Negativna regulacija signalizacije receptora hemokina i hemotaksija b-stanica po p66shc | stanična smrt i bolest

Negativna regulacija signalizacije receptora hemokina i hemotaksija b-stanica po p66shc | stanična smrt i bolest

Anonim

teme

  • B ćelije
  • Stanična signalizacija
  • kemokina
  • kemotaksije

Sažetak

Shc (adapteri domene Src homologija 2) su sveprisutne komponente signalnih putova pokrenutih receptorima vezanim za tirozin kinazu. U limfocitima, slično ostalim tipovima stanica, p52 i p66 izoformi ShcA / Shc sudjeluju u samoograničavajućoj petlji gdje p52Shc djeluje kao pozitivni regulator signala receptora antigena promičući Ras aktivaciju, dok p66Shc ograničava tu aktivnost konkurentnim inhibiranjem p52Shc, Na temelju činjenice da mnogi signalni mediatori dijele antigene i hemokinske receptore, uključujući p52Shc, procijenili smo potencijalnu implikaciju p66Shc na regulaciju B-staničnih odgovora na hemokine, usredotočujući se na receptore starenja CXCR4 (CXC hemokinski receptor tip 4 ) i CXCR5 (CXC hemokinski receptor tip 5). Rezultati identificiraju p66Shc kao negativni regulator kemotaktičkih odgovora koje su aktivirali ti receptori, uključujući adheziju, polarizaciju i migraciju. Također pružamo dokaze da ova funkcija ovisi o sposobnosti p66Shc da komunicira s hemokinskim receptorima i promovira sastavljanje inhibicijskog kompleksa, koji uključuje fosfataze SHP-1 (Src homologija fosfataza-1) i SHIP-1 (SH2 domena - koji sadrži inozitol 5'-fosfatazu-1), što rezultira oštećenom Vav-ovisnom reorganizacijom aktinocitoskeleta. Ova se funkcija preslikava na fosforilibilne tirozinske ostatke u domeni kolagena homologija 1 (CH1). Rezultati identificiraju p66Shc kao negativni regulator kemotaksije B-stanica i sugeriraju ulogu ovog adaptera u kontroli navođenja B-stanica.

Glavni

Homeostaza i aktivacija limfocita zahtijevaju njihov ciklički promet kroz sekundarne limfoidne organe (SLO). Limfociti koji dolaze u SLO, kao i njihov promet tamo regulirani su receptorima koji reagiraju na hemokine koji nastaju iz stromalnih stanica. 1 Glavni receptori za B-stanične stanice su CCR7 (CC hemokinski receptor tip 7) i CXCR4 (CXC hemokinski receptor tip 4) koji su odgovorni za njihov izlazak iz krvotoka i ulazak u SLO, 2 dok promet B-stanica u folikule je regulirano CXCR5 (CXC hemokinski receptor tip 5). 3 Ovi receptori također pomažu zadržavanje B-stanica u SLO-ima što je bitno da B-stanice dobiju znakove preživljavanja i aktiviraju se u prisutnosti antigena. 3

Hemokinski receptori orkestriraju sekvencijalne korake starenja limfocita, to jest zaustavljanje, polarizaciju i transendotelnu migraciju, oba izazivajući pretvorbu integina u njihovu visoko afinitetnu konformaciju za njihove ligande na endotelnim stanicama (ECs), što rezultira čvrstom adhezijom, i promicanjem citoskeletnih izmjenjivanja potrebnih za polarizaciju i migraciju. 4 Hemokinski receptori su trans-membranski receptori povezani u vezi s proteinom koji smanjuju cikličku proizvodnju adenozin monofosfata (cAMP) inhibiranjem adenylat ciklaze. 5 Src kinaza sudjeluje u Gi / cAMP-ovisnim putima koje pokreću hemokinski receptori, pokreću kaskadu fosorilacije koja promiče signale iznutra prema van integrinima i Rho GTPase-ovisne citoskeletne preuređevine potrebne za staničnu polarizaciju i migraciju. 6, 7, 8 Hemokinski receptori također pokreću Gi-neovisan, Janus kinaza (JAK) ovisan put uključen u staničnu migraciju. 8 Stoga je hemotaksija koordinirano regulirana s više signalnih putova.

Za razliku od T stanica, gdje je signaliziranje hemokinskih receptora značajno okarakterizirano 9, naše razumijevanje signalnih kaskada koje pokreću navođenje receptora u B-stanicama je izrazito ograničeno, bez obzira na činjenicu da su neke od molekula uključene, poput npr. slezena tirozin kinaza (Syk), fosfatidilinozitid 3-kinaza (PI3-K) i Bruton-ova tirozin-kinaza (Btk) terapeutski se koriste za liječenje novotvorina B-stanica. 10, 11 Konkretno, uloga adaptera koji spajaju proksimalne tirozin kinaze (TK) na medijatorima nizvodno u drugim signalnim putovima B-stanica ostaje u velikoj mjeri nedostižnom.

Shc (adapteri domene Src homologija 2) uključeni su u sve središnje stanične procese, uključujući proliferaciju, diferencijaciju, preživljavanje i pokretljivost. 12 U limfocitima p52 i p66 ShcA / Shc izoformi formiraju samoograničavajuću petlju s p52Shc pozitivno regulirajućom signalizacijom receptora antigena (AgR), a p66Shc djeluje kao konkurentski inhibitor. 12 Sukladno tome, mitogeni i preživljavajući odgovori na AgR angažman poboljšani su kod p66Shc - / - miševa, što rezultira autoimunitetom. 13 Nadalje, B-stanice kronične limfocitne leukemije (CLL) imaju oštećenje ekspresije p66Shc što pridonosi njihovom produljenom preživljavanju. 14 Na temelju činjenice da mnogi signalni posrednici dijele AgR i hemokinske receptore, uključujući p52Shc, 15 ovdje smo procijenili potencijalnu implikaciju p66Shc na regulaciju odgovora B-stanica na hemokine. Pokazujemo da p66Shc djeluje kao negativni regulator svih koraka hemotaktičkih odgovora aktiviranih CXCR4 i CXCR5 inhibirajući reorganizaciju citoskeleta aktina ovisnih o Vav-u i pruža uvid u mehanizam kojim p66Shc odvaja ove receptore od Vav-aktivacije.

Rezultati

p66Shc inhibira ljepljenje i polarizaciju B-stanica ovisnih o CXCR4 i CXCR5

Adhezija B-stanica na EC regulirana je antigenom-1 (LFA-1) povezanim s funkcijom limfocita limfocita, koji djeluje na međućelijsku adhezijsku molekulu-1 (ICAM-1) i vrlo kasni antigen-4 (VLA-4), koji komunicira s VCAM-1 i ECM komponentom, fibronektinom (FN). Uloga p66Shc u adheziji B-stanica prvobitno je obrađena u pECS-deficitarnim MEC B-stanicama, 14 stabilno transfektiranim s p66Shc-enkodirajućim konstrukcijama, koristeći prazne vektorski transficirane stanice kao kontrolu. Svi transfektanti izražavaju slične razine LFA-1 i VLA-4, kao i CXCR4 i CXCR5 (dopunska slika S1A). Stanice su posađene na imobiliziranom ICAM-1 ili FN u prisutnosti ili odsutnosti CXCL12 (CXC motiv hemokina 12) ili CXCL13 (CXC motiv hemokina 13). Udio stanica koje su se prilijepile nakon kratke inkubacije određen je protočnom citometrijom. Kao što se očekivalo, kontrolne stanice su bile podvrgnute dubokim morfološkim promjenama u prisutnosti bilo kemokina, od okruglog do polariziranog fenotipa, karakteriziranog izbočinama bogatim F-aktinom (Slika 1a). p66Shc ekspresija rezultirala je oštećenom adhezijom ovisnom o CXCR4 i CXCR5 na ICAM-1 / FN (Slika 1b). U skladu s ovim nalazom, snimanje ovih stanica pokazalo je da je punktatni obrazac LFA-1, koji nastaje kao rezultat grupiranja integrina nakon konformacijske promjene visokog afiniteta, 16 izgubljen u MEC stanicama koje eksprimiraju p66Shc (dopunska slika S2). Polarizacija je također smanjena u prisutnosti p66Shc, što je procijenjeno kvantiziranjem stanica obojenih faloidinom u kojima se nalazi polarizirana morfologija (Slike 1a i c).

Image

p66Shc inhibira CXCR4- i CXCR5-ovisnu, integgrinski posredanu B-staničnu adheziju i polarizaciju. ( a ) Imunofluorescentna analiza kontrolnih MEC-ovih transfektanata (ctr) postavljenih na toboganima prekrivenim 10 µg / ml rhICAM-1 / Fc, bilo nestimulirano ili stimulirano sa 100 ng / ml CXCL12 ili 200 ng / ml CXCL13, i označeno sa Phalloidin- TRITC (crvena) i antitijela protiv aktina (zelena). Prikazani su medijani optičkih presjeka. Traka veličine, 5 µm. ( b, d ) Kvantifikacija protočnom citometrijom postotka ctr i p66 stabilno transficiranih MEC stanica ( b ) ili splenocita iz mt i p66Shc - / - miševa ( d ) koji su se lijepili na pločice s 48 jažica obložene s 10 µg / ml rhICAM-1 / Fc ili 10 µg / ml Fibronektina nakon 10 minuta liječenja s 100 ng / ml CXCL12 ili 200 ng / ml CXCL13. Miševe stanice obilježene su anti-CD3-FITC / anti-CD22-PE antitijelima prije analize. Podaci koji se odnose na četvorostruke uzorke iz četiri neovisna pokusa prikazani su kao% ukupnih ulaznih ćelija koje su ostale pričvršćene na svaku jažicu. Trake grešaka, SD * P ≤0, 05; ** P ≤ 0, 01; *** P ≤0, 001. ( c, e ) Kvantifikacija postotka polariziranih stanica u ctr i p66 MEC transfektantima ( c ) ili u B limfocitima pročišćenim iz slezene wt i p66Shc - / - miševa ( e ) posađenih 5 min na slajdovima obloženim bilo 10 µg / ml rhICAM-1 / Fc ili 10 µg / ml Fibronektin stimuliran je 5 min s 100 ng / ml CXCL12 ili 200 ng / ml CXCL13 i označen s Phalloidin-TRITC i anti-aktin protutijela. Postotak polariziranih prema nepolariziranim stanicama izračunan je na četiri različite slike širokog polja iz svake jažice u tri neovisna pokusa. Trake grešaka, SD * P ≤0, 05; ** P ≤0.01

Slika pune veličine

Slični eksperimenti provedeni su na B-stanicama slezene s divljih vrsta i p66Shc - / - miševima. Adhezija ovisna o CXCL12 i CXCL13 na ICAM-1 / FN (slika 1d), kao i polarizacija (slika 1e) značajno su poboljšane u p66Shc - / - B-ćelijama u usporedbi sa njihovim divljim kolegama, što ukazuje na to da izraz p66Shc na fiziološkoj razini je dovoljan da negativno regulira reakciju B-stanica na ove hemokine. Nije primijećena razlika u razinama ekspresije bilo LFA-1 / VLA-4 ili CXCR4 / CXCR5 između divljeg tipa i p66Shc - / - B-stanica (dopunska slika S1B). Dakle, p66Shc djeluje kao negativni regulator izlaznih putova koji spajaju CXCR4 / CXCR5 s aktivacijom integrin.

p66Shc inhibira hemotaksiju B-stanica ovisnu o CXCR4 i CXCR5

Utjecaj p66Shc na B-staničnu hemotaksiju razmotren je u testima transwell migracije, koristeći CXCL12 / CXCL13 kao kemoatraktante. I migracija ovisna o CXCR4 i CXCR5 oslabljena je u MEC stanicama koje eksprimiraju p66Shc u usporedbi s kontrolama (slika 2a). U skladu s ovim opažanjem, migracija p66Shc - / - B-stanica prema CXCL12 / CXCL13 je poboljšana u usporedbi s kontrolama divljeg tipa (Slika 2b).

Image

p66Shc inhibira hemotaksiju B-stanica ovisnu o CXCR4 i CXCR5. ( a ) Migracija ctr i p66 MEC transfektanata, izmjerena nakon tretmana u trajanju od 3 sata s 100 ng / ml CXCL12 ili 200 ng / ml CXCL13. Podaci dobiveni na duplikatnim uzorcima iz najmanje tri neovisna eksperimenta, prikazani su kao srednji indeks migracije ± SD (omjer migriranih stanica u tretiranim hemokinom u odnosu na neobrađene uzorke). *** P ≤0, 001. Nepovezani hemotaktički stimulans (10 µM f-MLP) korišten je kao negativna kontrola. Nije opažena migracija niti kontrolnih niti p66Shc-ekspresionirajućih MEC stanica kao odgovor na ovaj tretman (podaci nisu prikazani). ( b ) Migracija stanica dobivenih iz slezene, koštane srži ili limfnih čvorova wt i p66Shc - / - miševa tretiranih 3 sata s 100 ng / ml mCXCL12 ili 200 ng / ml mCXCL13 i obojene anti-CD3-FITC / anti-CD22-PE antitijela. Podaci dobiveni na duplikatnim uzorcima iz najmanje tri neovisna eksperimenta, prikazani su kao srednji indeks migracije ± SD * P ≤ 0, 05; ** P ≤0.01. ( c i d ) Kvantifikacija protočnom citometrijom postotka ctr i p66 stabilno transficiranih MEC stanica ( c, donja ploča) ili splenocita iz wt i p66Shc - / - miševa ( d ) koji su ostali prianjaju za stromalne stanice uzgajane na 48- ploče za jažice nakon stimulacije sa 100 ng / ml CXCL12 ili 200 ng / ml CXCL13. Prije prebrojavanja, MEC stanice su obilježene anti-CD19-FITC mAb, a mišje stanice sa anti-CD3-FITC / anti-CD22-PE antitijelima. Podaci koji se odnose na četvorostruke uzorke iz najmanje četiri neovisna pokusa prikazani su kao% ukupnih ulaznih ćelija koje su ostale pričvršćene na svaku jažicu. Trake grešaka, SD * P ≤0, 05; ** P ≤ 0, 01; *** P ≤0, 001. ( c, gornja ploča). Imunofluorescentna analiza ctr i p66 MEC transfektanata obojenih s DiO (zeleno) ili Dil (crveno) inkubirano 10 minuta na stromalnim stanicama uzgojenim na slajdovima s 8 jažica i bilo nestimulirano ili stimulirano 40 min sa 100 ng / ml CXCL12 ili 200 ng / ml CXCL13. Prikazani su medijani optičkih presjeka. Traka veličine, 5 µm

Slika pune veličine

Sposobnost p66Shc da utječe na hemotaksiju dodatno je procijenjena u testovima pseudoemperipoleze B-stanica koji mjere sposobnost B-stanica da prelaze ispod ko-kultivirane stromalne stanice. 17 Spontana emperipoleza nije bila zahvaćena p66Shc. U varijanci, MEC stanice koje eksprimiraju p66Shc su podvrgnute pseudoemperipolizi koja ovisi o CXCR4 i CXCR5, s manjom učinkovitošću u usporedbi s kontrolama (Slika 2c). Taj je defekt potvrđen u eksperimentima s kulturom pomoću mješavine kontrolnih i p66Shc-ekspresirajućih MEC stanica označenih s različitim fluorescentnim sondama. Zapravo, manji broj stanica koje eksprimiraju p66Shc podvrgnut je pseudoemperipolizi u usporedbi s kontrolama unutar istog sloja strome (Slika 2c). U skladu s ovim rezultatima, pseudoemperipoleza je pojačana u p66Shc - / - B-stanicama u usporedbi s B-stanicama divljeg tipa (Slika 2d). Stoga, p66Shc djeluje kao negativni regulator migracije B-stanica ovisnih o CXCR4 i CXCR5.

p66Shc inhibira polimerizaciju aktina koja ovisi o CXCR4 i CXCR5 i vav aktivaciju

Sposobnost p66Shc-a da utječe na polarizaciju i migraciju B-stanica kao odgovor na CXCL12 / CXCL13 sugerira da može biti uključeno u spajanje CXCR4 / CXCR5 za polimerizaciju aktina. Ovaj problem je riješen konfokalnom mikroskopijom kontrolnih i p66Shc-ekspresionirajućih MEC stanica posađenih na ICAM-1 / FN u prisutnosti ili odsutnosti CXCL12 ili CXCL13. Stanice su označene sa faloidinom kako bi se identificiralo F-aktin i anti-aktinsko monoklonsko antitijelo (mAb) kao normalizacijska kontrola. Mjerenje intenziteta fluorescencije F-aktina pokazalo je da ekspresija p66Shc rezultira značajnim oštećenjem polimerizacije aktina ovisnih o CXCR4 i CXCR5 (slika 3a; nije prikazana za FN). Slični eksperimenti provedeni su na pročišćenim slezeni divljeg tipa i p66Shc - / - B-stanicama. Uočena je snažnija polimerizacija aktina kao odgovor na CXCL12 / CXCL13 p66Shc - / - B-stanica presadjenih ili na ICAM-1 (slika 3b) ili FN (nije prikazana) u usporedbi s divljim B-stanicama koje podržavaju ulogu za p66Shc u povezivanju CXCR4 / CXCR5 za polimerizaciju aktina.

Image

p66Shc inhibira polimerizaciju aktina i ovisnost o CXCR4 i CXCR5 i vav fosforilaciju. ( a i b ) Kvantifikacija polimerizacije aktina u ctr i p66 MEC transfektantima ( a ) ili u B limfocitima pročišćenim od slezene wt i p66Shc - / - miševa ( b ), posađenih 5 minuta na toboganima prekrivenim 10 µg / ml rhICAM-1 / Fc i stimulirao se 5 min s 100 ng / ml CXCL12 ili 200 ng / ml CXCL13. Nakon toga su dijapozitivi obilježeni Phalloidin-TRITC i anticitenskim antitijelima. Podaci, izračunati na četiri različite slike širokog polja iz četiri neovisna pokusa, prikazani su kao srednji intenzitet fluorescencije (MFI) obojenja Phalloidinom u stimuliranim nasuprot nestimuliranim uzorcima, kvantitativno korištenjem ImageJ softvera i normaliziran u unutarćelijski sadržaj aktina. Trake grešaka, SD ** P ≤0.01; *** P ≤0, 001. ( c ) Imunoblotska analiza antifosfo-Vav antitijema postnuklearnih supernanata iz ctr i p66 MEC transfeknata bilo nestimulirana ili stimulirana 1 ili 5 min sa 100 ng / ml CXCL12 (lijevo) ili 200 ng / ml CXCL13 (desno). Kontrolni anti-Vav imunoblots oduzetih filtera su prikazani dolje. Označena je migracija markera molekularne mase. ( d, desno) Konfokalna mikroskopska analiza fosforilacije Vav u ctr i p66 MEC transfektantima stavljena 5 minuta na stakalce obložene s 10 µg / ml rhICAM-1 / Fc i stimulirane 2 min s 100 ng / ml CXCL12 ili 200 ng / ml CXCL13. Zatim su dijapozitivi obilježeni anti-fosfo-Vav i anti-Vav antitijelima. Prikazani su medijani optičkih presjeka. Traka veličine, 5 µm. ( d, lijevo) Kvantifikacija Vav fosforilacije na četiri različite slike širokog polja iz tri neovisna eksperimenta predstavljena kao MFI obojenja fosfo-Vava u stimuliranim nasuprot nestimuliranim uzorcima, kvantificirana pomoću ImageJ softvera i normalizirana u intracelularni sadržaj Vav. Trake pogrešaka, SD *** P ≤0.001

Slika pune veličine

Polimerizacija aktina orkestrira Rho GTPases. Aktivacija Rac1 (supstrat 1 povezan sa C3 botulinskim toksinom 1) i Cdc42 (protein dijeljenja stanične stanice 42 homolog) ovisi o gvanin nukleotidnom izmjenjivaču, Vav, koji se aktivira fosforilacijom tirozina i štoviše regulira PIP 2 / PIP 3 ( 4, 5-bisfosfat / (3, 4, 5) -trifosfat fosfatidilinozitol) veže se na njegovu domenu pleckstrin homologije (PH). 19 Imunoblotska analiza vas fosforilacije u MEC transfektantima pokazala je da p66Shc ekspresija rezultira oštećenjem vav fosforilacije ovisne o CXCR4 i CXCR5 u usporedbi s kontrolama (slika 3c). Fosfo-Vav snimanje u kontrolnom transfektantu pokazalo je obogaćivanje fosfo-Vava u ispupčenjima bogatim F-aktinom, a koja nije bilo otkriveno u prisutnosti p66Shc (Slika 3d). Stoga, p66Shc modulira reorganizaciju F-aktina ovisnu o hemokinu, prigušavajući Vav aktivaciju.

p66Shc inhibira i Src kinazu i PI3-K ovisne putove koje pokreću CXCR4 i CXCR5

Gi-proteini potiču vav aktivaciju kroz dva puta aktivirana od strane G α i i podjedinice G βγ . 20, 21 G α i aktivacija rezultira smanjenjem aktivnosti proteinske kinaze A (PKA) koja pojačava inhibitornu petlju koja kontrolira Src kinaze pojačavanjem aktivnosti C-terminalne Src kinaze (Csk). 20 Kao rezultat toga, Lyn se aktivira i pokreće kaskadu fosforilacije koja uključuje Syk i Btk koji zajedno promiču Vav fosforilaciju. 20 G γγ promiče PI3-K aktivaciju 22 koja se konvergira na Vav aktivaciju stabilizirajući se u plazma membrani i Vav i Btk pomoću interakcije posredovane PH domenom s PIP 2 / PIP 3 . 21

Da bi se utvrdio koji je od ovih putova reguliran p66Shc, ispitivanja migracije provedena su u prisutnosti farmakoloških inhibitora signalizacije hemokinskih receptora. Kao što se očekivalo, liječenje kontrolnih MEC stanica s pertusis toksinom (PTX), inhibitorom G α i ili inhibitorom fosfodiesteraze 3-izobutil-1-metilksantinom (IBMX), koji neutralizira učinke G α i, rezultira blokadom u CXCR4 / CXCR5 migracija (Slika 4a). Migraciju su inhibirali i Src kinaza inhibitor PP2 i PI3-K inhibitor wortmannin (slika 4a), kao i Jak inhibitor AG490 (dopunska slika S3). Sposobnost p66Shc-a da oslabi hemotaksiju ovisnu o CXCR4 i CXCR5 dodatno je poboljšana PTX i IBMX, kao i PP2 i wortmannin (slika 4a), ali ne i AG490 (dopunska slika S3), što ukazuje da p66Shc selektivno sudjeluje u Putovi Src i PI3-K pokrenuti ovim receptorima nizvodno od Gi aktivacije.

Image

p66Shc inhibira signalizaciju ovisnu o Src kinazi i PI3-K kao odgovor na CXCL12 i CXCL13. ( a ) Migracija ctr i p66 MEC transfektanata neobrađena ili tretirana 2 sata s PP2 ili 500 ng / ml PTX ili 500 µM IBMX ili 100 µM Wortmannin i zatim stimulirana u trajanju od 3 sata s 100 ng / ml CXCL12 (lijevo ) ili 200 ng / ml CXCL13 (desno). Podaci dobiveni na duplikatnim uzorcima iz najmanje tri neovisna eksperimenta, prikazani su kao srednji indeks migracije ± SD (omjer migriranih stanica u tretiranim hemokinom u odnosu na neobrađene uzorke). * P ≤ 0, 05; ** P ≤ 0, 01; *** P ≤0, 001. ( b ) Imunoblotska analiza anti-fosfo-Lyn, anti-fosfo-Syk ili anti-fosfo-Btk protutijela postnuklearnih supernanata iz ctr i p66 MEC transfeknata bilo nestimulirana ili stimulirana u trajanju od 1 min sa 100 ng / ml CXCL12 ili 200 ng / ml CXCL13. Kontrolni imunobloti oduzetih filtera su prikazani dolje. Označena je migracija markera molekularne mase. ( c ) Imunofluorescentna analiza ctr i p66 MEC stanica prolazno transficirana da bi se izrazila PH-GFP fuzija, imobilizirana 24 sata nakon transfekcije na toboganima prekrivenim 10 μg / ml rhICAM-1 / Fc ili nestimuliranim ili stimuliranim sa 100 ng / ml CXCL12 ili 200 ng / ml CXCL13 i obilježen je Phalloidin-TRITC (crveno) i anti-GFP antitijelo (zeleno). Prikazani su medijani optičkih presjeka. Traka veličine, 5 µm. Farmakološki CXCR4 antagonist (50 μM AMD3100, dodan 1 sat prije hemokina) korišten je u kombinaciji s CXCL12 kao kontrolom specifičnosti. Pod tim uvjetima nije primijećena migracija ni u kontrolnim ni u p66Shc-ekspresionirajućim MEC stanicama (podaci nisu prikazani), što je u skladu s potiskivanjem pod tim uvjetima svih signalnih kaskada koje pokreće CXCR4 uključen u migraciju stanica.

Slika pune veličine

Za preslikavanje p66Shc u putu ovisnom o Src pokrenutom CXCL12 / CXCL13, fosforilacija početne kinaze Lyn i efektorske kinaze Syk i Btk izmjerena je imunoblotom s fosfo-specifičnim antitijelima. Lyn je aktiviran na sličan način sudjelovanjem CXCR4 / CXCR5 u kontrolnim i p66Shc-eksprimirajućim MEC stanicama (Slika 4b). Suprotno tome, aktivacija Syk i Btk ovisna o hemokinu značajno je oslabljena u prisutnosti p66Shc (slika 4b), što ukazuje da p66Shc sudjeluje u putu ovisnom o TK koji je pokrenut CXCR4 / CXCR5, prigušivši signalizaciju nizvodno od Lyna.

Utvrđena je i implikacija p66Shc na PI3-K putu koji je pokrenuo CXCL12 / CXCL13, koristeći kao očitanje reporter PI3-K koji kodira PH domenu zelenog fluorescentnog proteina (GFP). Konfokalna mikroskopija kontrolnih i p66Shc-ekspresionirajućih MEC stanica, prolazno transficiranih s konstrukcijom PH-GFP, pokazala je da stimulacija CXCL12 ili CXCL13 dovodi do obogaćivanja plazma membrane u PH-GFP u kontroli, ali ne u stanicama koje eksprimiraju p66Shc (Slika 4c). Stoga, p66Shc odvaja CXCR4 / CXCR5 od Vav aktivacije smanjujući signale ovisne o TK i o fosfoinozidu.

Inhibicija signalizacije ovisne o CXCR4 i CXCR5 od strane p66Shc zahtijeva fosforilaciju svoje CH1 domene

Sposobnost p66Shc-a da modulira signalizaciju ovisi o mapiranju dviju aktivnosti na različite domene proteina. p66Shc djeluje kao adapter koristeći dvije domene koje vežu fosfotirozin i domenu kolagena homologa 1 (CH1) bogat prolinom koji regrutuje proteine ​​kroz tri fosforilabilna tirozinska ostatka (YYY239 / 240/317). Nadalje, p66Shc ima pro-oksidacijsku aktivnost koja se preslikava i na fosforilibilni serinski ostatak u CH2 domeni (S36) i na dva ostatka glutaminske kiseline (EE132 / 133) u domeni vezivanja za citokrom c . 12

Da bismo razumjeli da li inhibiranje signala CXCR4 / CXCR5 od strane p66Shc ovisi o njegovom adapteru ili njegovoj prooksidantnoj aktivnosti, koristili smo ploču MEC transfektanata koji izražavaju točkaste mutante p66Shc neispravne za ove aktivnosti. Tu su obuhvaćeni p66Shc3F (YYY239 / 240 / 317FFF), p66ShcSA (S36A) i p66ShcQQ (EE132 / 133QQ). Ti su mutanti eksprimirani odgovarajućim transfektantima na razinama koje su usporedive s divljim tipom proteina u p66 MEC stanicama (Slika 5a). Nisu primijećene razlike u ekspresiji LFA-1, VLA-4, CXCR4 ili CXCR5 u usporedbi s stanicama koje kontroliraju ili p66Shc-eksprimirajuće (dopunska slika S1A).

Image

Inhibicija adhezije i hemotaksije ovisne o CXCR4 i CXCR5 od strane p66Shc zahtijeva fosforilaciju tirozina njegove domene CH1. ( a ) Imunoblotska analiza ekspresije Shc u MEC B-stanicama stabilno transficirana praznim vektorom (ctr) ili ekspresijskom konstrukcijom koja kodira bilo divlji tip p66Shc (MEC p66) ili S36A (p66SA), EE132 / 133QQ (p66QQ) ili YYY239 / 240 / 317FFF (p663F) mutanti. Ispod je prikazana kontrolna mrlja uklonjenog filtra protiv aktina. Označena je migracija markera molekularne mase. Struktura domena p66Shc koja pokazuje lokalizaciju aminokiselinskih ostataka supstituiranih u mutantima shematizirana je na vrhu ploče. ( b ) Migracija ctr, p66, p66SA, p66QQ i p663F MEC transfektanata stimulirana 3 h bilo 100 ng / ml CXCL12 (gornja ploča) ili 200 ng / ml CXCL13 (donja ploča). Podaci dobiveni na duplikatnim uzorcima iz najmanje tri neovisna eksperimenta, prikazani su kao srednji indeks migracije ± SD (omjer migriranih stanica u tretiranim hemokinom u odnosu na neobrađene uzorke). *** P ≤0, 001. ( c ) Kvantifikacija protočnom citometrijom postotka ctr, p66 i p663F stanica koje su se lijepile na ploče s 48 jažica obložene s 10 μg / ml rhICAM-1 / Fc nakon obrade s 100 ng / ml CXCL12 ili 200 ng / ml CXCL13 tijekom 10 minuta. Podaci koji se odnose na četvorostruke uzorke iz četiri neovisna pokusa prikazani su kao% ukupnih ulaznih ćelija koje su ostale pričvršćene na svaku jažicu. Trake grešaka, SD * P ≤0, 05; *** P ≤0, 001. Kvantifikacija postotka polarizacije ( d ) ili polimerizacije aktina ( e ) na ctr, p66 i p663F ćelijama platiranim na toboganima prekrivenim 10 µg / ml rhICAM-1 / Fc, stimuliranih 5 min s 100 ng / ml CXCL12 ili 200 ng / ml CXCL13 i obilježen je Phalloidin-TRITC i protucjenovima protiv aktina. Postotak polariziranih stanica ( d ) i srednji intenzitet fluorescencije (MFI) obojenja Phaloidinom u stimuliranim nasuprot nestimuliranim uzorcima ( e ) izračunati su na četiri različite slike širokog polja iz svake jažice u tri neovisna eksperimenta. Phalloidin obojenje kvantitativno je korišteno ImageJ softverom i normalizirano u unutarćelijski sadržaj aktina. Trake grešaka, SD * P ≤0, 05; *** P ≤0, 001

Slika pune veličine

Ekspresija mutanta koji su reagirali na reaktivnu kisik (ROS) rezultirala je oslabljenom migracijom B-stanica i adhezijom u usporedbi s kontrolnim stanicama, slično p66Shc (slika 5b i dopunska slika S4A), isključujući ulogu za prooksidantnu aktivnost p66Shc u ovoj funkciji. Suprotno tome, mutacija 3F poništavala je sposobnost p66Shc da inhibira hemotaksiju B-stanica (slika 5b), kao i adheziju i polarizaciju (slike 5c i d i dodatne slike S4A i B). U skladu s tim, LFA-1 formirao je tipični punktatni obrazac koji je rezultat klasteriranja integrina u stanicama koje eksprimiraju p66Shc3F (dopunska slika S2). Mutacija 3F također je u potpunosti ukinula sposobnost p66Shc da inhibira polimerizaciju aktina ovisna o CXCR4 / CXCR5 (slika 5e i dodatna slika S4C), vav fosforilaciju (slika 6a) i obogaćivanje fosfo-Vav u izbočenjima bogatim F-aktinom (slika 6b i Dopunska slika S4D). Nadalje, nije opaženo oštećenje aktiviranja Syk, Btk ili PI3-K (hemokin) (slike 6c i d) u stanicama koje eksprimiraju p66Shc3F, što ukazuje da su YYY239 / 240/317 potrebni za inhibicijske učinke p66Shc na signalne putove koji kontroliraju Vav aktivaciju i reorganizaciju aktina u B-stanicama.

Image

Inhibicija signala CXCR4 i CXCR5 od strane p66Shc zahtijeva fosforilaciju tirozina njegove domene CH1. ( a ) Imunoblotska analiza antifosfo-Vav antitijela postnuklearnih supernanata iz ctr, p66 i p663F MEC transfektanta bilo nestimulirana ili stimulirana 1 min sa 100 ng / ml CXCL12 ili 200 ng / ml CXCL13. Niže je prikazan kontrolni imunoblot protiv skidanja filtra. Označena je migracija markera molekularne mase. ( b, gore) Konfokalna mikroskopska analiza Vav fosforilacije u ctr, p66 i p663F MEC transfektantima stavljen na dijapozitive obložene s 10 µg / ml rhICAM-1 / Fc i stimulirana 2 min s 100 ng / ml CXCL12 ili 200 ng / ml CXCL13. Zatim su dijapozitivi obilježeni anti-fosfo-Vav i anti-Vav antitijelima. Prikazani su medijani optičkih presjeka. Traka veličine, 5 µm. ( b, dno) Kvantifikacija Vav fosforilacije na četiri različite slike širokog polja iz tri neovisna eksperimenta predstavljena kao srednji intenzitet fluorescencije (MFI) bojenja fosfo-Vav u stimuliranim u odnosu na nestimulirane uzorke, kvantitativno korištena pomoću ImageJ softvera i normalizirana u unutarćelijski sadržaj od Vav. Trake grešaka, SD * P ≤0, 05; ** P ≤ 0, 01; *** P ≤0, 001. ( c ) Imunoblotska analiza s anti-fosfo-Syk antitijelima postnuklearnih supernanata iz ctr, p66 i p663F MEC transfektanta bilo nestimulirana ili stimulirana 1 min sa 100 ng / ml CXCL12 ili 200 ng / ml CXCL13. Niže je prikazan kontrolni imunoblot protiv skidanja filtra. Isti filtar je ispitivan s anti-fosfo-Btk antitijelom. Označena je migracija markera molekularne mase. ( d ) Imunofluorescentna analiza ctr, p66 i p663F MEC stanica prolazno transficirana da se izrazi PH-GFP fuzija, imobilizirana 24 sata nakon transfekcije na toboganima prekrivenim 10 µg / ml rhICAM-1 / Fc ili nestimuliranim ili stimuliranim sa 100 ng / ml CXCL12 ili 200 ng / ml CXCL13 i obilježeno je Phalloidin-TRITC (crveno) i anti-GFP antitijelo (zeleno). Prikazani su medijani optičkih presjeka. Traka veličine, 5 µm. ( e ) Imunoblotska analiza s antifosfotirozin protutijelama p66Shc-specifičnim imunoprecipitatima iz lizata p66 i p663F MEC stanica ili nestimulirana ili aktivirana 1 min sa 500 ng / ml CXCL12 ili 1, 25 µg / ml CXCL13. Izvučeni filtar je ponovno testiran sa anti-Shc antitijelima

Slika pune veličine

U skladu sa zahtjevom za fosforilacijom YYY239 / 240/317 u regulaciji signalizacije CXCR4 / CXCR5 pomoću p66Shc, utvrđeno je da se p66Shc fosforilira na tirozinu kao odgovor na CXCL12 / CXCL13 (slika 6e).

p66Shc regrutuje SHIP-1 i SHP-1 do CXCR4 i CXCR5

Rezultati dobiveni sa p66Shc mutantima sugeriraju da p66Shc može ometati spajanje CXCR4 / CXCR5 na Vav djelujući kao adapter za regrutovanje negativnih regulatora puta ovisnih o TK ili PI3-K koji pokreću ti receptori. Da bi se riješio taj problem, p66Shc / p66Shc3F je imunoprecipitiran iz MEC transfektanata koji eksprimiraju proteine ​​označene GFP i ispitivan na prisutnost CXCR4 i CXCR5. Otkriveno je da su oba receptora uključena u konstitutivnu interakciju s p66Shc kao i p66Shc3F (slika 7a). Prema tome, imunofluorescentna analiza pokazala je da se udio p66Shc, kao i p66Shc3F, lokalizirao na plazma membrani u bazalnim uvjetima (slika 7b).

Image

p66Shc regrutuje fosfataze SHIP-1 i SHP-1 do CXCR4 i CXCR5. ( a ) Imunoblotska analiza sa anti-CXCR4, CXCR5, SHIP-1 ili SHP-1 protutijela na GFP-specifična imunoprecipitata iz lizata GFP-p66 i GFP-p663F MEC transfeknata bilo nestimulirana ili stimulirana 1 min sa 100 ng / ml CXCL12 ili 200 ng / ml CXCL13. Kontrolni anti-GFP imunobloti oduzetih filtera su prikazani dolje. Označena je migracija markera molekularne mase. ( b ) Konfokalna mikroskopska analiza SHIP-1 u ctr, p66 i p663F MEC transfektantima postavljenim na stakalce obložene s 10 µg / ml rhICAM-1 / Fc i stimulirana 1 min s 100 ng / ml CXCL12 ili 200 ng / ml CXCL13. Zatim su dijapozitivi obilježeni anti-SHIP-1 antitijelima. Prikazani su medijani optičkih presjeka. Traka veličine, 5 µm. ( c ) Konfokalna mikroskopska analiza GFP-a i SHIP-1 u GFP-p66 i GFP-p663F MEC transfektantima stavljena na dijapozitive obložene s 10 µg / ml rhICAM-1 / Fc i stimulirana 1 min sa 100 ng / ml CXCL12 ili 200 ng / ml CXCL13. Zatim su dijapozitivi obilježeni anti-SHIP-1 antitijelima. Prikazani su medijani optičkih presjeka. Traka veličine, 5 µm

Slika pune veličine

PIP 3 se brzo defosforilira fosfatazom SHIP-1 (SH2 domena koja sadrži inozitol 5'-fosfataza-1) 23 koja negativno regulira hemotaksiju ovisnu o CXCR4 B-stanicama. 24 Eksperimenti sa su-imunoprecipitacijom pokazali su baznu SHIP-1 povezanost s p66Shc koja je snažno poboljšana kao odgovor na CXCL12 / CXCL13 (Slika 7a). Značajan udio SHIP-1 uočen je na plazma membrani u bazalnim uvjetima u MEC stanicama koje eksprimiraju p66Shc, uz značajnu kolokalizaciju s GFP-označenim p66Shc (Slika 7c). Iako je opažena i bazna povezanost SHIP-1 s p66Shc3F, nije poboljšana liječenjem hemokinom (slika 7a). Štoviše, SHIP-1 je u velikoj mjeri bio citosolni u nedostatku stimulacije u stanicama koje eksprimiraju p66Shc3F, a također je uočen i značajan citosolni bazen nakon liječenja hemokinom (slika 7b). Dakle, p66Shc inhibira PI-3K signalizaciju regrutirajući SHIP-1 u CXCR4 / CXCR5 kroz CH1 domenu.

The fact that p66Shc negatively regulates the TK cascade triggered by CXCR4/CXCR5 suggests that it may counteract TKs by recruiting tyrosine phosphatases to these receptors. The tyrosine phosphatase SHP-1 (Src homology phosphatase-1) is implicated in negative signaling by a variety of receptors in hematopoietic cells. 25 Probing p66Shc-specific immunoprecipitates revealed the presence of SHP-1 under basal conditions that was enhanced in response to CXCL12/CXCL13 (Figure 7a). A basal interaction, which however did not increase in response to chemokine stimulation, was observed in cells expressing p66Shc3F (Figure 7a), indicating that p66Shc inhibition of TK signaling involves SHP-1 recruitment to CXCR4/CXCR5 through YYY239/240/Y317.

Rasprava

Despite our limited mechanistic understanding of CXCR4 and CXCR5 signaling in B-cells, several signaling mediators have been identified. The integrin high-affinity conformational shift triggered by CXCR4 involves Ras-proximate-1 (Rap1), protein tyrosine kinase 2 (Pyk2) and focal adhesion kinase (FAK) activation. 26 Moreover, CXCR4 triggers the Lyn-, Syk- and PI3-K-dependent activation of Rho GTPases through a cascade involving Btk and phospholipase C, γ (PLC γ ). 27 Less is known about CXCR5, although the signaling mediators identified in this pathway, such as Rap1, PI3-K and Pyk2, 27, 28, 29 suggest that it may recapitulate the CXCR4 pathway. The role of the adaptors that act as scaffolds to promote the activation and function of these molecules in the pathways triggered by AgRs has been addressed only for very few instances. Both SLP-76 (SH2 domain-containing leukocyte protein of 76 kDa), which controls TCR-dependent Rap1 activation, 30 and LAT, which couples the TCR to Vav and Rho GTPases, 31 are dispensable for CXCR4 signaling in T cells, 32, 33 suggesting that different adaptors may be implicated in the assembly of the chemokine receptor-associated signalosome. However, SLP-76 has been recently identified as a common target of TCR and CXCR4 in the generation of signaling microclusters; 34 moreover, the role for SLP-76 in LFA-1-dependent T-cell adhesion has been re-evaluated in the setting of shear flow. 35 The adaptors CrkL and Cbl-b are recruited in a multimolecular complex in response to CXCR4 engagement in a pre-B lymphoma line, 36 but their role in B-cell migration has not been directly addressed. The results presented here contribute to filling this gap by identifying p66Shc, which participates as a negative regulator in B-cell receptor (BCR) signaling, 37 as a central component of the pathways that couple CXCR4/CXCR5 to integrin activation and actin dynamics in B-cells. Although the physiological levels of p66Shc expression in primary B-cells are relatively low, they are clearly sufficient to tune down the responses triggered by these receptors, as highlighted by their significant enhancement in p66Shc −/− B-cells.

p66Shc appears to function downstream of Gi activation at the early steps of CXCR4/CXCR5 signaling in the pathways that couple Lyn and PI3-K to Vav, but not in the Gi-independent Jak pathway, as supported by the exacerbation of the chemotaxis defects in p66Shc-expressing B-cells when treated with either PTX or PP2 or wortmannin, but not AG490. A comparison of Lyn, Syk and Btk activation in B-cells differing in p66Shc expression maps p66Shc downstream of Lyn. Lyn activation is believed to occur through its recruitment to lipid rafts with the activated chemokine receptors. 38 That p66Shc does not affect Lyn activation indicates that its constitutive interaction with CXCR4/CXCR5 does not impinge on either their raft clustering or their ability to recruit Lyn. A mechanism by which p66Shc attenuates TK signaling downstream of Lyn can be proposed based on our finding that it interacts with SHP-1 that binds to and dephosphorylates Syk in B-cells. 39 This does not rule out the possibility of a transdominant inhibition of p52Shc that participates in TCR transactivation by CXCR4 in T cells. 15 Nevertheless, this possibility appears unlikely, as this inhibitory function of p66Shc relies on S36 phosphorylation, 12 whereas the data presented here indicate that this molecular determinant is dispensable for the negative regulation of CXCR4/CXCR5 signaling by p66Shc in B-cells.

Inhibition of phosphoinositide signaling by p66Shc is likely to contribute to the Vav activation defect in response to CXCR4/CXCR5, as both Btk and Vav are provided of a phosphoinositide-binding domain. 21 The ability of p66Shc to reduce phosphoinositide accumulation may moreover contribute to the impairment of inside-out signaling to integrins by affecting the assembly of the complex that promotes Rap1 activation that in B-cells includes the PH domain-containing adaptor Src kinase-associated phosphoprotein-homology (SKAP-hom). 40 Although a modulation of PI3-K activity by p66Shc cannot be ruled out, inhibition of CXCR4/CXCR5-dependent phosphoinositide accumulation by p66Shc stems, at least in part, from its ability to enhance SHIP-1 recruitment to the plasma membrane, similar to what we have described for Fc ɛ RI signaling in mast cells. 41 SHIP-1 associates with p52Shc through a bidentate interaction involving binding of the SHIP-1 SH2 domain to phosphorylated YYY239/240/317, as well as binding of the phosphorylated SHIP-1 NPXY motif to the Shc PTB domain. 42, 43 The basal association of p66Shc with CXCR4/CXCR5 suggests that p66Shc could recruit an initial SHIP-1 pool to the receptors in the absence of stimulation, as supported by the constitutive membrane localization of SHIP-1 in p66Shc-expressing cells. Following chemokine binding, CXCR4/CXCR5 could promote p66Shc and SHIP-1 phosphorylation, thereby stabilizing the p66Shc-SHIP-1 complex at the plasma membrane, as supported by the chemokine-dependent enhancement in SHIP-1 binding to p66Shc, but not p66Shc3F. It is noteworthy that SHIP-1 −/− B-cells display adhesion and chemotaxis defects similar to the ones described here for p66Shc −/− B-cells, 24 supporting the notion that p66Shc negatively regulates these processes through SHIP-1.

The ability of p66Shc to generate ROS appears in contrast to its inhibitory effects on B-cell adhesion and migration, as these processes are regulated by oxidants. During EC migration, the NADPHox (nicotinamide adenine dinucleotide phosphate-oxidase) subunits NOX2 and p47 phox are targeted to the leading edge where they generate superoxide 44, 45 that promotes cell migration through the oxidation-dependent inhibition of protein phosphatases. 46 ROS also promote leukocyte adhesion to ECs by enhancing ICAM-1 and P-selectin expression, 47, 48 and by inducing a turnover of EC junction proteins. 49 p66Shc promotes ROS accumulation by both inhibiting forkhead transcription factors that control the expression of anti-oxidant enzymes 50 and interrupting the mitochondrial respiratory chain. 51 Subcellular compartmentalization of ROS generation has emerged as an important feature of ROS signaling. 52 We can hypothesize that p66Shc may generate ROS at locations that are not relevant to the signaling pathways that mediate CXCR4/CXCR5-dependent B-cell migration. In support of this notion, NADPHox inhibition did not affect the ability of p66Shc to increase intracellular ROS in T cells (A Nuccitelli and CT Baldari, unpublished). It is noteworthy that p66Shc mediates anoikis in fibroblasts by promoting RhoA activation and focal adhesion formation 53 and promotes VEGF-dependent ROS production in ECs by activating Rac1 and NAPDHox. 54 Hence, the effects of p66Shc on chemotaxis and the role of its pro-oxidant activities in this process appear to be cell type-specific.

We have recently shown that p66Shc modulates the expression of receptors that control B-cell entry (CCR7) and egress (sphingosine-1-phosphate receptor 1 (S1P1)) through its pro-oxidant activity, 14 suggesting its implication in their trafficking to SLOs. The results presented here show that p66Shc can additionally participate in B-cell homing by attenuating signaling to the actin cytoskeleton by CXCR4/CXCR5, acting as an adaptor to recruit negative regulators. Collectively, the data identify p66Shc as a multifunctional regulator of B-cell trafficking.

Materijali i metode

Cell lines, plasmids, antibodies and reagents

A panel of MEC-1 B-cell stable transfectants expressing either p66Shc (p66) or the p66ShcSA (p66SA) or p66ShcQQ (p66QQ) point mutants, as well as an empty vector transfectant (ctr), were previously described. 14 A MEC-1 transfectant was generated using a construct encoding a p66Shc point mutant lacking the three phoshorylatable tyrosine residues (YYY239/240/317) in the CH1 domain (p66Shc3F). 55 The cDNAs encoding p66Shc and p66Shc3F were cloned into pEGFP-C3 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) and stably transfected into MEC-1 cells as described previously. 14 A vector encoding the GFP-tagged Akt PH domain 56 was transiently transfected into the stable control, p66 and p663F transfectants. Murine OP9 57 and human HS-5 58 stromal cells were used for pseudoemperipolesis experiments.

Phosphospecific antibodies recognizing the phosphorylated active forms of Syk, Btk and Lyn were from Cell Signaling Technology (Beverly, MA, USA) and anti-phospho-Vav was from Biosource (Camarillo, CA, USA). Anti-Erk2, anti-SHIP-1 and anti-Shc antibodies were from Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA), anti-actin was from Chemicon Int. (Temecula, CA, USA), and anti-phosphotyrosine, anti-Vav and anti-Shc antibodies were from Millipore (Billerica, MA, USA). Anti-CXCR5 and anti-SHP-1 antibodies were from Abcam (Cambridge, UK), anti-CXCR4 polyclonal antibodies were from Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA), anti-CXCR4 mAbs were from Abnova (Aachen, Germany), anti-GFP polyclonal and mAbs were from Invitrogen. Anti-CXCR4 (12G5) antibodies were kindly provided by J Hoxie, Leukosite Inc. and the MRC AIDS Reagent Project (Cambridge, MA, USA). p66Shc was immunoprecipitated using a rabbit polyclonal antiserum raised against a CH2-glutathione S -transferase (GST) fusion protein. 59 Secondary peroxidase-labeled antibodies were from GE Healthcare (Fairfield, CT, USA). Anti-CD11a, anti-human CD3 and CD19, anti-mouse CD3 and CD22 and secondary fluorochrome-labeled antibodies were from eBioscience (San Diego, CA, USA); anti-GFP and Alexa Fluor 488- and 555-labeled secondary antibodies were from Invitrogen (Leek, The Netherlands). Human and mouse CXCL12 and CXCL13, FN, AG490, PP2, AMD3100, IBMX, f-MLP and TRITC-labeled Phalloidin were purchased from Sigma-Aldrich. PTX was purchased from Sigma-Aldrich. rhICAM-1/Fc was purchased from R&D Systems (Minneapolis, MN, USA). The chemiluminescence detection kit was from Pierce (Rockford, IL, USA). DiO and Dil fluorescent dyes were purchased from Molecular Probes (Invitrogen).

Miševi

p66Shc −/− /129 mice (p66Shc −/− ) have been previously described. 59 Analyses were performed on age- and sex-matched 2–9-month-old wild-type 129 mice (wt). All experiments were carried out in agreement with the Guiding Principles for Research Involving Animals and Human Beings and approved by the local ethics committee. Experiments were carried out on spleen, lymph nodes and bone marrow suspensions, or splenic B-cells negatively purified by immunomagnetic sorting using the Dynabeads Mouse CD43 Negative Isolation Kit (Invitrogen) (>85% purity).

Activations and immunoprecipitations

Cells were starved for 2 h in RPMI/1% BSA. Activations with CXCL12 or CXCL13 (10–500 ng/ml, 0.1–1.25 μ g/ml, respectively, depending on cell concentration) were carried out at 37°C in RPMI/1% BSA. Cells were lysed in 1% Triton X-100 in 20 mM Tris-HCl, pH 8, 150 mM NaCl (in the presence of protease inhibitor cocktail, Invitrogen), resolved by SDS-PAGE and transferred to nitrocellulose (Whatman, GE Healthcare). Alternatively, postnuclear supernatants from 2.5–5 × 10 7 cells/sample were immunoprecipitated using the appropriate antibodies and protein A-Sepharose (GE Healthcare).

Flow cytometry and chemotaxis assay

Transwell migration assays were carried out as described previously. 15 Migrated cells were counted by flow cytometry. Mouse cells were stained with anti-CD3/anti-CD22 antibodies before analysis. The migration index was calculated by determining the ratio of migrated cells in treated versus untreated samples.

Test adhezije

The 48-well plates were coated o/n at 4°C with either 10 μ g/ml FN or 10 μ g/ml rhICAM-1/Fc, washed with PBS and incubated for 30 min at 37°C with RPMI/1% BSA. Then, 2 × 10 5 cells/well serum-starved B-cells were added. The plates were incubated at 37°C for 10 min, then added with 100 ng/ml CXCL12 or 200 ng/ml CXCL13 for further 10 min. Cells that had not adhered (recovered in medium and washes) were resuspended in 0.2 ml RPMI. Cells that remained adherent after 3 washes were recovered by 1-min incubation with trypsin/EDTA, immediately added with RPMI-10% BCS, washed and resuspended in 0.2 ml RPMI. Cells were counted by flow cytometry. Mouse cells were stained with anti-CD3/CD22 antibodies before flow cytometry. The percentage of adherent cells was calculated as follows:

Image

where 'total' is the sum of adherent and nonadherent cells/well.

Pseudoemperipolesis assay

Stromal cells were seeded on 48-well plates (1.5 × 10 5 cells/well) in RPMI/10% BCS and cultured to confluence. Then, 2 × 10 5 cells/well serum-starved B-cells were added. Plates were incubated at 37°C for 10 min, then added with 100 ng/ml CXCL12 or 200 ng/ml CXCL13 for 40 min. Wells were vigorously washed three times with RPMI and the cells that had not adhered (recovered in medium and washes) were resuspended in 0.2 ml medium. The stromal cell layer containing migrated cells was trypsinized as described above and cells were suspended in 0.2 ml medium. Cells were counted by flow cytometry. All samples were stained with anti-CD19 (human cells) or anti-CD3/CD22 (mouse cells) antibodies before flow cytometry to exclude stromal cells. The percentage of migrated cells was calculated as above.

Immunofluorescence, confocal microscopy and polarization assay

Diagnostic microscope slides were coated with FN or rhICAM-1/Fc and cells (1 × 10 5 /sample) were allowed to adhere for 5 min before stimulation for 2–5 min with 100 ng/ml CXCL12 or 200 ng/ml CXCL13. Cells transiently transfected with the PH-GFP-expressing vector were used 24 h after transfection. Slides were immediately fixed in 4% paraformaldehyde at RT for 20 min as previously described. 60 For SHIP-1 and SHP-1 staining, cells were plated for 15 min on polylysine-coated slides and then stimulated as above. Following fixation, samples were washed 5 min in PBS and incubated with primary antibodies or TRITC-labeled Phalloidin o/n at 4°C or 1 h at RT. After washing in PBS, samples were incubated for 1 h at RT with Alexa Fluor 488- and 555-labeled secondary antibodies.

Confocal microscopy was carried out on a Zeiss LSM700 (Carl Zeiss, Jena, Germany) using a × 63 objective. Images to quantify were acquired with pinholes opened to obtain 0.8 μ m-thick sections. Detectors were set to detect an optimal signal below the saturation limits. Images were processed with Zen 2009 image software (Carl Zeiss) and analyses were performed using ImageJ software (downloaded from //www.embl-heidelberg.de/eamnet/).

For the polarization assay, slides were stained with TRITC-labeled Phalloidin and anti-actin mAb, four different wide-field images/well (at least 25 cells/field) were taken and the percentage of polarized cells (with protrusions or with irregular morphology; see representative images in Figure 1a) against total cells was calculated. In the same images, mean fluorescence intensity (MFI) of Phalloidin and actin staining was quantitated using ImageJ software. For each the Phalloidin staining was normalized to the actin staining.

RNA purification and real-time PCR

Total RNA was extracted from MEC transfectants or mouse B lymphocytes and retrotranscribed as previously described. 37 Real-time PCR was performed in triplicate on 96-well optical PCR plates (Sarstedt AG, Nümbrecht, Germany) as previously described 14 using SSoFast EvaGreen SuperMix (Bio-Rad Laboratories Inc., Hercules, CA, USA) and a CFX96 Real-Time system (Bio-Rad Laboratories, Waltham, MA, USA). Transcript levels were normalized to the housekeeping gene HPRT1 .

Statistička analiza

Srednje vrijednosti, SD i Studentov t- test (nespareni) izračunati su korištenjem Microsoftovog Excela (Redmont, WA, SAD). P <0, 05 se smatra statistički značajnim.

Dodatna informacija

PDF datoteke

  1. 1.

    Dopunske brojke

Glosar

AGR

antigenski receptor

BCR

B-stanični receptor

Btk

Brutonova tirozin kinaza

kamp

ciklički adenozin monofosfat

CCR7

CC hemokinski receptor tip 7

cdc42

stanični dio za kontrolu proteina 42 homolog

CH1

homologija kolagena 1

KLL

kronična limfocitna leukemija

CSK

C-terminalna Src kinaza

CXCL12

CXC motiv hemokin 12

CXCL13

CXC motiv hemokin 13

CXCR4

CXC hemokin receptor tip 4

CXCR5

CXC hemokin receptor 5

EK

endotelna stanica

FAK

kinaza žarišne adhezije

FN

fibronektina

GFP

zeleni fluorescentni protein

IBMX

3-izobutil-1-metilksantin

ICAM-1

molekula međućelijske adhezije-1

JAK

Janus kinaza

LFA-1

antigen-1 povezan sa funkcijom limfocita

mAb

monoklonsko antitijelo

NADPHox

nikotinamid adenin dinukleotid fosfat-oksidaza

PH

pleckstrin homologija

PIP 2 / PIP 3

fosfatidilinozitol 4, 5-bisfosfat / (3, 4, 5) -trifosfat

PI3-kinaza

fosfatidilinozitid 3-kinaza

PKA

protein kinaza A

PLC γ

fosfolipaza C, γ

PTX

pertusis toksin

PYK2

proteinska tirozin kinaza 2

Rac1

Rasta povezana sa supstrom C3 botulinskog toksina 1

Rap1

Ras-neposredan-1

ROS

reaktivne vrste kisika

SHC

Src homologija 2 domena koja sadrži

BROD-1

SH2 domena koja sadrži inozitol 5'-fosfatazu-1

SHP-1

Src homologija fosfataza-1

SKAP-hom

Fosfoprotein-homologija koja je povezana sa Src kinazom

SLO

sekundarni limfoidni organ

SLP-76

SH2 protein leukocita koji sadrži 76 kDa

Svk

slezena tirozin kinaza

S1P1

sfingosin-1-fosfatni receptor 1

TK

tirozin kinaza

VEGF

vaskularni endotelni faktor rasta

VLA-4

vrlo kasni antigen-4

Dodatne informacije nalaze se u ovom radu na web stranici Cell Death and Disease (//www.nature.com/cddis)