističke analize izvršene su pomoću GraphPad Prism 6 (GraphPad Software, La Jolla, CA, SAD). Svaki je rezultat predstavljen kao srednja vrijednost ± SD tri neovisna pokusa ( n = 3) i obavljen je dvostrani t- test učenika za procjenu razlika između povezanih skupina, a P- vrijednosti <0, 05 smatrane su statistički značajnim. * P <0, 05, ** P <0, 01, *** P <0, 001 i **** P <0, 0001.

Dodatna informacija

Word dokumenti

  1. 1.

    Dopunske brojke

    Bilješka izdavača

    Springer Nature ostaje neutralan s obzirom na zahtjeve za jurisdikciju u objavljenim mapama i institucionalnoj pripadnosti.

    Dodatne informacije nalaze se u ovom radu na web stranici Cell Death and Disease (//www.nature.com/cddis)