Inhibicija αnaka osi fadd-jnk igra anti-apoptotičku ulogu u više ćelija raka | stanična smrt i bolest

Inhibicija αnaka osi fadd-jnk igra anti-apoptotičku ulogu u više ćelija raka | stanična smrt i bolest

Anonim

teme

  • apoptoza
  • Rak
  • Stanična signalizacija

Sažetak

Naftni polipeptid-povezani kompleks α ( α NAC) navodno je prekomjerno izražen u nekoliko vrsta karcinoma i regulira staničnu apoptozu pod hipoksičnim uvjetima u stanicama HeLa. Cilj naše studije bio je istražiti apoptotsku funkciju α NAC- a u progresiji raka. Prvo smo uočili stanične učinke iscrpljivanja α NAC. Miševi α NAC korišten je za obnavljanje razine proteina i provjeru učinka. Kao markeri korišteni su ANEKSEIN test, izvjestitelj o aktivnosti kaspaze, apoptotski molekularni marker i test formiranja kolonija kao markeri za istraživanje mehanizama ćelijske smrti uzrokovanih iscrpljivanjem α NAC. Rječnik 10-putnog testa izvještavanja korišten je za provjeru puteva nizvodno. PCR usmjereno brisanje na temelju funkcionalnih domena α NAC korišteno je za izgradnju mutanata za brisanje. Ti mutanti za brisanje funkcionalne domene korišteni su za oporavak apoptotičkog fenotipa uzrokovanog iscrpljivanjem α NAC- a . Konačno, uloga inhibitora α NAC u liječenju ligandom koji izazivaju apoptozu (TRAIL) koji potiču apoptozu. Otkrili smo da iscrpljivanje α NAC u više vrsta karcinoma potiče tipičnu apoptotsku staničnu smrt. Ovu anti-apoptotsku funkciju posreduje put FADD / c-Jun N-terminalne kinaze. Netaknuti α NAC potreban je za izravno vezanje FADD-a kao i njegovu anti-apoptoznu funkciju. Osiromašenje α NAC ili brisanje domene povezane s ubikvitinom α NAC senzibilizira stanice raka L929 na mTRAIL tretman. Naše istraživanje otkrilo je anti-apoptotičku funkciju α NAC u više vrsta karcinoma i sugeriralo njegov potencijal u terapiji raka.

Glavni

Vanjska apoptoza, koja je potaknuta izvanstaničnim signalima koji aktiviraju obitelj receptora smrti (DR), razlikuje se od unutarnje apoptoze koja je inducirana unutarćelijskim signalima, poput oštećenja DNK, oksidativnog stresa i oduzimanja hranjivih sastojaka. 1 Vanjska apoptoza pokreće vezanjem specifičnih liganda, kao što su faktor nekroze tumora α (TNF α ), Fas ligand i ligand koji izaziva TNF-srodnu indukciju (TRAIL), na njihove odgovarajuće receptore zvane DRs. 2 FADD je glavni adapter koji prenosi apoptotske signale posredovane od strane svih poznatih DR-ova. 3

Nakon interakcije DR-a s ligandima ćelijske smrti i FADD-a, dvije različite stanice proteina pokreću dvije različite skupine proteina. Prva skupina uključuje CD95 / Fas, DR4 / TRAIL-R1 i DR5 / TRAIL-R2, a svi oni regrutuju signalni kompleks koji potiče smrt i koji se sastoji od FADD i propapaze-8. 4 Signalni kompleks koji izaziva smrt olakšava auto-proteolitičko cijepanje propaspaze-8 i -10, što proteinu daje enzimsku aktivnost i omogućava njihovo otpuštanje. 3 Aktivacija kaspaze-8 i -10 dovodi do proteolitičke stimulacije silaznih efektora kaspaze-3, -6 i -7, koja može cijepiti unutarćelijske supstrate, poput lamina A, poli- (ADP-riboze) polimeraze (PARP), i MEKK1. 4, 5 Druga skupina DR-a, uključujući TNFR1, DR3, DR6 i EDAR, regrutuje TRADD kao protein adaptera koji povezuje DR-ove sa faktorima 2, 5 koji su povezani sa TNF receptorima, protein kinazom koja djeluje na receptor (RIP1 ili RIPK1) i stanični inhibitor apoptoze, formirajući dva signalna kompleksa nazvana "kompleks I" i "kompleks II", koji oba mogu inicirati apoptozu. 2, 6, 7, 8

Zabilježeno je da JNK (c-jun N-terminalne kinaze) posreduju putem aktiviranja DR-inducirane apoptoze u više vrsta staničnih linija. 9, 10, 11, 12, 13 DR / FADD aktivira JNK na dva različita puta. Aktivirana kaspaza može cijepati MEKK1 i pojačati njenu kinaznu aktivnost, nadalje inducirajući JNK aktivaciju preko kaskade MAPK (mitogen-aktivirane proteinske kinaze). 5 DR / FADD je također odgovoran za regrutovanje i aktiviranje kinaze ASK1. ASK1 zauzvrat aktivira kaskadu MAPK, što rezultira JNK aktivacijom. 10, 14 Nekoliko nizvodnih ciljeva, poput Bima, 15, 16 Loše, 17 p53 18 i C-Jun, 19, dobro je dokumentovano kako bi posredovalo apoptotički učinak JNK aktivacije.

NAC (kompleks koji nastaje u polipeptidu) je hetero-dimerni kompleks koji je u višim eukariotima identificiran kao faktor povezan s ribosomom u neposrednoj blizini lanaca koji se pojavljuju. 20, 21 NAC koji sadrži α i β podjedinice, djeluje s neprošutim polipeptidnim lancima neovisno o aminokiselinskom slijedu. 21 Nedavna istraživanja pokazuju da α NAC u razvoju ima funkcije neovisne od β -podjedinice, 22 regulaciju transkripcijskih faktora, 23 stres endoplazmatskog retikuluma i apoptozu. 24 Klinička ispitivanja opažala su povišene razine α NAC proteina u više vrsta karcinoma, kao što su maligni gliomi, 25 adenokarcinom dojke, 26 i juvenilna mijelomonocitna leukemija. 27

Funkcionalni mehanizam α NAC u progresiji raka ostaje uglavnom nepoznat. Prethodno istraživanje izvijestilo je da α NAC djeluje u interakciji s FADD. 28 U ovom istraživanju dokumentirano je da α NAC pokazuje anti-apoptotičku funkciju u različitim staničnim linijama karcinoma. Nadalje, pokazali smo da je FADD / JNK put nizvodno od α NAC- a i da je α NAC potreban za onkogenu transformaciju u normalnim stanicama fibroblasta.

Rezultati

Iscrpljivanje α NAC smanjuje vitalnost stanica raka

Stvorili smo shRNA za iscrpljivanje α NAC (slika 1a) u nekoliko staničnih linija raka, uključujući PC3 (prostata), H1299 (pluća), MCF7 (dojka), HCT116 (debelo crijevo) i Hela (grlić maternice; slika 1b, dopunska slika 1), Iznenađujuće, α NAC je uspio smanjiti životnu sposobnost stanica za više od 75% u svim staničnim linijama raka osim Hela stanica (Slika 3a). Da bismo izbjegli off-target učinak shRNA, spasili smo razinu NAC proteina u PC3 ćelijama ispuštenim od NAC-a pomoću mišjih α NAC (m α NAC; Slika 1c). m α NAC, koji pokazuje 99% identitet s ljudskim α NAC (dopunska slika 2), uspio je oporaviti preko 60% stanične vitalnosti (Slika 1d). Provedene su analize krivulje rasta stanica. Stanice s osiromašenim NAC-om rasle su sporije od kontrolnih stanica, dok je uvođenje egzogenih m α NAC u stanice s osiromašenim α NAC-om uspjelo spasiti defekt rasta (Slika 1e).

Image

Iscrpljivanje α NAC smanjuje vitalnost stanica. ( a ) Dvije ciljne sekvence (652 i 901) dizajnirane su prema α NAC na različitim mjestima. Ove dvije male RNA dlačice (shRNA) uvedene su u stanice PC3 lentivirusnom transdukcijom. Nakon selekcije, stanice su sakupljene i podvrgnute Western blot analizi. Stanice (sh α NAC) zaražene miješanim lentivirusnim smjesama postižu bolju efikasnost iscrpljivanja od svake same. ( b ) α NAC je u PC3 stanicama osiromašen dvama nezavisnim sekvencama. Stanice su odabrane puromicinom tokom 2 dana i podvrgnute ispitivanju formiranja kolonije. ( c ) Provedene su zapadne mrlje kako bi se potvrdio oporavak m α NAC sa ili bez endogenog α NAC. ( d ) m α NAC spašen stanični smrt uzrokovana iscrpljivanjem α NAC. Provedeni su testovi formiranja kolonije kako bi se ispitala održivost naznačene PC3 stanice (lijeva ploča, EV znači prazan vektor). Kolonije su brojene pomoću ImageJ softvera (desna ploča). ( e ) m α NAC smanjuje inhibiciju rasta stanica induciranu α NAC-osipkom. Navedene stanice zasijane su u pločice s 96 jažica pri 1000 stanica po jažici. Stanice su tripsinizirane i brojene pod mikroskopom svaki dan. Trostruki uzorci napravljeni su za svaki uvjet

Slika pune veličine

Iscrpljivanje α NAC inducira apoptozu ovisnu o kaspazi-8

Za provođenje mehanizma inhibicije životinjske sposobnosti inhibiranja α NAC, provedena su ispitivanja iz Priloga V. Manje od 5% kontrolnih PC3 stanica imalo je V-pozitivne signale od Aneksina, dok je oko 90% stanica osiromašenih NAC pokazalo V-pozitivne signale iz Priloga (Slika 2a). Za provjeru rezultata testa Annexin V ispitano je nekoliko apoptotskih molekularnih markera. Razine cijepanja kaspaze-3, -8 i -9 bile su mnogo veće u PC3 stanicama smanjenim α NAC-om u usporedbi s kontrolom. PARP, koji je supstrat kaspaza, cijepio se češće u stanicama s osiromašenim α NAC nego u kontrolnim stanicama (Slika 2b). Kaspaza-3 prima signale kaspaze-8 ili -9 kao odgovor na vanjski apoptotski put odnosno intrinzični apoptotski put. Dakle, uveli smo dominantno negativne kaspaze-3, -8 ili -9 u kontrolne ili α NAC-osiromašene stanice i promatrali aktivnost kaspaze-3. U PC3 stanicama transfektiranim kontrolnim praznim vektorom aktivnost kaspaze-3 povećala se dvostruko. U stanicama koje su transficirane kaspazom-3 ​​DN- i kaspazom-8 DN, aktivnost kaspaze-3 je inhibirana. Zanimljivo je da kaspaza-9 DN nije bila sposobna učinkovito inhibirati aktivnost kaspaze-3 (slika 2c). Ovaj rezultat sugerira da je apoptotski proces pokrenut vanjskim putem kada je α NAC potrošen.

Image

Iscrpljivanje α NAC inducira apoptotsku staničnu smrt i kasp8-ovisnu aktivaciju casp3. ( a ) Aneks V test. PC3 stanice osiromašene s α NAC pokazuju pozitivne fluorescentne signale (gornja ploča). Brojimo 500 stanica u svakoj skupini i obavili smo statističku analizu (donja ploča). ( b ) Navedene PC3 stanice su sabrane i podvrgnute analizi Western blot-a. Navedena antitijela korištena su za ispitivanje membrane. ( c ) PC3 stanice su transfektirane praznim vektorom ili plazmidima koji eksprimiraju kaspazu -3, -8 ili -9 DN. Nakon 12 h, medij je prebačen u lentivirusni supernatant. Nakon 6 h, medij je promijenjen u svježe medije. Nakon 48 h, stanice su sakupljene i podvrgnute ispitivanju enzimske aktivnosti kaspaza-3

Slika pune veličine

FADD posreduje apoptozu pod α -NAC uvjetima

Među stanicama karcinoma koje smo otkrili, HeLa stanice pokazale su mnogo niži odgovor na staničnu smrt pod iscrpkom α NAC u usporedbi s ostalim stanicama koje smo izmjerili. Preko 50% HeLa stanica je preživjelo iscrpljivanje α NAC- a (Slika 3a). HeLa stanice luče humani virus papiloma virusa 18, koji eksprimira protein E6 koji je u stanju inhibirati funkciju p53 29 i FADD 30 i štiti stanice od apoptoze. PC3 i PC3-E6 stanice korištene su za testiranje hipoteze da je E6 odgovoran za otpornost stanica HeLa. Preživjelo je manje od 5% PC3 sh α NAC stanica, dok je preživjelo više od 80% PC3-E6 sh α NAC stanica (Slika 3b). Iscrpljivanje α NAC- a učinkovito je izazvalo staničnu smrt u PC3 i H1299 stanicama, a obje ove stanice su funkcionalne p53-null. Stoga smo dodatno istražili ulogu FADD-a. Kad se FADD koplesira s α NAC, preživjelo je oko 80% stanica (slika 3c). Aktivnosti kaspaze-3, -8 i -9 izmjerene su u naznačenim stanicama (slika 3d). Aktivnosti sve tri kaspaze pojačane su samo u stanicama koje su osiromašile α NAC i inhibirale u stanicama koje su osiromašile FADD. PARP i rascjep kaspaze-3 također su smanjeni u skupini 'sh α NAC + shFADD' (Slika 3e). Izvršena je statistička analiza za p-JNK signal (dopunska slika 5).

Image

FADD posreduje apoptotički učinak smanjenja α NAC. ( a ) Sa ili bez α NAC iscrpljivanja, PC3 stanice ili Hela stanice podvrgnute su ispitivanju formiranja kolonije (lijeva ploča). ( b ) Sa ili bez iscrpljivanja α NAC, stanice PC3 ili PC3-E6 podvrgnute su ispitivanju formiranja kolonije (lijeva ploča). ( c ) PC3 stanice sa α NAC i (ili) FADD iscrpljenjem podvrgavaju se ispitivanju formiranja kolonije (lijeva ploča). Za a, b i c, sve kolonije su brojene i analizirane (srednja ploča). Kad su stanice presadjene za ispitivanje formiranja kolonije, 1 × 106 stanica je zadržano za zapadne mrlje kako bi se potvrdila efikasnost iscrpljivanja (desna ploča). Neke ćelije iz eksperimenta c zadržane su za analize aktivnosti kaspaze -3, -8 i -9 (Slika 3d) ili Western blot (Slika 3e)

Slika pune veličine

Staza MAPK / JNK posreduje apoptotički učinak osiromašenja α NAC

Da bi se istražila transdukcija signala u uvjetima iscrpkavanja α NAC, provedena su ispitivanja raka na 10 puta. Aktivnost dvaju staza, MAPK / ERK i MAPK / JNK, povećala se u dva puta. Konkretno, put JNK povećao se u pet puta (slika 4a). Kako bi blokirali aktivnost MEKK i JNK, dva dominantno-negativna proteina kinaze, MEKK-CF-KR i JNK-APF, uvedena su u α NAC-iscrpljene ili kontrolne PC3 stanice. Oba mrtva proteina od kinaze bila su u stanju inhibirati JNK fosforilaciju i cijepanje kaspaze-3, a JNK-APF je bio snažniji od MEKK-CF-KR (Slika 4b). Izvršena je statistička analiza za p-JNK signal (dopunska slika 6). Eksperimenti formiranja kolonije otkrili su da su oba mrtva proteina kinaza uspjela spasiti staničnu vitalnost koja je smanjena α- NAC iscrpljenjem i da je JNK-APF bio jači od MEKK-CF-KR (Slika 4c). Aktivnosti puta bile su mjerene primjenom transkripcijskog izvještaja luciferaze. JNK-APF je bio u mogućnosti inhibirati aktivnost AP1 transkripcije preko 70%. MEKK-CF-KR je mogao inhibirati aktivnost transkripcije SRE preko 50% (dopunska slika 3).

Image

Staza MAPK / JNK djelomično posreduje apoptotički učinak osiromašenja α NAC. ( a ) PC3 shGFP ili sh α NAC stanice podvrgnute su reporterskoj matrici s 10 puta. Aktivnost luciferaze predstavlja aktivnost staze. Za b i c, prazni vektor, MEKK-KR ili JNK-APF je transfektiran u PC3 stanice. Nakon odabira, α NAC je osiromašen u sve tri stanične linije. Stanice su skupljene za analizu western blota kako bi se istražila razina naznačenih proteina ( b ) ili su podvrgnute ispitivanju formiranja kolonije ( c, lijeva ploča). Kolonije su brojene i analizirane ( c, desna ploča)

Slika pune veličine

Netaknuti α NAC protein je neophodan za anti-apoptotičku funkciju

α NAC protein sadrži tri funkcionalna područja koja se odnose na vezanje DNA, C-Jun vezivanje ili ubikvitin. Na temelju funkcionalnih regija, konstruirali smo niz mutanata za brisanje m α NAC (slika 5a). Mutanti su uvedeni u osiromašene NAC-ove ili kontrolne PC3 stanice kako bi se spasio apoptotski fenotip. Eksperimenti formiranja kolonije otkrili su da samo netaknuti m α NAC uspijeva učinkovito spasiti održivost stanica (Dopunska slika 4, slika 5b). U skladu s tim, aktivnost JNK staze mogla bi se inhibirati netaknutim m α NAC pod uvjetima iscrpljivanja α NAC (slika 5c). Zanimljivo je da je prekomjerna ekspresija mutanta za brisanje D180-215, koji je domena povezana s ubikvitinom (UBA domena), u PC3 stanicama smanjila vitalnost za preko 60%, a aktivnost AP-1 povećala se odgovarajuće. Odcjepljena kaspaza-3 bila je sondirana. Samo je netaknuti m α NAC uspio u potpunosti inhibirati cijepanje kaspaze-3 (Slika 5d).

Image

Netaknuti α NAC potreban je za anti-apoptotičku funkciju. ( a ) Strategija za stvaranje mutanta za uklanjanje α NAC. Svi su mutanti uvedeni u stanice PC3 da bi se napravile stabilne stanice, a stanice su tada zaražene shGFP ili sh α NAC lentivirusima. Sve su stanice podvrgnute ispitivanju formiranja kolonije i prebrojane su brojeve kolonija ( b ), JNK-izvještajne staze ( c ) i Western blot analizu ( d )

Slika pune veličine

Srednje i C-krajnje regije α NAC i N-kraj FADD su potrebne za interakciju

Istraživane su interakcije endogenih proteina između α NAC i FADD. FADD antitijelo je uspjelo razgraditi α NAC protein (Slika 6a). Imunofluorescencija (IF) otkrila je suorganizaciju endogenog α NAC i FADD proteina (Slika 6b). Da bi se istražilo područje interakcije u oba proteina, provedena je imunoprecipitacija (IP) u nizu m α NAC ili FADD deletacijskih mutanata. Označena cijelom dužinom m α NAC uspješno imunoprecipitiranog FADD proteina. Kada su uklonjene 89–128 aminokiselina (aa) ili 180–215 aa m α NAC, interakcija je prekinuta (slika 6c). Označen m α NAC uspio je istaložiti FADD proteine ​​i mutante pune dužine, s izuzetkom 1–153 aa mutantnog deleta (Slika 6d).

Image

Identifikacija domene interakcije α NAC i FADD. ( a ) Otkupljeno je približno 2 × 10 7 stanica, lizirano u RIPA puferu i razdvojeno na tri dijela. Otprilike 5% lizata korišteno je kao "ulazni" uzorak, polovina preostalog lizata je inkubirana s normalnim zečjim IgG, koji je odvojen kao negativna kontrola, a druga polovica preostalog lizata je inkubirana s FADD antitijelom. Nakon inkubacije preko noći na 4 ° C, uzorci su isprani tri puta s PBS-om, a zatim podvrgnuti Western blot analizi. ( b ) Endogena distribucija α NAC i FADD je ispitana IF. ( c ) FADD s cijelom dužinom GFP-a kofeficiran je m-NAC cijele duljine ili mutanti za brisanje. IP je proveden s M2 perlama da se istaloži označena zastavicom m α NAC. Fadd koji je istaložen zajedno ispituje se korištenjem antitijela protiv FADD. Nepovezani protein, YB1, poslužio je kao negativna kontrola. ( d ) m α NAC cijele duljine zastave kofeficiran je FADD-om s cijelom dužinom označenim GFP-om ili deletirajućim mutantima. Izvedeno je IP da bi se povuklo M2 perle kako bi se istaložio označen zastavom m α NAC. Fadd koji je istaložen zajedno ispituje se korištenjem antitijela protiv FADD. Nepovezani protein, Rab7, poslužio je kao negativna kontrola

Slika pune veličine

Gubitak m α NAC ili dodavanje mutanta D185-215 senzibiliziralo je staničnu liniju L929 aneuploidnog fibrosarkoma na mTRAIL tretman

TRAIL se klinički koristi u svrhu terapije tumora da izazove vanjsku smrt apoptotskih stanica. Kao model koristili smo stanice L929, koje su osjetljive na mTRAIL tretman in vitro . mTRAIL je sam izazvao smrt stanica od 45%. Kombinacija mTRAIL-a s mutatorom D185-215 ili shNAC izazvala je više stanične smrti. Zanimljivo je da je mutant D180-215 izazvao samo oko 40% stanične smrti, dok je 85% stanične smrti zabilježeno kada je mutant kombiniran s mTRAIL tretmanom (slike 7a i b).

Image

Gubitak α NAC- a ili ekspresija D180-215 mutantnih senzibilizira stanice L929 na mTRAIL. L929 stanice zaražene su virusom da bi iscrpile m α NAC ili eksprimirale D180-215 mutant. Nakon odabira, stanice su posijane u pločice sa šest jažica i tretirane mišjim TRAIL-om. Nakon 6 h, stanice su snimljene ( a ) i tripsinizirane za ispitivanje tripano plavim ( b )

Slika pune veličine

Rasprava

Vanjski apoptotski put ima vrlo važnu ulogu u progresiji raka kao i u terapiji raka. Maligne stanice razvijaju nekoliko strategija za inhibiciju vanjske aktivnosti apoptotskog puta protiv signala smrti, kao što su TNF α , TRAIL i Fas ligand. Smanjenje regulacije DR često je povezano s otpornošću na smrt uzrokovanu lijekovima. 31, 32, 33 Smanjenje regulacije Fas signalizacije može se pripisati promjenama na genomskoj, transkripcijskoj i posttranslacijskoj razini. Mutacije u domeni smrti Fas prijavljene su u 7% metastatskih melanoma, 34 što rezultira abnormalnim proteinom koji pokazuje poništenu povezanost s FADD-om i prokompazom-8. Češći je događaj prigušivanje promotora Fas receptora. 35, 36, 37 Drugo sredstvo ublažavanja ekspresije Fas-a je njegova selektivna inhibicija da se izražava na staničnoj površini. 38, 39 Sve ove patološke promjene mogu ublažiti transdukciju signala i stanične reakcije na signale smrti. Nedavna istraživanja otkrila su da ciljanje nekoliko proteina nizvodno, kao što je stanični inhibitor sličan FLICE 40, 41 i kaspaza-8, 42, može prevladati otpornost na lijekove uzrokovanu smanjivanjem regulacije DR-a. Naša studija pruža dokaze da osiromašenje α NAC- a snažno inducira apoptotsku staničnu smrt u više staničnih linija raka, ali ne i u normalnim stanicama fibroblasta. α NAC je potencijalni kandidat za terapiju raka.

α NAC ima UBA domenu u svom krajnjem C-kraju. UBA domena je mala strukturna domena u proteinima koju karakterizira snop od tri spirale i obično je povezana s ubikvitinskim putem. Vezivanje dugolančanog ubikvitina proteina na UBA proteine ​​može pospješiti njihovu razgradnju. 43 Utvrđeni su neki proteini koji sadrže UBA domene na putu proteasoma povezanih s ubikvitinom, kao što je esencijalni modulator nuklearni faktor-κB, R23A, Dsk2 i NBR1. 44, 45, 46, 47 Svi ovi proteini pripadaju klasi 1, 2 ili 4 UBA. Klasa 3, kojoj pripada α NAC, nema vidljiv afinitet vezanja s dugolančanim ubikvitinom u kvascima ( Egd2 je homolog αNAC u kvascima). Ne nalazimo nikakve dokaze koji bi podupirali da α NAC regulira FADD regulirajući stabilnost proteina jer iscrpljivanje ili prekomjerna ekspresija α NAC nije značajno promijenila razinu FADD. Stoga bi bilo zanimljivo istražiti afinitet vezanja između FADD i kaspaze-8 ili RIP1 sa ili bez α NAC- a .

Zanimljivo je da mutant D180-215, izbrisan s UBA domene, aktivira AP1 put i inhibira vitalnost stanica kad je prekomjerno izražen u PC3 stanicama. D180-215 mutant također in vitro osjetio mTRAIL-induciranu L929 staničnu apoptozu. S obzirom da je ovaj učinak u skladu s α NAC-om iscrpljenjem, predlažemo da UBA domena ima važnu ulogu u anti-apoptotičkoj funkciji α NAC. Daljnja istraga usredotočena na ovu domenu bila bi korisna za razjašnjenje mehanizma.

Iscrpljivanje FADD-a potpuno je blokiralo JNK fosforilaciju (slika 3e), sugerirajući da je JNK aktivacija nizvodno od FADD. Iscrpljivanje FADD-a učinkovito oporavlja staničnu apoptozu induciranu α NAC-osipkom. Prekomjerna ekspresija JNK APF u α -NAC-osiromašenim stanicama uspjela je oporaviti staničnu vitalnost do 40% (slika 4c), iako je blokirala aktivnost endogenih JNK-a preko 70% (dopunska slika 3). Dakle, put JNK je glavni, ali ne jedini put koji posreduje kod α NAC / FADD učinka. Transdukcija signala s FADD-a na JNK ima dva potencijalna puta, odgovarajuće posredovana s MEKK1 4 ili ASK. 14 Kada je endogeni MEKKl inhibirao MEKK-CF-KR, stanična vitalnost se smanjila na približno 20%. Stoga, MEKK1 nije jedini posrednik prenosa signala s FADD na JNK (dopunska slika 5).

Na dva načina odziva odgovor na apoptotički signal. Za kratkotrajno podražavanje kaspape su cijepljene i aktivirane. Za trajni stres, JNK i drugi putevi promiču transkripciju gena kaspaze i povećavaju razinu proteina. 48 U ovom istraživanju koristili smo lentivirus za unošenje siRNA protiv α NAC u stanice. Potrebno je oko 3 dana. Pronašli smo ne samo rascjep kaspaze, već i povišenje razine proteina kaspaze u stanicama koje oštećuju α NAC. To je u skladu s JNK aktivacijom koju smo pronašli.

Kad se stanice podvrgnu vanjskoj apoptozi, u takozvanim stanicama tipa 1, proteolitička aktivacija kaspaze-3 pomoću kaspaze-8 dovoljna je za učinkovitu indukciju apoptoze. U takozvanim stanicama tipa 2, ubijanje zahtijeva pojačavanje kaskade kaspaze. To se može postići proteolitičkom aktivacijom posredovanom kaspazom-8 proteaptotične Bcl-2 homologne domene (BH) 3-jedini agonist smrti domena koji utječe na protein BH-interakcije (Bid), koja zatim uzrokuje permeabilizaciju vanjske membrane mitohondrija. 49 Potrebno je daljnje istraživanje kako bi se razjasnila uloga BID-a kada je α NAC potrošen.

Naše istraživanje otkrilo je da α NAC, protein koji je povezan s peptidom, pokazuje anti-apoptotičku funkciju neovisnu o NAC kompleksu u stanicama raka. Anti-apoptotički mehanizam α NAC-a zaključen je kao dijagram (slika 8). α NAC je potencijalni cilj terapije, te je potrebno daljnje istraživanje mehanizma α NAC regulacije FADD-a.

Image

Shematski dijagram apoptoze ćelije izazvan osipanjem α NAC- a . FADD isključivo posreduje α NAC anti-apoptotički učinak. Jedan od nizvodnih putova FADD-a je put JNK. MEKK1, ASK1 i (ili) druge kinaze prenose signal iz FADD u JNK. Postoji još jedan (ili drugi) put djelomično posredovan apoptotičkim učinkom iscrpljivanja α NAC- a na JNK neovisan način

Slika pune veličine

Materijali i metode

PCR i kloniranje

Oligonukleotidi su sintetizirani prema protokolu Invitrogenom (Grand Island, NY, USA) i navedeni su u Dodatnoj tablici 1. C-MYC, 50 myr-AKT, 51 HRasV12 (Kat. 1768), MEKK1-CF-KR, 52 JNK- APF 53 kaspaza-3 DN (dominantno negativan), 54 kaspaza-8 DN, 55 i kaspaza-9 DN 55 kupljeni su od Addgene (//adadgene.org) i sublonirani su u odgovarajuće lentivirusne ekspresijske plazmide. Svi detalji tih plazmida dostupni su u odgovarajućim referencama. PCR su izvedeni s KOD Taq polimerazom (TOYOBO, Novi, MI, SAD) i Mastercycler nexusom (Eppendorf, Hamburg, Njemačka).

Stanična kultura, transfekcija i reagensi

PC3, MCF7, H1299, MDA-MB-231, U2OS i 293T kupljene su iz američke zbirke tipičnih kultura i održavane su u odgovarajućim medijima kao standardni protokol. PC3-E6 stanice su stvorene i održavane na temelju objavljenih metoda gradnje MCF7-E6. 56 Svi reagensi za staničnu kulturu kupljeni su od Gibca (New York, NY, SAD). MIR TRAIL (kat. SRP3237) i drugi reagensi kupljeni su od Sigme (St. Louis, MO, USA), osim ako nije drugačije naznačeno. Transfekcije su izvedene s Lipofectamine 2000 (Invitrogen) u skladu sa standardnim uputama. U svakom su pokusu količine transficiranih plazmida bile konzistentne, a prazni vektor korišten je za nadoknadu preostale količine. Svaki eksperiment je ponovljen tri puta.

Reporterski nizovi s 10 staza raka

Rak 10-putni Reporter komplet (CCA-001L) kupljen je od SABiosciences (Frederick, MA, SAD). Proces probira je proveden slijedeći standardni priručnik. Ukratko, MCF7 stanice su posijane u pločice s 96 jažica s gustoćom od 1 × 10 4 stanice po jažici. Obrnute transfekcije obavljene su kad su stanice presadjene. Nakon 48 h, stanice su sakupljene i podvrgnute dvostrukoj luciferaznoj analizi, koja je izvedena korištenjem Dual-Luciferase Reporter Assay System (E1960, Promega, Madison, WI, USA).

Analiza Western blot-a, IP, IF i antitijela

Analiza Western blot-a, IP-ovi i IF provedeni su u skladu s opisanim postupcima. 50 α NAC (sc-87324, 1: 500), BCL2 (sc-492, 1: 1000), MYC (SC-40, 1: 2000), HRas (sc-34, 1: 500), JNK2 (sc- 827, 1: 1000), FADD (sc-5559, 1: 500), HPV16 E6 (sc-1584, 1: 1000), GFP (sc-390394, 1: 2000) i V5-sonda (sc-81594, 1: 500) antitijela i zrnca agaroze proteina A / G PLUS (SC-2003) kupljena su u Biotechnology Santa Cruz (Dallas, TX, SAD). Zastave (F4042, 1: 5000, miš), zastava (F2555, 1: 1000, zec) i antitijela za aktin (A4700, 1: 5000) i magnetske perlice protiv FLAG M2 (M8823) kupljeni su od Sigme. PARP (9532, 1: 500), cijepljena kaspaza-3 (9664, 1: 500), cijepljena kaspaza-8 (9496, 1: 500), cijepljena kaspaza-9 (9505, 1: 500), i p-JNK ( 4668, 1: 1000) antitijela su kupljena od Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA). Koza anti-miša (SC-2005, 1: 500) i kozja anti-zečja (SC-2004, 1: 500) sekundarna protutijela kupljena su od Bio Crunolog Biotechnology. Sekundarna antitijela koja se koriste za IF kupljena su od Invitrogen-a, uključujući Alexa Fluor 594 (A11020, 1: 500) i Alexa Fluor 488 (A11034, 1: 500). Blot slike su snimljene pomoću ChemiDoc XRS + sustava (Bio-Rad, Hercules, CA, SAD). AKO su slike snimljene mikroskopijom (CX41-32RFL, OLYMPUS). IP je proveden na temelju prethodnog protokola. 52

Pakiranje virusa i infekcija

PLKO1 plazmid, pLenti sustav ulaska-odredišta, 57 i pomoćni vektori, VSVG i delta8.2, kupljeni su od Addgenea. Pakiranje virusa i infekcija ciljnih stanica provedeni su slijedeći standardne protokole Addgene-a. Stabilne stanične linije stvorene su selekcijom s 1 µg / ml puromicina (P9620, Sigma) 6 dana.

Aneksin V test

Aneksin V-FITC komplet za otkrivanje apoptoze kupljen je od tvrtke Sigma (APOAF-50TST). Stanice su posijane na sterilnim poklopcima u 35 mm posudama. Sljedećeg dana stanice su isprane dva puta s PBS-om i 30 minuta inkubirane radnom otopinom Annexin V-FITC. Slajdovi su postavljeni prema stanici prema dolje, a pozitivno obojene stanice brojene su pod mikroskopom.

Analiza aktivnosti enzima kaspaze

Tri kompleta za ispitivanje aktivnosti kaspaze, kaspaza-Glo3 / 7 (G8090), kaspaza-Glo8 (G8200) i kaspaza-Glo9 (G8210), kupljeni su od Promega. Eksperimenti su izvedeni prema uputama proizvođača.

Test formiranja kolonije

Stanice su tripsinizirane i suspendirane u kulturi. Nakon prebrojavanja, stanice su razrijeđene do 50 stanica / ml. U svako jelo od 60 mm izmrvljeno je oko 2 ml stanične suspenzije (otprilike 100 stanica). Medij se mijenjao svaka 1 ili 2 dana. Nakon 2 tjedna u normalnim uvjetima, stanice su fiksirane u 4% formaldehidu tijekom 10 minuta. Nakon dva pranja s PBS-om, u posude je dodano 0, 05% kristalno ljubičica. Nakon 15 minuta uklonjena je kristalna ljubičica i stanice su isprane dva puta s PBS-om (gornja ploča). Kolonije su brojene pomoću ImageJ softvera (verzija 1.43; //rsbweb.nih.gov/ij/download.html).

Statistička analiza i softver

Svi su pokusi ponovljeni tri puta. Za svaki histogram, prosječna vrijednost i traka pogreške izračunata je iz tri neovisna pokusa. Za analizu podataka i stvaranje histograma korišten je GraphPad Prism 5. Za procjenu statističke važnosti za određene podatke korištena je ANOVA jednosmjernost. Dvostruka zvjezdica (**) označava P <0, 01, a jedna zvjezdica (*) P <0, 05.

Dodatna informacija

PDF datoteke

  1. 1.

    Dopunske brojke

  2. 2.

    Dopunska tablica S1

Glosar

DR

receptor smrti

TNF

faktor nekroze tumora

TRAG

TNF-ligand koji izaziva apoptozu

PRAP

polimera (poli- (ADP-riboza))

α NAC

kompleks nastalog polipeptida α

m α NAC

miš α NAC

UBA

domena povezana s ubiquitinom

Dodatne informacije nalaze se u ovom radu na web stranici Cell Death and Disease (//www.nature.com/cddis)