Mutant p53-r273h posreduje preživljavanju stanica raka i otpornosti na anoikis putem akt-ovisnog suzbijanja faktora koji modificira bcl2 (bmf) | stanična smrt i bolest

Mutant p53-r273h posreduje preživljavanju stanica raka i otpornosti na anoikis putem akt-ovisnog suzbijanja faktora koji modificira bcl2 (bmf) | stanična smrt i bolest

Anonim

teme

  • apoptoza
  • Stanična signalizacija
  • Ciljane terapije
  • Proteini koji su supresori tumora

Sažetak

p53 je najčešće mutirani gen supresije tumora u karcinomu čovjeka. Za razliku od drugih tumora-supresorskih gena, p53 mutacije uglavnom nastaju kao mutacije mutacije unutar domene koja veže DNA, što dovodi do ekspresije mutantnog p53 proteina pune dužine. Mutantni p53 proteini ne samo da gube funkciju supresije tumora, već mogu dobiti i nove onkogene funkcije i pospješuju tumorigenezu. Ovdje smo pokazali da prigušivanje endogenog kontaktnog mutanta p53-R273H, ali ne i p53-R175H konformacijski mutant, smanjena AKT fosforilacija, inducirana ekspresija BCL2 faktora (BMF), osjetljiva BIM disocijacija od BCL-X L i inducirana apoptoza ovisna o mitohondriji u stanicama raka. Važno je također da su stanice raka koje sadrže endogeni mutant p53-R273H također inherentno rezistentne na anoikis i nemaju indukciju BMF nakon kulture u suspenziji. U osnovi ovih aktivnosti je sposobnost p53-R273H mutanta da suzbije BMF ekspresiju koja je ovisna o konstitutivno aktivnom PI3K / AKT signalizaciji. Kolektivno, ovi nalazi sugeriraju da p53-R273H može specifično pokretati AKT signalizaciju i suzbiti BMF ekspresiju, rezultirajući poboljšanom preživljavanjem stanica i otpornošću na anoikis. Ovi nalazi otvaraju mogućnost da će blokiranje PI3K / AKT imati terapijsku korist kod mutiranih karcinoma koji eksprimiraju p53-R273H.

Glavni

Protein p53 je tumor supresor koji djeluje kao faktor transkripcije specifičan za sekvencu koji regulira ekspresiju različitih ciljnih gena koji su uključeni u apoptozu, zaustavljanje staničnog ciklusa, popravljanje DNK, starenje i inhibiciju angiogeneze i metastaze. 1 Međutim, otprilike 50% svih humanih karcinoma sadrže mutaciju gena TP53 , pri čemu se većina tih mutacija događa unutar domene koja veže DNA, uzrokujući oštećeno vezanje p53 na DNK. 2, 3, 4, 5 Za razliku od većine tumorskih supresorskih gena, koji su pretežno inaktivirani deletacijama ili trucizacijskim mutacijama tijekom napredovanja raka, često se utvrdi da gen TP53 kod humanih tumora prolazi kroz missense mutacije koje proizvode samo protein koji sadrži samo punoću jednostruka supstitucija aminokiselina sa znatno produženim poluživotom. 6, 7

Većina mutacija TP53 povezanih s rakom može se pripisati dvije glavne klase: kontaktima DNA i konformacijskim mutantima. Prva skupina uključuje mutacije u ostacima koji su izravno uključeni u vezanje DNK (npr. R248Q i R273H). Drugu skupinu čine mutacije koje uzrokuju lokalne (npr. R249S i G245S) ili globalne konformacijske distorzije (npr. R175H i R282W). 8, 9, 10 Biološke posljedice p53 mutacija kreću se od pukog gubitka funkcije do dobitka funkcije. Mnoge in vitro studije jasno su pokazale da neki p53 mutanti mogu steći nove funkcije i na taj način aktivno pridonijeti pokretanju, progresiji i povećanju otpornosti na konvencionalne lijekove protiv raka. 3, 10, 11, 12, 13 Zaista, miševi obrubljeni s mutiranim p53-R270H ili p53-R172H, što odgovara mutantima ljudske žarišta p53-R273H i p53-R175H, razvili su visoko metastatske tumore u usporedbi s p53-nula miševima, podupirući pojam svojstava dobitaka funkcije stečenih mutantnim p53. 14, 15, 16, 17, 18, 19

Na molekularnoj razini predloženo je nekoliko mehanizama da bi se utjecalo na povećanje funkcije mutanta p53, uključujući aktivaciju transkripcije MYC, BAG1, MDR1, NFkB2, EGR1, GEF-H1, ID4 i MAD1; 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 transkripcijske represije ATF3, CD-95, ID2, hTERT i MST1; 30, 31, 32, 33 jedinstvene interakcije sa specifičnim motivima DNK, kao što su regije za pričvršćivanje nuklearne matrice / skele; 34 epigenetske modifikacije, 35 regulacije miRNA 36, 37, 38 i interakcije s drugim proteinima (npr., P63, p73, NFY i BRD1). 39, 40, 41, 42

Prethodne studije iz naših laboratorija pokazale su da podskup mutanata dobivenih p53 mutantima posreduje u preživljavanju stanica u stanicama karcinoma dojke koje su ih izrazile. 43 Otkrili smo da ćutanje mutanta p53-R273H u stanicama MDA-MB-468 inducira masovnu apoptozu. 43 Važno je da su apoptotički učinci nakon mutacije p53 obustave neovisni o funkcijama TAp63 i TAp73. Iako su dostupni znatni dokazi koji dokumentiraju potencijalne mehanizme putem kojih p53 mutanti dereguliraju rast stanica, mehanizmi pomoću kojih mutirani p53 proteini povećavaju opstanak tumorskih stanica ostaju relativno neistraženi.

Stoga smo u ovoj studiji istražili učinke mutanata dobivenih funkcija p53 na deregulaciju staničnog preživljavanja. Otkrili smo da kontaktni mutant p53-R273, ali ne i konformacijski mutant p53-R175, potiče preživljavanje stanica karcinoma i otpornost na anoikis stanica raka. Temelj ovih aktivnosti je sposobnost p53-R273H mutanta da suzbije BMF ekspresiju na način koji je ovisan o PI3K / AKT signalnom putu. Naši rezultati pružili su, dakle, još jedan mehanizam kako mutirani p53 proteini mogu pridonijeti raznim onkogenim i pro-metastatskim signalizacijama.

Rezultati

Pripadanje endogenog mutanta p53-R273H, ali ne i R175H konformacijski mutant, izaziva apoptozu ovisnu o mitohondrijima

Da bi se odredila funkcionalna uloga p53 mutanta u stanicama ljudskog karcinoma dojke, endogeni p53 gen utišan je pomoću lentivirusne transdukcije shRNA. Kao što je prikazano na slikama 1a i c i dopunskoj slici 1, prigušivanje endogenog mutanta p53-R273H kontaktnog mutanta p53 pomoću dvije neovisne p53 specifične lentivirusne šRNA u stanicama MDA-MB-468 (dojka), HT29 (debelo crijevo) i A431 (epidermoid) izazvao masovnu apoptotsku staničnu smrt što je dokazano cijepanjem PARP-a, mrljenjem stanica i obojenjem po aneksinu V / 7-AAD. Pored toga, aktivnosti kaspaze 3, kaspaze 9 i, u manjoj mjeri, aktivnosti kaspaze 8 značajno su regulirane nakon mutacije p53-R273H propadanja u stanicama MDA-MB-468 (Slika 1d). Inhibicija aktivnosti kaspaze 9, kaspaze 3 i pan-kaspaze blokirala je apoptozu induciranu ušutkivanjem p53-R273H, dok inhibicija aktivnosti kaspaze 8 nije spasila stanice od apoptoze, sugerirajući da je indukcija apoptoze nakon iscrpljivanja p53-R273H potrebna kaspaza 9 i kaspaza 3, ali ne aktivnosti kaspaze 8 (Slika 1e). Dosljedno, iscrpljivanje endogenog p53-R273H u stanicama MDA-MB-468 također je induciralo značajnu količinu mitohondrijske depolarizacije (Slika 1f). Suprotno tome, nisu primijećeni apoptotički učinci u stanicama MCF-7 koje eksprimiraju divlji tip p53, niti u stanicama SKBR3 koje eksprimiraju konformacijski mutant p53-R175H (slika 1a i dopunska slika 1c). Ovi rezultati sugeriraju da endogeni p53-R273H kontakt mutant posreduje preživljavanju stanica karcinoma dojke potiskujući apototski put mitohondrija.

Image

Propadanje endogenog mutanta p53-R273H, ali ne i R175H konformacijski mutant, inducira apoptozu ovisnu o mitohondrijama. ( a - c ) Mutant p53-R273H potreban je za preživljavanje stanica ljudskih karcinoma dojke. Stanice su transducirane kontrolnim vektorom (vec), neciljanjem (NS) i dvije različite lentivirusne konstrukcije koje specifično ciljaju ljudski p53 (p53si-1 i p53si-2). Lizati su pripremljeni za imunobloting 72 sata nakon transdukcije. β -aktin služi kao kontrola opterećenja. Morfološke promjene uočene su 96 sati nakon lentivirusne transdukcije svjetlosnom mikroskopijom (izvorno povećavanje × 100). Smrt apoptotske stanice je određena protočnom citometrijom annexin V / 7-AAD 96 sati nakon transdukcije. ( d ) Vraćanje mutanta p53 izaziva aktivaciju kaspaze 8, 9 i 3. Aktivnosti kaspaze procijenjene su ispitivanjem CaspaseGlo u 72 h nakon transdukcije. ( e ) Iscrpljivanje mutantnog p53 u stanicama MDA-MB-468 inducira apoptozu koja zahtijeva aktivnosti kaspaze 9 i 3, ali ne kaspazu 8. Stanična smrt ovisna o kaspazi procijenjena je protočnom citometrijom aneksina V / 7-AAD u prisutnosti ili odsutnosti 20 μM inhibitora kaspaze nakon propadanja mutanta p53-R273H. ( f ) Pripadanje mutanta p53 u stanicama MDA-MB-468 inducira depolarizaciju mitohondrijske membrane. Stanice su obojene s JC-1 u 72 h nakon transdukcije p53 lentivirusne shRNA. Crvena boja označava prisustvo agregata JC-1 u netaknutim mitohondrijama. Zelena boja označava JC-1 monomere u citoplazmi. JC-1 obojene stanice analizirane su uz pomoć epifluorescentne mikroskopije (izvorno povećavanje × 100). Trake predstavljaju prosjek ± SD od tri pokusa. * označava statističku značajnost ( P <0, 05) Studentovim t- testom

Slika pune veličine

Iscrpljivanje mutantnog p53-R273H izaziva faktor koji modificira BCL2 (BMF)

Budući da se pokazalo da proteini obitelji BCL2 imaju kritičnu ulogu u apoptotičkom putu ovisnom o mitohondrijima, pretpostavljamo da mutirani p53-R273H može posredovati u preživljavanju stanica karcinoma dojke kroz regulaciju ekspresije proteina obitelji BCL-2. Da bismo testirali ovu hipotezu, istražili smo ekspresiju proteina i anti-apoptotičnih proteina obitelji BCL2 na njihovu ulogu u apoptotskom putu ovisnom o mitohondrijama. Kao što je prikazano na slici 2a i dopunskoj slici 1a, jedan od pro-apoptotskih proteina obitelji BCL2, BMF, reguliran je 48 sati nakon iscrpljivanja endogenog p53-R273H, prije apoptotskog događaja koji se dogodio u roku od 72 h (na što je ukazalo cijepanje PARP-a ). Suprotno tome, nema značajne razlike u ekspresiji drugih pro-apoptotičkih (npr. P-BAD, BAD, BAX, BID, BIM, PUMA i BOK) ili anti-apoptotičkih (npr. BCL-X L i MCL-1) BCL Promatrana su -2 člana obitelji (dopunska slika 2).

Image

Iscrpljivanje mutantnog p53-R273H inducira BMF. Srušenje mutantnog p53 inducira ( a ) BMF protein i ( b ) mRNA ekspresiju. MDA-MB-468 stanice transducirane su s p53 lentivirusnom shRNA. Ekspresiji proteina i mRNA pristupili su imunoblot i kvantitativni RT-PCR. Ekspresija BMF mRNA je normalizirana u odnosu na ljudski GAPDH. ( c ) Ektopna ekspresija BMF je dovoljna da inducira apoptozu u stanicama MDA-MB-468. Stanice su transficirane s 5 μg HAF-označenog BMF-a primjenom X-tremeGENE HP-ovog transfekcijskog reagensa kako je opisano u odjeljku Materijali i postupci. ( d - e ) Iscrpljivanje BMF-a spašava stanice MDA-MB-468 od apoptoze izazvane mutacijom p53. Lizati proteina i apoptoza analizirani su ( d ) imunoblotingom i ( e ) aneksinom V / 7-AAD protočnom citometrijom u 72 h nakon transdukcije. Trake predstavljaju prosjek ± SD od tri pokusa. * označava statističku značajnost ( P <0, 05) Studentovim t- testom

Slika pune veličine

Da bi se dalje istražilo je li došlo do ugulacije BMF-a na nivou transkripcije, proveden je RT-PCR u stvarnom vremenu kako bi se utvrdila razina ekspresije BMF mRNA u stanicama MDA-MB-468 nakon pada p53-R273H. Kao što je prikazano na slici 2b, obustava p53-R273H značajno je inducirala BMF ekspresiju mRNA za 48 i 72 h, a potkrijepila je s regulacijom razine proteina. Suprotno tome, nije opažena takva indukcija u stanicama SKBR3 koje eksprimiraju p53-R175H (podaci nisu prikazani). Značajno je da supresija BMF ekspresije mutantnim p53-R273H u stanicama karcinoma dojke neovisna o izravnom vezanju promotora, jer nije otkriven endogeni p53-R273H na promotoru BMF imunoprecipitacijom kromatina (Dopunska slika 3).

BMF je potreban za indukciju apoptoze nakon iscrpljivanja endogenog p53-R273H

Da bi se ispitalo može li sama regulacija BMF-a inducirati apoptozu, provedena je ektopična ekspresija BMF-a u stanicama MDA-MB-468 prolaznom transfekcijom. Kao što je prikazano na slici 2c, ektopična ekspresija BMF inducira značajnu količinu apoptoze, što sugerira da doista, prekomjerna ekspresija BMF može inducirati apoptozu u stanicama MDA-MB-468.

Nadalje smo istražili da li apoptoza izazvana osiromašenjem p53-R273H zahtijeva endogenu funkciju BMF. Naš rezultat pokazao je da iscrpljivanje p53-R273H inducira značajnu ugulaciju BMF-a u staničnim kontrolnim stanicama potvrđuje značajnu apoptotsku staničnu smrt (slike 2d i e i dopunska slika 4); razina apoptoze značajno je smanjena u stanicama iscrpljenim BMF-om, što sugerira da indukcija apoptoze nakon osiromašenja p53-R273H zahtijeva BMF funkciju.

Indukcija BMF senzibilizira otpuštanje BIM-a iz BCL-X L za promicanje mitohondrijske apoptoze

Razne studije su pokazale da će određeni signali oštećenja, poput gubitka vezanosti za stanicu, osloboditi BMF, dopuštajući mu da se smjesti i veže za pro-apoptotične bh3-samo proteine, BIM, izmjenjujući BC-2 ili BCL-X L za preživljavanje inducirati apoptozu. 44, 45, 46 Ovdje smo istražili može li regulacija BMF-a nakon iscrpljivanja endogenog p53-R273H u stanicama MDA-MB-468 izazvati heterodimerizaciju BCL-X L / BMF-a i poremetiti BCL-X L / BIM interakciju. Zaista su naši rezultati pokazali da se BCL-X L u normalnim uvjetima veže na BIM, ali ne i na BMF (slika 3a). Međutim, indukcijom BMF-a nakon pada p53-R273H, pronađeno je da značajna količina BMF-a veže BCL-X L, što se podudara s disocijacijom BIM-a od BCL-X L (slika 3a). Dosljedno, prekomjerna ekspresija BCL-X L potpuno je poništila apoptotičke učinke iscrpljivanja p53-R273H (Slike 3b i c). Napominjemo da nije pronađen BCL-2 u stanicama MDA-MB-468. Zajedno, ovi rezultati sugeriraju da utišavanje endogenog mutantnog p53-R273H u stanicama MDA-MB-468 inducira BMF ekspresiju i stvaranje BMF / BCL-X L kompleksa. To zauzvrat dovodi do premještanja BIM-a iz BCL-X L u indukciju apoptoze.

Image

Indukcija BMF senzibilizira otpuštanje BIM-a iz BCL-X L. ( a ) MDA-MB-468 stanice transducirane su ne-ciljanom šRNA (NS) ili p53si-1 lentivirusnom šRNA tijekom 72 h, a interakcija BMF / BCL- XL i BIM / BCL-X L otkrivena je co- imunoprecipitacijski test. Unosi za ko-imunoprecipitaciju također su podvrgnuti imunoblotskoj analizi. IgG i teški lanac (HC) korišteni su kao negativna kontrola i kontrola opterećenja. ( b - c ) Prekomjerna ekspresija BCL-X L ukinula je apoptotičke učinke mutacije p53-R273H propadanja u stanicama MDA-MB-468. Stanice su transfektirane BCL- XL ekspresijskim konstruktom i p53si-1 shRNA. Lizati proteina i apoptoza analizirani su imunoblotingom i aneksinom V / 7-AAD protočnom citometrijom u 72 h nakon ko-transfekcije. Trake predstavljaju prosjek ± SD od tri pokusa. * označava statističku značajnost ( P <0, 05) Studentovim t- testom u usporedbi s kontrolnim stanicama vektora

Slika pune veličine

Mutant p53-R273H suzbija stanične anoike

Budući da su naši rezultati pokazali da endogeni p53-R273H posreduje preživljavanju stanica karcinoma dojke putem supresije BMF-a i da je za BMF prijavljeno da posreduje u staničnim anoikisima, 44, 47, hipotetirali smo da bi p53-R273H mogao ispoljavati i onkogenu funkciju kroz suzbijanje stanični anoikis u stanicama raka. Da bismo testirali ovu hipotezu, ispitali smo osjetljivost niza staničnih linija karcinoma koje su podnosile različite mutacije p53 na anoikis. Kao što je prikazano u Tablici 1, više od 50% apoptotske ćelijske smrti zabilježeno je u staničnoj liniji raka koja eksprimira divlji tip p53 ili različite mutante (R280T, R175H, R179R, L194F i M246I) u suspenziji kulture. Suprotno tome, stanice raka koje eksprimiraju p53-R273H (MDA-MB-468, HT29 i A431) pokazuju značajnu otpornost na anoikis. Slično tome, značajna BMF mRNA i indukcija proteina također su primijećene u stanicama MCF-7 i MCF-10A (divlji tip p53) i SKBR3 (p53-R175H) na anoikis osjetljive na anoikis, dok u anoikisu nije primijećena značajna indukcija BMF-a. rezistentne stanice MDA-MB-468, HT29 i A431 u kojima se nalazi mutacija p53-R273H (slike 4a i c i dopunske slike 5a i b). Ovi rezultati sugeriraju da p53-R273H mutant može inhibirati stanične anoikise kroz suzbijanje BMF indukcije.

Tablica pune veličine

Image

Mutant p53-R273H suzbija stanične anoike. ( a - b ) Endogeni p53-R273H suzbija indukciju BMF-a u stanicama karcinoma dojke kultiviranim u suspenziji. Ukupni uzorci RNA i proteinski lizati dobiveni iz stanica uzgajanih kao priloženi monoplasti ili u suspenziji podvrgnuti su RT-PCR analizi u stvarnom vremenu i imunoblotingu. ( c ) p53-R273H koji eksprimira MDA-MB-468 stanice su inherentno rezistentne na anoikis. Sve stanice su uzgajane kao u a. Apoptoza / anoikis je određena protočnom citometrijom annexin V / 7-AAD. ( d ) Ektopna ekspresija p53-R273H, ali ne p53-R175H, suzbija indukciju BMF proteina i mRNA (dopunska slika 5c) u MCF-10A stanicama uzgojenim u suspenziji. MCF-10A p53si-3 stanice transficirane su vektorskim, p53-R175H- ili p53-R273H eksprimirajućim plazmidom. Proteinski lizati dobiveni iz stanica uzgojenih kao priloženi monoplasti (att) ili u suspenziji (susp) podvrgnuti su imunoblotingu. ( e ) Ektopna ekspresija p53-R273H daje otpornost na anoikis u MCF-10A stanicama. MCF-10A p53si-3 stanice uzgajaju se i transficiraju kao u d . Apoptoza je analizirana protočnom citometrijom annexin V / 7-AAD 48 sati nakon kulture. Bar predstavlja srednju vrijednost ± SD tri neovisna pokusa. * označava statističku značajnost ( P <0, 05) Studentovim t- testom

Slika pune veličine

Da bismo izravno potvrdili je li kontaktni mutant p53-R273H doista sposoban suzbiti BMF ekspresiju i anoikis, a ne zbog urođene otpornosti na anoikis stanica MDA-MB-468, HT29 ili A431, izveli smo eksperiment rekonstitucije gena u ne -transformisane MCF-10A stanice. Skup MCF-10A stanica stabilno transduciranih lentivirusnom p53 shRNA ciljajući endogeni 3'-UTR divljeg tipa p53 (p53si-3) je generiran praćen ektopičnom prolaznom ekspresijom p53-R175H ili p53-R273H mutanata. Razine anoikisa su zatim analizirane uzgajanjem transficiranih stanica na pločicama s kulturom tretiranim poli-HEMA-om, nakon čega je slijedila analiza protočne citometrije aneksina V / 7-AAD.

Kao što je prikazano na slici 4d, više od 80% endogene p53 ekspresije je bilo regulirano u stanicama koje stabilno eksprimiraju p53si-3 shRNA u MCF-10A stanicama. Kao što se očekivalo, odvajanje stanica izazvalo je značajnu regulaciju BMR mRNA i razine proteina u kontrolnim stanicama vektora i p53-R175H koji eksprimiraju MCF-10A (Slika 4d i Dodatna slika 5c). Suprotno tome, nije primijećena takva regulacija BMF-a u stanicama transficiranim mutantima p53-R273H, što sugerira da p53-R273H, ali ne p53-R175H, suzbija ekspresiju BMF-a u stanicama MCF-10A koje rastu u suspenziji. Dosljedno, MCF-10A stanice koje eksprimiraju p53-R273H bile su značajno otpornije na anoikis u usporedbi s stanicama koje eksprimiraju vektor ili p53-R175H ( P <0, 05, Studentov t -test) (Slika 4e). Slični rezultati opaženi su i u p53-null H1299 stanicama karcinoma pluća (dopunske slike 5d i e), što sugerira da p53-R273H kontakt mutant, ali ne i p53-R175H konformacijski mutant, daje otpornost anoikisa u ljudskim stanicama raka.

Mutant p53-R273H regulira PI3K / AKT signalni put

Kako bi se identificirao mehanizam kojim mutant p53-R273H posreduje u preživljavanju tumorskih stanica i rezistenciji na anoikis, provedeno je profiliranje mikroračuna nakon gena endogenih p53-R273H u stanicama MDA-MB-468. Ukupno 58 gena je bilo regulirano (> 1, 5 puta promjena), dok je 117 gena bilo regulirano u 72 h nakon pada p53-R273H (dopunska slika 6). Napomena, rezultati mikroračuna pokazuju da je ekspresija BMF regulirana dok je p53 mRNA smanjena nakon rušenja p53-R273H u stanicama MDA-MB-468, neovisno potvrdivši naše prethodne rezultate koji su pokazali da iscrpljivanje p53-R273H inducira BMF mRNA i ekspresiju proteina.,

Da bismo potvrdili rezultate mikroračunanja, izveli smo neovisni RT-PCR u stvarnom vremenu na većem broju gena kandidata. Zaista, ekspresija LZTFL1, POU2F3 i SOSTDC1 regulirana je na način ovisan o vremenu nakon propadanja p53-R273H u stanicama MDA-MB-468, dok su TMBIM1, ICAM1 i LIFR bili značajno regulirani, u skladu s podacima o mikroračunu (Dodatna slika 6 ).

Nakon što smo utvrdili potpis gena p53-R273H, pokušali smo identificirati izravnu molekularnu metu p53-R273H pomoću resursa Map Connectivity. 48, 49 Mapa povezivanja sastoji se od softvera za podudaranje uzorka koji uspoređuje potpis ulaznog gena s bazom podataka od 7000 izraženih profila koji predstavljaju 1309 malih molekula (nazvanih perturbagens). Ocjena povezivanja od +1 do -1 dodjeljuje se na temelju stupnja sličnosti ili različitosti između dva potpisa. 48, 49 Dakle, lijek s visokom ocjenom povezanosti i niskom P vrijednošću ima genetski potpis vrlo sličan potpisu upita i može se pretpostaviti da djeluje na put paralelno s lijekom koji je generirao potpis upita.

Analiza karte povezanosti pokazuje da su tri od prvih pet perturbagena za koje se predviđalo da dijele zajedničke putove aktivirane iscrpljivanjem p53-R273H u stanicama MDA-MB-468 bilo izravni ili indirektni inhibitori PI3K signalnog puta (tablica 2). Oni uključuju wortmannin i LY-294002, koji su PI3K inhibitori, 50 i sirolimus, mTOR inhibitor. 51 Pored toga, identificirali smo i vorinostat i trihostatin A, oba su inhibitora histon deacetilaze, kao jedan od hitova nakon pada p53-R273H. Međutim, za razliku od inhibitora PI3K, genski potpis koji je obogaćen nakon pada p53-R273H bio je obrnuto koreliran s genskim potpisima induciranim inhibitorima histon deacetilaze. Ovi nalazi doveli su nas do hipoteze da bi p53-R273H mogao pokazati svoje efekte dobivanja funkcije aktivacijom PI3K / AKT signalnog puta i / ili inhibicijom aktivnosti histon deacetilaze.

Tablica pune veličine

Iscrpljivanje p53-R273H defosforilira AKT

Za izravno testiranje ove hipoteze, provedeno je imunobloting za procjenu ekspresije fosforiliranog AKT nakon propadanja p53-R273H u stanicama MDA-MB-468.

Kao što je prikazano na slici 5a i dopunskoj slici 7a, indukcija BMF nakon iscrpljivanja endogenog p53-R273H potvrđuje redukciju AKT fosforilacije u serinu 473 i treoninu 308. Slično, ektopična ekspresija p53-R273H u MCF-10A p53si-3 ili Stanice H1299 uzrokovale su značajnu AKT fosforilaciju i supresiju BMF, dok takvi efekti nisu primijećeni u stanicama koje su transficirane p53-R175H, niti u stanicama koje su bile transficirane s vektorskom kontrolom (Slika 5b i Dodatna slika 7b).

Image

Mutant p53-R273H regulira PI3K / AKT signalni put. ( a ) Pripadanje p53-R273H u stanicama MDA-MB-468 smanjuje AKT-foforilaciju. MDA-MB-468 stanice transducirane su neciljanjem (NS) ili p53si-1 lentivirusnom shRNA, a lizati su izolirani za analizu imunoblotingom 48 i 72 h nakon transdukcije. ( b ) Ektopična ekspresija mutanta p53-R273H, ali ne p53-R175H, inducira AKT fosforilaciju. MCF-10A stanice transducirane su lentivirusnim vektorom ili p53si-3 shRNA ciljajući 3'-UTR endogenog divljeg tipa p53 nakon čega je uslijedila kratka selekcija lijeka (1 μM puromicina). Bazen p53si-3 stabilno eksprimirajuće stanice 3 transficiran je vektorom, p53-R175H ili p53-R273H, nakon čega je slijedilo imunobloting u 72 h nakon transfekcije. ( c ) Ektopna ekspresija myr-AKT suzbija BMF ekspresiju nakon propadanja p53-R273H u stanicama MDA-MB-468. ( d ) Ektopična ekspresija myr-AKT ukinula je apoptotičke učinke izazvane osiromašenjem p53-R273H u stanicama MDA-MB-468. Stanice su transficirane 72 sata s myr-AKT i p53si-1. Apoptoza je određena protočnom citometrijom annexin V / 7-AAD. Bar predstavlja srednju vrijednost ± SD tri neovisna pokusa

Slika pune veličine

Nadalje smo istražili ovisnost supresije BMF i p53-R273H posredovane BMF i opstanak stanica na aktivnost AKT. Doista, ekspresija konstitutivno aktivnog mistotiliranog AKT potpuno je ukinula indukciju BMF-a i dramatično smanjila apoptozu nakon osiromašenja p53-R273H u stanicama MDA-MB-468, HT29 i A431 (Slike 5c i d i Dodatne slike 7c i d). Zajedno, ovi rezultati pokazuju da p53-R273H mutant može regulirati PI3K i AKT signalizaciju.

Mutant p53-R273H specifično regulira ekspresiju AKT i BMF u širokom rasponu stanica raka

Da bismo utvrdili da li je učinak proživljavanja mutanta p53-R273H prisutan u drugim tipovima tumora, izveli smo propadanje gena p53 na ploči humanih staničnih linija raka koja sadrži različite mutacije p53. Kao što je prikazano na slici 6, iscrpljivanje endogenog p53-R273H u MDA-MB-468, HT29 i A431 izazvalo je značajnu količinu apoptoze i ekspresije BMF-a, u skladu s našim prethodnim opažanjima.

Image

Mutant p53-R273H regulira ekspresiju AKT i BMF u širokom rasponu stanica raka. Stanice su transducirane s p53si-1 lentivirusnom shRNA. Izolirani su proteinski lizati za imunobloting u 72 h nakon transdukcije. Napominjemo da je defosforilacija AKT potvrđena BMF indukcijom samo u stanicama koje nose p53-R273H.

Slika pune veličine

Intrigantno, iscrpljivanje endogenog p53-R280K u MDA-MB-231 i p53-R280T u stanicama CNE-1 također je smanjilo AKT fosforilaciju, ali umjesto uregulacije, otkriveno je da je ekspresija BMF značajno smanjena i nije primijećena smrt apoptotske stanice. U kontrastu, osiromašenje p53-M246I u stanicama karcinoma pluća NCI-H23 dovelo je do smanjenja BMF sa nepromijenjenim razinama fosfo-AKT. Razine fosho-AKT i BMF ostale su nepromijenjene u SKBR3 (p53-R175H), KM12 (p53-H179R), MCF-7 (divlji tip p53) ili MCF-10A (divlji tip p53) nakon endogenog p53 pada. Ovi rezultati sugeriraju da mutirani p53-R273H, ali ne i drugi mutanti, posebno reguliraju preživljavanje tumorskih stanica pomoću supresije AKT ovisne o AKT.

p53 mutant povezuje s AKT fosforilacijom u primarnim tumorima dojke

Budući da naši rezultati predviđaju da bi tumori s mutiranim p53 pokazali aktivniju PI3K / AKT signalizaciju, obojili smo mikroraščice tkiva uzoraka raka dojke kod čovjeka za p53 i usporedili to s razinama AKT fosforilacije. Koristili smo bojanje s visokim p53 kao pokazatelj prisutnosti mogućih mutacija dobitak funkcije p53 (Dopunska slika 6). U skladu s našim modelom, otkrivena je značajna pozitivna korelacija ( P <0, 001, Chi-kvadrat test) između povišene p53 bojenosti i visoke razine AKT fosforilacije (dopunska slika 8). Kolektivno, ovi rezultati sugeriraju da p53 mutanti specifično utječu na preživljavanje stanica raka i otpornost na anoikis kroz izmjenu AKT signalizacije.

Rasprava

Ova studija opisuje dobitak funkcije mutantnog p53-R273H u promicanju i staničnog preživljavanja i otpornosti na anoikis stanica raka. Temelj ovih aktivnosti je sposobnost mutantnog p53-R273H da suzbije BMF ekspresiju na način koji je ovisan o PI3K / AKT signalnom putu. Iscrpljivanje mutantnog kontaktnog mutanta p53-R273H, ali ne i p53-R175H konformacijski mutant, deregulirana AKT fosforilacija, inducirana BMF ekspresija, senzibilizirana BIM disocijacija iz BCL-X L i inducirana značajnom apoptozom ovisnom o mitohondriji u širokom rasponu raka Stanice. Važno je da je obustava BMF-a ili ektopična ekspresija mistotiliranog AKT značajno spasila apoptotičke učinke iscrpljivanja p53-R273H, sugerirajući da je indukcija BMF potrebna za smrt apoptotske stanice nakon obaranja p53-R273H. Slično tome, otkriveno je da su stanice karcinoma koje sadrže endogeni mutant p53-R273H urođeno otporne na anoikis i nedostatak indukcije BMF nakon kulture u suspenziji. Kao što je predviđeno ovim modelom, prekomjerna ekspresija p53-R273H, ali ne i p53-R175H, u p53 MCF-10A stanicama divljeg tipa učinila je stanice otpornim na anoikis i suzbila BMF indukciju. Ovi rezultati sugeriraju da mutirani p53-R273H specifično utječe na preživljavanje stanica karcinoma putem supresije BMF-a, što može doprinijeti povećanju otpornosti anoikisa tijekom metastaza. Budući da je indukcija BMF također ukinuta u myristoylated stanicama koje eksprimiraju AKT nakon propadanja p53-R273H, čini se da je indukcija BMF-a niža od AKT inhibicije.

Daljnji dokaz kliničke važnosti mutanata p53 i osi PI3K / AKT pružen je IHC obojenjem primarnih karcinoma dojke kod ljudi koji pokazuju pozitivnu povezanost između visoke ekspresije p53 (pokazatelj prisutnosti mutanta dobitak funkcije) p53) i jaka fosfo-AKT bojenja.

No treba upozoriti da učinak mutanta p53 na PI3K / AKT signalizaciju nije ograničen samo na p53-R273H mutante. Rezultati ne podrazumijevaju nužno da bi svi tumori koji imaju visoku razinu fosfo-AKT imali mutaciju p53-R273H i imali bi isti stupanj otpornosti na apoptozu i anoikis. Doista, iscrpljivanje endogenog p53-R280K u stanicama MDA-MB-231 i p53-R280T u stanicama CNE-1 dovodi do slične smanjene regulacije fosfo-AKT-a, ali je pronađeno da se BMF ekspresija značajno smanjila (umjesto da se regulira kao što je uočeno u p53-R273H -ekspresioniraju stanice) i nije zabilježena smrt apoptotske stanice. Čini se vjerovatnim da bi drugi mutanti p53 mogli surađivati ​​preko različitih mehanizama, neovisnih o BMF-u, kako bi prenijeli različite onkogene signale za promicanje agresivnosti u karcinoma čovjeka. Ovo zahtijeva daljnju istragu.

Kako točno, p53 mutanti doprinose PI3K / AKT aktivaciji ostaje otvoreno pitanje. Budući da p53 mutanti s povećanom funkcijom mogu potaknuti tumorigenezu aktiviranjem receptora faktora rasta (npr. TGF- P receptor, 52 EGFR 53, 54, 55 i MET 56, 57 ) ili promovirati recikliranje proteina povezanog proteinom koje povezuje integrin / Rab. 53 Ovi putovi signalizacije uključeni su u aktiviranje PI3K / AKT signalizacije. Stoga je primamljivo nagađati da konstitutivna aktivacija PI3K / AKT p53-R273H može biti djelomično modulirana jednim ili kombinacijom ovih mehanizama. Doista, tri stanične linije (MDA-MB-468, HT29 i A431) koje su reagirale na AK-defosforilaciju, indukciju BMF-a i apoptotsku staničnu smrt nakon ispadanja p53-R273H, izražavaju umjerene do visoke razine EGFR-a. 58 Daljnji je rad doista potreban da bismo shvatili utječe li uloga mutanta p53-R273H u regulaciji PI3K / AKT signalizacije i ekspresije BMF-a na metastatski razvoj u karcinoma čovjeka. Istraživanja koja se bave ovim aspektom također će trebati utvrditi relativni doprinos svakog funkcionalnog svojstva mutantnog p53-R273H, odnosno kontrole apoptoze, stanične migracije i invazije stanica u tumorigenezi.

Konačno, nekoliko studija je također otkrilo ulogu za TAp63, protein p53 porodice i faktor transkripcije, koji djeluje na mutantni, ali ne i divlji p53. 59, 60 Inhibiranjem TAp63, mutant p53 može regulirati proinvazivni program transkripcije koji uključuje regulaciju ekspresije Dicer, DEPDC1, Cyclin G2 i Sharp1. 52, 61 Međutim, naša otkrića sugeriraju da mutant p53-R273H može regulirati preživljavanje stanica raka i otpornost na anoikis neovisno o funkcijama TAp63 (i TAp73). 43 To je u skladu s prethodnom studijom koja pokazuje da je gubitak TAp63 manje moćan u induciranju metastaza u usporedbi s mutantnom ekspresijom p53 u mišjem modelu duktalnog adenokarcinoma gušterače, sugerirajući da mutant p53 čini više nego što inhibira TAp63. 62

Zaključno, pokazali smo da p53-R273H kontakt mutant potiskuje BMF ekspresiju na način koji je ovisan o PI3K / AKT signalnom putu radi promicanja preživljavanja stanica raka i otpornosti na anoikis. Naši rezultati, stoga, dokazuju još jedan mehanizam koji tumori mogu koristiti za promicanje metastaza, posebno u tumorima u kojima je mutant p53 jako izražen. Ovi nalazi također otvaraju mogućnost da će ciljanje PI3K / AKT signalnog puta imati terapijsku korist kod mutiranih karcinoma koji eksprimiraju p53-R273H.

Materijali i metode

Stanična kultura i konstrukti

Stanične stanice karcinoma dojke čovjeka (HCC38, MCF-7, MDA-MB-231, MDA-MB-468 i SKBR3), stanične linije karcinoma debelog crijeva (HT-29 i KM12), stanične linije karcinoma pluća (NCI-H1299 i NCI- H23), stanični vodovi epidermoidnog karcinoma (A431) i nazofaringealni karcinom (CNE1) održavani su u RPMI 1640 koji je sadržavao 10% fetalni goveđi serum, 100 IU / ml penicilina i 100 μg / ml streptomicina (Sigma-Aldrich, St Louis, MO), SAD). MCF-10A stanice uzgajane su u DMEM-F12 (Sigma-Aldrich) uz dodatak 5% konjskog seruma, 20 ng / ml EGF, 0, 5 g / ml hidrokortizona, 100 ng / ml kolerenog toksina, 10 μg / ml inzulina, 100 IU / ml penicilina i 100 µg / ml streptomicina. Sve ćelije su održavane na 37 ° C u okruženju koje je sadržavalo 5% C02. Ekspresijski konstrukti dobiveni su iz Addgenea (Cambridge, MA, SAD) i transfektirani su primjenom X-tremeGENE HP-ovog reagensa za transfekciju DNA (Roche, Indianapolis, IN, SAD) u skladu s uputama proizvođača (Dodatna tablica 1).

Proizvodnja i pretvorba leća

Konstrukcije lentivirusne šRNA kupljene su od Sigma-Aldricha. Lentiviralne zalihe visokog titra nastale su ko-transfekcijom sa ambalažnim plazmidima psPAX2 (Addgene; plazmid 12260) i plazmidi ovojnice pMD2.G (Addgene; plazmid 12259) u stanice HEK-293T kao što je prethodno opisano. 43, 63, 64, 65, 66 ShRNA ciljane sekvence za p53 i BMF prikazane su u Dodatnoj tablici 2.

Imunoblotska analiza

Lizati proteina iz stanica ekstrahirani su u ledeno puferu za lizu (0, 75% NP-40, 1 mM DTT, inhibitori fosfataze i inhibitori proteaze u PBS). Ukupni protein (50 μg) podvrgnut je SDS-PAGE nakon čega slijedi imunobloting. Pojedinosti o izvorima protutijela koja su korištena za imunobloting nalaze se u Dodatnoj tablici 3.

Analiza apoptoze i anoikisa

Kvantitacija apoptoze obojenjem Annexin V-PE / 7-AAD provedena je kao što je prethodno opisano. 43, 63 Sva analiza provedena je na protočnom citometru FACSCalibur pomoću softvera CellQuest Pro (verzija 5.1.1; BD Biosciences, San Jose, CA, USA). Za test anoikisa, stanice su postavljene na pločice s kulturom tkiva prethodno obrađene s 20 mg / ml polyHEMA (Sigma, St. Louis, MO, SAD) i analizirane na apoptozu pomoću ispitivanja Annexin V-PE.

Aktivacija kaspaze i inhibicija

Aktivnosti kaspase 3, 8 i 9 u stanicama izmjerene su na 72 h nakon transdukcije lentivirusnih šRNA pomoću CaspaseGlo kompleta (Promega, Madison, WI, USA) prema protokolu proizvođača. Za inhibiciju aktivnosti kaspaze upotrijebljen je kaspaza 3, 8, 9 ili inhibitor pan-kaspaze (Z-DEVD-FMK, Z-IETD-FMK, Z-LEHD-FMK i Z-VAD-FMK; Promega); Optimalna koncentracija svih inhibitora određena je na 20 μM. Inhibitori su dodani u stanice 24 sata nakon pretvorbe lentivirusne šRNA. Apoptoza je izmjerena Aneksin V-PE testom u 72 h.

Test depolarizacije mitohondrijske membrane

Stanice se inkubiraju s 5 µg / ml JC-1 (Merck, Darmstadt, Njemačka) u tamnom stanju 30 minuta na sobnoj temperaturi nakon čega slijedi vizualizacija fluorescentnom mikroskopom ili analizom protočne citometrije.

Kvantitativni RT-PCR

Ukupna RNA iz stanica ekstrahirana je primjenom Qiagen RNA izolacijskog kompleta (Qiagen, Valencia, CA, USA), a cDNA iz prvog lanca je sintetizirana pomoću Master Cana RNA-to-cDNA High Capacity (Applied Biosystems, Carlsbad, CA, USA) protokol proizvođača. Razine genske ekspresije mjerene su RT-PCR u stvarnom vremenu pomoću FastStart Universal SYBR Green Master reagensa (Roche) i Bio-Rad iQ5 sustava detektora u stvarnom vremenu (Bio-Rad, Richmond, CA, SAD). Analiza podataka provedena je korištenjem Bio-Rad iQ5 Optical System Software V1.0. Specifični prednji i reverzni slijed prajmera prikazani su u Dodatnoj tablici 4. Uvjeti za reakcije RT-PCR u stvarnom vremenu bili su sljedeći: 3 min na 94 ° C, a zatim 40 s na 94 ° C, 40 s na 60 ° C i 25 s na 72 ° C tokom 40 ciklusa. Podaci o ekspresiji normalizirani su protiv GAPDH ili B2M kao gena za održavanje.

Analiza mikrorasta i karte povezivanja

Eksperimenti mikrorasta izvedeni su u duplikatu u stanicama MDA-MB-468 transduciranim s p53 lentivirusnom shRNA ili s nespecifičnom kontrolom shRNA tijekom 48 h. Izolirana RNA podnesena je u certificiranu servisnu laboratoriju tvrtke Affymetrix (Origen Labs, Singapur) radi kontrole i obrade kvalitete. Sva hibridizacija izvedena je na Affymetrix Human Gene 1.0ST matrici. Analiza podataka mikroračunanja izvedena je korištenjem ekspresione konzole Affymetrix V1.1 (Santa Clara, CA, USA), analizom obogaćivanja gena (Broad Institute of Harvard i MIT, MA, USA) 67 i Connectivity Map. 48 Svi podaci o ekspresiji mikroračuna pohranjeni su u omnibusu ekspresije gena Nacionalnog centra za biotehnološke informacije (pristupni broj GEO serije: GSE65967).

primki

Omnibus ekspresije gena

  • GSE65967

Dodatna informacija

Datoteke Powerpoint

  1. 1.

    Dopunska slika 1

  2. 2.

    Dopunska slika 2

  3. 3.

    Dopunska slika 3

  4. 4.

    Dopunska slika 4

  5. 5.

    Dopunska slika 5

  6. 6.

    Dopunska slika 6

  7. 7.

    Dopunska slika 7

  8. 8.

    Dopunska slika 8

Word dokumenti

  1. 1.

    Dopunske slikovne legende

  2. 2.

    Dopunske tablice

Glosar

7-AAD

7-aminoaktinomicin D

AKT

v-akt mišjeg timoma virusnog onkogena homolog 1

ATF3

aktiviranje transkripcijskog faktora 3

B2M

beta-2-mikroglobulin

LOŠE

BCL2-agonist stanične smrti

BAG1

BCL2-atanogen

BAX

XL protein povezan sa BCL2

Bcl-2

CL-limfom B-stanica 2

BCL-X L

BCL2 nalik 1 (BCL2L1)

PONUDA

BH3 interaktivni agonist smrti domene

BIM

BCL2 nalik 11 (facilitator apoptoze) (BCL2L11)

BMF

Bcl2-modificirajući faktor

BOK

BCL2 povezanih ubojica jajnika

BRD1

bromodomena koja sadrži 1

CD-95

Receptor smrtnosti na brzoj staničnoj površini (poznat i kao FAS)

DEPDC1

DEP domena koja sadrži 1

Kockar

ljepši 1, ribonukleaza tipa III

DTT

ditiotreitol

EGF

faktor rasta epiderme

EGFR

receptor faktora rasta

Egr-1

rani odgovor rasta 1

GAPHD

gliceraldehid-3-fosfat dehidrogenaza

GEF-H1

Rho / Rac faktor izmjene nukleotida guanina (GEF) 2 (poznat i kao ARHGEF2)

Dodatne informacije nalaze se u ovom radu na web stranici Cell Death and Disease (//www.nature.com/cddis)