Neuritin može normalizirati neuronski deficit alzheimerove bolesti | stanična smrt i bolest

Neuritin može normalizirati neuronski deficit alzheimerove bolesti | stanična smrt i bolest

Anonim

teme

  • Alzheimerova bolest
  • Stanična signalizacija

Sažetak

Smatra se da smanjena složenost neurita hipokampala i sinaptička plastičnost doprinose progresivnom slabljenju epizodne memorije i blagom kognitivnom padu koji se javljaju osobito u ranim fazama Alzheimerove bolesti (AD). Unatoč funkcionalnoj i terapijskoj važnosti za pacijente s AD-om, intervencija za spašavanje ili normalizaciju dendritičke elaboracije i sinaptičke plastičnosti jedva je osigurana. Ovdje pokazujemo da je prekomjerna ekspresija neuritina , proteina ovisnog o aktivnosti, pospješila rast neurita i sazrijevanje sinapse paralelno s pojačanim bazalnim sinaptičkim prijenosom u kultiviranim neuronima hipokampa. Važno je da je egzogena primjena rekombinantnog neuritina u potpunosti vratila dendritičku složenost, kao i gustoću kralježnice u hipokampalnim neuronima pripremljenim od Tg2576 miševa, dok nije utjecala na neuritno razgranavanje neurona od njihovih divljih vrsta legla. Također smo pokazali da je topljivi rekombinantni neuritin, kada se kronično inficira u mozak miševa Tg2576, normalizirao sinaptičku plastičnost u akutnim križcima hipokampa, što dovodi do netaknute dugoročne potencijale. Otkrivanjem zaštitnih djelovanja topljivog neuritina protiv neuroloških oštećenja povezanih s AD-om, pružamo potencijalni terapijski pristup pacijentima s AD-om.

Glavni

Učinkovita komunikacija neurona putem sinapsi presudna je za normalne moždane funkcije, dok se promjene u brojevima sinapse, morfologija dendritičke kralježnice i dendritička složenost odražavaju različitim oblicima sinaptičke plastičnosti i uzročno su povezane s različitim neurološkim poremećajima. 1, 2, 3, 4, 5 Na primjer, gubitak sinapse i neuritna atrofija glavni su neurobiološki supstrati koji su temelj oštećenja pamćenja kod neurodegenerativnih bolesti poput Alzheimerove bolesti (AD). 6, 7 Čini se da povećana dendritička mislokalizacija hiperfosforiliranog proteina tau, proteina povezanog mikrotubulom obogaćenog aksonama zrelih neurona, 8 i obilje topljivih oligomernih oblika β- amiloida (A β ) uzrokuju sinaptičke nedostatke i poremećaj sinaptičke plastičnosti koji uključuju progresiju AD patologije. 6, 9, 10 Očigledno smanjenje neurotrofičnih čimbenika primijećeno u mozgu pacijenata s AD 11 potaknulo je nekoliko ispitivanja za primjenu neurotrofičnih čimbenika, poput neurotrofičnog faktora koji potiče iz mozga (BDNF), kako bi se ublažili i eventualno preokrenuli sinaptički nedostaci. 11, 12, 13 Međutim, skraćenje ili smanjena ekspresija njegovih kognitivnih receptora u mozgu AD ograničila je njihovu potencijalnu upotrebu kao AD terapeutici. 12, 14, 15

Neuritin, također poznat kao kandidatni gen za plastičnost 15, prvobitno je identificiran u screening studiji za regulirane aktivnosti gena, a potom je otkriveno da je jedan od signalnih molekula nizvodno do BDNF i njegovog receptora za kinazu srodnu receptorima tropomiozinom tipa B. 17 Provjere studija pokazale su da bi neuritin mogao biti induciran eksperimentalnim napadima ili normalnim životnim iskustvima, poput senzorne stimulacije i vježbanja. 17, 18, 19, 20, 21, 22 Smješten u intervalu 6p24-p25 na kromosomu 6, 23, neuritinski gen kodira mali, visoko konzervirani protein koji sadrži sekretornu signalnu sekvencu na N-terminusu i konsenzusni slijed glikozilfosfatidilinozitola ( GPI) na C-kraju. 16 Ova GPI veza omogućuje neuritinu da se usidri na staničnim površinama, a nakon cijepanja GPI fosfolipazom rezultirajući topljivi neuritin ispušta se u izvanćelijski prostor. 16, 20, 24, 25, 26

Tijekom embrionalnog neuronskog razvoja, neuritin se uglavnom eksprimira u područjima mozga koja prolaze brzo proliferaciju neuronskih bazena, što sugerira zaštitnu ulogu neuritina za diferencirane neurone. 26, 27 Zanimljivo je da razina ekspresije neuritina ostaje povišena nakon rođenja ili se čak povećava, posebno u predjelima mozga koji vjerojatno pokazuju visoku neurološku aktivnost i sinaptičku plastičnost, poput hipokampusa, vidnog korteksa i vanjskog granuliranog sloja cerebeluma. 16, 19, 20, 26 Osim toga, neuritin potiče rast neuritskih šupljina i stvaranje sinaptika. 16, 20, 24, 25, 28, 29, 30, 31 Iako su razne studije sugerirale ove moćne neuritogenetske aktivnosti neuritina, doprinos ekspresije neuritina ili njegova učinkovitost protiv neurodegenerativnih bolesti koje pokazuju atrofiju neurita i gubitak sinapsije uglavnom je neistražen,

Ovdje smo utvrdili da neuritinska ekspresija povećava složenost neurita i potiče sazrijevanje pojedinih bodlji u kulturiranim hipokampalnim neuronima. U skladu s ovim nalazima, bazalni sinaptički prijenos pojačan je prolaznom ekspresijom neuritina. Važno je da je, kada se egzogeno primjenjuje, topljivi neuritinski peptid spasio dendritu složenost neurona pripremljenih od Tg2576 miševa, transgeničnog mišjeg modela AD, tako da je složenost bila usporediva s onom u miševa divljeg tipa (WT) i također normalizirala sinaptičku plastičnost u hipokampus miševa Tg2576. Uzeti zajedno, ovi rezultati sugeriraju da neuritin, posebno topiv oblik neuritina, poništava sinaptičke nedostatke koji se manifestuju kod Tg2576 miševa i da manipulacije za povećanje razine neuritina mogu biti korisni terapijski pristupi u AD.

Rezultati

Neuritin povećava rast neurita

Neuritogeneza je ključni stanični proces koji stvara neuronske krugove upravljajući aksonskim lukovima i dendritičkim grananjem tijekom razvoja neurona, a također doprinosi preuređivanju neuronske povezanosti koja je podloga sinaptičke plastičnosti u odrasloj dobi. 32 Ovaj proces kontroliraju ne samo stanično svojstveni čimbenici, već i vanjski faktori koji su uključeni u sinaptičku aktivnost. 32 Pokazalo se da je neuritin moćan regulator za neuritogenezu in vitro i in vivo . 16, 24, 26 Da bismo potvrdili neuritogenetski učinak neuritina u uzgojenim neuronima, transficirali smo neurone s neuritinom pune duljine (pIRES-eGFP-neuritin-Flag) 26 ili njegovim kontrolnim vektorom. Kako rast neurita počinje rano u postnatalnom razvoju, 29, 33 hipokampna neurona u kulturi su transficirana 3 dana in vitro (DIV) i analizirana 3 dana kasnije. Ti transficirani neuroni identificirani su s ekspresijom eGFP-a ili neuritin-Flag-a koji je označen s Alexa Fluor 488, jer je intenzitet samog eGFP signala iz pIRES-eGFP-neuritin-Flag obično bio slab. Aksonski i dendritični procesi diskriminirani su s Tau-1 i mikrotubulom povezanim proteinom 2 (MAP2), odnosno (Slike 1a i b). 8 Dobiven je i ponovno sastavljen niz konfokalnih slika kako bi se rasvijetlile čitave neuronske strukture. U usporedbi s neuronima koji su bili zaraženi kontrolnim vektorom, ekspresija neuritina tijekom 3 dana značajno je povećala i ukupnu aksonalnu (*** P <0, 001, Mann-Whitney U- test; Slike 1a i c) i ukupnu dndritičku duljinu (*** P = 0, 0005, Mann-Whitney U- test; Slike 1b i d).

Image

Neuritinska ekspresija povećava rast neurita. ( a i b) Konfokalne slike bilo kontrolnih vektora ili neuritina koji eksprimiraju neurone koji su bili istovremeno imunostanirani samo s eGFP ili eGFP / zastava (zelena), Tau-1 ( a, crvena) ili MAP2 ( b, crvena). Linija mjerila, 100 nm. Umetci su × 6, 9 uvećanih prikaza određenih regija. Ukupna aksonska duljina ( c : kontrola, 1017, 13 ± 112, 96 µm, n = 19 neurona nasuprot Neuritinu, 2555, 57 ± 341, 08 µm, n = 26 neurona) i dendritička duljina ( d : kontrola, 709, 35 ± 78, 79 µm, n = 23 neurona nasuprot Neuritinu, prikazano je 1446, 69 ± 171, 17 μm, n = 30 neurona) neurona koji eksprimiraju kontrolu i neuritin. ( e ) detaljne analize neurita vizualiziranih bojenje zastavama. Neuritin je usporio brzinu smanjenja prijelaznih brojeva (na 30 μm: kontrola, 5, 64 ± 0, 76 nasuprot Neuritinu, 7, 88 ± 0, 71, * P = 0, 0402; na 40 µm: 4, 86 ​​± 0, 93 nasuprot 7, 13 ± 0, 58, * P = 0, 0415; na 60 µm: 3, 57 ± 1, 06 u odnosu na 7, 19 ± 0, 77, ** P = 0, 0011; na 70 µ m: 3, 57 ± 0, 97 prema 6, 94 ± 0, 91, ** P = 0, 0053; na 80 µm: 2, 64 ± 0, 88 prema 4, 25 ± 1, 06, *** P = 0, 0004; na 90 µm: 2, 64 ± 0, 82 naspram 5, 94 ± 0, 62, ** P = 0, 0018; na 100 µm: 2, 27 ± 0, 63 naspram 5, 71 ± 0, 68, ** P = 0, 0018; na 110 µm : 1, 79 ± 0, 55 nasuprot 5, 44 ± 0, 61, *** P = 0, 0009; pri 120 μm: 1, 91 ± 0, 51 u odnosu na 4, 69 ± 0, 58, ** P = 0, 0012). Statistička značajnost izražena je * P <0, 05; ** P <0, 01; *** P <0, 001

Slika pune veličine

Neuritna složenost također je važna za aktivnost neurona kroz neuronske krugove, jer složenost utječe na širenje akcijskog potencijala kao i na unutarnje paljenje. 34, 35 Stoga smo izračunali broj neuritičkih presjeka koncentričnih krugova radijusa koji se povećavaju za 10 μm (Sholl analiza) 36 da bismo kvantitativno analizirali složenost neuritičkih stabala. U kontrolnim vektorima transfektiranim neuronima, brojevi presijecanja dosegli su vrhunac na 30 µm od soma, a zatim se kontinuirano smanjivali (Slika 1e). Kao što je opaženo kod optičkih tektalnih neurona ili motornih neurona Xenopus laevis , 24, 25, 28, neuritin je povećao broj presjeka za ~ 40% na vrhuncu, a zatim je smanjio brzinu smanjenja (Slika 1e). Ovi rezultati jasno pokazuju da prolazna ekspresija neuritina potiče rast aksonalnih i dendritičkih procesa i dramatično povećava složenost neuritskih stabala. Iako smo procijenili neuritogenetsku aktivnost neuritina u ranoj fazi razvoja (6 DIV), regulirani izraz neuritina može modulirati neuritsku razradu i, zauzvrat, može utjecati na kvalitetu i količinu sinaptičkog prijenosa čak i u kasnijim fazama.

Neuritin potiče sinaptičko sazrijevanje

Pokazalo se da neuritin pojačava dendritičku razradu i sinaptogenezu, 27, 30, 31, no utječe li ekspresija neuritina na sazrijevanje sinapsi sisavaca još uvijek nije poznato. Stoga smo analizirali morfologiju pojedinih bodlji, kao i gustoću kralježnice nakon transfekcije na 9 DIV i dodatnu inkubaciju od 14 dana. Ko-transfekcija monomernog DsRed omogućila nam je vizualizaciju i kvantitativnu analizu dendritskih struktura kralježnice neovisno o ekspresiji neuritina. Neuritini koji eksprimiraju neurone pokazali su porast gustoće kralježnice u usporedbi s kontrolnim neuronima (* P = 0, 0134, neparni t- test; Slike 2a i b-1).

Image

Ekspresija neuritina pospješuje sazrijevanje bodlji. ( a ) Reprezentativne slike ili kontrolnog vektora (lijevo) - ili neuritina (desno) koji eksprimiraju neurone imunostanirane sa eGFP / zastavom i (zeleno, gornje) i istovremeno označeno monomernim DsRed (mDsRed, crveno, srednje). Fluorescentne slike su spojene (dolje). Linija skale, 10 µm. ( b ) Brojevi kralježnice na 10 µm mjere se ( b – 1 : kontrola, 9, 73 ± 0, 83 nasuprot Neuritinu, 12, 86 ± 0, 90) i razvrstavaju u njihove podvrste ( b – 2 : Klasa I: Kontrola, 1, 85 ± 0, 18 nasuprot Neuritinu, 2, 53 ± 0, 22; Klasa II: 3, 88 ± 0, 43 naspram 6, 23 ± 0, 51; Klasa III: 3, 20 ± 0, 36 prema 3, 26 ± 0, 38; Klasa IV: 0, 80 ± 0, 09 u odnosu na 0, 84 ± 0, 12) iz kontrolnog vektora- ( n = 31) i neuritinskog ekspresije ( n = 34) neurona. ( c ) Pitene karte koje prikazuju učestalost promatranja svake vrste bodlji. ( d ) Kumulativni dijagrami vjerojatnosti za promjere glave kralježnice ( d – 1 ) i duljine kralježnice ( d – 2 ). Prikazani su umeci: prosječni promjeri glave kralježnice (kontrola, 0, 86 ± 0, 1 µm naspram Neuritina, 0, 97 ± 0, 01 µm) ili duljine kralježnice (1, 78 ± 0, 03 µm naspram 1, 79 ± 0, 02 µm). Za ( c i d ) koristi se 1345 bodlji iz 31 neurona koji eksprimira vektor i 2245 bodlji iz 34 neurona koji eksprimiraju neuritin. Statistička značajnost izražena je * P <0, 05 i *** P <0, 001

Slika pune veličine

Oblik dendritične kralježnice izrazito se mijenja sinaptičkom aktivnošću koja joj se nameće, pa stoga strukturni potpis može predstavljati sinaptičku učinkovitost. 2, 3, 4, 37 bodlje su kategorizirane u četiri klase na temelju promjera glave (širine) i dužine kralježnice, koji obuhvaćaju glavu i vrat: I – IV: bodljikava, gljiva, tanka i filopodija. 3, 37, 38 Svaka klasa kralježnice ima izrazitu funkciju u sinaptičkom prijenosu i različito doprinosi sinaptičkoj plastičnosti; bodljike od gljiva obično su funkcionalnije kompetentnije od ostalih. 5 Kad smo klasificirali pojedinačne kičme (vidi materijale i metode za detaljne kriterije), 38 neurona koji eksprimiraju neuritin pokazao je značajno povećan broj bodlji koji pripadaju klasi I (* P = 0, 0269, Mann-Whitney U- test) i klasi II ( *** P <0, 001) u usporedbi s kontrolom. Suprotno tome, ekspresija neuritina nije utjecala na broj bodlji u klasi III ( P = 0, 8696) ili klasi IV ( P = 0, 7775) (Slike 2b – 2). U skladu s tim, od ukupnog broja izbočenja udio bodlji klase II povećan je za ~ 10%, uz neznatna smanjenja udjela bodlja klase III i klase IV (slika 2c). Podržavajući povećani udio bodova klase II, ekspresija neuritina rezultirala je povećanjem prosječnog promjera glava kralježnice (*** P <0, 001, Kolmogorov-Smirnov test; Slike 2d-1), ali nije utjecala na duljinu kralježnice ( P = 0, 1344, Kolmogorov-Smirnov test; Slike 2d-2). U skladu s našim podacima, bodljike gljive (klasa II) na neuronima u vizualnom korteksu bile su manje obilne u miševa kojima je nedostajao neuritin od onih u njihovim WT leglomaterima. 29 Stoga neuritin vjerojatno ima ulogu u stabiliziranju funkcionalno zrelih sinapsi ili, možda, u olakšavanju sazrijevanja dendritičnih bodlji.

Neuritin pojačava bazalni sinaptički prijenos

Promicanje neuritičkog rasta i sazrijevanje dendritičke kralježnice sugeriralo je da neuritin može kontrolirati funkcionalnost sinaptičkih veza. Kao i u morfološkoj analizi kralježnice, hipokampalni neuroni su transficirani ili kontrolnim ili neuritinskim vektorima u 9 DIV i inkubirani dodatnih 14 dana. Za mjerenje kvantalnih sinaptičkih odgovora zabilježili smo minijaturne ekscitatorne postsinaptičke struje (miniEPSC), uglavnom miniEPSC-ove posredovane receptorima α -amino-3-hidroksi-5-metil-4-izoksazolepropionske kiseline (AMPA), s potencijalom zadržavanja od -70 mV ( Slika 3a). Amplituda miniEPSC-a predstavlja kvantalnu veličinu koja se normalno izvodi iz sadržaja vezikula vezikula ili obilja postinaptičkog AMPA receptora, dok promjene u učestalosti miniEPSC-a označavaju promjene u vjerojatnosti oslobađanja presinaptičkih vezikula ili u broju sinapsi koje sadrže AMPA receptore. 39 Važno je da je neuritin značajno povećao učestalost miniEPSC-a u usporedbi s onom u kontrolama (** P = 0, 007, Mann-Whitney U- test; Slike 3b i c), ali nije utjecao na amplitudu miniEPSC-a ( P = 0, 3, Mann-Whitney U- test; Slike 3b i c). Povećavanje učestalosti miniEPSC-a zabilježeno je i u optičkim tektalnim neuronima X. laevis koji su virusno eksprimirali neuritin. 25 Stoga, ovi podaci pokazuju da neuritin povećava broj funkcionalnih sinapsi, možda promičući sazrijevanje sinapsi.

Image

Ekspresija neuritina povećava učestalost miniEPSC u uzgojenim hipokampalnim neuronima. ( a ) Reprezentativni tragovi miniEPSC-a zabilježeni iz kontrolnog vektora (gore) - ili neuritina (dno) koji eksprimiraju neurone hipokampala. Umjeravanje: 20 pA i 200 ms. ( b ) Kumulativni dijagrami vjerojatnosti amplituda miniEPSC-a (vrh) i intervala intervala-događaja (dno). ( c ) Srednja amplituda miniEPSC-a (gornja: kontrola, 11, 7 ± 0, 4 pA nasuprot Neuritinu, 12, 7 ± 0, 7 pA) i miniEPSC frekvencija (dno: 1, 2 ± 0, 2 Hz u usporedbi s 2, 08 ± 0, 2 Hz) uspoređuju se između kontrolnog vektora- ( n = 10) i neuritin- ( n = 13) koji izražavaju neurone. Statistička značajnost izražena je kao ** P <0, 01

Slika pune veličine

Topivi neuritin sprečava dendritičku atrofiju hipokampalnih neurona iz Tg2576 miševa

Nećelijska autonomna funkcija koju vrši neuritin sugerira da djeluje kao ligand na nepoznate receptore. 24, 25 Zapravo, pokazalo se da neuritin postoji pretežno kao topljivi izlučeni oblik in vivo , 26 i nekoliko studija pokazalo je da taj topljivi oblik ima neurotrofne učinke na neurone sisavaca. 16, 26, 27 Neuritska atrofija obično se opaža u mozgu pacijenata s AD i modela AD, 40 te se lako rekapitulira u uzgojenim neuronima pripremljenim od Tg2576 miševa. 41 Da bismo razvili potencijalnu uključenost neuritina u neuritsku atrofiju, izmjerili smo nivo mRNA neuritina u hipokampu 6-mjesečnih Tg2576 miševa, što je otkrilo smanjenje mRNA neuritina u usporedbi s onom kontrole WT legla (** P = 0, 0079, neparni t- test; Slika 4a). Stoga smo odlučili ispitati nudi li porast neuritina zaštitno djelovanje na dendritičkoj kulturi u kultiviranim hipokampalnim neuronima iz Tg2576 miševa ili od njihovih WT legla. Da bismo pravilno kontrolirali koncentraciju neuritina tijekom sljedećih pokusa, egzogenski smo primijenili rekombinantni neuritin peptid, topljivi neuritin u 150 ng / ml, 16, 27, 42, umjesto da pretjerano eksprimiramo neuritin pune dužine. Za vizualizaciju čitavih dendritičnih grana koristili smo virus bjesnoće koji kodira eGFP (SADΔG eGFP) 43 i analizirali smo i dendritičku arbornizaciju koristeći Sholl analizu i gustoću kralježnice nakon liječenja neuritinom (Slika 4b). Neočekivano, sam topljivi neuritin peptid nije utjecao na dendritičku arbornizaciju u WT kontrolnim neuronima ni na jednoj udaljenosti od soma (slike 4c-e i dopunska tablica 1), što se razlikovalo od naših rezultata prolaznim izrazom neuritina pune duljine (slika 1). 24, 25, 28, 30 Broj kralježnice također nije promijenjen liječenjem neuritin peptidom ( P > 0, 05, jednosmjerna ANOVA s post hoc Bonferroni; Slike 4f ​​i g).

Image

Topivi neuritin peptid sprečava neuritsku atrofiju u neuronima iz Tg2576 miševa. ( a ) Razine mRNA neuritina prikazane su iz hipokampa 6-mjesečnih Tg2576 i WT miševa nakon normalizacije u odnosu na WT steljere (WT, 1 ± 0, 0201 u odnosu na Tg2576, 0, 8340 ± 0, 0177, n = 5 miševa, respektivno ). ( b ) Eksperimentalna shema za liječenje i obrađivanje neuritin peptidom. ( c ) Reprezentativne slike hipokampnih neurona koji eksprimiraju eGFP, pripremljene od Tg2576 ili njihovih miševa s WT leglom nakon tretmana rekombinantnim neuritin peptidom (150 ng / ml 16, 27, 42 ) ili nosačem (PBS kao kontrola). Linija skale, 50 µm. ( d ) Provode se potresne analize za mjerenje dendritičnih prijelaza grane sa označenim udaljenim krugovima od soma. Statistička značajnost između WT-kontrole naspram Tg2576-Control izražava se kao * P <0, 05, ** P <0, 01, *** P <0, 001, dok se usporedba između Tg2576-Control i Tg2576-Neuritina izražava kao P <0, 05, ‡ ‡ P <0, 01. ( e ) Ukupni broj prijelaza do rubne grane, ~ 120 μm, prikazan je za svaku skupinu. WT-kontrola, 286, 8 ± 11, 3 u odnosu na WT-Neuritin, 320, 4 ± 11, 1 u odnosu na Tg2576-Control, 182, 3 ± 16, 6 u odnosu na Tg2576-Neuritin, 253, 3 ± 14, 1, n = 11 neurona, respektivno. ( f ) Predstavljene su reprezentativne slike eGFP obilježenih dendrita Tg2576 i WT neurona nakon liječenja rekombinantnim neuritinom ili nosačem (PBS kao kontrola). Linija skale, 10 µm. ( g ) Ukupni broj bodlji na 10 µm iz svake skupine. WT-kontrola, 8, 69 ± 0, 37 u odnosu na WT-neuritin, 8, 78 ± 0, 33 u odnosu na Tg2576-Control, 5, 48 ± 0, 37 u odnosu na Tg2576-neuritin, 8, 68 ± 0, 46, n = 11 neurona, respektivno. Višestruka usporedba korištenjem post-hoc Bonferronijeva testa nakon ANOVA otkriva značajno smanjenje ukupnog broja križanja ( e ) i broja kralježnice ( g ) iz Tg2576 neurona u usporedbi s onima iz drugih skupina. Statistička značajnost izražena je kao ** P <0, 01 i *** P <0, 001

Slika pune veličine

U skladu s prethodnim izvješćem, 41 neuron izoliran iz Tg2576 miševa pokazao je pretjerano pojednostavljenje u svojim dendritičkim stablima, što pokazuje i značajno smanjen broj ukupnih dendritičkih križanja (*** P <0, 001, jednosmjerna ANOVA s post hoc Bonferroni; Slika 4e ) i bodlje (*** P <0, 001; Slike 4f ​​i g) u usporedbi s onima iz WT kontrolnih miševa. Važno je da je liječenje neurona s Tg2576 miševima topljivim neuritin peptidom značajno oslabilo smanjenje dendritičke elaboracije (Tg2576-Neuritin naspram Tg2576-Control, ** P = 0, 0036; Slika 4e) i sinaptičku tvorbu (*** P <0, 001; Slika 4g), pa čak i preokrenuo gotovo na razinu opaženu u WT neuronima ( P > 0, 05 i za dendritičke prelaze i za broj kralježnice; Slike 4e i g), u skladu s našim nedavnim opažanjima. 44 Da bismo dodatno ispitali učinkovitost neuritina, liječili smo Tg2576 neurone s povećanom koncentracijom topljivog neuritina. Složenost neuritskih procesa Tg2576 neurona povećala se na način ovisan o dozi korištenog neuritin peptida i bila je usporediva s kontrolnom razinom, posebno od 150 ng / ml (dopunska slika 1). Stoga, topljivi neuritin vjerojatno ima zaštitnu ulogu protiv dendritičke degeneracije koja se očituje u modelima AD i eventualno u bolesnika s AD.

Topivi neuritin spašava sinaptičku plastičnost hipokampa u Tg2576 miševima

Brojni životinjski modeli AD pokazuju manjak u sinaptičkoj plastičnosti hipokampalnih krugova, prvenstveno zbog sinaptotoksičnih aktivnosti oligomernog A β . 45, 46, 47, 48 Na primjer, dugotrajno potenciranje (LTP), elektrofiziološki predstavnik sinaptičkog jačanja u neuronskim vezama na kojima počivaju učenje i pamćenje, 49 u hipokampusu Tg2576 miševa ozbiljno je oslabljeno u dobi od 6 mjeseci istodobno s nagli porast toksičnog deficita A β peptida i pamćenja. 50, 51, 52, 53 S obzirom na uočenu neuroprotektivnu ulogu topljivog neuritina, kao i nedavno izvješće da je neuritin poboljšao kognitivne sposobnosti u Tg2576 miševa, 44, mi smo zaključili da topljivi neuritin može imati utjecaj na LTP u Tg2576 miševima.

U početku smo uspoređivali LTP u Schaffer-ovom kolateralnom putu akutnih križaka hipokampa kod šestomjesečnih miševa Tg2576 s onim u njihovih WT legla. U skladu s prethodnim izvještajima, 47, 50 LTP značajno je oslabljeno kod Tg2576 miševa u usporedbi s WT miševima (*** P = 0, 00004, neparni t- test; Slike 5a i c). Kako bismo riješili mogućnost da je topljivi neuritin utjecao na ovaj deficit LTP-a, infuzirali smo rekombinantni neuritinski peptid u cerebroventrike 6-mjesečnih Tg2576 miševa pomoću osmotskih pumpi tijekom 2 tjedna i zatim pregledali LTP. Otkrili smo da je ova kronična infuzija topljivog neuritina u mozgove Tg2576 miševa spasila LTP, dok su miševi Tg2576 koji su primili umjetnu cerebrospinalnu tekućinu (aCSF) još uvijek imali oštećenja u LTP (* P = 0.03346; Slike 5b i c). Zapravo, veličina LTP-a dobivena od Tg2576 miševa infuziranih topljivim neuritinom bila je usporediva s WT miševima (Tg2576-Neuritin naspram WT, P = 0, 438; Slika 5c). Uzeti zajedno, ovi rezultati pokazuju da topljivi neuritin funkcionalno vraća sinaptičku plastičnost, vjerovatno svojim neuroprotektivnom aktivnošću na razini strujnog kruga.

Image

Topivi neuritin spašava LTP u hipokamima Tg2576 miševa. ( a ) LTP u Schaffer kolateralnom putu 6-mjeseci starih WT legla i Tg2576 miševa. Terenski EPSP snimljeni su iz CA1 regije akutnih kriški hipokampa, a LTP je induciran TBS, označenim crnom strelicom. LTP je izražen kao srednja vrijednost ± SEM% nagiba referentne vrijednosti fEPSP-a zabilježenih tijekom najmanje 20-minutnog početnog razdoblja. Umetci pokazuju reprezentativne tragove na vremenskim točkama kolorima (kalibracija: 1 mV i 10 ms). ( b ) LTP Tg2576 miševa koji su podvrgnuti osmotskoj infuziji bilo aCSF ili rekombinantnog neuritin peptida. Strelica, umeci i umjeravanje kao u a . ( c ) Sažeti histogram za sinaptičko potenciranje 1 sat nakon LTP indukcije u a i b . Jačina LTP u Tg2576 miševa značajno se smanjila (WT, 166, 8 ± 10, 9%, n = 8 kriški od 3 miševa u odnosu na Tg2576, 101, 4 ± 4, 8%, n = 9 kriški od 3 miševa), ali nastavljena je osmotskom infuzijom topljivog neuritin peptida (Tg2576-Control, 100, 5 ± 4, 9%, n = 12 kriški od 4 miševa u odnosu na Tg2576-Neuritin, 146, 3 ± 22, 2, n = 9 kriški od 4 miševa). Statistička značajnost izražena je * P <0, 05 i *** P <0, 001

Slika pune veličine

Rasprava

Funkcionalna uloga neuritina u živčanom sustavu u razvoju opsežno je proučena, dok fiziološka djelovanja neuritina na sinaptičke značajke, posebno one povezane s neurodegenerativnim bolestima, ostaju u velikoj mjeri nepoznata. Ovdje smo procijenili promovirajuće učinke neuritina na neuritsku razradu, sazrijevanje dendritičke kralježnice i sinaptički prijenos. Prvi put smo pokazali da je topljivi neuritin preokrenuo neuritsku atrofiju i oštećenje sinaptičke plastičnosti očitovane u Tg2576 transgeničnom modelu miša AD, podržavajući ulogu za necelijske autonomne funkcije neuritina.

Neurotrofične uloge neuritina

Izraz "neurotrofični" općenito se koristi za opisivanje zbirke učinaka koji pokreću neuritogenezu, arbornizaciju grana, sinaptogenezu ili preživljavanje diferencirajućih neurona. 11 Prethodna ispitivanja koja su koristila prolaznu ekspresiju neuritinskog gena ili primjenu neuritin peptida pružila su dokaze da neuritin ima neurotrofičnu ulogu barem tijekom razvojne faze. Te neurotrofne funkcije uključuju promicanje neuritogeneze, 16, 24, 27 regulaciju formiranja i stabilizacije sinapse, 25, 28, 29, 31 i prevenciju programirane stanične smrti. 26, 27 U skladu s ovim neurotrofnim djelovanjima, ekspresijski obrazac neuritina je prostornotemporalno povezan s ekspanzijom neuronskih progenitornih stanica 26, 54 i sinaptičkim modifikacijama izazvanim aktivnostima. 18, 19, 20, 22 Na primjer, transkripcija neuritina u vizualnom korteksu pojačana je tijekom otvaranja oka, 19, 55, kada se bilježe znatna povećanja u složenosti dendritičkih grananja i broju kralježnice, kao i u miniEPSC-ima. 33, 56, 57

Prethodna otkrića proširili smo na djelovanje neuritina na formiranje i sazrijevanje dendritičnih bodlji, pokazujući da je izraz neuritina doveo do povećanja broja i udjela bodljikavog i gljivastog bodlja. Za razliku od svestranih malih bodljikava (filopodija i tankih bodlji), koje obično tvore sinate ili tipove na glutamat osjetljive na glutamat, velike bodlje (bodljikave i gljive) s velikom postsinaptičkom gustoćom visoko su obogaćene AMPA receptorima i tako snažno osjetljive na presinaptički glutamat izdanje. 2, 58 Ekspresija neuritina rezultirala je povećanjem učestalosti, ali ne i amplitudom miniEPSC-a. U kombinaciji s povećanim brojem funkcionalno zrelih bodlji, selektivni utjecaj na učestalost miniEPSC-a može se pripisati pretvaranju tihih sinapsa posredovanih neuritinom u funkcionalne sinapse, uključujući uključivanje AMPA receptora u čisti-N-metil-D -aspartat ( Sinapse receptora NMDA). 25 Alternativno, postinaptička ekspresija neuritina može retrogradno mijenjati presinaptičke značajke, poput povećanja vjerojatnosti oslobađanja presinaptičkih vezikula, što rezultira povećanom učestalošću miniEPSC-a. 39 Detaljna analiza molekularnih mehanizama koji stoje na osnovi sinaptičkih učinaka neuritina doprinijet će daljnjem razumijevanju funkcionalnog sazrijevanja sinapsi.

Neuritin pune duljine nasuprot topivom neuritinu

Slično endogenom neuritinu, egzogeni eksprimirani neuritin postoji u oblicima povezanim na površini stanice i u izlučenim oblicima. 26 U optičkim tektalnim neuronima X. laevisa, ekspresija neuritina pune duljine pospješila je aksonski rast ili dendritičko grananje, kao i pretvorbu tihih sinapsi u funkcionalne sinapse, dok skraćeni oblik neuritina koji nedostaje GPI slijed nije imao. 24, 25 Intrigantno, izlučeni oblik neuritina, uključujući neuritin peptid, doveo je do neurotrofičnih posljedica na neurone sisavaca, uključujući promicanje neuritske razrade i prevenciju apoptoze. 16, 26, 27 Postoji mogućnost da bi neuritin koji nedostaje GPI mogao biti nepravilno obrađen, te se stoga ne bi mogao izlučiti u izvanćelijski prostor. 59 Međutim, trebalo bi utvrditi da li i na koji način topivi neuritin daje različite izlaze u usporedbi s neuritinom povezanim na staničnoj površini.

Iznenađujuće, efekt na dendritičku složenost topljivog neuritina primijenjenog na neurone iz WT miševa bio je nerazdvojiv od efekta neurona liječenih PBS-om (Slika 4). Ovaj nedostatak topljivog neuritina bio je u velikoj suprotnosti s onim koji je prethodno uočen u kortikalnim i hipokampalnim neuronima. 16, 26, 27 Ova se odstupanja mogu pripisati razlici u razvojnom stadiju neurona, to jest DIV. Ispitivali smo dendritičku složenost u kasnoj fazi (DIV, 19) nakon primjene topljivog rekombinantnog neuritina, dok su analize u tim prethodnim studijama rađene u ranijim fazama (DIV, 3–7). 16, 26, 27 Ovu mogućnost dodatno podupire i naše opažanje da je neuritska obrada povećana ekspresijom neuritina procijenjenom na 6 DIV (Slika 1). Različita morfološka učinkovitost neuritina unutar ograničenog vremenskog razdoblja može biti posljedica stropnog učinka na signalne mehanizme aktivirane endogenim neuritinom, jer se razina endogenog neuritina hipokampa povećala od postnatalnog dana 4. do odrasle dobi. 16 Rekapitulirajući porast endogenog neuritina u uzgojenim hipokampnim neuronima može pojačati kaskadne signalne kaskade, koje su u 12 DIV potpuno zasićene; prema tome, egzogena primjena topljivog neuritina nakon toga ne bi proizvela dodatne učinke. Zanemariv učinak neuritin peptida na sazrele WT neurone (Slika 4) tjera nas na pretpostavku da neuritin ima ulogu u dendritičkoj arborizaciji, formiranju sinapse i sinaptičkom prijenosu tijekom rane faze razvoja, ali ne i kada se njegova ekspresija zasiti u kasnijoj fazi (DIV, 19). S obzirom na smanjenu razinu neuritina u mozgu bolesnika s AD 44 i u hipokampu Tg2576 miševa (slika 4a), moguće je nagađati da egzogeni neuritin može suzbiti smanjenje endogenog neuritina opaženog u neuronima s Tg2576 miševa na preokret neuritičkog atrofija.

Topivi neuritin sprečava sinaptički deficit u AD-u

Važno je da smo pokazali da topljivi neuritin sprječava dendritičku atrofiju i oštećenje LTP-a u neuronima hipokampala i hipokampa kod Tg2576 miševa. Oba deficita uključuju aktiviranje kaspaze-3. 46, 60, 61 Dokazano je da sinaptotoksični A β aktivira kaspazu-3, što rezultira cijepanjem Aktl (također poznatom kao protein kinaza B- α ), čija je aktivnost od kritične važnosti za dendritičku arborarizaciju i sinaptičku plastičnost. 46, 60, 62, 63 Dakle, moguće je da aktiviranje pretpostavljenog receptora za neuritin ometa aktivaciju kaspaze-3 (Putz i sur. 26 ) i naknadno cijepanje Akt1, iako ta mogućnost nije procijenjena.

Nedavno je objavljeno da je topljivi neuritin pokrenuo put receptora za inzulin, sugerirajući receptor za inzulin kao pretpostavljeni receptor za neuritin. 42 Pored toga, topljivi neuritin stimulirao je izvanćelijsku signalno reguliranu kinazu (ERK) i sisavca metu rapamicina (mTOR) putem inzulinskog receptora. 42 Aktivnosti ERK-a i mTOR-a usko su bile uključene u sintezu de novo proteina, što je preduvjet normalne sinaptičke plastičnosti i stvaranja memorije. 49, 64, 65 Sve novi dokazi upućuju na to da disregulacija mTOR signalizacije uzročno pridonosi patogenezi AD-a, iako to i dalje ostaje diskutabilno. 64, 66, 67, 68 Kod miševa Tg2576 aktivnost mTOR-a je znatno suzbijena, a farmakološka regulacija mTOR-a spasila je LTP. 66 Funkcionalni značaj mTOR u sinaptičkim defektima AD-a potkrijepljen je podacima o ponašanju drugog životinjskog modela AD. 68 Stoga, normalizacija LTP u Tg2576 miševa infuzijom topljivog neuritina može biti posljedica povećanja mTOR aktivnosti posredovanog neuritinom. S obzirom na neuroprotektivnu aktivnost topljivog neuritina, posebno za neurone s Tg2576 miševa, a ne za one s WT kontrola, bit će korisno utvrditi da li infuzija topljivog neuritina u mozak miševa Tg2576 također normalizira njihov memorijski deficit.

Ukratko, samo liječenje neuritinom rezultiralo je neurotrofičnim aktivnostima u rastu neurita i sazrijevanju dendritičke kralježnice u normalnim neuronima, osobito u ranim fazama razvoja. Ono što je također važno, pokazali smo da topljivi neuritin provodi neuroprotektivne akcije za neurone i hipokampalne sklopove kod miševa Tg2576, što je spriječilo dendritičku atrofiju i oštećenje sinaptičke plastičnosti. Pružili smo značajne dokaze da topljivi neuritin poništava sinaptičke nedostatke u životinjskom modelu AD, sugerirajući da manipuliranje nivoom endogenog neuritina ili opskrbom egzogenim topljivim neuritinom može ponuditi terapijske koristi protiv neurodegenerativnih bolesti.

Materijali i metode

DNK i virusni konstrukti

Koristili smo pIRES-EGFP-neuritin1-FLAG za prekomjernu ekspresiju neuritina i pIRES-EGFP za njegov kontrolni plazmid na primarnim hipokampalnim neuronima, koje je dr. Nedivi ljubazno pružio na MIT-u. 26 Da bismo vizualizirali ili kategorizirali dendritične bodlje, koristili smo pDsRed-Monomer-N1 za dodatnu transfekciju ili virus bjesnoće koji kodira poboljšani GFP (SADΔG eGFP) za virusnu infekciju. 43

Kultura hipokampalnih neurona, transfekcija i imunocitokemija

Primarni neuroni hipokampale secirani iz embrionalnog miševa 18 dana C57BL / 6 postavljeni su na pokrivače od poli-L-lizina (Sigma, St. Louis, MO, SAD). Neuroni su održavani u neurobasalnom mediju (Invitrogen, Carlsbad, Kalifornija, SAD) sa dodatkom B27 (Invitrogen), 5 mM L-glutamina (Sigma), 2, 5 µM citozina β - D-arabinofuranosida (Sigma), 5% fetalnog goveđeg seruma ( Hiklon, Logan, UT, SAD) i 1% penicilina / streptomicina (Invitrogen) u vlažnom okruženju od 5% inkubatora CO 2 /95% O2 na 37 ° C.

Neuroni su transfektirani Kit za transfekciju kalcijevim fosfatom (Invitrogen) slijedeći prethodno opisane metode. 69 Ukratko, inkubirali smo neurone u prethodno zagrijanom minimalnom esencijalnom mediju (Invitrogen) dopunjenom s 5 mM MgCl2 tijekom 30 minuta i rastvarali prethodno pomiješani talog DNA / kalcijev fosfat u medij. Nakon inkubacije od 45 minuta, neuroni su isprani tri puta prethodno ekvilibriranim HBSS-om u 10% -tnom CO 2 /90% O2 inkubatoru pri 37 ° C.

Za imunocitokemiju, neuroni su fiksirani s PBS koji sadrži 4% paraformaldehida, 4% saharoze 10 minuta na 37 ° C, i permealizirani s PBS koji sadrži 0, 2% Triton X-100, 20 mM glicina tijekom 5 minuta na sobnoj temperaturi. Neuroni su isprani tri puta s PBS-om u trajanju od 5 minuta, blokirani s 2% goveđeg serumskog albumina 30 minuta na sobnoj temperaturi i inkubirani s primarnim antitijelima protiv zastave (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, SAD), MAP2 (Sigma) i Tau-1 (Millipore, Bedford, MA, SAD) na 4 ° C preko noći. Nakon ispiranja, sekundarna antitijela konjugirana na Alexa Fluor 488 (Invitrogen) ili Alexa Fluor 568 (Invitrogen) nadalje se inkubiraju 45 minuta na 37 ° C.

Akvizicija slike i kvantitativna morfometrija

Fluorescentne slike dobivene su uporabom Olympus Fluoview 1000 konfokalnog mikroskopa. Slike prikupljene iz tri ili četiri neovisna eksperimenta pod istim parametrima analizirane su korištenjem softvera za obradu slika MetaMorph (Universal Imaging, Bedford Hills, NY, USA). Da se izbjegnu umirući neuroni koji utječu na rezultat, iz analize su isključeni neuroni s vakuolama u soma i s dendritičkom fragmentacijom.

Za analizu dendritične kralježnice odabrani su rijetko transfektirani neuroni koji su umanjili dendritičko preklapanje i snop slika je dobiven u z- dimenziji pri optičkoj debljini reza od 0, 4 µm kako bi se pokrili čitavi neuroni. Kriteriji za kategorizaciju kralježnice korišteni su prema ranije opisanoj metodi. 38 Ukratko, izbočenja duž dendrita razvrstana su u četiri klase kralježnice, ovisno o njihovoj širini glave i duljini vrata. Klasa I, „tvrdoglava“, kratke duljine <0, 5 µm, bez velikih glava bez vrata; II. Razred, "gljiva" za zrele bodlje s dužinom između 0, 5 i 1, 25 μm, s velikom kralježnicom i kratkim vratom; Klasa III, „tanka“ za bodlje s dužinom između 1, 25 i 3, 0 µm, s malom glavom kralježnice i izduženim vratom; Klasa IV, „fillopodia“ za immatuerove bodlje s dugim vlaknastim izbočenjima kojima nedostaju bilo kakve glave koje mogu rastaviti kralježnicu.

Za kvantitativno mjerenje složenosti dendrita, koristili smo Sholl-ovu analizu kao što je prethodno opisano. 36, 41 Nakon uklanjanja neuritskih procesa koji su očito proizašli iz ostalih stanica s izvornih slika, koncentrični krugovi s polumjerom od 10 µm izvučeni su 15 mm m osim soma, a broj križanja s dendritičkim granama u svakom krugu je izračunat korištenjem Slika J (NIH). Šolna analiza provedena je brojenjem ukupnih prijelaza na udaljenosti ~ 120 µm od soma.

Kvantitativni RT-PCR u stvarnom vremenu

Total RNA was extracted by miRNeasy mini kit (Qiagen, Hilden, Germany) and 0.5 μ g of RNA was processed for cDNA synthesis using SuperScript III First-Strand Synthesis System for RT-PCR Kit (Invitrogen) according to the manufacturer's instruction. Quantitative real-time RT-PCR was carried out using SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems, Carlsbad, CA, USA). Quantitative real-time RT-PCR was performed on a 7500 Fast Real-Time PCR systems (Applied Biosystems). The primers used were as follows: Neuritin forward, 5′-GGGACTTAAGTTGAACGGCA-3′; Neuritin reverse, 5′-ACCCAGCTTGAGCAAACAGT-3′; Gapdh forward, 5′-TCCATGACAACTT TGGCATTG-3′; Gapdh reverse, 5′-CAGTCTTCTGGGT GGCAGTGA-3′. All of the mRNA level were normalized to that of Gapdh mRNA.

Intracerebroventricular infusion of recombinant neuritin peptide using osmotic pumps

To examine the effect of soluble neuritin on synaptic plasticity in the hippocampus of AD model mice, we used Tg2576 mice that expressed human APP695 gene harboring the Swedish double mutation (KM670/671NL). 70 Tg2576 mice (Taconic, Germantown, NY, USA) were crossed with C57BL6/SJL F1 hybrid mice to get the offspring. For LTP experiments, we used 6-month-old heterozygous transgenic mice and their WT littermates. All mice were housed under a 12 h light/dark cycle and given ad libitum access to food and water. All procedures for animal experiments were approved by the ethical review committee of POSTECH (Pohang University of Science and Technology), Korea, and performed in accordance with the relevant guidelines.

Installation of the osmotic pumps was performed following the manufacturer's guideline. Forty eight hours before the surgery, the osmotic mini pump (1007D, Alzet, Cupertino, CA, USA) was filled with aCSF (containing the followings: 10 mM glucose, 119 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM NaH 2 PO 4, 1.3 mM MgSO 4, 2.5 mM CaCl 2, and 26 mM NaHCO 3 at pH 7.4) with or without recombinant neuritin peptide (1260 ng, Abcam, Cambridge, UK) and equilibrated in 0.9% NaCl at 37 o C. Delivery cannula (Alzet, brain infusion kit 3) was implanted in order to target the end of cannula to intracerebroventricle (coordination of anteroposterior, −0.4; mediolateral, ±1; dorsoventral, −2.3 in mM from the bregma) of anesthetized (Ketamine/Xylazine) mice in a stereotaxic apparatus (Kopf Instruments, Tujunga, CA, USA). The osmotic pump was attached to the delivery cannula tubing and subcutaneously implanted at the back to allow spontaneous infusion (injection speed: 90 ng/day). After 2 weeks of infusion, animals were killed for the LTP experiment.

Elektrofiziologiia

To measure miniEPSCs, neurons were placed in a recording chamber while perfused with aCSF containing 1 μ M voltage-gated sodium channel blocker tetrodotoxin (Tocris, Minneapolis, MN, USA), 20 μ M NMDA receptor antagonist D -2-amino-5-phosphonovaleric acid (Tocris), 100 μ M γ -aminobutyric acid class A receptor antagonist picrotoxin (PTX, Tocris). Whole-cell voltage-clamp recording was performed with a MultiClamp 700B amplifier (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA) using the recording electrodes (3–5 MΩ) filled with a pipette solution containing 100 mM Cs methanesulfonate, 20 mM CsCl, 10 mM HEPES, 10 mM EGTA, 4 mM MgCl 2, 0.4 mM NaGTP, 4 mM MgATP, and 10 mM phosphocreatine (finally adjusted to pH 7.2). Throughout the recording experiments, the series resistance (10–30 MΩ) was monitored while holding neurons at −70 mV. Currents were filtered at 2.4 kHz, digitized at 10 kHz, and then miniEPSCs were analyzed in Mini Analysis Program (Synaptosoft Inc., Fort Lee, NJ, USA) using custom software with detection criteria that included an amplitude>8 pA, a minimum rise rate of 5 pA/ms, and a decay constant between 1–12 ms.

For LTP in acute hippocampal slices, field excitatory postsynaptic potentials (fEPSPs) were recorded from transverse-sectioned acute hippocampal slices (400 μ m thick) obtained from 6-month-old male Tg2576 or their WT littermate mice. After decapitation, hippocampi were quickly isolated from the brain and chilled in ice-cold 50% sucrose-based (175 mM sucrose, 11 mM glucose, 20 mM NaCl, 3.5 mM KCl, 1.4 mM NaH 2 PO 4, 1.3 mM MgCl 2, and 26 mM NaHCO 3, adjusted to pH 7.4) aCSF that was oxygenated with 95% O 2 and 5% CO 2 gas. Acute hippocampal slices were obtained using an 800-McIlwain Tissue Chopper (Brinkman Instruments, Westbury, NY, USA) and placed in oxygenated aCSF at 37 °C for more than 1 h. Slices were maintained in a submerged recording chamber continuously perfused with oxygenated aCSF bath solution, containing 100 μ M PTX, at a flow rate of 2.5–3 ml/min. The fEPSPs were recorded in the striatum radiatum of the CA1 subfield by the 3 M NaCl-filled microelectrodes (3–5 MΩ) while stimulating the Schaffer collateral pathway afferent fibers with a bipolar concentric electrode (WPI). The pulses were generated with an A360 stimulus isolator (WPI) and fEPSPs were recorded with an Axopatch 200A amplifier linked to a Digidata 1200 (Molecular Devices) interface. Test fEPSPs were evoked by the stimulation intensity that yielded one-third of the maximal fEPSP responses at a frequency of 0.033 Hz, and LTP was induced by five episodes of theta burst stimulation (TBS) that were delivered at 0.1 Hz. In each episode, 10 trains of stimulation that consisted of four pulses at 100 Hz were delivered at 5 Hz.

Statistička analiza

All the numerical data resulted from analysis were denoted as mean±SEM%. Mann–Whitney U- test or unpaired t -test was used to determine statistical significance between two data set as appropriately. Kolmogorov–Smirnov test was used to compare the spine head diameter and length between groups. In the case of multiple comparisons, one-way ANOVA with post hoc Bonferroni test was used. Statistical significance between groups is expressed as follows: NS, not significant; * P <0, 05; ** P <0, 01; *** P <0, 001.

Dodatna informacija

Word dokumenti

  1. 1.

    Dodatna informacija

PDF datoteke

  1. 1.

    Dodatna informacija

Glosar

OGLAS

Alzheimerova bolest

A β

β -amyloid

BDNF

moždani neurotrofni faktor

GPI

glycosylphosphatidylinositol

WT

wild type

DIV

days in vitro

MAP2

microtubule-associated protein 2

miniEPSCs

miniature excitatory postsynaptic currents

AMPA

α -amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepro-pionic acid

LTP

long-term potentiation

aCSF

artificial cerebrospinal fluid

NMDA

N-methyl- D -aspartate

ERK

extracellular signal-regulated kinase

mTOR

mammalian target of rapamycin

fEPSPs

field excitatory postsynaptic potentials

TBS

theta burst stimulation

Dodatne informacije nalaze se u ovom radu na web stranici Cell Death and Disease (//www.nature.com/cddis)