Myt3 supresija senzibilizira otočke stanice na staničnu smrt visoku glukozu putem indukcije bima | stanična smrt i bolest

Myt3 supresija senzibilizira otočke stanice na staničnu smrt visoku glukozu putem indukcije bima | stanična smrt i bolest

Anonim

teme

  • apoptoza
  • Stanična signalizacija
  • Dijabetes

Sažetak

Dijabetes je kronična bolest koja proizlazi iz nemogućnosti tijela da pravilno kontrolira razinu glukoze u krvi koja cirkulira. Gubitak homoeostaze glukoze može nastati gubitkom β -stanične mase zbog napada posredovanih imunološkim stanicama, kao kod dijabetesa tipa 1 i / ili zbog disfunkcije pojedinih β -ćelija (zajedno s inzulinskom rezistencijom ciljnih organa), kao kod dijabetesa tipa 2. Bolje razumijevanje transkripcijskih putova koji reguliraju preživljavanje otočnih stanica od velikog je značaja za razvoj terapijskih strategija koje ciljaju β- stanice za dijabetes. U tu svrhu, prethodno smo identificirali transkripcijski faktor Myt3 kao faktor preživljavanja u otočićima nakon akutne supresije Myt3 in vitro . Da bismo odredili učinke supresije Myt3 na preživljavanje otočnih stanica in vivo , upotrijebili smo adenovirus za izražavanje shRNA ciljanog Myt3 u sinteničnim optimalnim transplantacijama i graničnim masnim isječcima i pokazali da suzbijanje Myt3 narušava funkciju grafitata granične mase. Analiza transplantata 5 tjedana nakon transplantacije otkrila je da transplantati transducirani s sh Myt3 adenovirusom sadrže ~ 20% broja transduiranih stanica kao transplantata transduciranih kontrolnim adenovirusom. U stvari, povećana apoptoza i značajan gubitak stanica u sh Myt3- transduciranim graftima očitali su se nakon samo 5 dana, što sugerira da suzbijanje Myt3 senzibilizira otočke stanice na stresove prisutne u ranom posttransplantacijskom razdoblju. Konkretno, otkrivamo da suzbijanje Myt3 senzibilizira otočke stanice do stanične smrti uzrokovane visokom glukozom uregulacijom pro-apoptotičkog člana Bim-ove obitelji Bcl2. Ovi podaci uzeti zajedno pokazuju da Myt3 može biti važna veza između glukotoksičnih i imunoloških signalnih putova.

Glavni

Dijabetes tipa 1 (T1D) rezultat je autoimunosti koja postepeno dovodi do gubitka β- stanica i hiperglikemije. 1 Smatra se da je regrutovanje i aktiviranje auto-reaktivnih T-stanica koje ciljaju β- stanice primarni upalni proces koji pokreće bolest. 2, 3, 4 Regrutovane imunološke stanice proizvode Fas, perforin, IL-1 β , TNF α i IFN γ koji se vežu na receptore na površini β- ćelija što dovodi do aktiviranja signalnih kaskada nizvodno i izazivajući promjene u ekspresiji gena β- ćelija što rezultira indukcijom disfunkcije P- stanica i apoptozom. 5, 6, 7, 8, 9, 10 Važno je razviti strategije za zaustavljanje imunološkog napada na otočićima i spriječiti promjene uzrokovane citokinima u ekspresiji i apoptozi gena β- stanica. I dalje postoje značajne praznine u našem razumijevanju regulatornih postupaka i posrednika nizvodne citokine izazvane disfunkcije β- stanica i smrti koje je potrebno riješiti kako bi se razvili novi terapijski pristupi koji bi blokirali štetne učinke imunološkog napada tijekom napredovanja dijabetesa i transplantacija otočića.

Da bismo poboljšali razumijevanje promjena ekspresije gena izazvanih citokinima, odlučili smo se usredotočiti na faktor transkripcije mijelina 3 ( Myt3 ), također poznat kao supresor tumorske sposobnosti 18 ( St18 ), faktor transkripcije cink-prsta tipa C2HC koji je izrazito izražen u otočići gušterače. 11 Prije smo utvrdili da izloženost otočića IL-1 β , TNF α i IFN γ suzbija ekspresiju Myt3 na način koncentracije i vremena. Nadalje smo pokazali da suzbijanje Myt3 na otocima ex vivo , u trajanju od samo 48 h, dovodi do povećane smrti otočnih stanica. 12 Ovi podaci sugeriraju da Myt3 može sudjelovati u razvoju dijabetesa niz imunološki napad. Ovdje smo, kako bismo odredili ulogu Myt3 u funkciji otočića i preživljavanju in vivo , izveli optimalne transplantacije singenih otočića marginalne mase i procijenili homeostazu glukoze i histologiju grafta. Pretpostavili smo da bi u ovom modelu suzbijanje Myt3 izazvalo apoptozu otočnih stanica, podupirući našu hipotezu da je Myt3 ključni regulator preživljavanja otočnih stanica.

Rezultati

Suzbijanje Myt3 smanjuje graničnu, ali ne i optimalnu funkciju transplantata sinđeoskih otočića

Da bismo potvrdili korisnost sinenetskih graftiranih otočića kao modela kojim se proučavaju in vivo efekti supresije Myt3 , prvo smo izradili ženke dijabetesa C57 / B6N dijabetesom liječenjem streptozotocinom (STZ), a potom ih presadili optimalnom (300) masom otočića i procjenjena ekspresija Myt3 u presadnicama tijekom 5 tjedana. Ekspresija Myt3 tijekom ovog vremenskog okvira čini se da se u graftovima održava na sličnoj razini kao i kod odraslih otočića, što ukazuje da je ovo prikladan model za proučavanje učinaka suzbijanja Myt3 na preživljavanje i funkciju transplantata (Dopunska slika S1). Kao takvi, transplantirali smo STZ-dijabetične miševe, kao gore, bilo s optimalnom (300) ili graničnom (150) masom otočića transduciranih adenovirusima koji izražavaju shRNA ciljajući Myt3 (sh Myt3 ) ili kontroliranjem (sh Scramble ). Praćenje nasumično hranjenih razina glukoze u krvi kod miševa koji su primili optimalne transplantate pokazalo je da su i sh Scramble i sh Myt3- prevedeni transplantati jednako sposobni normalizirati razinu glukoze u krvi (slike 1a i b). Nadalje, nije bilo razlike u sposobnosti sh Scramble ili sh Myt3 grafta da odgovore na izazov glukozi kako je određeno provođenjem testova intraperitonealne tolerancije na glukozu (IPGTT) 5 dana ili 5 tjedana nakon transplantacije (dopunske slike S2a-f).

Image

Suzbijanje Myt3 smanjuje graničnu, ali ne i optimalnu funkciju transplantata otočića. ( a ) Nasumično hranjena mjerenja glukoze u krvi za miševe koji su presađeni s optimalnom masom (300 otočića) sh Scramble - ili sh Myt3- transduciranih otočića. Rezultati su prikazani kao srednja vrijednost ± SEM od sedam neovisnih pokusa. ( b ) Područje ispod krivulje za mjerenje glukoze u krvi od prvog do 35 dana nakon optimalne transplantacije. Rezultati su prikazani kao srednja vrijednost ± SEM od sedam neovisnih pokusa. ( c ) Slučajno hranjena mjerenja glukoze u krvi za miševe koji su presađeni s marginalnom masom (150 otočića) sh Scramble - ili sh Myt3- transduciranim otočića. Rezultati su prikazani kao prosjek ± SEM pet neovisnih pokusa. * P <0, 05, ** P <0, 01, *** P <0, 001 uspoređujući miševe koji su primali transplantate koristeći sh Myt3- transducirane otočiće s miševima koji su primali graftove pomoću sh Scramble - transduciranih otočića (dvosmjerni ANOVA). ( d ) Područje ispod krivulje za mjerenje glukoze u krvi od 1. do 35. post-suboptimalne transplantacije. Rezultati su prikazani kao prosjek ± SEM pet neovisnih pokusa. *** P <0, 001 uspoređujući miševe koji su primali transplantate koristeći sh Myt3- transducirane otočiće i miševe koji su primali grafte koristeći sh Scramble - transducirane otočiće (neparni t- test). ( e ) Kaplanova-Mejerova krivulja preživljavanja uspoređujući vrijeme za povratak u normoglikemiju za miševe koji su primali transplantacije marginalne mase sh Scramble - ili sh Myt3- transduciranih otočića. Miševi su smatrani nedijabetičnim nakon dva uzastopna mjerenja glukoze u krvi <12 mM

Slika pune veličine

S druge strane, miševi koji su transplantirani s marginalnom masom otočića koji su preneseni od Myt3 imali su značajno više razine glukoze u krvi od 7. do 21. dana nakon transplantacije ( P <0, 05), u usporedbi s miševima koji su presađeni s Shbrable-transduciranih otočića (Slike 1c i d). Nakon 21. dana, miševi koji su transplantirani s otočićima koji se prenose sh Myt3 počeli su se normalizirati, ali su i dalje skloni višim razinama glukoze u krvi i imali su znatno odgođeno vrijeme za ponovno uspostavljanje normoglikemije ( P <0, 01; dva mjerenja glukoze u krvi ispod 12 mM) ( Slika 1e). U 5 tjedana nakon transplantacije, miševi koji su primali otoke transkribirane Myt3 također su bili umjereno manje sposobni odgovoriti na izazov glukozi, ali ni sh Scramble i sh Myt3 transplantati nisu bili u mogućnosti ponovno stabilizirati razinu glukoze u krvi u vremenskom okviru IPGTT-a., a ta razlika nije bila značajna (dopunske slike S2g – i). Uzeto zajedno, ovi podaci sugeriraju da, iako kod miševa koji su transplantirani s optimalnom masom Sh Myt3- transduciranih otočića, ostaje dovoljno p -stanične mase za normalizaciju razine u krvi, kod transplantacija rubnih masa potiskivanje Myt3 smanjuje sposobnost grafta da uspostave normoglikemiju.

Suzbijanje Myt3 povećava smrt stanica kod transplantacija syngeneic otočića

Da bismo utvrdili da li je sutina Myt3 uzrokovana gubitkom stanica u graftovima otočića, izveli smo imunohistokemiju na transplantatima sakupljenim iz optimalnih transplantacija mase otočića, da se usredotočimo na izravne učinke Myt3 na gubitak β- stanica, u nedostatku ER-stresa i drugih zbunjujućih čimbenika može se pojaviti kod transplantacija rubnih masa. FACS analiza transduciranih otočića prije transplantacije, na temelju GFP-a (koji je koeksprimiran sa shRNA), pokazala je transdukcijsku učinkovitost od 35–40% i za sh Myt3 i sh Scramble adenovirus (dodatne slike S3a i b). Analiza transplantata 5 dana nakon transplantacije pokazala je da sh Scramble- transducirani transplantati još uvijek sadrže oko 40% transduciranih stanica, dok sh Myt3- transducirani graftovi sadrže samo ~ 25% transduciranih stanica ( P <0, 05) (Slike 2a i c). Suprotno tome, kultura s Scramble - ili sh Myt3- transduciranih otočića in vitro tijekom 5 dana na izvanstaničnoj matrici 804G nije utjecala na broj otočića koji su pozitivni na GFP (dopunske slike S3c i d), niti značajno povećala razinu apoptoze ( Dopunske slike S3e i f). U međuvremenu, kvantifikacija površine GFP-a u presadnicama 5 tjedana nakon transplantacije pokazala je da sh Myt3 transplantati sadrže samo 2–3% GFP-pozitivnih stanica, pet puta manje od broja pronađenog u Scramble transplantatima (13%; P <0, 001) ( Slike 2b i c). S obzirom da se činilo da je gubitak stanica najbrži u ranom periodu usađivanja (gotovo 40% sht Myt3- prevedenih stanica je izgubljeno u prvih 5 dana nakon transplantacije), procijenili smo broj cijepljenih stanica kaspaza-3-pozitivnih 5 dana nakon transplantacije. U ovom trenutku, sh Scramble- transducirani transplantati sadržavali su samo nekoliko cijepljenih stanica kaspaza-3-pozitivnih (~ 1, 7%), dok sh Myt3- transducirani graftovi sadrže tri puta više cijepljenih stanica kaspaza-3-pozitivnih (~ 5, 3%) ( Slike 2d i e), što ukazuje da je supresija Myt3 u ovom trenutku značajno povećala razinu apoptoze u graftovima ( P <0, 05).

Image

Gubitak sh Myt3- transduciranih stanica nastaje u roku od 5 dana od transplantacije. sh Scramble - i sh Myt3-transducirani otočići otočića ( a ) 5 dana ili ( b ) 5 tjedana nakon transplantacije obojeni su inzulinom (crveno) i GFP (zeleno) kako bi označili transducirane stanice. Nuklei su označeni sa Topro3 (plava). Bijela isprekidana linija predstavlja granicu grafta. Glave žute strelice pokazuju reprezentativne stanice inzulina i GFP. Ljestvice: bijela traka = 75µm. ( c ) Kvantifikacija površine GFP-a u sh Scramble - i sh Myt3- transduciranim otočićima prije transplantacije, 5 dana i 5 tjedana nakon transplantacije. Rezultati su prikazani kao prosjek ± SEM tri neovisna pokusa. * P <0, 05, *** P <0, 001 uspoređujući transplantate pomoću sh Myt3- transduciranih otočića naspram transplantata pomoću sh Scramble -transduiranih otočića (neparni t -test). ( d ) Grafti su obojeni inzulinom (crveno) i cijepljenom kaspazom-3 ​​(zeleno). Nuklei su označeni sa Topro3 (plava). Bijela isprekidana linija predstavlja granicu grafta. Glave žute strelice označavaju reprezentativni inzulin i cijepljene supozitivne stanice kaspaze-3. Ljestvice: bijela traka = 25 μ m. ( e ) Kvantifikacija postotka cijepljenih stanica obojenih zbog cijepljene kaspaze-3. Rezultati su prikazani kao prosjek ± SEM tri neovisna pokusa. * P <0, 05 uspoređujući transplantate pomoću sh Myt3- transduciranih otočića naspram transplantata pomoću sh Scramble -transduiranih otočića (neparni t- test)

Slika pune veličine

Učinkovitost transdukcije 35 -40% otočnih stanica koju smo postigli vjerovatno objašnjava zašto nije primijećena opažena disfunkcija transplantata kod miševa koji su dobivali optimalnu masu od otočića pretočenih u Myt3 . Doista, kvantifikacija broja α - i β- ćelija u tim transplantatima tijekom 5 dana (slike 3a i b) i 5 tjedana (slike 3c i d) nakon transplantacije ukazuje da ostaje dovoljan broj α - i β- stanica. za održavanje normoglikemije unatoč selektivnom gubitku otočića stanica Myt3- transduciranih. Bez obzira na to, činjenica da je suzbijanje Myt3 značajno povećalo razinu apoptoze u sh Myt3- transduciranim graftovima nakon samo 5 dana, ali nije značajno povećalo apoptozu otočnih stanica u istom vremenskom okviru in vitro , sugerira da suzbijanje Myt3 senzibilizira otočke stanice da podliježu apoptoza kao odgovor na stresove s kojima su suočeni posebno unutar cijepljenja.

Image

sht Myt3- prevedene stanice gube se od transplantata bez mijenjanja sastava transplantata. ( a ) sh Scramble - i sh Myt3- transducirani transplantati otočića 5 dana nakon transplantacije obojeni su na inzulin (crveni) i glukagon (zeleni) kako bi se označile transducirane stanice. Nuklei su označeni sa Topro3 (plava). Bijele isprekidane linije predstavljaju granice cijepljenja. Ljestvice: bijela traka = 75 μ m. ( b ) Kvantifikacija površine inzulina i glukagona u ( a ). Rezultati su prikazani kao prosjek ± SEM tri neovisna pokusa. ( c ) sh Scramble - i sh Myt3-transducirani grafiti otočića obojeni su inzulinom (crveno) i glukagonom (zeleno) 5 tjedana nakon transplantacije. Nuklei su označeni sa Topro3 (plava). Bijele isprekidane linije predstavljaju granice cijepljenja. Ljestvice: bijela traka = 75 μ m. ( d ) Kvantifikacija površine inzulina i glukagona u ( c ). Rezultati su prikazani kao prosjek ± SEM tri neovisna pokusa

Slika pune veličine

Suzbijanje Myt3 povećava ekspresiju hemokina, ali ne i imunološku infiltraciju

Citokini koje proizvode imunološke stanice koje infiltriraju otočić induciraju ekspresiju proupalnih hemokina i citokina u P- stanicama koje djeluju na regrutovanje dodatnih imunoloških stanica, pridonoseći disfunkciji β- stanica i apoptozi. 2, 3, 4, 6, 7, 8, 13, 14, 15, 16, 17, 18 Analiza naših prethodno generiranih podataka RNA- sekvence 19 pokazala je da supresija Myt3 inducira ekspresiju nekoliko hemokina, uključujući Ccl2, Cxcl10 i Ccl20 (Dodatna slika S4a), i na taj način smo pokušali utvrditi značaj ove povećane ekspresije hemokina za sh Myt3- transducirani gubitak otočnih stanica u našim presadima. Kvantitativno potvrđivanje lančane reakcije polimeraze u stvarnom vremenu (qPCR) pokazalo je da je 2, 4-puta ( P <0, 001) smanjenje ekspresije Myt3 rezultiralo značajnim porastom ekspresije Ccl2 (3, 7 puta, P 0, 05) , Cxcl10 (7, 7- pregib, P  0, 05) i Ccl20 (8, 3 puta, P  0, 05) (dopunska slika S4b). Da bi se utvrdilo je li protuupalna ekspresija hemokina uzrokovana sh Myt3 dovoljnom da se pokrene regrutovanje imunoloških stanica, grafti otočića imunološki su obojeni za marker paneimunitetnih stanica CD45 i tokom 5 dana i 5 tjedana nakon transplantacije. Međutim, kvantificiranje infiltracije imunoloških stanica u graftima pokazalo je da je infiltracija zanemariva i ekvivalentna između sh Scramble i sh Myt3- transduciranih otočića (dopunska slika S4c). Ovi podaci sugeriraju da je razina proizvodnje hemokina izazvana supresijom Myt3 nedovoljna za pokretanje dodatnog regrutovanja imunoloških stanica na sindromom sindroma otočića.

Suzbijanje Myt3 senzibilizira otočke stanice na metabolički stres uzrokovan staničnom smrću

S obzirom da je supresija Myt3 uzrokovala značajnu razinu gubitka otočnih stanica tijekom vremenskog okvira u kojem dolazi do uklještenja , dalje smo pokušali utvrditi da li je otočiće senzitiziranih otočnih stanica za supresiju Myt3 da podliježu staničnoj smrti kao odgovor na stres koji je doživio tijekom ovog procesa. 20, 21 Naime, tijekom ugrađivanja, transplantacije otočića izložene su značajnom metaboličkom stresu, uključujući hipoksiju i lišavanje hranjivih tvari prije revaskularizacije, hiperglikemiju nakon početne revaskularizacije, kao i oksidativni stres i stres uzrokovan izlaganjem citokinima proizvedenim od imunoloških stanica koje su regrutovane u mjesto cijepljenja. 21, 22, 23, 24, 25 Prethodno smo utvrdili da izloženost citokinima suzbija Myt3, 12 pa smo u početku pokušali utvrditi učinak tih dodatnih staničnih naprezanja na Myt3 ekspresiju. Za to smo stanice otoka izložili citokinima (0, 4 ng / ml IFN γ , 0, 07 ng / ml IL-1 β i 0, 04 ng / ml TNF α ), visokoj glukozi (30 mM glukoze), niskoj glukozi (2, 8 mM glukoze), hipoksiji (1% O2) ili lišavanje hranjivih sastojaka (oduzimanje seruma). Ovo potvrđuje da je ekspresija Myt3 inhibirana izloženošću citokinima (1, 9 puta, P <0, 01) i pokazala je da hipoksija (2, 2 puta, P <0, 01) i niska glukoza (2, 9 puta, P <0, 01) slično inhibiraju Myt3 (Slika 4a ). Da bismo utvrdili da li supresija Myt3 senzibilizira otočke stanice na ove napone, transducirali smo dispergirane otočne stanice uzgajane na 804G s našim sh Myt3 i sh Scramble adenovirusima i nakon toga izložili stanice svakom od staničnih stresora i pratili staničnu smrt (ugradnjom PI). Izloženost Sh Myt3-transduciranih otočkih stanica visokoj glukozi u trajanju od 48 h povećao je broj PI-pozitivnih stanica za 3, 4 puta ( P <0, 001) u usporedbi sa stanicama koje su pretvorene u kontrolu klika (Slika 4b) i 22, 5 puta ( P <0, 001) u usporedbi sa sh Myt3- transduciranim otočićima u normalnim glukoznim uvjetima. Suzbijanje Myt3 , međutim, nije značajno utjecalo na razinu ćelijske smrti izazvane bilo kojim drugim stresorima. Ovi rezultati pokazuju da suzbijanje Myt3 senzibilizira otočke stanice do stanične smrti uzrokovane visokom glukozom.

Image

Suzbijanje Myt3 senzibilizira otočne stanice na staničnu smrt visoku glukozu. ( a ) Ekspresija Myt3 određena je qPCR-om nakon izlaganja bilo 11 mM glukozi (kontrola), 0, 4 ng / ml IFN y , 0, 07 ng / ml IL-1 β i 0, 04 ng / ml TNF α (citokin), visokoj glukozi (30 mM glukoza), niska glukoza (2, 8 mM glukoze), hipoksija (1% O2) ili gladovanje u serumu (bez FBS). Rezultati su prikazani kao srednja vrijednost ± SEM za četiri neovisna pokusa. * P <0, 05, ** P <0, 01 uspoređujući stanice otočića izložene navedenim tretmanima u usporedbi s 11 mM glukozom (kontrola) (jednosmjerna ANOVA). ( b ) Stanična smrt mjerena je ugradnjom propidijum-jodida u disperziranim otočićima transduciranim s sh Scramble ili sh Myt3 adenovirusima koji su bili izloženi ili 11 mM glukozi (kontrola), 0, 4 ng / ml IFN γ , 0, 07 ng / ml IL-1 β i 0, 04 ng / ml TNF α (citokin), visoka glukoza (30 mM glukoze), niska glukoza (2, 8 mM glukoze), hipoksija (1% O2) ili gladovanje u serumu (bez FBS). Rezultati su prikazani kao prosjek ± SEM pet neovisnih pokusa. *** P <0, 001 uspoređujući naznačene trake (dvosmjerna ANOVA)

Slika pune veličine

Budući da je otočenje stanica Myt3 osjetljivo na otočiće specifično na stanicu uzrokovanu visokom glukozom, utvrdili smo da li supresija Myt3 pogoršava ekspresije gena pro-apoptotika, ER- ili oksidativno-stresa povezane s hiperglikemijom. Supresija Myt3 rezultirala je 1, 7-puta povećanjem ( P <0, 01) ekspresije Bim -a izazvane visokom glukozom u usporedbi s kontrolama tretiranim sh Scrambleom , ali je malo utjecala na ekspresiju drugih pro-apoptotičkih gena, ili gena izazvanih ER- ili oksidativni stres (slike 5a-d). Nadalje, razine C / EBP homolognog proteina (CHOP), ili fosforiliranog eukariotskog faktora inicijacije-2 (eIF2 α ), također su bile nepromijenjene, što implicira da suzbijanje Myt3 ne utječe na hiperglikemiju uzrokovanu ER stresom u ovom kontekstu (slike 5e-g).

Image

Supresija Myt3 povećava Bim-induciranu Bim ekspresiju u otočićima. qPCR analiza ( a ) ekspresije Myt3 , ( b ) gena pro- i anti-apoptoptičke Bcl porodice i ( c ) ER stresa ili ( d ) gena izazvanih oksidativnim stresom, u sh Scramble - ili sh Myt3- transduciranim otočićima pod normalnim stanja glukoze (NG) ili visoke glukoze (HG). ( e ) CHOP i ( g ) fosforilirani eIF2 α u odnosu na ukupne razine eIF2α proteina određene su Western blotom u sh Scramble - ili sh Myt3- transduciranim otočićima u uvjetima NG ili HG. ( f ) Kvantifikacija proteina CHOP kao dio Gapdh proteina u ( c ). Rezultati su prikazani kao prosjek ± SEM tri neovisna pokusa. ( h ) Kvantifikacija fosforiliranog eIF2 α kao dijela ukupne razine proteina eIF2 α u ( g ). Rezultati su prikazani kao prosjek ± SEM tri neovisna pokusa

Slika pune veličine

Ovi rezultati sugeriraju da suzbijanje Myt3 može posebno osjetiti stanice otočića na staničnu smrt visoku glukozu putem Bim-a. U prilog tome, supresija Myt3 rezultirala je približno peterostrukim porastom ( P <0, 001) razine Bim proteina (slike 6a i b) u stanicama tretiranim visokom glukozom. Zatim smo izmjerili smrt otočnih stanica u sh Myt3- transduciranim stanicama izloženim visokoj glukozi i ko-transducirali lentivirusom koji eksprimira shRNA ciljajući Bim , što je rezultiralo petostrukim smanjenjem Bim ekspresije (Slika 6c) . Suzbijanje bima u suštini je poništilo porast sh Myt3 - transducirane apoptoze otočnih stanica kao odgovor na visoku glukozu, u usporedbi sa sh Scramble- transduciranim kontrolama (Slika 6d). Ovi podaci pokazuju da izlaganje otočnih stanica, u kojima je Myt3 potisnut, visokim glukozama rezultira Bim uregulacijom, uzrokujući neravnotežu pro-apoptotičkih i pro-preživljavajućih članova Bcl2 obitelji što rezultira smrću otočnih stanica.

Image

Suzbijanje Myt3 senzibilizira otočne stanice na visoku razinu glukoze uzrokovanu staničnom smrću uregulacijom Bima . ( a ) Bim protein određen je zapadnim mrljama u sh Scramble - ili sh Myt3- transduciranim otočićima u normalnim uvjetima glukoze (NG) ili visoke glukoze (HG). ( b ) Kvantifikacija Bim proteina kao frakcije Gapdh proteina iz ( a ). Rezultati su prikazani kao prosjek ± SEM tri neovisna pokusa. * P <0, 05, ** P <0, 01, *** P <0, 001 uspoređujući označene trake (dvosmjerna ANOVA). ( c ) qPCR analiza Bim ekspresije u disperziranim staničnim otočićima transduciranim s sh Scramble (L-shScram) ili sh Bim (L-shBim) ekspresijom lentivirusa. Rezultati su prikazani kao srednja vrijednost ± SEM za četiri neovisna pokusa. *** P <0, 001 uspoređujući L-shScram s L-shBim transduciranim stanicama (nespareni t -test). ( d ) Stanična smrt je određena ugradnjom propidijum-jodida u disperziranim stanicama otoka ko-transduciranim s lentivirusnim Sh Scramble (L-shScram) ili sh Bim (L-shBim), i adenovirusnim Sh Scramble (Ad-shScram) ili sh Myt3 (Ad -shMyt3), u uvjetima visoke glukoze. Rezultati su prikazani kao srednja vrijednost ± SEM za četiri neovisna pokusa. *** P <0, 001 uspoređujući naznačene trake (dvosmjerna ANOVA)

Slika pune veličine

Rasprava

Tijekom progresije dijabetesa izloženost β- ćelija citokinima proizvedenim infiltracijom imunoloških stanica aktivira proupalnu signalnu kaskadu što u konačnici dovodi do pojačanja upalnih signala i pokretanja apoptoze. 2, 3, 4, 6, 7, 8, 13, 14, 15, 16, 17 Prethodno smo pokazali da je faktor transkripcije Myt3 jedan od nizvodnih meta IL-1 β , TNF α i IFN y signalizacije u β - stanice i da je njegova supresija dovoljna da inducira dvostruko povećanje apoptoze kada se otočne stanice uzgajaju in vitro , bez utjecaja na funkciju otočića. 12 Međutim, ove su analize provedene u vrlo kratkom razdoblju (~ 48 h), u nedostatku izvanćelijske matrice, i nisu dale uvid u dugoročne učinke suzbijanja Myt3 na funkciju otočića i preživljavanje in vivo . U trenutnom radu pokušali smo riješiti taj deficit pomoću modela transplantacije syngeneskih otočića kako bismo ispitali učinke suzbijanja Myt3 na preživljavanje i funkciju transplantata.

Dokazano je da, premda ni tjelesna težina ni homoeostaza glukoze u krvi nisu značajno utjecali na miševe koji su transplantirani s optimalnom masom otočića transdruženih sht Myt3 , kod transplantacija rubne mase suzbijanje Myt3 znatno odgađa vrijeme potrebno da primateljima transplantata ponovno uspostave normoglikemiju. Nadalje, kod optimalnih masnih transplantacija, 5 tjedana nakon transplantacije samo 2–3% stanica preostalih u transplantiranim otočićima Myt3 bile su Myt3- transducirane stanice. Iako je u izvjesnom trenutku zabilježen i gubitak GFP ekspresije u sh Scramble- transduciranim otočićima, s obzirom na to da je naša početna učinkovitost transdukcije bila ~ 40%, a prisutnost pet puta manje GFP-pozitivnih stanica u sh Myt3 transplantatima nego u sh Scramble transplantata, ova niska učestalost sh Myt3- transduciranih stanica u graftovima u ovom trenutku sugerira da je većina sh Myt3- transduciranih stanica prošla staničnu smrt. U prilog tome, suzbijanje Myt3 značajno je povećalo razinu apoptoze u optimalnim masnim presadima nakon samo 5 dana, a gubitak transduciranih stanica već je bio očit u ovom trenutku. Važno je da suzbijanje Myt3 nije imalo značajnog utjecaja na smrt otočnih stanica u stanicama otočića koje su uzgajane in vitro na izvanstaničnom matriksu 804G u isto toliko vremena. Ovi podaci sugeriraju da supresija Myt3 senzibilizira otočne stanice da podliježu apoptozi kao odgovor na stresove s kojima se suočavaju unutar otoka.

Supresija Myt3 u otočićima in vitro dovodi do regulacije nekoliko hemokina, vjerovatno putem Myt3 supresije posredno ili direktno dopuštajući njihovu derepresiju , s obzirom na to da smrt otočnih stanica nije značajno povećana supresijom Myt3 u tim uvjetima. Kako su hemokini izazvani supresijom Myt3 sposobni regrutirati imunološke stanice, pretpostavili smo da njihova ekspresija može pridonijeti gubitku otočnih stanica nakon transplantacije. 2, 3, 4, 6, 7, 8, 13, 14, 15, 16, 17 Međutim, čini se da je razina indukcije ovih hemokina nedovoljna za pokretanje rekrutacije dodatnih imunoloških stanica na transplantate, sugerirajući da su alternativni mehanizmi vjerovatno odgovorna za povećanu staničnu smrt koja se opaža u sh Myt3- transduciranim graftovima otočića.

Transplantacije otočića izložene su značajnoj razini staničnog stresa tijekom procesa urezivanja. 21 Povećana stanična smrt zabilježena tijekom prvih 5 dana nakon transplantacije na našem modelu podrazumijevala je ove stanične naprezanja kao potencijalni modifikator smrti otoka-stanica uzrokovanih sh Myt3 . U stvari, analiza različitih staničnih stresora pokazala je da je supresija Myt3 značajno povećala smrt otočića. U kontekstu transplantacije, ovo sugerira da gubitak Myt3 potiče staničnu smrt kad su otočani izloženi visokim cirkulacijskim koncentracijama glukoze u krvi neposredno nakon transplantacije. Supresija Myt3 nije dodatno senzibilizirala otočke stanice na smrt stanica uzrokovanih citokinima, niskom glukozom ili hipoksijom, vjerojatno zato što ti stresori već smanjuju Myt3 ekspresiju. Nadalje pokazujemo da osjetljivost otočnih stanica na staničnu smrt visoku glukozu nakon Myt3 supresije ovisi o indukciji pro-apoptotičkog Bcl2 člana porodice Bim. Indukcija bima slično je kritična za smrt otočnih stanica kao odgovor na nedostatak Pdx1 i IRS2 i kao odgovor na glukotoksičnost. 26, 27, 28

Izloženost β- ćelija upalnim citokinima može pogoršati učinke glukotoksičnosti; međutim, kako se ta „glukocitotoksičnost“ pojavljuje nije dobro okarakterizirana. 29, 30, 31 Naši prethodni podaci pokazuju da supresija Myt3 pomoću upalnih citokina igra značajnu ulogu u citokin-induciranoj β -staničnoj apoptozi, dok naši podaci ovdje ukazuju da supresija Myt3 senzitizira β- stanice na staničnu smrt visoku glukozu. Zajedno, ovi podaci sugeriraju da Myt3 može djelovati kao posrednik upale i glukotoksične signalizacije, presvlačenje Myt3 , uzrokovano upalnom signalizacijom, kao što se može pojaviti kod T1D i T2D, senzibiliziranje β- stanica za podmirenje stanične smrti kao odgovor na hiperglikemijske epizode putem omogućujući prijevremenu Bim aktivaciju. Vjerujemo da budući napori trebaju biti usmjereni na otkrivanje mehanizama koji stoje na osnovi učinaka supresije Myt3 na apoptozu P- stanica i utvrđivanje može li održavanje razine Myt3 smanjiti smrt i disfunkciju stanica.

Materijali i metode

Održavanje i rukovanje mišima

Miševi su održavani u skladu sa smjernicama Kanadskog vijeća za njegu životinja koristeći protokole koje je odobrio UBC Odbor za njegu životinja. Miševi su smješteni u grupnom okruženju do pet miševa po kavezu uz dnevne zdravstvene preglede i održavanje kaveza koje su obavljali članovi osoblja ustanove za životinje. U našoj koloniji miševi su održavani u 12-satnom ciklusu svijetlo / tamno, hranili su se standardnom dijetom s niskim udjelom masti (LabDiet, St. Louis, MO, USA) ad libitum i njihovo se okruženje obogaćivalo primjenom suncokretovih sjemenki i skrovišta. Miševi su bili smješteni u ovom okruženju sve dok nije bilo potrebno za eksperimente. U svim studijama korišteni su miševi C57 / B6N (u dobi od 8-12 tjedana).

Miševi koji su korišteni u postupcima neživljavanja bili su anestezirani pomoću inhalacije izofluorana nakon čega je slijedila dislokacija grlića maternice. Refleks uboda prstiju provjeren je prije dislokacije grlića maternice kako bi se osiguralo da su životinje na kirurškoj ravnini anestezije.

Izolacija otoka i kultura

Pancreata od 8 do 12 tjedana starih miševa bila je perfuzirana s 1000 U / ml kolagenaze XI (Sigma-Aldrich, Oakville, ON, Kanada) i inkubirana je 15 minuta na 37 ° C. Pancreata je ručno prekinuta i propuštena kroz filtar od 70 µM (Corning, New York, NY, USA), a otočići su odabrani ručno. Otoci su uzgojeni u RPMI 1640 (11 mM glukoze) uz dodatak 10% FBS, 50 U / ml penicilina / streptomicina i 2 mM 1-glutamina na 37 ° u 5% CO2 vlažnom inkubatoru. Svi reagensi za kulturu tkiva kupljeni su od tvrtke ThermoFisher (Burlington, ON, Kanada). Otoci su transducirani s Scramble ili sh Myt3 adenovirusima kao što je prethodno napravljeno 12 i uzgajali 48 sati prije transplantacije.

Transplantacija otoka

Miševima primateljima transplantacije dijabetes je postavljen ubrizgavanjem 230 mg / kg streptozotocina (Sigma-Aldrich) u intraperitonealni prostor. Svakodnevno smo pratili ove životinje radi otkrivanja znakova bolesti i mjerili glukozu u krvi pomoću mjerača za testiranje glukoze One Touch Ultra (LifeScan Canada Ltd, Burnaby, BC, Kanada) za utvrđivanje indukcije hiperglikemije. Nakon razvoja dijabetesa izazvanog streptozotocinom, kod ovih miševa presađeni su pod bubrežnu kapsulu sa 300 otočića za optimalne masovne transplantacije ili 150 otočića za transplantaciju rubnih masa. Sat vremena prije operacije, miševi su primili supkutanu injekciju kombinacije meloksikama (1 mg / kg) i buprenorfina (0, 1 mg / kg). Miševi su anestezirani za operaciju s izofluoranom (2% u protoku kisika od 2 l / min), a kirurška ravnina anastezije određena je refleksom prsta. Napravljen je mali nadimak u bubrežnoj kapsuli i otočići su polako ubrizgani ispod kapsule. Reznice su ušivene zatvorene i miševima je ostavljeno da se oporave od anestetika prije nego što su vraćeni u svoje kaveze. 32

Testovi za toleranciju na glukozu

In vivo funkcija otočića ocijenjena je testom tolerancije intraperitonealne glukoze (IPGTT). Miševi su postivani 6 sati i ubrizgavali su 1 g / kg D50 glukoze (Sigma-Aldrich), a izmjerena glukoza u krvi u 0, 15, 30, 60 i 120 min.

imunohistokemija

Imunohistokemija izvedena je na parafinskim dijelovima otočića ugrađenih ispod bubrežne kapsule. Odjeci su obojeni kozjim anti-glukagonom (1: 500; Santa Cruz, Dallas, TX, SAD), antiinzulinom zamorca (1: 500; Linco, St. Charles, MO, SAD), zečjim anti-GFP (1 : 1000; MBL, Woburn, MA, SAD) i zečje anti-cijepljene kaspaze-3 (1: 500; Santa Cruz). Primarna antitijela detektirana su korištenjem magaraca protiv zeca Alexa 488 (1: 1000; Molekularne sonde, Eugene, OR, SAD), kozjeg anti-zamorca Alexa 546 (1: 500; Molekularne sonde) ili magarećeg protu-kozjeg Alexa 488 (1 / 1000; Molekularne sonde).

Stanični test smrti

Otočići su izolirani kako je gore opisano, a jednostanična suspenzija pripravljena je tripsinizacijom. Dvjesto ekvivalenata po jažici je posađeno u pločice s kulturom od 24 jažice tretirane s 804G, potpunim vanćelijskim matriksom (ECM) proizvedenim staničnom linijom karcinoma mokraćnog mjehura štakora. 33 Stanice su transducirane s Scramble ili sh Myt3 adenovirusima preko noći na MOI od 10 i kultivirane u prisutnosti ili odsutnosti različitih staničnih stresora daljnjih 48 h. RPMI medij sa 11 mM glukoze (normalna glukoza) služio je kao kontrolni uvjet, dok su stresori uključivali citokinski koktel (0, 4 ng / ml IFN γ , 0, 07 ng / ml IL-1 β i 0, 04 ng / ml TNF α ), serumsko gladovanje, niska glukoza (2, 8 mM glukoze), visoka glukoza (30 mM glukoze) ili hipoksija (1% O2). PLKO-Bim shRNA (TRCN0000009692-9695) koja cilja sve Bimove izoforme, 26 i vektori lentivirusne kontrole (RHS6848) kupljeni su od GE Dharmacon-a (Ottawa, ON, Kanada). sh Scramble i sh Myt3- transducirani otočići ko-transducirani su s 2, 5 μl lentivirusnim sh Scramble ili sh Bim (1 × 10 9 pfu) preko noći. Medij je promijenjen u svježi 30 mM RPMI glukoze i stanice su kultivirane daljnjih 48 h. U svaku jažicu smo 24 sata prije snimanja dodali 1 μl propidijum jodida (PI, 1 mg / ml; Sigma-Aldrich) i 0, 5 μl Hoeschta. Stanice su snimljene konfokalnim mikroskopom SP8 (Leica, Wetzlar, Njemačka) i kvantifikacija je provedena programom za analizu slike CellProfiler (Broad Institute, Cambridge, MA, USA).

qPCR

Raspršeni otočići su ili transducirani kao gore ili su ostavljeni neprerađeni i uzgojeni u RPMI mediju sa dodatkom staničnih stresora opisanih 36 sati. RNK je izolirana pomoću Trizola i PureLink RNA kompleta za pročišćavanje (Ambion, Burlington, ON, Kanada). cDNA je generirana korištenjem Superscript III (Invitrogen, Burlington, ON, Kanada). Taqmanove sonde korištene su za kvantificiranje β-aktina i Myt3, a svi ostali primeri su dizajnirani pomoću Primer3plus i naručeni od IDT-a. Za sve reakcije korišten je Viia7 PCR sustav u stvarnom vremenu i SYBR Green supermix (Applied Biosystems, Burlington, ON, Kanada) ili Taqman Fast Advanced Master Mix (Applied Biosystems). cDNA (10ng) korištena je u svakoj reakciji, a sve su reakcije izvedene u tri primjerka. P-aktin je korišten kao unutarnja kontrola, a promjena u ekspresiji izračunata je korištenjem 2 -ΔΔCt .

Western blot analiza

Stanični lizati su pripremljeni iz pretvorenih, disperziranih otočića uzgojenih u normalnim glukozama (11 mM glukoze) ili visokim nivoom glukoze (30 mM glukoze) u trajanju od 48 h. Stanice su oporavljene tripsinizacijom i lizirane sonikacijom u RIPA puferu (ThermoFisher). Dvadeset pet mikrograma ukupnog proteina bilo je napunjeno u svaku jažicu 4–15% TGX gela (Biorad, Mississauga, ON, Kanada). Gelovi su preneseni na 0, 2 μm polivinil difluoridne membrane (Biorad) pomoću Trans-Blot Turbo aparata (Biorad) prema uputama proizvođača. Membrane su ispitivane antitijelima na Bim (1: 500; Stanična signalizacija, Danvers, MA, SAD), CHOP (1: 500; Santa Cruz), fosfo-eIF2α (1: 1000; Stanična signalizacija) i ukupni eIF2α (1: 500 Abcam, Cambridge, MA, SAD) na 4 ° C u 5% obranom mlijeku razrijeđenom u TBS-u uz dodatak 0, 05% Tween-20. Mrlje su uklonjene pomoću protokola blagim uklanjanjem Abcam-a i ponovno ispitivane anti-Gapdh (1: 10000; stanična signalizacija). Donkey anti-Rabbit ili anti-Mouse (Santa Cruz) HRP-konjugirana sekundarna antitijela korištena su u 1:10 000 u PBS-u tokom 1 sata na sobnoj temperaturi. Membrane su tretirane s ECL reagensom (ThermoFisher) 1 min prije razvijanja filmova.

Statistička analiza

Statistička analiza provedena je korištenjem dvosmjerne ANOVA s Sidakovim višestrukim usporednim testom za fiziološka mjerenja tijekom vremena. Statistička analiza izvršena je korištenjem ANOVA s Tukeyjevim višestrukim usporednim testom za mjerenje qPCR-a, western blota i stanične smrti. Svi ostali podaci analizirani su pomoću neparnog, dvoreznog Studentova t- testa. Podaci iz najmanje tri neovisna eksperimenta predstavljeni su kao srednja vrijednost ± SEM Statistički značaj prihvaćen je kod P- vrijednosti <0, 05.

Dodatna informacija

Datoteke slika

  1. 1.

    Dopunska slika 1

  2. 2.

    Dopunska slika 2

  3. 3.

    Dopunska slika 3

  4. 4.

    Dopunska slika 4

Glosar

St18

suzbijanje tumorske genosti 18

Myt3

faktor transkripcije mijelina 3

INF γ

gama-interferona

IL- 1P

interleukin-1 beta

TNF α

faktor nekroze tumora-alfa

qPCR

kvantitativna lančana reakcija polimeraze u stvarnom vremenu

MUP

mnoštvo infekcije

STZ

streptozotocinom

IPGTT

intraperitonealni testovi tolerancije na glukozu

FACS

razvrstavanje stanica aktivirano fluorescencijom

GFP

zeleni fluorescentni protein

TUNEL

označavanje krajnje deoksinukleotidil-transferaze dUTP nick end

shRNA

kratka ukosnica RNA

T1ŠB

dijabetes tipa 1

T2D

dijabetes tipa 2

ECM

izvanstanični matriks

Dodatne informacije nalaze se u ovom radu na web stranici Cell Death and Disease (//www.nature.com/cddis)