Inhibicija namptusa senzibilizira stanice adenokarcinoma gušterače na tumor-selektivnu metaboličku katastrofu koja je neovisna o tumoru i staničnu smrt izazvanu β-lapafonom | stanična smrt i bolest

Inhibicija namptusa senzibilizira stanice adenokarcinoma gušterače na tumor-selektivnu metaboličku katastrofu koja je neovisna o tumoru i staničnu smrt izazvanu β-lapafonom | stanična smrt i bolest

Anonim

teme

  • Metabolizam raka
  • Stanična smrt
  • Rak gušterače
  • Ciljane terapije

Sažetak

Inhibitori nikotinamid fosforibosiltransferaze (NAMPT) (npr. FK866) ciljaju najaktivniji put sinteze NAD + u tumorskim stanicama, ali im nedostaje selektivnost tumora za upotrebu kao pojedinačnog sredstva. Smanjivanje bazena NAD + inhibiranjem NAMPT primiranih stanica gušterače duktalnog adenokarcinoma (PDA) za poli (ADP riboza) polimerazu (PARP1) ovisna stanična smrt inducirane ciljanim terapijskim karcinomom, β- lapakfonom ( β- kapica, ARQ761), neovisno o poli Akumulacija (ADP riboza) (PAR). β- kap bioaktivira NADPH: kinon oksidoreduktaza 1 (NQO1) u uzaludnom redoks ciklusu koji troši kisik i stvara visoku razinu reaktivnih vrsta kisika (ROS) koje uzrokuju velika oštećenja DNK i brzu potrošnju NAD + posredstvom PARP1. Sinergija s FK866 + β- kapom bila je tumorsko selektivna, pojavljivala se samo u NQO1-prekomjerno ekspresirajućim stanicama karcinoma, što je zabilježeno u većini (∼ 85%) slučajeva PDA. Ova strategija liječenja istodobno smanjuje sintezu NAD + uz istodobno povećanje potrošnje NAD +, smanjenje potrebnih doza i vremena liječenja za oba lijeka i povećanje potencije. Ovi komplementarni mehanizmi uzrokovali su duboko iscrpljivanje NAD (P) + i inhibirali glikolizu, smanjujući razinu adenosin trifosfata i sprječavajući oporavak koji se uobičajeno opaža s bilo kojim lijekom. Stanice raka su umrle kroz ROS-induciran, µ -kalpain posredovan proces programirane stanice smrti koji ubija neovisno o aktivaciji kaspaze i nije potaknut PAR akumulacijom, koju nazivamo NAD + -Keresis. Ne preklapajuće se specifičnosti FK866 za PDA tumore koji se uvelike oslanjaju na NAMPT-kataliziranu sintezu NAD + i β- kapicu za stanice raka s povišenom razinom NQO1 pruža visoku selektivnost tumora. Koncept redukcije NAD + bazena u stanicama raka da bi ih se senzibilizirao na ROS-posredovanu staničnu smrt pomoću β- kapka je nova strategija s potencijalnom primjenom za gušterače i druge tipove NQO1 + solidnih tumora.

Glavni

Nastala metabolička meta za liječenje raka koji se vraćaju, kao što je adenokarcinom gušterače (PDA) ovisi o njihovoj sintezi NAD +, posebice putem recikliranja nikotinamida. 1, 2, 3 Brza i učinkovita sinteza NAD + presudna je za održavanje signalnih procesa, poput deacetilacije sirtuinima i ribozilacije adenozin difosfata (ADP) poli (ADP riboza) polimerazom 1 (PARP1). NAD (P) + bazeni su također potrebni za podršku anaboličkom metabolizmu i proliferaciji stanica raka. U pokušaju da se poveća povećano oslanjanje tumorskih stanica na sintezu NAD +, razvijeni su inhibitori male molekule nikotinamid fosforibosiltransferaze (NAMPT) (npr. FK866). 4 NAMPT katalizira korak ograničavanja brzine najaktivnijeg puta sinteze NAD + . Inhibitori NAMPT, kao što je FK866, smanjuju razinu NAD +, induciraju kanoničnu apoptozu u stanicama raka in vitro , inhibiraju rast tumora i povećavaju opće preživljavanje u predkliničkim modelima raka. 1, 5, 6, 7 FK866 (APO866) je relativno dobro podnošen kod ljudi i uznapredovao je u klinička ispitivanja faze II. Međutim, zbog kratkog poluživota u cirkulaciji, potrebni su produženi režimi liječenja i primijećena je toksičnost na normalne, brzo razmnožavajuće hematopoetske stanice. Prema tome, FK866 i drugi inhibitori NAMPT nisu pokazali dovoljnu selektivnost tumora da bi postigli klinički uspjeh kao pojedinačni agensi. 8

Da bismo povećali specifičnost i učinkovitost inhibicije NAMPT-a, kombinirali smo FK866 s p- lapafonom ( β- kapaljkom), ciljanim terapijom za rak koji uzrokuje hiperaktivaciju tumora-selektivne PARP1 i iscrpljivanje NAD + u NADPH: kinonoksidoreduktazi 1 (NQO1) način. 9 β -Lap je supstrat za dvoelektronsku oksidoredukciju pomoću NQO1, enzima faze II kitona-detoksikacije. 9 Nastali hidrokinon oblik β- kapka je vrlo nestabilan i spontano reagira s kisikom da bi se vratio natrag do matičnog spoja, stvarajući dva mola superoksida po molu NAD (P) H korištenog u postupku. To rezultira uzaludnim ciklusom koji se brzo pojavljuje u stanicama prekomjerne ekspresije NQO1, uzrokujući izrazitu NADH / NADPH oksidaciju. Oštećenje DNK u obliku bazne oksidacije i razbijanja jednostrukih DNK rezultat je H20, nastalog iz uzaludnog redoks ciklusa. U pokušaju da popravi ovo oštećenje, PARP1 postaje hiperaktiziran, stvarajući razgranati razgranati poli (ADP riboza) (PAR) polimer. Hiperaktizirani PARP1 znatno iscrpljuje razinu NAD + i u konačnici adenozin trifosfat (ATP), te tako inhibira naknadno popravljanje DN-lezija uzrokovanih β -kapcima. Promatrana stanična smrt neovisna je o kaspazi i vođena je nuklearnom translokacijom faktora koji inducira apoptozu (AIF), aktiviranjem µ -kalpaina i posttralacijskom modifikacijom GAPDH. 10, 11, 12, 13 NQO1 je izrazito izražen kod mnogih vrsta karcinoma, a terapijski prozor koji je omogućen bioaktivacijom β- kapljica NQO1 proširio je njegovu upotrebu u klinička ispitivanja faze I (ARQ761). 14 Povišena ekspresija NQO1 (≥10 puta) identificirana je u ~ 85% bolesničkog tkiva iz duktalnog adenokarcinoma gušterače (PDA), što je karcinom gušterače posebno privlačan cilj za terapiju upotrebom bioaktivacijskih lijekova NQO1, poput β- kapka. 15, 16, 17, 18 Međutim, methemoglobinemija koja ograničava dozu uzrokovana stvaranjem nespecifičnih reaktivnih vrsta kisika (ROS) pri visokim dozama β- kapka može ograničiti učinkovitost β- kapka kao monoterapija. 19 Strategije za povećanje citotoksičnosti stanica raka uz održavanje specifičnosti NQO1 mogu poboljšati uporabu β- kapka za terapiju protiv PDA-a, kao i drugih čvrstih karcinoma koji prekomjerno izražavaju NQO1.

Otkrili smo da je ispitivanje putova stanične smrti izazvano pomoću β- kapka, sa ili bez tretmana FK866, novo sredstvo za rasvjetljavanje općih mehanizama smrtonosnosti posredovanih gubitkom NAD +, jer se stanična smrt uslijed hiperaktivacije PARP1 događa u drugim kontekstima. Značajno je da ćelijska smrt izazvana ishemijom / reperfuzijom dijeli mnoge iste karakteristike: ROS indukcija, hiperaktivacija PARP1, otpuštanje kalcija, ALO translokacija i neovisnost o kaspazi. 20, 21 Slično, liječenje metilnitronitrosoguanidinom (MNNG; DNA alkilirajući agens) ili indukcija neuronske ekscitotoksičnosti izaziva hiperaktivaciju PARP1 i staničnu smrt, ali bez uzaludne ciklično-inducirane proizvodnje ROS-a. 22, 23, 24 Nedavna istraživanja sugeriraju važnu ulogu za akumulirani slobodni PAR polimer koji može izravno aktivirati µ -kalpain, aktivirati i osloboditi AIF i inhibirati glikolizu. 22, 25, 26, 27, 28 Kombinirajući β- lak i FK866, razdvajamo iscrpljivanje NAD + i ATP-a iz robusne formacije PAR zabilježene samo s β- zatvaračem, što nam omogućava da definiramo funkciju formiranja PAR-a u β- kapcu -inducirana stanična smrt.

P- Lamp i FK866 imaju različite, ali vrlo komplementarne mehanizme djelovanja. P- Lap inducira tumor-selektivno iscrpljivanje NAD + posebno u stanicama raka koje eksprimiraju visoku razinu NQO1. FK866 primirira stanice raka za staničnu smrt snižavajući bazene NAD + / NADH i sprječava oporavak inhibirajući NAD + sintezu iz nikotinamida oslobođenog aktiviranim PARP1. Pokazano je da je povećana ovisnost PDA stanica o glikolizi posebno usmjerena ROS-om, iscrpljivanjem NAD + uzrokovanim izlaganjem oba lijeka. Glikolitička inhibicija, iscrpljivanje ATP-a i stanična smrt neovisni su o formiranju PAR-a, snažno sugerirajući da akumulacija PAR-a nije izravno uključena. Upotreba β- kapka s NAMPT inhibitorima rezultira sinergijskom smrtnošću stanica karcinoma ovisnog o NQO1 i PARP1, što omogućuje upotrebu nižih doza i kraća vremena liječenja za oba terapeuta.

Rezultati

FK866 prethodna obrada senzibilizira PDA stanice na β- kapalicu

Hipotetizirali smo da će ih obrada PDA ćelija prekomjernim ekspresijom NQO1 osjetiti na naknadno izlaganje β- kapanjem snižavanjem raspoloživih NAD + bazena, čime bi se povećala sposobnost PARP1 da iscrpi preostali NAD + kada je potaknuta generiranjem ROS-a izazvanog NQO1. MiaPaca2 stanice su prethodno tretirane s FK866 tijekom 24 sata, a zatim izložene 2 h na β- kapicu + FK866. Pred tretman s FK866 rezultirao je povećanom osjetljivošću na β- kapicu, na normalno subletalne i veće doze lijeka (slika 1a). Na LD 90 razinama β- kapka, predvrdnjavanje FK866 dovelo je do omjera povećanja doze 1, 6, koji je zasićen 4 nM FK866 ( P = 0, 0018). Dok je FK866 smrtonosan za stanice MiaPaca2 u niskim nanomolarnim koncentracijama uz dugotrajno liječenje od 72 sata (dopunska slika S1A), kratkotrajno (24 h + 2 h) liječenje nije imalo utjecaja na održivost (Slika 1a, a svi su se rezultati normalizirali na neobrađene stanice). Klonogeni opstanak također je smanjen u stanicama MiaPaca2 izložene FK866 + β- kapima u odnosu na samo liječenje p- kapima ( P = 0, 0004) (dopunska slika S1B).

Image

FK866 prije i nakon tretmana optimalno senzibilizira PDA stanice na β- kapicu. ( a ) MiaPaca2 stanice su prethodno obrađene 24 sata pomoću FK866 ili samog nosača u naznačenim dozama. Stanice su isprane i potom izložene p- poklopcu 2 sata, sa ili bez FK866, kako je naznačeno. 24 sata kasnije CellTiter-Glo je nadgledao relativnu staničnu vitalnost (T / C). Sve vrijednosti luminiscencije su normalizirane u netretirane stanice (bez FK866 ili β- kapka). ( b ) FK866 prije i ko-tretman uvelike smanjuje minimalno učinkovito vrijeme liječenja za β- kap. MiaPaca2 ćelije su tretirane kao u a s 8 nM FK866, a zatim su izložene 1 ili 2 sata u prisutnosti ili odsutnosti (bez dodatka) 8 nM FK866. Lijekovi su uklonjeni i 24 sata kasnije procijenjena je relativna održivost stanica (T / C). ( c ) Normalni humani embrionalni IMR-90 fibroblasti su tretirani s FK866 i p- kapom kao u i relativna vitalnost stanica. ( d ) Dodatne stanične linije NQO1 + PDA (CFPAC-1, HS766T i AsPC1), kao i stanice karcinoma dojke (MCF7) i ne-sitne stanice pluća (A549) tretirane su samo s FK866, β- zatvaračem, ili s kombinacija kao u a i procijenjena za relativnu staničnu vitalnost (T / C) kao u a . Svi su rezultati usporedjeni koristeći Studentove t- testove ( n = 3 sa srednjom vrijednosti ± SD) kao što je naznačeno. * P <0, 05 ; ** P <0, 01 ; *** P <0, 001

Slika pune veličine

Optimizirali smo sposobnost FK866 da senzibilizira PDA stanice na β- kap, ispitujući dozu-odgovor i izloženost vremenskom toku. Prethodno smo utvrdili da je minimalno vrijeme izloženosti da se inducira stanična smrt za β- lapu ~ 2 h s LD 50 vrijednostima od ~ 3 μM u većini stanica, gdje su stanice NQO1 + eliminirane bez obzira na položaj staničnog ciklusa ili p53 status. 29 Zanimljivo je da je minimalno vrijeme liječenja β- kapljicama potrebno za indukciju stanične smrti smanjeno na 1 h kombiniranim tretmanom FK866 i β- kapcima (Slika 1b). Suprotno tome, normalni humani IMR-90 embrionalni fibroblasti pluća koji eksprimiraju nisku razinu NQO1 ostali su otporni na β- kapaljku, sa ili bez prethodne obrade FK866 (Slika 1c), što sugerira da toksičnost za normalne stanice nije povećana prethodnom tretmanom FK866. 9 Kao i kod stanica MiaPaca2, preživljavanje ostalih PDA stanica pokazalo je sličnu preosjetljivost na β- lap + FK866 u usporedbi s bilo kojim lijekom (slika 1d). Nadalje, ostale NQO1 + prekomjerne ekspresije stanica karcinoma, poput A549 ne-staničnih stanica raka pluća, pokazale su sinergističku smrtonosnost s ovim kombiniranim liječenjem.

Sinergija FK866 + β- kapka ovisi o NAMPT i NQO1

Za određivanje ciljane specifičnosti FK866 + β -lap kombinirane terapije korišten je niz malih molekula i genetičkih eksperimenata. Dicoumarol (Dic), inhibitor male molekule NQO1, u potpunosti je spriječio citotoksičnost stanica MiaPaca2 tretirane samo s β- zatvaračem ili FK866 + β- zatvaračem (slika 2a). Kako je Dic mimik NADH i može imati van-ciljane efekte, razvili smo genetski podudarne NQO1 + i NQO1-PDA stanice iz roditeljskih NQO1 polimorfnih NQO1-S2-013 stanica kako je opisano. 30 Napominjemo da iscrpljivanje ATP-a uzrokovano samim FK866 nije ovisilo o ekspresiji NQO1, dok je citotoksičnost i sinergija izazvana p -kapima nastala samo u NQO1 +, a ne u NQO1-, S2-013 stanicama (Slika 2b) ( P = 0, 00012). Suprotno tome, prekomjerna ekspresija NQO1 u IMR-90 rezultirala je povećanom osjetljivošću na β- lak, ali ne i sinergijom s FK866, što je vjerojatno zbog smanjenog oslanjanja na NADPT-posredovanu sintezu NAD + u ovim normalnim fibroblastima (dopunska slika S1C). Slični sinergistički efekti doza-odgovor primijećeni su s GMX1778, drugim NAMPT inhibitorom (dopunska slika S1D). 31 NAMPT specifičnost je dokazana dodavanjem nikotinamid mononukleotida (NMN, 500 μM), produkta NAMPT-katalizirane reakcije, koja je spasila preosjetljivost FK866 na β- kapicu (Slika 2c). Primjetno, dodavanje NMN nije spasilo kombinaciju citotoksičnosti iznad one koja je inducirana samim β- zatvaračem (Slika 2c). Nadalje, osiromašenje razine NAMPT mRNA i proteina primjenom specifičnih siRNA u stanicama MiaPaca2 (slika 2d, unos) povećalo je osjetljivost na β- kapicu, a ta preosjetljivost je spašena na bazalnu razinu osjetljivosti β- kapka s NMN (slika 2d). Dakle, NAMPT inhibicija i NQO1 ovisna bioaktivacija p- zatvarača bili su nužni i dovoljni za promatranu sinergijsku letalnost.

Image

Sinergija između FK866 i P- zatvarača ovisna je o NQO1 i specifična je za NAMPT. ( a ) MiaPaca2 stanice su prethodno obrađene sa ili bez FK866 (8 nM), isprane i potom izložene različitim dozama β- zatvarača (μM) sa ili bez 8 nM FK866 u prisutnosti ili odsutnosti dikumarola (50 μM) tijekom 2 h. Testovi održivosti tada su korišteni za praćenje preživljavanja 24 sata nakon tretmana. ( b ) PDA stanice S2-013 (NQO1-) ispravljene su za NQO1 ekspresiju CMV-NQO1 stabilnom transfekcijom kako je opisano. 30 stanica je tretirano kao u a i procjenjeno je za relativni ATP sadržaj (T / C) 2 sata kasnije. ( c ) Nikootamamid mononukleotid (NMN, 500 µM), koji zaobilazi reakciju katalitiranu NAMPT za spašavanje inhibicije NAMPT, dodan je tijekom prethodne tretiranja FK866 i izlaganja β- kapcima kao u. NMN spriječio je senzibilizaciju FK866, ali nije poštedio smrtnost uzrokovanu p -zatvaračem. ( d ) Rušenje NAMPT-a povećalo je osjetljivost na β- poklopac. Za suzbijanje ekspresije proteina NAMPT (inset) korištene su dvije jedinstvene siRNA specifične za kodirajuću regiju NAMPT. Stanice su zatim tretirane s p- kapom (3 μM, 2 h) i test održivosti je proveden 24 sata kasnije. Rezultati su upoređeni pomoću Studentovih t- testova ( n = 3 sa srednjom vrijednosti ± SD), * P <0, 05 ; ** P <0, 01 ; *** P <0, 001

Slika pune veličine

FK866 tretman povećava potrošnju energije i sprječava oporavak od β- kapka

Stanice tretirane β- kapom pokazuju ozbiljno iscrpljivanje NAD + / NADH ovisnog o NQO1 u smrtonosnim dozama kao rezultat procesa u dva koraka: (i) Konverzija NADH ovisna o NQO1 u povišene bazene NAD + uz popratno povišenje razine ROS ; i (ii) brzo iscrpljivanje nivoa NAD + uslijed hiperaktivacije PARP1 stimulirane od ROS-a. 9, 13, 16, 32, 33 Kad su stanice MiaPaca2 bile izložene FK866 + β- poklopcu, primijećeno je značajno veće iscrpljivanje NAD + / NADH kao rezultat manje veličine bazena NAD + uzrokovane inhibicijom recikliranja nikotinamida kataliziranog NAMPT ( Slika 3a), sa sličnim nalazima u ostalim staničnim linijama PDA. Iako male doze β- kapka (1–2 µM) uzrokuju aktiviranje PARP1 i potrošnju NAD +, sinteza NAD + nadoknađuje održavanje veličine bazena. Međutim, kada je sintezu NAD + inhibirao FK866, rameno područje u kojem su razine NAD + / NADH održavane niskim dozama β- kapka je eliminirano (Slika 3a). Dodavanje NMN u određenoj mjeri je smanjilo gubitak ukupnih bazena NAD + / NADH uzrokovanih FK866 + β- zatvaračem (slika 3a). Iako nije došlo do potpunog spašavanja nukleotidnih bazena s NMN-om, ovo djelomično spašavanje je relevantno jer je spriječilo smanjenje vitalnosti stanica uslijed učinaka kombiniranog liječenja (slika 2c). Gubici NADP + / NADPH pratili su slične trendove, ali s manje ukupnog iscrpljivanja (Slika 3b), najvjerojatnije zato što NADP + ne troši izravno PARP1, već se sintetizira iz NAD + .

Image

Izloženost stanica MiaPaca2 FK866 + β- poklopcu rezultira sinergijskim iscrpljivanjem bazena NAD + / NADH, NADP + / NADPH, glutation i ATP. ( a i b ) MiaPaca2 stanice prethodno su tretirane s FK866 (8 nM, 24 h), sa ili bez NMN (500 μM ), a zatim izložene ili ne različitim dozama β- zatvarača (µM, 2 h sa ili bez FK866 ± NMN). Ukupni bazeni NADH i NAD + ( a ) ili NAD ( P ) H & NAD ( P ) + ( b ) analizirani su u 2 sata kada su uklonjeni lijekovi. Dodatak NMN-a djelomično je spasio iscrpljivanje obaju nukleotida. Rezultate je analizirala ANOVA ( n = 3 ± SD) uspoređujući samo β- zatvarač (bez dodatka) sa FK866 + β- kapkom. ( c ) MiaPaca2 stanice su tretirane kao u a i b i praćene su relativno smanjene razine glutationa (GSH) (T / C). ( d ) MiaPaca2 stanice su prethodno obrađene kao u a i b s FK866 (8 nM), a zatim sa ili bez p- zatvarača (2, 5 µM) u prisutnosti ili odsutnosti FK866 (8 nM) i relativni ATP bazeni. Provedena su studentska t- testiranja ( n = 3 ± SD). * P <0, 05; ** P <0, 01; **** P <0, 0001

Slika pune veličine

Kako se reducirani glutation (GSH) oksidira da neutralizira ROS generiran p- kapkom, istražili smo učinke kombinirane terapije FK866 + β- kapkom na GSH. Primijetili smo značajno iscrpljivanje GSH razina u stanicama MiaPaca2 izloženim b -kapcima, koja je bila niža nakon kombiniranog liječenja i spašena s NMN (slika 3c). 34 Dodatni gubitak razine GSH mogao bi biti rezultat i smanjene aktivnosti glutation-reduktaze zbog niskih razina NADPH (Slika 3b) i manje de novo GSH sinteze uzrokovanog gubitkom ATP-a zabilježenim s β- kapkom. 29, 35 Zaista, zabilježen je dodatni gubitak ATP-a u stanicama MiaPaca2 izložene FK866 (8 nM) + β- kapku (2, 5 μM) u usporedbi s bilo kojim agensom (slika 3d).

Sinergistička inhibicija glikolize FK866 + β- kapkom

Kako su primijećene značajne promjene u razini ATP-a kombiniranim liječenjem, testirali smo stanice MiaPaca2 na glikolitičku aktivnost nakon liječenja s β- kapom + FK866. Analiza brzine izvanstanične kiseline (ECAR) s XF Flux analizatorom otkrila je da su bazni glikoliza i sposobnost glikolitičke rezerve stanica izloženih β -kapcima odmah nakon izloženosti lijeku (Slika 4a). Prethodna ispitivanja pokazala su da dugotrajno liječenje FK866 inhibira glikolizu smanjenjem aktivnosti gliceraldehid 3-fosfat dehidrogenaze (GAPDH) zahvaljujući niskim razinama NAD + . 36, 37 Otkrili smo da kratkotrajno (24 h) liječenje FK866 praćeno uklanjanjem lijeka nije rezultiralo smanjenjem ECAR-a (slika 4a). Ipak, FK866 tretmanom drastično je smanjio ECAR nakon su-tretmana s β- kapkom. Kako se GAPDH može reverzibilno inhibirati ROS-induciranom oksidacijom ili nepovratno post-translacijskim modifikacijama (npr. PARilacija), 38, 39, 40, 41, proučavali smo da li je β- kapka utjecala na aktivnost GAPDH. U stvari, aktivnost GAPDH inhibirana je u stanicama MiaPaca2 nakon izloženosti p- kapku (Slika 4b). Višak NADH dodan je testnom puferu, tako da umjerena inhibicija GAPDH prikazana na slici 4b ne ovisi o iscrpljivanju NAD + . 36 Ono što je također važno, tretmanom FK866 nije smanjilo inhibiciju GAPDH uzrokovanu izloženošću β- kapcima, ali Dic je spriječio tu inhibiciju (slika 4b). Ovi podaci sugeriraju da β- kap uzrokuje ROS-induciranu stabilnu posttranslacijsku modifikaciju GAPDH-a, dok je povećana glikolitička inhibicija primijećena kombiniranim tretmanom sekundarna povećanju iscrpljivanja NAD + (slike 3a i 4a i b). Inhibicija GAPDH snažno je podržana od 12 puta nakupljanja gliceraldehidnog 3-fosfata (GA3P), supstrata GAPDH i manjeg nakupljanja uzlaznih metabolita glukoze-6-fosfata / fruktoze-6-fosfata (G6P / F6P ) u stanicama tretiranim s β- kapom + FK866 (Slika 4c). Dodatna akumulacija ovih metabolita u B- Lap + FK866 tretiranim MiaPaca2 stanicama koje su tretirane samo s B- kapama ( P <0, 01) bila je u skladu sa smanjenim ECAR-om nakon kombiniranog liječenja zbog nižih NAD + bazena unatoč sličnoj razini NAD + -ovisnih enzima inhibicija opažena na slici 4b. Zatim smo istražili je li inhibicija glikolize tretmanom FK866 + β- kapom trajna. Primijećena je sinergistička inhibicija proizvodnje laktata i iskorištavanja glukoze nakon uklanjanja lijeka nakon kombiniranog liječenja, ali prije nego što stanice počnu umrijeti (u 12–48 h), sugerirajući da kombinirani učinci β- kapka na inhibiciju GAPDH i oba lijeka na iscrpljivanje NAD + uzrokovao dugotrajnu inhibiciju glikolize u stanicama PDA (slike 4d i e).

Image

Tretman FK866 + β- kapom rezultira sinergijskom inhibicijom glikolize. ( a ) Testovi glikolitičkog stresa izvedeni su korištenjem bioanalizatora Seahorse XF za mjerenje glikolitičke sposobnosti MiaPaca2 stanica prethodno obrađenih sa ili bez FK866 (8 nM), β- zatvarača (4 µM), ili kombinirane terapije FK866 (8 nM ) + β- kapica (4 μM). Analize su provedene odmah nakon izloženosti 2 h p- kapku. Rezultati su uspoređeni koristeći ANOVA ( n = 4). **** P <0, 0001 . ( b ) Aktivnosti enzima GAPDH izmjerene su iz lizata MiaPaca2 stanica sa ili bez FK866 (8 nM), a zatim su izložene ili ne izložene β- kapcu u prisustvu ili odsutnosti dikumarola (50 μM) tijekom 2 sata. Pripremljeni su ekstrakti i praćene enzimske aktivnosti ( μ mol NADH / min) i normalizirane na netretirane uzorke. Podaci su izraženi kao relativna GAPDH aktivnost (T / C), a rezultati su uspoređeni upotrebom Studentovih t- testova ( n = 6, ± SD) * P <0, 05 ; ** P <0, 01. ( c ) Glukozni 6-fosfat / fruktoza 6-fosfat (G6P / F6P) i gliceraldehid 3-fosfat (GA3P) kvantificirani su u stanicama MiaPaca2 30 min nakon tretmana kako je opisano u postupcima. ( d i e ) MiaPaca2 stanice tretirane su kao u i izvanstanične laktate ( d ) ili razine glukoze ( e ) u mediju za kvantificiranje kvantificirajući Nova Bioprofile analizatorom u naznačeno vrijeme nakon oba uklanjanja lijeka. Rezultati su uspoređeni upotrebom Studentovih t- testova ( n = 3 ± SD) * P <0, 05 ; ** P <0, 01 ; *** P <0, 001 ; **** P <0, 0001

Slika pune veličine

Kombinirana terapija FK866 + β- kapljicama rezultira značajno smanjenom tvorbom PAR

Prethodno smo izvijestili da je smrtnost uzrokovana β -kapkom uzrokovana hiperaktivacijom PARP1 i značajnim gubitkom NAD + bazena u stanicama karcinoma NQO1 +, uključujući PDA. 13 Kao što su drugi pokazali da je sam PAR polimer kritičan za signalizaciju i smrtonosnost u drugim oblicima (npr. Izloženost MNNG-u) stanične smrti posredovane hiperaktivacijom PARP1, pokušali smo definirati različite doprinose aktivnosti PARP1 i stvaranja PAR-a u sinergiji s kombiniranim tretmanom FK866 + β- kap. Kombinacija 26 β- Lap i FK866 NQO1 + MiaPaca2 ili AsPC1 rezultirala je gotovo neotkrivenim stvaranjem PAR-a zapadnom mrljom, za razliku od povišene razine PAR koja se uobičajeno primjećuje u stanicama raka NQO1 + tretiranim p -kapima (Slika 5a). Ovaj učinak je spašen obnavljanjem razina NAD + s NMN-om. Unatoč smanjenom skupu NAD + uzrokovanom prethodnom tretmanom FK866, izloženost MiaPaca2 stanica tretiranih β -kapom, inhibitorima PARP1, Rucaparib (AG014699) ili dodavanje BAPTA-AM za helat Ca 2+ (što je potrebno za indukciju p -lapa Hiperaktivacija PARP1), 29, 42, spriječila je dodatno iscrpljivanje ATP-a uzrokovano tretmanom β- kapkom u kombinaciji s FK866 (slika 5b). Ovi nalazi snažno sugeriraju da smanjenje NAD + bazena tretmanom FK866 povećava sposobnost PARP1 da potpuno iscrpi bazene NAD + nakon tretmana p- kapom, bez generiranja značajnog formiranja PAR (Slike 5b i c). Jednom kada se razina NAD + iscrpi, aktivnost PARP1 neće ispravno funkcionirati na popravljanju DNK lezija stvorenih visokim razinama ROS-a induciranim β- kapom, što rezultira bržom pretvorbom u dvostruke prekide DNK. Doista, odgođena γH2AX indukcija koja se obično vidi samo s liječenjem β- kapka pojavila se brže u stanicama MiaPaca2 izložene FK866 + β- kapku (Slika 5c, Dopunska slika S1E).

Image

Dodatak FK866 ukinuo je formiranje PAR-a i povećao DSB-ove u MiaPaca2 stanicama tretiranim p -kapkom. ( a ) PDK stanice NQO1 + MiaPaca2 ili AsPC1 prethodno su tretirane s FK866 (8 nM, 24 h), zatim je dodan β- kap (2, 5 μM) u prisutnosti ili odsutnosti dikumarola (Dic, 50 μM ) ili NMN (500 μM ) 20 min. Stanični ekstrakti su analizirani na formiranje PAR. Dikumarol inhibira aktivnost NQO1 čime sprječava hiperaktivaciju PARP1. B -inducirana PAR tvorba ukinuta je FK866 (8 nM) i spasila se NMN (500 μM). Razine aktinija su nadgledane kao kontrole opterećenja. ( b ) MiaPaca2 stanice prethodno su tretirane sa ili bez FK866 (8 nM), a zatim izložene p- kapici (3 μM) u prisutnosti ili odsutnosti (i) PARP1 inhibitora (Rucaparib (AG014699), 20 µM) ili (ii) helator kalcija (BAPTA-AM) u trajanju od 2 sata; Tretmani rukaparibom ili BATPA-AM sprječavaju hiperaktivaciju PARP1 u stanicama liječenim s β -kapkom. Izmjerene su 16, 29, 42 razine ATP-a nakon dvosatnog liječenja. Studentski t- testovi su izvedeni uspoređujući β- kapicu ili FK866 + β- kapicu s dodatkom Rucapariba (AG014699) ( n = 3 ± SD). ** P <0, 01. ( c ) MiaPaca2 stanice su prethodno tretirane ili nisu sa FK866 (8 nM, 24 h), zatim izložene p- zatvaraču (2, 5 μM), a formiranje PAR i γ -H2AX praćeno je u raznim vremenima tijekom 2 h izloženosti zapadnom mrljicom, Srednji intenziteti γ H2AX, kao mjera formiranja prekida dvostruke žice DNA, normalizirani su da djeluju na aktin, a razine su grabirane tijekom vremena (min) na Dodatnoj slici S1D. Smanjena aktivnost PARP1, kao rezultat sniženih razina NAD + od izloženosti FK866, rezultirala je bržom indukcijom γ -H2AX

Slika pune veličine

Formiranje ROS-a i mehanizam stanične smrti

Jedna od briga u spuštanju razina NAD + / NADH je da bi se mogao ugroziti uzaludni ciklus ovisan o NQO1. Međutim, primijetili smo da su razine H20 o generirane u stanicama MiaPaca2 nakon p- lapa tretmana sa ili bez FK866 (8 nM, prije i istodobne primjene) bile identične (Slika 6a). Nadalje, dodavanje pegilirane katalaze (150 U / ml) djelomično je spasilo smrtonosnost u stanicama MiaPaca2 izložene p- lapi + FK866 (slika 6b) na način sličan spašavanju zabilježenom u stanicama tretiranim samo s β- kapkom. 13, 43

Image

Izloženost NQO1 + MiaPaca2 stanica FK866 + β- kapkom dovodi do smrti stanice ovisne o NQO1, μ -calpainom. ( a ) Razine H2O2, nastale kao rezultat uzaludnog ciklusa p -lapa ovisnog o NQO1, praćene su u stanicama MiaPaca2 tretirane kao u 5 a pomoću CellRox-Glo, normalizirane u stanicama tretiranim DMSO. Pred8 i tretman FK866 s β- zatvaračem (μM) nije promijenio produkciju H202 tijekom 2 sata tretmana. ( b ) Dodavanje pegilirane katalaze (150 U / ml), neutralizirane formacije H2O2 u stanicama FK866 (8 nM) + β- zatvaraču (μM) tijekom 2 sata liječenja, što je djelomično spasilo kombiniranu smrtnost od tretmana, ( c ) Proteolitičko cijepanje kaspaze-7 i male podjedinice (27 kDa, strelica) µ -kalpaina kao pokazatelja aktivacije praćeno je western blotom 48 h nakon tretmana u stanicama MiaPaca2, prethodno tretiranim s FK866 (8 nM), sa ili bez β- zatvarača (4 μM) 2 h. Tretiranje stanicama MiaPaca2 staurosporinom (1 µM, 18 h) poslužilo je kao pozitivna kontrola klasične apoptoze. Analiza protočne citometrije stanica subG 0 G 1 nakon istih uvjeta liječenja (SD u zagradama), histogram na Dodatnoj slici S2A. ( d ) Atipična proteoliza p53, kao što se očekivalo sa staničnom smrću uzrokovanom µ -kalopainom, uočena je 48 sati nakon izlaganja samo β- kaplju ili nakon kombinacije liječenja FK866 + β- kapkom. Intenzitet pojasa kvantificiran je i normaliziran na intenzitet aktinskog opsega kao indirektnog kvantifikacije aktivnosti µ-kalpaina. ( e ) MiaPaca2 stanice su prethodno i istovremeno tretirane sa ili bez FK866 (8 nM, 24 h) i zatim izložene ili nisu izložene FK866 + β- kapku (2 M) tijekom 2 sata. Propusnost membrane izmjerena je 24 sata nakon liječenja lijekom primjenom CellTox Green, membranske nepropusne boje koja mjeri vanćelijsku DNA. Stanice su lizirane s SDS-om radi 100% normalizacije propusnosti. Za usporedbu, STS je izazvao unutarnju apoptozu, ali ne nekrozu. Svi navedeni rezultati uspoređeni su sa Studentovim t- testovima ( n = 3, ± SD). * P <0, 05 ; ** P <0, 01 ; *** P <0, 001

Slika pune veličine

Hipotetizirali smo da će stanice MiaPaca2 izložene FK866 + β- kapljici umrijeti istim putem nezavisnim od kaspaze, ali apoptozom programiranom stanicom smrti stanice koja se događa u stanicama raka NQO1 + tretiranim s β -kapkom. 30 Izlaganje MiaPaca2 stanica 4 h M β- kapku tijekom 2 sata rezultiralo je značajnom apoptozom (41%); stanicama je nedostajalo rascjep kaspaze, 9 i pokazali su se µ -kalpain aktivacijom stvaranjem 23 kDa aktivnog oblika male podjedinice µ -kalpaina 48 sati nakon tretmana (Slika 6c). Atipično cijepanje p53 kataliziranog µ -calpainom također je uočeno u stanicama β- kapka i kombinirano tretiranim (Slika 6d). 12 Izlaganje MiaPaca2 stanica FK866 + β- kapku rezultiralo je značajnim razinama apoptotskih stanica (> 50%) za koje se čini da umiru istim mehanizmom (slike 6c i d) kao što je zabilježeno smrtonosnom dozom β- kapka. 9, 16 Liječenje MiaPaca2 stanica samo FK866 (8 nM, 24 h) nije uzrokovalo značajnu apoptozu (Slika 6c). Kako nakupljanje PAR-a nije zabilježeno u staničnoj smrti uzrokovanoj FK866 + β- kapom, zaključujemo da slobodni PAR nije potreban u ovom stadiju smrti stanice ovisne o gubicima (Slike 5 i 6).

Iscrpljivanje NAD + / NADH, NADP + / NADPH i ATP se dogodilo u većoj mjeri s kombiniranim liječenjem β- lap + FK866 nego samo s β- kapkom (slika 3), što može promicati nekrozu, pa smo ispitali promjene u propusnosti stanične membrane. Otkrili smo da propusnost membrane nakon izlaganja FK866 + β- kapku ne nadmašuje onu stanica koje su tretirane samo s β- kapom i da su obje usporedive sa stanicama koje su podvrgnute kanoničnoj apoptozi induciranoj agensom koji izaziva apoptozu, staurosporinom (slika 6e)., kondenzirane jezgre i redukcija citoplazme uočene nakon kombiniranog liječenja je slična morfologiji apoptotskih stanica (dopunska slika S2B).

Rasprava

Dodavanje β- kapka kratkotrajnom liječenju FK866 rezultiralo je poboljšanom specifičnošću i djelotvornošću tumorskih stanica, što se obično ne može naći samo s FK866 tretmanom. Ova kombinacija rezultirala je povećanim lezijama DNA, opsežnijim gubitkom NAD + / ATP posredovanim PARP1 i metaboličkom katastrofom. Za MNNG, alkilirajuće sredstvo koje uzrokuje oštećenje DNK i hiperaktivaciju PARP1, prijavljeno je da blokira glikolizu pomoću slobodnog mehanizma inhibicije heksokinaze posredovanog PAR-om. 27 Suprotno tome, izlaganje β- kapka uzrokovalo je inhibiciju GAPDH-a čak i u prisutnosti viška NADH, što bi moglo biti posljedica post-translacijske modifikacije izazvane oksidativnim stresom ili PARilacijom. 40 Međutim, PAR se nije akumulirao u stanicama koje su tretirane s FK886 + β- kapkom, ali postojeća inhibicija GAPDH zabilježena je u istoj mjeri kao i stanice izložene samo p- zatvaraču. Iako mehanizam pomoću kojeg GAPDH inhibira kombiniranim liječenjem nije definitivno poznat, postoji nekoliko mogućih opcija. Ranije smo izvijestili da ovisna o NQO1, ROS-inducirana S-nitrozilacija i nuklearna translokacija GAPDH u različitim stanicama karcinoma NQO1 nakon liječenja s p- kapom, 13 i nepovratna inhibicija GAPDH posredovana reaktivnim dušikom također je prethodno prikazana in vitro . 44 Bez obzira na specifični mehanizam, inhibicija GAPDH β- kapom pojačana je dodatnim iscrpljivanjem NAD + uzrokovanim kombiniranim liječenjem FK866, što se vidi drastično povećanom akumulacijom GA3P, i ima dugoročne učinke na glikolitičku aktivnost. In addition, our data strongly suggest that free PAR accumulation is not a major component. Without active ATP synthesis, cancer cells cannot recover from depleted NAD + pools or repair the extensive DNA lesions caused by β -lap, resulting in cell death. 29

Addition of FK866+ β -lap to NQO1-overexpressing cancer cells caused a burst of ROS-induced DNA damage and NAD + /ATP depletion in a near-identical manner to the caspase-independent, μ -calpain-mediated cell death pathway induced by lethal doses of β -lap alone, despite the additional energy depletion. Death occured in over 90% of asynchronous cancer cells after 2 h of combination treatment, and the cell cycle distribution was not altered post treatment, suggesting cell cycle independence. There are reports of β -lap inducing caspase-mediated apoptosis, but this is noted only after long-term continuous treatment with β -lap, which also reduces specificity for NQO1+ overexpressing cells. 45, 46, 47 Others have reported that PAR polymers directly influence μ -calpain activation, and are critical for inducing cell death under conditions where PARP1 hyperactivation occurs, such as with MNNG treatment or ischemia-reperfusion. 25, 26 With the treatment conditions reported herein, PARP1 activity is stimulated by β -lap, but extensive PAR formation did not occur owing to low NAD + levels, and rescuing PAR formation and NAD + levels with NMN decreases cytotoxicity. Nevertheless, μ -calpain activation/proteolysis and caspase-independent apoptosis still occured, demonstrating that PARP1 hyperactivation to deplete energy stores was more important than the formation and accumulation of extensive PAR polymers. Our findings with β -lap are consistent with a report that NAMPT inhibition synergizes with pemetrexed in a PARP1-dependent manner with an associated reduction in PAR formation. 48 We find that severe NAD + /NADH depletion induced by β -lap causes metabolic catastrophe, ATP depletion, and cell death that is independent of PAR accumulation and is promoted by NAMPT inhibition. We refer to this mode of cell death as NAD + -Keresis, after the death spirits in Greek mythology called Keres, who pull the life out of those who die violently, in this case through severe NAD + /NADH depletion.

Novel therapies are desperately needed for patients with PDA. By combining NAMPT inhibitors (eg, FK866) and NQO1 bioactivatable drugs (eg, β -lap, ARQ761) we exploit the reliance of PDA on rapid NAD + synthesis, as well as the tumor-selective overexpression of NQO1 through the use of agents that are bioactivated to induce cell death. Combination treatment with NAMPT inhibitors+ β -lap addresses issues associated with either agent alone. This combination is expected to enhance efficacy at well-tolerated doses of these drugs. We noted that FK866+ β -lap combination treatment was most effective with FK866 pretreatments followed by β -lap co-treatment. This was consistent with our hypothesis that lowered NAD + /NADH levels caused by FK866 would sensitize NQO1+ tumor cells to rapid futile redox cycling initiated by β -lap. Importantly, cytotoxicity of these drugs to normal cells is not increased with combination treatment; elevated NQO1 expression is still required to achieve cell death. Furthermore, the β -lap doses used in our studies are relevant to those achievable in vivo. 49 Likewise, the maximum tolerated dose of FK866 in clinical trials yielded a 14 nM steady state plasma concentration, which is in the effective synergy range for combination treatment with β -lap. 50 However, for single-agent treatment, it was administered continuously for 96 h. Combination treatment with β -lap significantly reduced the required FK866 treatment time, which should increase the feasibility of its clinical application. Next-generation NAMPT inhibitors currently in development, which demonstrate better PK profiles, are expected to similarly benefit from combination treatment, with reduced need for long-term infusion. 51 This treatment strategy will be pursued in further preclinical studies to explore potential clinical application and to further elucidate the pathways and mechanism of NAD-Keresis.

Materijali i metode

Kemikalije i reagensi

We synthesized and purified β -lap and prepared a stock solution at 50 mM in DMSO. FK866 hydrochloride hydrate, GMX1778, Dic, catalase-polyethylene glycol, and BAPTA-AM were purchased from Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA).

Stanična kultura

Cell lines were obtained from ATCC. They were grown in DMEM (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) containing 10% FBS (Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) in a 37 ° incubator with 5% CO 2 . Cells were tested monthly to confirm the absence of mycoplasma contamination. Lipofectamine RNAiMAX (Life Technologies) was used for siRNA transfections. Cells were transfected with one of two siRNAs purchased from Sigma-Aldrich to target NAMPT (NAMPT #1: SASI_Hs02_00340191, NAMPT #2: SASI_Hs02_00340192, or a non-targeting control siRNA). After 48 h of incubation with RNAiMax and siRNA in OptiMEM (Life Technologies), cells were detached with trypsin/EDTA (Life Technologies) and seeded for treatment assays or lysed for analysis of knockdown efficiency. For combination drug treatments, cells were treated for 24 h with FK866 followed by co-treatment with β -lap in complete media. Two hours after β -lap addition, drug-containing media were removed and replaced with fresh media.

Clonogenicity

After β -lap, FK866, or combination treatment at 60% confluency, cells were trypsinized, counted with a Coulter Counter, and diluted in single-cell suspension. Cells were then seeded at 100, 500, or 1000 cells per plate on 60 mm plates and allowed to proliferate for 7 days. Plates were washed in PBS and cells were fixed and dyed with methanol/crystal violet. Colonies of 50 or more cells with normal appearance were counted and results were normalized to the colonies formed without drug treatment.

Nucleotide, GSH, and H2O2 assays

CellTiter-Glo (Promega, Madison, WI, USA) was used for cell viability assays (24 h after treatment) and ATP assays (at indicated time points during or after β -lap treatment). The following assays were purchased from Promega: GSH/GSSG-Glo, NAD/NADH-Glo, NADP/NADPH-Glo, and ROS-Glo and were used as directed. Unless otherwise noted, all raw luminescent values for treatment conditions were normalized to the signal from untreated cells (T/C). Standard curves were generated to ensure linearity.

imunoblatin

Cells were lysed in ice-cold RIPA with protease and phosphatase inhibitors (Santa Cruz, Dallas, TX, USA). Whole-cell extracts were prepared by centrifugation at 14 000 × g to remove insoluble components. Protein concentration was determined by BCA assay (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) and loading volume was normalized. Extracts were run on 8 or 4–20% (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) gradient acrylamide SDS-PAGE gels and transferred to PVDF membrane. Primary antibodies for protein detection included: phospho-H2A.X (JBW301, Millipore, Billerica, MA, USA), PARP1 (F-2, Santa Cruz), PAR (Trevigen, Gaithersburg, MD, USA), Actin (C-2, Santa Cruz), visfatin/NAMPT (rabbit polyclonal, Abcam, Cambridge, UK), small subunit calpain (EPR3324, Abcam). Primary hybridization was carried out in Sigma casein blocking buffer at 4 ° overnight. Secondary HRP conjugated antibodies were incubated for 1 h at room temperature, followed by detection with SuperSignal West Pico (Thermo Scientific). Bands were quantified by mean intensity in ImageJ and normalized to the actin band intensity to control for loading variation.

Glycolytic flux

A Seahorse XF24 bioanalyzer (Seahorse Bioscience, North Billerica, MA, USA) was used for glycolytic stress tests. Cells were seeded at 3 × 10 4 cells/well in 24-well plates and were treated with β -lap at 4 μ M for 2 h in complete media and washed with fresh Seahorse media. The glycolytic stress test kit was used to inject glucose, oligomycin, and 2-deoxy-D-glyucose at the indicated times.

GAPDH activity

Cells were pretreated ± FK866 for 24 h, co-treated ± β -lap for 2 h, washed with PBS, and assayed for GAPDH activity using the KDalert GAPDH activity assay (Life Technologies) as directed.

Metabolomics

Subconfluent MiaPaca2 cells were pretreated ± FK866 for 24 h and co-treated with β -lap for 30 min. Cells were washed twice with ice-cold saline, then scraped in methanol/water (50/50, v/v). Cells were subjected to three freeze–thaw cycles. After rigorous vortexing, cell debris was removed by centrifugation. Pellets were used for protein quantitation (BCA Protein Assay, Thermo Scientific). The supernatant was evaporated to dryness using a SpeedVac concentrator (Thermo Savant, Holbrook, NY, USA) and metabolites were reconstituted in 0.03% formic acid in analytical-grade water and centrifuged to remove insoluble debris. Supernatants were transferred to HPLC vials for metabolomics analyses.

Targeted metabolite profiling was performed using a liquid chromatography-mass spectrometry/mass spectrometry approach. Separation was achieved on a Phenomenex Synergi Polar-RP HPLC column (150 × 2 mm, 4 μ M, 80 Å) using a Nexera Ultra High Performance Liquid Chromatograph system (Shimadzu Corporation, Kyoto, Japan). The mobile phases used were 0.03% formic acid in water (A) and 0.03% formic acid in acetonitrile (B). The gradient program was as follows: 0–3 min, 100% A; 3–15 min, 100–0% A; 15–21 min, 0% A; 21–21.1 min, 0–100% A; 21.1–30 min, 100% A. The column was maintained at 35 °C and samples were kept in the autosampler at 4 °C. The flow rate was 0.5 ml/min, and injection volume 10 μ l. The mass spectrometer was an AB QTRAP 5500 (Applied Biosystems SCIEX, Foster City, CA) with electrospray ionization source in multiple reaction monitoring (MRM) mode. Sample analyses were performed in positive/negative switching mode. Declustering potential and collision energy were optimized for each metabolite by direct infusion of reference standards using a syringe pump prior to sample analysis. The MRM MS/MS detector conditions were set as follows: curtain gas 30 psi; ion spray voltages 5000 V (positive) and −1500 V (negative); temperature 650 °C; ion source gas 1 50 psi; ion source gas 2 50 psi; interface heater on; entrance potential 10 V. Dwell time for each transition was set at 3 msec. MRM data were acquired using Analyst 1.6.1 software (Applied Biosystems SCIEX). Chromatogram review and peak area integration were performed using MultiQuant software version 2.1 (Applied Biosystems SCIEX). The integrated peak area values were used as variables for the statistical data analysis. The chromatographically co-eluted metabolites with shared MRM transitions were shown in a grouped format, that is, G6P/F6P.

Lactate and glucose quantification

Cells were pretreated with FK866 for 24 h and co-treated with β -lap for 2 h in complete media. After co-treatment, media was replaced with low glucose, phenol-free DMEM (Invitrogen) with 5% FBS and collected at indicated times for analysis with a BioProfile Automated Analyzer (Nova Biomedical, MA, USA).

Protok citometrija

For cell cycle analysis, cells were pretreated with FK866 followed by co-treatment with β -lap for 2 h. Drug-containing media was removed and cells were incubated in fresh complete media for 48 h. Cells were trypsinized, and both adherent and floating cells were collected and washed in 1% BSA in PBS. After fixing cells in 70% ethanol, cells were washed and resuspended in BSA/PBS buffer containing propidium iodine and saponin. Cells were analyzed on a FACSAria (BD Biosciences, San Jose, CA, USA) and cell cycle distribution was calculated in FlowJo.

statistika

Unless otherwise noted, graphs are plotted as mean with error bars denoting SD Curve fitting and calculation of IC50 values, ANOVA, and two-tailed student t -tests for statistical significance with Holm/Sidak multiple comparison correction were performed in GraphPad Prism 6.

Dodatna informacija

Datoteke slika

  1. 1.

    Dopunska slika S1

  2. 2.

    Dopunska slika S2

Word dokumenti

  1. 1.

    Dopunske slikovne legende

Glosar

PDA

pancreatic ductal adenocarcinoma

NAD

nicotinamide adenine dinucleotide

ADP

adenosine diphosphate

PAR

poly(ADP ribose)

NAMPT

nicotinamide phosphoribosyltransferase

NQO1

NADPH:quinone oxidoreductase

PARP1

poly(ADP ribose) polymerase

AIF

faktor koji izaziva apoptozu

GAPHD

glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase

β -lap

β -lapachone

ROS

reaktivne vrste kisika

MNNG

methylnitronitrosoguanidine

ATP

adenozin trifosfat

DER

dose enhancement ratio

Dic

dicoumarol

NMN

nicotinamide mononucleotide

GSH

glutathione (reduced)

ECAR

extracellular acidification rate

Oligo

oligomycin

2-DG

2-deoxy-D-glucose

FK

FK866

G6P

glucose 6-phosphate

F6P

fructose 6-phosphate

GA3P

glyceraldehyde 3-phosphate

STS

staurosporina

RNS

reactive nitrogen species

PK

pharmacokinetics

Dodatne informacije nalaze se u ovom radu na web stranici Cell Death and Disease (//www.nature.com/cddis)