Neuroprotektivni učinak osmotina protiv etapto-izazvane neurodegeneracije izazvane etanolom u mozgu štakora u razvoju | stanična smrt i bolest

Neuroprotektivni učinak osmotina protiv etapto-izazvane neurodegeneracije izazvane etanolom u mozgu štakora u razvoju | stanična smrt i bolest

Anonim

Sažetak

Fetalni alkoholni sindrom je neurološki i razvojni poremećaj uzrokovan izlaganjem mozga koji se razvija etanolu. Davanje osmotina mladuncima štakora smanjilo je apoptozu uzrokovanu etanolom u kortikalnim i hipokampalnim neuronima. Osmotin, biljni protein, ublažio je porast citokroma c , cijepljene kaspaze-3 i PARP-1 uzrokovanog etanolom. Osmotin i etanol smanjuju neurotoksičnost etanola i in vivo i in vitro smanjenjem razine proteina cijepljene kaspaze-3, unutarstaničnog [Ca2 + ] cita i mitohondrijskog transmembranskog potencijala, a također i reguliranog antiapoptotskog proteina Bcl-2. Osmotin je homolog adiponektina i on kontrolira energetski metabolizam fosforilacijom. Adiponektin može zaštititi neurone hipokampala od apoptoze izazvane etanolom. Širenje signala putem receptora AdipoRl ili AdipoR2, transfekcijom siRNAs, smanjuje sposobnost osmotina i adiponektina da zaštite neurone od neurodegeneracije izazvane etanolom. Metformin, aktivator AMPK (proteinska kinaza aktivirana adenosinovim monofosfatom), povećao je dok je spoj C, inhibitor puta AMPK, smanjio sposobnost osmotina i adiponektina u zaštiti od apoptoze izazvane etanolom. Osmotin je aktivirao svoju neuroprotekciju bjelančevinama Bcl-2 i aktiviranjem AMPK signalnog puta. Modulacija AMPK puteva osmotinom, adiponektinom i metforminom drži obećanje kao preventivnu terapiju fetalnog alkoholnog sindroma.

Glavni

Konzumiranje alkohola u majci izlaže mozgu fetusa etanolu koji remeti razvoj mozga kod ljudi i na životinjskim modelima. 1 Nastali neurološki poremećaji i nedostaci u razvoju očituju se tijekom čitavog životnog vijeka potomstva i nazivaju se fetalnim alkoholnim učincima ili fetalnim alkoholnim sindromom (FAS), ovisno o njihovoj ozbiljnosti. U ljudi efekti izloženosti fetalnom mozgu alkoholu uključuju kraniofacijalne malformacije, kao i niz neuroloških poremećaja, uključujući hiperaktivnost, nedostatak učenja i pamćenja, mentalnu retardaciju, psihozu, depresiju i shizofreniju. 2, 3 Trenutno, ne postoje efikasni tretmani za sprječavanje ili poništavanje FAS nakon izlaganja etanolu. 4

Studije izloženosti alkoholu u razvojnim životinjskim modelima pružile su uvid u moguće mehanizme neurotoksičnosti izazvane etanolom i također su omogućile proučavanje intervencija koje ublažavaju učinke etanola. Takve su studije utvrdile da je izloženost etanolu povezana s masovnim smanjenjem broja neurona u moždanoj kore, hipokampusu, moždanomu i žarulji. 5 Sadašnje studije daju snažne dokaze da je neurodegeneracija u značajnoj mjeri mehanizam kojim etanol remeti razvoj mozga kod glodavaca, a slično, izloženost etanolu narušava razvoj ljudskog fetalnog mozga. 6, 7, 8 Čini se da nekoliko puteva doprinosi induciranju smrti neurona etanolom. Oni uključuju oksidativni stres, brze promjene unutar staničnog Ca2 +, ekscitotoksičnost uzrokovanu NMDA antagonistom i GABA mimetičkim svojstvima etanola, poremećaj interakcija stanica i stanica i ometanje aktivnosti faktora rasta. 8, 9, 10 Bez obzira na okidač, apoptoza izazvana etanolom povezana je s povećanom propustljivošću mitohondrija i oslabljenom funkcijom mitohondrija.

Nekoliko nedavnih izvještaja o molekularnim mehanizmima djelovanja etanola u mozgu sugerira povezanost s hormonom adiponektinom sisavaca. Adiponektin je protein od 30 kD koji se izlučuju adipocitima čija je razina u serumu pozitivno povezana s osjetljivošću na inzulin, primjenom glukoze i masnih kiselina, kardiovaskularnom zaštitom i zaštitom od hipertenzije. 11 Na mehaničkom nivou, ovi metabolički učinci posreduju adiponektinom, velikim dijelom preko njegovih učinaka na energetski metabolizam. 12, 13 Ukratko, interakcija adiponektina s njegovim receptorima plazma membrane AdipoRl i AdipoR2 inducira fosforilaciju i aktivaciju proteinske kinaze aktivirane adenosinovim monofosfatom (AMPK), proteina koji osjeti iscrpljivanje stanične energije.

Adiponektin ulazi u cerebrospinalnu tekućinu iz krvi. 14 Ekspresija adiponektinskog receptora 1 (AdipoRl) je sveprisutna u mozgu štakora, dok je ograničena ekspresija AdipoR2 primijećena u specifičnim područjima mozga kao što su hipotalamus, korteks i hipokampus. 15 Primjena adiponektina intracerebroventrikularnom injekcijom štiti mišje hipokampalne neurone od ćelijske smrti uzrokovane kainskom kiselinom, vjerojatno poboljšanjem vaskularnog endotelnog rada i očuvanjem integriteta krvne moždane barijere. 16 Adiponektin štiti od cerebralne ishemijske ozljede. 17, 18 Ovi podaci zajedno govore da adiponektin ima široku ulogu u metabolizmu mozga. Ograničeni dostupni dokazi upućuju na to da je mehanizam djelovanja adiponektina u moždanom tkivu vjerojatno isti kao u ostalim tkivima. U arkusiranom hipotalamusu miševa adiponektin aktivira AdipoRl / R2 i potom inducira fosforilaciju AMPK-a za sistemski balansiranje unosa i potrošnje energije. Davanje adiponektina intracerebroventrikularnom injekcijom inducira AMPK fosforilaciju u hipotalamusu štakora. 15 Dakle, mehanizmi djelovanja adiponektina u mozgu i drugim organima imaju sličnosti. Ukratko, adiponektinski i adiponektinski receptori postoje u područjima mozga koja su pod utjecajem alkohola izazvana apoptozom koja je odgovorna za FAS. Stoga smo ispitali neuroprotektivne učinke puteva aktiviranih adiponektinom protiv FAS-a. Zbog ekonomičnosti, ovo je istraživanje provedeno s homologom adiponektina koji se u velikim količinama može izolirati i pročistiti iz biljnog tkiva. Upotrijebljeni homolog adiponektina bio je duhanski protein zvan osmotin.

Ovdje smo pokazali da osmotin in vitro štiti fetalne neurone hipokampnih fetusa, kao i neonatalne hipokampalne i kortikalne neurone in vivo protiv apoptoze izazvane etanolom. Adiponektin je također štitio od uvrede etanola u uzgojenim fetalnim neuronima hipokampala. Neuroprotekcija osmotinom i adiponektinom bila je posredovana adiponektinskim receptorima i aktivnošću AMPK. Zajedno, naši rezultati sugeriraju da se pogubni učinci FAS-a mogu spriječiti ili poništiti terapijskim intervencijama koje rezultiraju aktiviranjem AMPK, što može uključivati ​​široko korišteni antidijabetički lijek metformin, kao i adiponektin i osmotin. Ovo istraživanje također pokazuje vrijednost osmotina kao ekonomski eksperimentalne alternative adiponektinu. Osmotin slični proteini su sveprisutni u biljkama i javljaju se u jestivom voću, povrću i žitaricama. 19 Stoga, naši rezultati također sugeriraju da biljni proteini poput osmotina mogu biti vrijedan izvor neuroprotektivnih sredstava protiv FAS-a.

Rezultati

Osmotin štiti od etapto-izazvane neurodegeneracije izazvane etanolom u primarnim kulturama hipokampalnih neurona

Kraniofacijalne malformacije izazvane etanolom uključuju apoptozu i neurodegeneraciju koje nastaju u roku od 12 sati od izlaganja. 7, 8 Preliminarno ispitivanje utjecaja osmotina na neurodegeneraciju uzrokovanu etanolom proučeno je u primarnim kulturama hipokampnih neurona mozga fetusa štakorijom dvostrukim bojenjem Fluoro-Jade B (FJB) i propidijum-jodidom (PI). Nakon 24 sata liječenja etanolom, neuroni su bili izrazito kondenzirani i pokazali su se intenzivne FJB i PI mrlje u usporedbi s kontrolnim skupinama (Slika 1A). Skupina etanol plus osmotin imala je intermedijarni obrazac bojenja, a kvantitativna mjerenja potvrdila su da je u skupini koja je bila tretirana osmotinom plus etanolom manje degenerirajućih stanica u usporedbi sa stanicama izloženim samo etanolu i da je liječenje osmotinom preokrenuto. Kolokalizacija FJB i PI mrlja u svim uzorcima sugerirala je da je degeneracija uzrokovana etanolom usko povezana s staničnom smrću.

Image

Osmotin štiti od toksičnosti etanola na primarne kulture fetalnih neurona. ( A ) Fluorescentna analiza neurodegeneracije u primarnim kulturama hipokampnih neurona mozga štakora. Kulture su bile izložene mediju za rast bez (Kontrola) i etanola (EtOH, 100 mM) ili osmotina (Osm, 0, 16 μM ) plus dodataka EtOH (100 mM) 24 sata prije bojenja s Fluoro-Jade B (FJB; zelena) i propidijev jodid (PI; crveni). Povećanje × 60; ljestvica ljestvice, 20 µm. Na grafikonu su prikazani postoci FJB- i PI-pozitivnih stanica po odjeljku ( n = 4). Navedeni parovi značajno se razlikuju pri P <0, 05. ( B ) MTT ispitivanje vitalnosti stanica u primarnim kulturama hipokampnih neurona mozga štakora. Stanična vitalnost mjerena je nakon izlaganja etanolu i osmotinu u naznačenim koncentracijama tijekom 12 i 24 sata. Podaci su prosjek ± SE za tri neovisna pokusa ( n = 3), s po tri ploče u svakom pokusu. Statistički značajno razlike u razinama P <0, 05 su označene simbolima. Simboli: a , različiti od kontrole; b , različito od etanola (100 mM). ( C ) Prikazane su analize koncentracije kalcija citosola u primarnim kulturama hipokampala i kortikalnih neurona fetalnog mozga štakora izloženih određenim tretmanima tijekom 24 sata, nakon čega slijedi označavanje fura-2 AM

Slika pune veličine

Neuroprotektivni učinak osmotina dodatno je kvantificiran testom MTT (3- [4, 5-dimetiltiazol-2-il] -2, 5-difeni tetrazolijum-bromid) primjenom primarnih kultura hipokampalnog neurona izloženog etanolu 12 i 24 sata. Kao što je prikazano na slici 1B, dodatak etanolu u kulturi smanjio je održivost stanica na 55–60% u usporedbi s kontrolnom skupinom. Međutim, osmotin zajedno s kombinacijom etanola značajno je poboljšao vitalnost stanica, i to do 80–90% u usporedbi s skupinama koje su tretirane etanolom (Slika 1B). Etanol ima NMDA antagoniste i GABA mimetička svojstva, a vjeruje se da abnormalna inhibicija neuronske aktivnosti etanolom pokreće apoptotsku neurodegeneraciju. 20 Agenti koji pridonose ekscitotoksičnosti ili apoptozi neurona narušavaju homeostazu kalcija povećanjem razine unutarćelijskog Ca +2 . 21, 22, 23 Ranije se navodi da sredstva koja inhibiraju porast unutarćelijskog Ca2 + imaju neuroprotektivni učinak. 21, 22, 24 Stoga je važno odrediti učinke osmotina, etanola i etanola, plus izloženosti osmotinu na unutarćelijsku razinu Ca2 + . Primijetili smo da je unutarćelijska koncentracija Ca2 + značajno povišena u stanicama izloženim etanolu (100 mM) tijekom 24 sata u usporedbi s kontrolnim skupinama (Slika 1C). Osmotin je preokrenuo učinak etanola na unutarćelijsku razinu Ca2 + na način ovisan o koncentraciji, tako da se normalne razine unutarćelijskog Ca2 + mogu obnoviti odgovarajućom dozom osmotina (0, 16 µM ).

Oksidativna oštećenja mitohondrije i disfunkcija mitohondrija prate neurodegeneraciju i apoptozu uzrokovanu etanolom. 24 Potencijal mitohondrijske membrane mjeren je stoga u primarnim hipokampalnim neuronskim kulturama izloženim etanolu, osmotinu ili osmotinu plus etanolu tijekom 24 sata kako bi se istražio mehanizam uspostavljanja vitalnosti stanica tretmanom osmotinom. Kao što je prikazano na slici 2, liječenje neurona etanolom rezultira značajnom subpopulacijom stanica s malim potencijalom mitohondrijske membrane (FL1 stanice, 45, 14%). Manji postotak stanica u kontrolnim, tretiranim osmotinom i osmotinom plus etanolom skupinama imao je relativno nizak potencijal mitohondrijske membrane (29, 29%, 31, 47%, i 33, 01%, respektivno), pokazujući da etanol inducira kolaps mitohondrijske membrane a osmotin ima zaštitni učinak protiv oštećenja mitohondrija izazvanog etanolom.

Image

Osmotin štiti od propadanja potencijala mitohondrija prouzročenog etanolom u primarnim kulturama fetalnih neurona hipokampala. Polarizacija mitohondrija praćena je protočnom citometrijskom analizom stanica obojenih JC-1 koje su 24 sata tretirane etanolom (EtOH, 100 mM), osmotinom (Osm, 0, 16 μM ), osmotinom i etanolom (Osm, 0, 16 μM + EtOH, 100 mM) ili neobrađen (kontrola). Kolaps potencijala mitohondrijske membrane povezan je s visokom FL1 fluorescencijom (zelena) i niskom FL2 fluorescencijom (crvena). Broj u svakom kvadrantu pokazuje postotak populacije stanica u tom kvadrantu od ukupne ćelije

Slika pune veličine

Druga velika promjena u mitohondrijama tijekom apoptoze je povećanje propusnosti vanjske membrane mitohondrija. 25, 26 Nadalje, primijetili smo promjenu u ekspresiji proteina nakon izlaganja etanolu tijekom 24 sata u primarnim kulturama hipokampalnih neurona primjenom western blot analize. Naši rezultati pokazali su da je stanična smrt izazvana etanolom praćena povećanom nakupljanjem proapoptotskog proteina Bax i malim, ali značajnim smanjenjem razine antiapoptotskog proteina Bcl-2 (slike 3a i b). Ukupni učinak bilo je značajno smanjenje omjera Bcl-2 / Bax, što je sugeriralo da etanol ima značajan štetni učinak na propusnost mitohondrijske membrane. Najistaknutiji učinak izloženosti osmotinu bio je porast razine antiapoptotskog proteina Bcl-2 u usporedbi s tretmanom etanolom i gotovo nikakvo uznemirenje omjera Bcl-2 / Bax u usporedbi s kontrolnom skupinom (Slika 3b). Stanice izložene osmotinu i etanolu imale su značajno veće omjere Bcl-2 / Bax u odnosu na stanice tretirane etanolom, što sugerira da osmotin štiti od etaptoze inducirane etanolom zaštitnim učinkom na propusnost mitohondrija.

Image

Zaštitno djelovanje osmotina protiv etaptoze izazvane etanolom u primarnim kulturama fetalnih neurona hipokampusa dokazano je staničnim razinama apoptotskih proteinskih markera. ( a ) Stanice su bile izložene 24 sata normalnom mediju za rast koji nije sadržavao dodatke (Kontrola) ili su dodane etanolom (EtOH) i osmotinom (Osm) kako je naznačeno. Prikazani su imunobloti staničnih ekstrakata koji su frakcionirani pomoću SDS-PAGE. Korišteno antitijelo kaspaza-3 bilo je sposobno prepoznati i pro- i cijepanu kaspazu-3. Međutim, u tim su uzorcima vidljive samo cijepljene trake kaspaze-3. Mrljice su reagirale s antitijelom na p- aktin kao kontrola opterećenja. ( b ) Prikazana je kvantitativna analiza podataka iz točke ( a ). Vrijednosti gustoće, normalizirane na aktinske signale, izražavaju se kao srednje ± SD ( n = 5) i izražavaju se kao proizvoljne jedinice. Navedeni parovi značajno se razlikuju pri P <0, 05. Uložak pokazuje prosječni omjer Bcl-2 prema prosjeku Baxova signala tijekom tretmana

Slika pune veličine

Kaspaze su proteaze koje imaju središnju ulogu u pokretanju i izvršenju smrti apoptotičkih stanica. 27 Uočeno je povećanje razine cijepljene kaspaze-3 u stanicama tretiranim etanolom zapadnom blot analizom, što je u skladu s mišljenjom da izloženost etanolom inducira apoptotsku staničnu smrt u primarnim kulturama fetalnih neurona hipokampusa (slike 3a i b). Liječenje osmotinom smanjilo je razinu cijepljene kaspaze-3. Budući da se kaspaza-3 može aktivirati i mitohondrijalnom i nemitohondrijskom apoptozom, to sugerira da bi osmotin mogao imati antiapoptotski učinak protiv širokog spektra apoptotskih podražaja. Razina cijepljene kaspaze-3 bila je niža u stanicama tretiranim osmotinom plus etanolom u usporedbi s etanolom samim, što potvrđuje da osmotin ima antiapoptotski učinak u uzgojenim etanolom kultiviranim neuronima hipokampala.

Osmotin inhibira etaptozu izazvanu etanolom u mozgu novorođenčadi štakora

Kako bi se proučio zaštitni učinak osmotina protiv etaptoze izazvane etanolom in vivo , P7 Sprague-Dawley štakorima je intraperitonealno ubrizgan 20% -tni etanol u normalnoj fiziološkoj otopini dajući 4 mg / g tjelesne težine. Štenci su ubijeni u različito vrijeme nakon injekcije, a apoptotska neurodegeneracija praćena je kao porast razine cijepljene kaspaze-3 u hipokampusu (dopunska slika S1). Apoptotska neurodegeneracija očitovala se od 4 h do najmanje 28 h nakon ubrizgavanja etanola. Da bi se uspostavila odgovarajuća doza osmotina, mladuncima se ubrizgavalo supkutano raznim dozama osmotina u fiziološkoj otopini do 30 min nakon ubrizgavanja etanola, a razina ekspresije cijepljene kaspaze-3 ispitana je zapadnim upijanjem 12 sati kasnije u tkivo hipokampala (Slika 4A). Tretman osmotinom smanjio je razinu cijepljene kaspaze-3 u tkivima izloženim etanolu na način ovisan o koncentraciji. Primijećeno je značajno smanjenje razlučene razine kaspaze-3 pri ili iznad doze osmotina od 7 µ g / g tjelesne težine. Na temelju tih nalaza etanol je davan u 4 mg / g tjelesne težine, a osmotin pri 15 µg / g tjelesne težine 30 min nakon tretmana etanolom u sljedećim eksperimentima.

Image

Osmotin in vivo inhibira etapto-induciranu apoptozu. P7 štakorima štakorica ubrizgana je fiziološkom otopinom (-) ili etanolom (EtOH; 4 mg / g tjelesne težine) i ponovo osmotinom (Osm) ili fiziološkom otopinom 30 minuta kasnije. ( A ) Tretmani su navedeni iznad mrlja. Razina cijepljene kaspaze-3 i P- aktina analizirana je u hipokampalnom dijelu mozga Western blotom 12 sati nakon primjene etanola. Grafikon prikazuje kvantificiranje cijepljene razine kaspaze-3 denzitometrijom. Vrijednosti su normalizirane na β- aktinske signale i predstavljaju srednju vrijednost ± SD ( n = 3). Značajna razlika u odnosu na etanolnu skupinu kod P <0, 01 označena je zvjezdicom. ( B ) Apoptotička fragmentacija DNA u moždanim tkivima ocijenjena je TUNEL-om, 12 sati nakon primjene etanola. Doza osmotina bila je 15 µg / g tjelesne težine. Strelice označavaju TUNEL-obojene jezgre u neuronima. Povećanje × 40; ljestvica, 50 µm. ( C ) P7 pacovima štakorica ubrizgana je fiziološka otopina (Kontrola) ili etanol (EtOH; 4 mg / g tjelesne težine) i ponovo osmotinom (Osm; 15 μg / g tjelesne težine) ili fiziološkom otopinom 30 min kasnije. Pupsi su ubijeni u 12 h nakon ubrizgavanja etanola radi analize neurodegeneracije bojenjem propidijum-jodidom (PI) i Fluoro-Jade B (FJB). ( C ) Prikazani su obojeni dijelovi iz CA1 regije hipokampusa. Povećanje × 60; ljestvica ljestvice, 20 µm. ( D ) Prikazani su obojeni dijelovi s prednjeg cinguliranog korteksa. (a – f) Povećanje × 40; ljestvica ljestvice, 20 µ m; (g – i) uvećanje × 100; ljestvica, 10 µm. ( E ) Kvantifikacija podataka prikazanih u ( A ) i ( B ). Podaci predstavljaju značenje ± SD ( n = 4, hipokampus; n = 3, korteks). Navedeni su uzorci parova koji su značajno različiti na P <0, 05. ( F ) Prikazani su prikazi područja CA1, CA3 i DG hipokampa nakon bojenja PI pri malom (× 20; ljestvici ljestvice = 20 µm) i velikom (× 100; ljestvici skale = 10 µm). Pravokutnici označavaju CA1 regije prikazane u uvećanim prikazima. Strelice označavaju smanjene i oštećene neurone

Slika pune veličine

Apoptoza je primijećena u kortikalnim i hipokampalnim tkivima pomoću TUNEL (terminalno deoksinukleotidil transferaza dUTP nick-end označavanjem) nakon bojenja etanolom, a opseg apoptoze je značajno smanjen post-tretmanom osmotinom (Slika 4B). Neurodegeneracija je također vizualizirana i kvantificirana FJB i PI bojenjem. Prednji cingulatni korteks i CA1 regija hipokampusa koji su primili etanol imali su značajno veći broj FJB- i PI-pozitivnih stanica u usporedbi s kontrolnom skupinom (Slike 4C i D). Suprotno tome, štenaci štakori tretirani etanolom koji su naknadno primili osmotin pokazali su značajno smanjenje FJB- ili PI-pozitivnih stanica u tim osjetljivim regijama mozga u usporedbi s samo liječenjem etanolom (Slika 4E). Međutim, post-tretman osmotinom nije smanjio broj FJB- i PI-pozitivnih stanica na razinu koja je pronađena u kontrolnoj skupini koja je tretirana fiziološkom otopinom, što ukazuje da potpuna preokretnost neurodegenerativnog učinka etanola nije postignuta u našim eksperimentalnim uvjetima. Pobliže ispitivanje odsječaka tkiva hipokampa obojenih PI iz mozga P7 štenaca pokazalo je da su se u potpolju hipokampalne CA1 raspršili piramidalni neuroni, intenzivnije obojali PI te imali različite veličine i oblike u skupini tretiranoj etanolom u usporedbi s osmotinom i kontrolne skupine (slika 4F).

Disfunkcija mitohondrije i apoptoza su dalje praćeni primjenom western blot analize (Slika 5). Manjak citokroma c smanjuje staničnu osjetljivost na apoptotičke podražaje koji djeluju putem mitohondrijskog puta. 28 To je zbog toga što se citokrom c oslobađa iz intermembranskog prostora mitohondrija u citosol kao odgovor na apoptotičke podražaje koji mijenjaju potencijal ili propusnost mitohondrijske membrane koji aktivira kaskadu kaspaze. Naši rezultati (slika 5. i dopunska slika S2a i b) pokazuju da je apoptotska neurodegeneracija izazvana etanolom u hipokampalnim i kortikalnim tkivima mozga štakora koja su se razvijala okarakterizirana značajnom redukcijom odnosa antiapoptotskih proteina (Bcl-2 i Bcl-XL) prema proapoptoticima proteini (Bax i Bak) i značajnom regulacijom proteapoptotskih marker proteina poput citokroma c , cijepljene kaspaze-9 i cijepljene kaspaze-3. Tretman samo osmotinom, kao i osmotin post tretman etanolom izloženim razvoju mozga štakora povećao je omjer antiapoptotskih proteina (Bcl-2 i Bcl-XL) u proteapoptotskim proteinima (Bax i Bak). Osmotin je sam po sebi utjecao na neke, ali ne sve, testirane apoptotske markere. Razine barem dva od tri markera proteina, citokroma c , cijepljene kaspaze-9 i cijepljene kaspaze-3, bile su značajno niže u tkivima hipokampala i kortiksa štenaca koji su primili osmotin nakon izloženosti etanolu u usporedbi s skupinom koja je tretirana etanolom. Nadalje, ukupna i cijepljena razina PARP-1 (poli [ADP-riboze] polimeraze 1) značajno je smanjena samo tretmanom osmotinom ili osmotinom plus etanolom u usporedbi s netretiranim i tretiranim etanolom skupinama. Osmotin i osmotin plus etanol uzrokovali su smanjenje ukupne razine PARP-1 u odnosu na netretirane i etanolirane skupine.

Image

Razine apoptotskih proteinskih markera u mozgu štakora sugeriraju zaštitno djelovanje osmotina in vivo protiv etaptoze izazvane etanolom. P7 štenad štakorima ubrizgan je fiziološkom otopinom (-) ili etanolom (EtOH; 4 mg / g tjelesne težine) i ponovo osmotinom (Osm; 15 µg / g tjelesne težine) ili fiziološkom otopinom 30 min kasnije. Prikazani su imunobloti koji predstavljaju razine naznačenih proteina apoptotskih markera u ekstraktima tkiva 12 h nakon primjene etanola. β -Aktin se u svakom slučaju uzima kao kontrola opterećenja. Eksperiment je ponovljen tri puta i prikazan je jedan reprezentativni eksperiment. Kvantifikacija i statistička analiza cjelovitih podataka prikazana je na Dodatnim slikama S2a i b

Slika pune veličine

Pored toga, ta tkiva mozga su histološki analizirana primjenom imunofluorescentnih tehnika za citokrom c i cijepanu kaspazu-3. Kao što je prikazano na reprezentativnim slikama (slike 6A i B), u skladu s rezultatima analize Western blot-a (slika 5 i dodatne slike S2a i b), ubrizgavanje etanolom povećalo je razinu citokroma c (zelena) s oznakom FITC i kaspaze-3 (TRITC-označena, crvena) u CA1 regiji hipokampusa, kao i na prednjem cingulatu korteksa mozga štakora u razvoju. Smanjena razina citokroma c i kaspaze-3 u kortikalnim tkivima nakon post-tretmana osmotinom, u usporedbi sa samo tretmanom etanolom (Slika 6B), također je bila u skladu s našim rezultatima Western blot-a (Slika 5 i Dodatne slike S2a i b). Suprotno tome, post-tretman osmotinom značajno je smanjio samo razinu citokroma c u ukupnom tkivu hipokampa u usporedbi sa samo tretmanom etanolom (Slika 5. i Dodatne slike S2a i b).

Image

Imunofluorescentna analiza razine citokroma c i kaspaze-3 koja pokazuje in vivo neuroprotektivno djelovanje osmotina protiv etaptoze izazvane etanolom u razvoju mozga štakora. P7 štakorima štakorica ubrizgana je fiziološkom otopinom (kontrola) ili etanolom (EtOH; 4 mg / g tjelesne težine) i ponovo osmotinom (Osm; 15 µg / g tjelesne težine) ili fiziološkom otopinom 30 min kasnije. Pupe su ubijene u 12 h nakon ubrizgavanja etanola radi analize. Prikazani su presjeci tkiva iz CA1 regije hipokampusa ( A ) i prednjeg cingulatskog korteksa ( B ) koji su dvostruko obojeni za citokrom c (naljepnica FITC, zelena) i kaspazu-3 (oznaka TRITC, crvena). Žuta boja (spajanje) ukazuje na kolokalizaciju. (a – c) uvećanje × 20; (d – i) uvećanje × 40; ljestvica ljestvice, 20 µm

Slika pune veličine

Sveukupno, molekularne analize podržavaju podatke snimanja pokazujući da je davanje etanola novorođenčadi štakora uzrokovalo apoptotsku neurodegeneraciju, dok je osmotin imao zaštitni učinak na mitohondrije u tkivima mozga neonatalnih štakora in vivo .

Aktivnost AMPK uključena je u zaštiti protiv etaptoze izazvane etanolom

Osmotin je strukturni homolog adiponektina. 29 Adiponektin je prisutan u cerebrospinalnoj tekućini, a receptori adiponektina se izražavaju u većini moždanih tkiva. 14, 30, 31 Nema izvještaja o uključenosti adiponektina u zaštitu od oštećenja neurona izazvanog etanolom u razvoju moždanog tkiva. Stoga je bilo važno utvrditi da li adiponektin oponaša osmotin u zaštiti od neurotoksičnosti etanola. U ovom istraživanju primijećena je protočna citometrijska analiza stanične smrti bojenjem aneksinom V-PI u uzgojenim hipokampalnim neuronima tretiranim etanolom, osmotinom, etanolom i osmotinom ili adiponektinom. Naši rezultati pokazali su da etanol-inducirana neurodegeneracija, dok je adiponectin, poput osmotina, zaštićen od stanične smrti uzrokovane etanolom (slike 7a i b) koji dodatno potvrđuju naše rezultate, kao što su prethodno pokazali Miele i sur. , 32 da se osmotin ponaša poput adiponektina jer su strukturne i funkcionalne sličnosti između osmotina i ljudskog adiponektina. Sličan je zaključak opažen opažanjem da se cijepljena kaspaza-3 u tim stanicama povećala tretmanom etanolom i da je kombiniranjem osmotina ili adiponektina s etanolom djelomično obrnuto djelovanje etanola (slika 7c).

Image

Aktivnost AMPK uključena je u zaštitu protiv apoptoze izazvane etanolom. ( a ) Protječite citometrijsku analizu apoptotskih stanica bojenjem s aneksinom V – propidijum-jodidom. Primarne kulture fetalnih (GD 17.5) hipokampalnih neurona tretirane su svježim rastnim medijem (Kontrola) ili s naznačenim kombinacijama etanola (100 mM), osmotina (0, 16 µM ), adiponektina (0, 1 µM ), spoja C (20 µ M) ili dodataka metforminu (5 mM) tijekom 24 sata, a zatim analizirani. Broj stanica pozitivnih ili na Aneksin V (rani apoptotik) ili na aneksin V i propidijev jodid (kasni apoptotik) su računati i leže u kvadrantima označenim crvenim ovalom. U donjem desnom kutu prikazani su rezultati imunoblotske analize razine fosfo-AMPK (P-AMPK) u tim stanicama u različito vrijeme nakon tretmana osmotinom (0, 16 µM ). P-AMPK signali su normalizirani na β- aktinske signale i izraženi kao srednja vrijednost ± SD ( n = 5). Zvezdica pokazuje značajnu razliku od vremenske nulte grupe na P <0, 01 ( b ) Prikazani su kvantitativni rezultati protočne citometrijske analize ( n = 3), izraženi u postocima apoptotičkih stanica u populaciji. ( c ) Prikazani su rezultati Western blot analize staničnih ekstrakata neurona hipokampala na kraju ovih tretmana. Stanični ekstrakti su frakcionirani pomoću SDS-PAGE i analizirani na kaspazu-3 i p- aktin imunoblotiranjem. Kaspaza-3 signali su normalizirani na β- aktinske signale i izraženi kao srednja vrijednost ± SE ( n = 5). Navedeni su uzorci parova koji se značajno razlikuju jedan od drugog pri P <0, 05

Slika pune veličine

Osmotinsko signaliziranje putem adiponektinskih receptora u miotubama miševa C2C12 kod mišića dovodi do aktiviranja AMPK. 33 Aktivacija AMPK fosforilacijom Thr 210 ključna je komponenta signala adiponektina koja posreduje mnoge korisne učinke adiponektina. 14, 34, 35 Otkrili smo da signalizacija osmotina u uzgojenim hipokampalnim neuronima također inducira AMPK Thr 210 fosforilaciju (Slika 7a). Nadalje, kako bismo ispitali može li aktiviranje AMPK imati zaštitu u zaštiti osmotina i adiponektina protiv toksičnosti etanola na fetalne neurone hipokampusa, testirali smo učinak istodobne primjene spoja C zajedno sa osmotinom, etanolom i adiponektinom s različitim kombinacijama. Spoj C je široko korišteni konkurentski inhibitor aktivnosti AMPK. Istodobna primjena spoja C osmotinom i etanolom ili adiponektinom i etanolom djelomično je poništila zaštitno djelovanje osmotina i adiponektina na stanično induciranu smrt etanolom mjereno FACS analizom pomoću stanica obojenih s aneksinom V – PI (slike 7a i b) i ukupno nivo ekspresije proteina kaspaza-3 primjenom western blot analize (Slika 7c). Došlo je do značajnog povećanja količine cijepljene kaspaze-3 nakon tretmana spojem C, što sugerira da inhibicija aktivnosti AMPK ubrzava napredovanje apoptoze.

Metformin je široko korišteni antidijabetički lijek koji aktivira AMPK neizravno svojim djelovanjem na uzvodnu kinazu. 36 Kako bismo potvrdili da aktiviranje AMPK-a može zaštititi od etaptoze izazvane etanolom, ispitali smo i učinak istodobne primjene metformina i etanola. Kao što je prikazano na slici 7, metformin je smanjio toksični učinak etanola mjereno obojenjem na aneksinu V – PI. Razina kaspaze-3 u stanicama tretiranim metforminom plus etanolom nije se značajno razlikovala od skupine tretirane etanolom. Moguće je da metformin nije bio toliko učinkovit kao osmotin ili adiponektin jer doza metformina nije bila dovoljno visoka ili zato što kinaza ciljana metforminom samo djelomično doprinosi signalizaciji osmotina i adiponektina.

Pokazavši da zaštitni učinak osmotina zahtijeva aktiviranje AMPK signalnog puta, sljedeće smo testirali jesu li potrebni i adiponektinski receptori, kao što je prikazano na slici 8a. Nadalje, uzgajane fetalne stanice hipokampusa transficirane nepovezanim siRNA imale su višu razinu cijepljenog PARP-1 kada su bile izložene etanolu, što ukazuje na apoptozu. Izloženost osmotinu plus etanolu ili adiponektinu plus etanolu rezultiralo je značajnim smanjenjem cijepljene kaspaze-3 i cijepljene razine PARP-1 u usporedbi s skupinom koja je tretirana etanolom, što sugerira da su osmotin i adiponektin zaštićeni od toksičnosti etanola. Stanice koje su transficirane kombinacijom siAdipoRl i siAdipoR2, koje su imale smanjenu ekspresiju i AdipoRl i AdopoR2 (slike 8b i c), imale su više razine cijepljene kaspaze-3 i cijepljene PARP-1 u odnosu na stanice zaražene nepovezanim siRNA, što sugerira da bazalna signalizacija preko ovih receptora imao je prosurvivalnu funkciju. Kao što se očekivalo, tretman etanolom povisio je razine cijepljene kaspaze-3 i cijepljenog PARP-1 u usporedbi s kontrolnom skupinom u stanicama koje su transficirane kombinacijom siAdipoRl i siAdipoR2, što ukazuje da etanol inducira apoptozu. Međutim, u stanicama koje su bile transficirane siAdipoRl plus siAdipoR2, razine cijepljene kaspaze-e i cijepljenog PARP-1 u osmotinu plus etanolu ili adiponektinu plus etanoliranim skupinama bile su veće ili jednake vrijednosti skupine tretirane etanolom (Slike 8b i c) sugeriranje da su osmotin i adiponektin zaštićeni od toksičnosti etanola. Nadalje, proučavali smo i izloženost osmotina plus etanola i adiponektina plus etanola u nepovezanim i AdipoRl plus AdipoR2 siRNA-transficiranim stanicama, što je rezultiralo značajnim porastom nivoa ekspresije p-AMPK-a u usporedbi s skupinom tretiranom etanolom u nepovezanoj siRNA i značajnoj smanjenje ekspresije p-AMPK u stanicama koje su transficirane siAdipoRl plus siAdipoR2 (Slika 8d). Stoga se zaključuje da je osmotin pokazao svoj neuroprotektivni učinak kroz adiponektinske receptore koji su potrebni za zaštitno djelovanje osmotina i adiponektina protiv neurodegeneracije izazvane etanolom u neuronima hipokampala.

Image

Zaštitni učinak osmotina na etaptozu izazvanu etanolom zahtijeva adiponektinske receptore. ( a ) Smanjivanje ekspresije receptora adiponektina transfekcijom siRNA. Prikazana je RT-PCR analiza ekspresije AdipoRl i AdipoR2 mRNA u primarnim fetalnim (GD 17, 5) hipokampnim neuronima koji su transficirani s nepovezanom siRNA ili AdipoRl plus ARiPr2 (1: 1) siRNA. Prikazane su razine mRNA GAPDH-a za normalizaciju nivoa ekspresije. ( b - d ) Primarne kulture fetalnih neurona hipokampale koje su transfektirane smjesom (1: 1) AdipoRl i AdipoR2 (AdipoRl + R2) siRNA i nepovezanim siRNA su tretirane etanolom (EtOH; 100 mM), osmotinom (Osm; 0, 16 µM), ili adiponektin (Adipo; 0, 1 µM) u kombinacijama tijekom 24 sata. Odstranjena razina PARP-1, odsječena kapsaza-3 i p-AMPK analizirani su zatim u ekstraktima kultiviranih neurona hipokampale Western blottingom. Prikazani su imunobloti za otkrivanje cijepljenog PARP-1 ( b ), cijepljene kaspaze-3 ( c ), p-AMPK ( d ) i β- aktina kao kontrole opterećenja u svim slučajevima. Graf predstavlja normalizirane vrijednosti gustoće za imunoblotske signale izražene kao prosjek ± SD ( n = 4). Navedeni su uzorci parova koji se značajno razlikuju jedan od drugog pri P <0, 05

Slika pune veličine

Rasprava

U ovoj studiji pokazali smo da biljni protein osmotin, homolog adiponektina, štiti od alkode izazvane neurodegeneracije u razvoju mozga štakora. Istodobna primjena osmotina i etanola u primarnim kulturama hipokampnih neurona izvedenih iz prenatalnog mozga štakora zaštićenih od apoptoze izazvane etanolom. Neuroprotektivno djelovanje osmotina protiv etaptoze izazvane etanolom u prenatalnim neuronima štakora rezultat je njegove sposobnosti da funkcionira poput adiponektina i pokreće unutarćelijsku signalizaciju putem adiponektinskih receptora. Post-tretman osmotinom supkutanom injekcijom spriječio je etanolu uzrokovanu etanolom izazvanom etanolom u prednjem dijelu cingulata mozga i hipokampalnoj regiji CA1 neonatalnih mozgova štakora. Adiponektin neizravno štiti neurone hipokampala od ekscitotoksičnosti uzrokovane kainskom kiselinom poboljšavajući funkciju vaskularnog endotela kako bi se spriječilo istjecanje barijere krvi u mozgu. 16 Nedavno je dokazano da osmotin pokazuje strukturnu i funkcionalnu sličnost s ljudskim adiponektinom. 32

Promatranja koja su izvršena na staničnoj razini pomoću FACS i imunofluorescentne tehnike i na razini tkiva primjenom imunobloting tehnika pokazala su da je apoptoza izazvana etanolom u mozgu štakora u razvoju povezana s disfunkcijom mitohondrija (Slike 2, 3, 5 i 6), slične njihovim učinak na hipokampus mozga fetusa zamorca. 37 Čini se da zaštitno djelovanje osmotina protiv toksičnosti izazvane etanolom djeluje na mitohondrijskoj razini (slike 2, 3, 5 i 6).

Najznačajniji i najkonzistentniji učinak kombinirane primjene osmotina i etanola bio je porast razine članova antiapoptotskih obitelji (npr. Bcl-2, Bcl-XL) u članova obitelji proapoptotika (npr. Bax, Bak) u usporedbi s samo liječenjem etanolom (Slike 3 i 5 i Dodatne slike S2a i b). Ovo upućuje na to da bi utjecaj osmotina na razine proteina Bcl-2 mogao biti značajan sastojak njegovog neuroprotektivnog djelovanja. Članovi obitelji antiapoptotični Bcl-2 posebno su važni u sprečavanju apoptoze neurona i neurodegeneracije. Njihova uloga u održavanju integriteta vanjske membrane mitohondrija i neučinkovita proizvodnja energije kroz kontrolu organizacije mitohondrijskih mreža neovisnih o njihovom utjecaju na propusnost mitohondrija vanjske membrane doprinose njihovom neuroprotektivnom učinku. 38, 39 Stoga regulacija staničnih razina članova Bcl-2 može biti izravan način utjecaja na apoptozu. Zanimljivo je da adiponektin štiti od toksičnosti 1-metil-4-fenilpiridinijuma u stanicama neuroblastoma, vjerojatno povećavajući razinu antioksidanata i utječući na omjer Bax / Bcl-2. 40 Potrebni su eksperimenti za rasvjetljavanje veze između osmotina i stanične razine proteina Bcl-2 i njegovog značenja.

Čini se da je aktiviranje AMPK važan čimbenik zaštitnog djelovanja osmotina i adiponektina protiv neurotoksičnosti etanola (slika 7). Tako je metformin, uzvodni aktivator AMPK, također zaštićen od neurotoksičnosti etanola (slika 7). Davanje metformina štakorima dijabetičarima sprečava oksidativnu neravnotežu u mozgu. 41 Metformin štiti i od oštećenja uzrokovanih etopozidima u primarnim kulturama kortikalnih neurona dobivenih iz mozga prenatalnih štakora. U ovom modelu dijabetičke neuropatije predložena je prevencija mitohondrijske disfunkcije (kolapsa potencijala mitohondrijalne membrane i oslobađanje citokroma c ) metforminom kao osnova njegovih neuroprotektivnih učinaka. 42 Još uvijek je potrebno razjasniti relativni doprinos proteina iz porodice Bcl-2 i putova ovisnih o AMPK u zaštitnom djelovanju osmotina prema mitohondrijama u razvijanju neurona.

Osmotin pripada obitelji sveprisutnih biljnih proteina nazvanih PR-5 proteinima. 22 Najbolje proučeni član ove klase je komercijalno dostupan zaslađivač, taumatin. PR-5 proteina dosta je u voću i povrću poput zrelog grožđa, plantaža i banana. 43, 44 Ova klasa proteina stoga predstavlja bogat izvor potencijalnih mimika adiponektina koji bi se mogli upotrijebiti za ispitivanja strukture adiponektina i funkcije ili za dizajn tretmana za FAS.

Osmotin je biljni protein i te komponente dobivene iz bilja mogu se koristiti za ispitivanje neurodegenerativnih poremećaja, pretilosti i karcinoma i igrati važnu ulogu u prevenciji bolesti. Preporučuje se nadzor prehrambene energije ili ograničenje kalorija kako bi se osigurao dug život i smanjilo karcinogeneza. 45 Predviđeno je nekoliko mehanizama kao što su faktori rasta, anabolički hormoni, upalni citokini i oksidativni markeri stresa povezani s različitim malignim bolestima i pokazali povezanost s molekulima kao što su adiponektin i AMPK. 46, 47 U ovom istraživanju pokazali smo da je osmotin stabilan protein i adiponektinski receptori u mozgu štakora koji se vežu za osmotin kao i adiponektin. Osmotin je dijetalni spoj koji je pokazao funkcionalnu sličnost s adiponektinom. 29 Štoviše, homolog biljnog podrijetla adiponektin, osmotin, pokazao je blagotvoran učinak protiv kolitisa. 48

Osmotin, biljni protein, može igrati važnu ulogu u oponašanju hormona koji ublažava dijabetes, pretilost, rak i neurodegenerativne poremećaje. To pokazuje vrijednost osmotina kao ekonomski eksperimentalne alternative adiponektinu. Naši rezultati također su sugerirali da osmotin može biti vrijedan izvor neuroprotektivnih sredstava protiv FAS-a i može se koristiti za postizanje zdravstvenih koristi. Koristeći biljne derivate adiponektinskih homologa, osmotin može postati terapijska opcija protiv neurodegenerativnih poremećaja poput FAS-a.

Materijali i metode

Pročišćavanje osmotinom

Osmotin je pročišćen iz kultura duhanskih kultura prilagođenih soli, kao što je prethodno opisano. 49 Endotoksin je uklonjen pomoću unaprijed pripremljenog stupca ActiClean Etox (Sterogene Bioseparations, Carlsbad, CA, SAD). Za krajnju pripremu je ocijenjeno da je> 99% homogena pomoću 2DGE i LC-MS peptidnih fragmenata dobivenih probavom tripsina. Sadržaj endotoksina u osmotinu bio je <0, 03 EU / mg proteina.

Liječenje životinja

Ženke ( n = 35) štakorica Sprague-Dawley (250 g, Nacionalno sveučilište Gyeongsang, Neurobiološka laboratorija, Chinju, Južna Koreja) smještene su u temperaturno kontrolirano okruženje sa svjetlima od 0600 do 2000 h sa hranom i vodom ad libitum . Životinje su tretirane u skladu sa standardnim smjernicama za laboratorijsku njegu životinja. Uloženi su svi napori kako bi se smanjio broj korištenih životinja i njihova patnja. All the experimental procedures were approved by the local animal ethics committee of the Division of Applied Life Sciences, Department of Biology, Gyeongsang National University, South Korea.

The animals were randomly divided into two experimental groups:

  1. Timed pregnant (the day of insemination equals to gestational day (GD) 0.5). At GD 17.5, rats received an iv injection of pentobarbital sodium (3 mg/100 g body weight) and were then killed by decapitation.

  2. Postnatal day 7 (P7) Sprague-Dawley pups were used in in vivo experiments and were equally distributed in four groups, that is, control, ethanol, osmotin, and osmotin plus ethanol. Ethanol (4 mg/g body weight) was delivered by subcutaneous injection. A saline solution of osmotin (15 μ g/g) was delivered by subcutaneous injection at 30 min after ethanol injection. Saline injections of equal volume were used for the control group.

Primary cell culture and drug treatment

Primary cultures of hippocampal and cortical neurons were generated from hippocampus and cortex isolated from rat fetuses at GD 17.5 as described previously. 50 After 4 days of growth, the growth medium was replaced with fresh medium without (control) or with supplements as indicated in the Figures. Cultures were analyzed 24 h later.

Western blotting

Western blot analysis was done as previously described with some modification. 50 Briefly, primary cultured hippocampal cells and tissue from both hippocampal and cortical brain from P7 rat pups were homogenized in cell lysis buffer (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA) and were supplemented with 100 mM PMSF. Extracts were fractionated by SDS-PAGE and, after transfer to a polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane, immunoreaction was carried out for 24 h at 4°C using a 1 : 1000 dilution of the primary antibodies. Antibodies used in immunoblotting for detecting proteins included rabbit-derived anti-actin, anti-Bcl-2, anti-Bax; goat-derived anti-cytochrome c and anti-caspase-9; and anti-PARP-1 polyclonal antibodies (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA). We also used rabbit-derived anti-caspase-3 and anti-AMPK (Cell Signaling Technology) and anti-p-AMPK (ABCAM, Cambridge, MA, USA). After reaction with horseradish peroxidase-conjugated secondary antibody, as appropriate, proteins were detected using an ECL-detecting reagent according to the manufacturer's instructions (Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden). The X-ray films were scanned, and the optical densities of the bands were analyzed by densitometry using the computer-based Sigma Gel program, version 1.0 (SPSS, Chicago, IL, USA).

MTT assay for cell viability

Cell viability in cultured neurons was estimated using MTT. Primary cultures of hippocampal neurons in the logarithmic growth phase were used to seed 96-well plates. Each well contained 200 μ l Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) containing indicated supplements and 1 × 10 5 cells. The cells were incubated at 37°C in a humidified 5% CO 2 incubator. At the end of incubation, MTT (5 mg/ml in PBS, pH 7.4) was added to each well and incubation was continued for 4 h at 37°C after which the A 570nm, indicating viable cells, was measured using a microplate reader (Anthos 2020, Anthos Labtech Instruments, Wals, Austria). Percent cell viability was calculated as 100 × the ratio of A 570nm of the treated cells to A 570nm of control cells.

Flow cytometric analysis of ΔΨm

Mitochondrial membrane potential was monitored using JC-1 mitochondrial membrane potential detection kit (Biotium Inc., Hayward, CA, USA) according to the manufacturer's protocol. Primary cultures of hippocampal neurons from G17.5 fetal brain were grown and treated with ethanol and osmotin as described earlier. After 24 h of drug treatment, cells in triplicate culture plates were harvested, stained with JC-1 reagents at 37°C for 15 min, washed twice in 1 × assay buffer, and resuspended in 0.5 ml PBS for FACS analysis (FACSCalibur Flow Cytometer; Becton Dickinson, San Jose, CA, USA). JC-1 aggregates in healthy polarized mitochondria emit red fluorescence at 590 nm. JC-1 monomers that leak from stressed depolarized mitochondria emit green fluorescence at 530 nm. 51 The red and green fluorescence was measured in the Green (FL-1) and Red (FL-2) channel of the flow cytometer, respectively. The cells were then immediately observed with a fluorescence microscope using a 'dual-band pass' filter designed to simultaneously detect fluorescein and rhodamine or fluorescein and Texas Red (Hayward, CA, USA).

Measurement of apoptosis by annexin-V staining

The Annexin-V-FLUOS Staining Kit (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany) was used for the detection and quantification of the apoptotic cells. This kit uses a dual-staining protocol in which the apoptotic cells are stained with annexin-V (green fluorescence) and the necrotic cells are stained with PI (red fluorescence). Briefly, hippocampal neuronal cells were grown on triplicate culture plates and then treated with fresh medium (control), and fresh medium containing supplements as indicated in the figure legend for 24 h (Figure 7). The cells were harvested with PBS and processed for labeling with annexin-V and PI according to the manufacturer's protocol. The fluorescence was measured by flow cytometric analysis on a FACSCalibur Flow Cytometer using 488 nm excitation and a 515 nm band pass filter for fluorescein detection and a 600 nm filter for PI detection (FL1: Annexin-V-FLUOS; FL2: PI).

Intracellular Ca 2+ measurement

The intracellular Ca 2+ concentration was measured with the fluorescent Ca 2+ indicator, Fura-2 acetoxymethyl ester (Fura-2AM). 52 After 4 days of growth and 24 h of treatment, cultured cortical or hippocampal neurons (triplicate culture plates each containing 1 × 10 6 cells) were washed twice with Krebs buffer and then incubated in the DMEM media containing 5 μ M Fura-2AM at 37°C in a humidified incubator with 5% CO 2 for 60 min. They were washed twice with Locke's solution (pH 7.8) and fura-2 fluorescence signals of [Ca +2 ] cyt were measured by a luminescence spectrophotometer (LS50B, Perkin Elmer, Boston, MA, USA). Excitation light from a Xenon lamp was alternated between 340 and 380 nm band-pass filters and the fluorescence emitted at 510 nm was revealed by a photon-counting photomultiplier. The 340/380-nm fluorescence ratio, averaged over a period of 2 s, was measured. Fluorescence signals were acquired stored and analyzed using a computer and universal imaging software, or a MicroVax II computer and software (origin 7, Northampton, MA, USA). Intracellular calcium was determined using the ratio method as mentioned above, and from the Grynkiewicz equation. 53

Image

where K d is the dissociation constant of the fura-2 Ca +2 interaction as 225 nM in the cytosolic environment; R is the fluorescence ratio at 340 and 380 nm; R min is the ratio with zero Ca +2 ; R max is the ratio with saturating Ca +2 (using calcium chloride); Sf2 is fluorescence at 380 nm with zero Ca +2 ; Sb2 is fluorescence at 380 nm with saturating Ca +2 .

RNA interference and transfection

Small interfering RNAs (siRNAs) were designed and synthesized by Invitrogen (Carlsbad, CA, USA). The sequences of the sense siRNAs were: Rat AdipoR1 siRNA 5′-UACAACACCACUCAAGCCAAGUCCC; Rat AdipoR2 siRNA 5′-AACAGGUGUCUCUAAACUGGGCUCC; and Rat unrelated siRNA 5′-AUUUAACUUCUGGUGACGAUACUGG. Cultured primary hippocampal neuronal cells were transfected for 6 h with 200 nM siRNA using Lipofectamine 2000 (Invitrogen). After the cultures were washed, the medium was replaced with DMEM containing 10% fetal bovine serum (FBS) and test compounds as indicated in the Figures. Cells were grown for 24 h and then analyzed.

Reverse transcriptase-PCR (RT-PCR)

RT-PCR analysis was performed using cDNA from transfected and nontransfected cells as previously explained. 54 Thermal cycling was performed under the following conditions: 94°C for 5 min, 28 cycles at 94°C for 1 min, 54°C for 1 min, and 72°C for (1 min), followed by 72°C (5 min) for the final extension. The GAPDH housekeeping gene was used for normalization of target gene expression. PCR products were separated on a 1% agarose gel containing ethidium bromide and viewed under UV light. The primers used were the following: Rat AdipoR1, forward 5′-TCTTCCTCATGGCTGTGATG-3′, reverse 5′-AGCACTTGGGAAGTTCCTCC-3′; Rat AdipoR2, forward 5-GGAGCCATTCTCTGCCTTTC-3′, reverse 5′-ACCAGATGTCACATTTGCCA-3′; GAPDH, forward 5′-GCCATCAATGACCCCTTCATT-3′, reverse: 5′-CGCCTGCTTCACCACCTTCTT-3′.

Histological analysis and detection of apoptosis

FJB staining was performed as previously described. 55 Briefly, immunofluorescence was performed on GD 17.5 primary hippocampal cells cultures grown in vitro on poly- D -lysine-coated chamber slides. Three-day-old cultures were treated for 24 h at 37°C as indicated in the figure legends. Treated cultures were fixed for 5 min with 4% paraformaldehyde in PBS and stored at −70°C. Slides were air dried for 3 h and then subjected to the following treatments in order: 10 min in 0.06% potassium permanganate solution, distilled water rinse, 20 min in 0.1% acetic acid containing 0.0004% FJB (Calbiochem, San Diego, CA, USA) and three washes in distilled water. The slides were then allowed to dry at 55°C for 10 min and viewed under a FITC filter in a confocal microscope (Olympus Fluoview FV1000, Tokyo, Japan). For PI staining, slides were dipped in PI solution (1 μ g/ml) in PBS with gentle mixing for 20 min at room temperature and washed twice with PBS for 10 min. Glass cover slips were mounted on the slides with mounting medium.

FJB and PI staining were also performed for in vivo analysis. At P7, the pups were anesthetized by intraperitoneal administration of sodium pentobarbital (50 mg/g body weight). Brains were removed, fixed in cold 4% neutral buffer paraformaldehyde for 48 h, and cryoprotected by immersion into 20% sucrose phosphate buffer for 48 h at 4°C. Whole brains were frozen in OCT compound (Sakura, Torrance, CA, USA) and 14 μ m sections were made in the coronal planes (Leica cryostat CM 3050S, Nussloch, Germany). Sections were thawed mounted on the probe-on plus charged slide (Fisher, Pittsburgh, PA, USA). Tissue sections were stained with FJB and PI as described above. Images were acquired using a Zeiss fluorescent microscope (Zeiss, Gottingen, Germany) and confocal laser scanning microscope (Fluoview FV 1000, Olympus, Hamburg, Germany).

TUNNEL assay for apoptosis

In situ detection of apoptotic cell death was performed on cryosections (16 μ m) using the In situ Cell Death Detection kit Fluorescein, according to the manufacturer's instructions (GenScript Corporation, Piscataway, NJ, USA). Glass cover slips were mounted onto the glass slides with mounting medium. The FITC filter was used was to detect TUNEL staining (green). TUNEL-positive staining patterns were acquired with a confocal laser scanning microscope (FluoView FV1000; Olympus, Japan). TUNEL-positive cells in the different regions of each section were counted using a computer-based program.

Immunofluorescence analyses

For in situ analysis of cytochrome c release and caspase-3 expression after in vivo treatments, P7 neonatal rat pups were perfused with 4% ice-cold paraformaldehyde following 1 × PBS perfusion transcardially as explained above. For hippocampal neuronal cells in primary culture, conditions of growth and treatment have been described above. Treated cultures were fixed with 4% neutral buffer paraformaldehyde and washed with cold PBS. Cytochrome c was detected by incubating with mouse anti-cytochrome c antibody overnight at 4°C and rabbit anti-mouse FITC-labeled antibody for 90 min at room temperature in dark (1 : 250 and 1 : 100, respectively; Santa Cruz Biotechnology). Subsequently, caspase-3 expression was detected by using rabbit anti-caspase-3 antibody (Cell Signaling) and goat anti-rabbit TRITC labeled antibody (Santa Cruz Biotechnology; 1 : 250 and 1 : 100, respectively) under the same conditions. Slides were mounted with Prolong Antifade reagent (Molecular Probes, Eugene, OR, USA). Cytochrome c (green) and caspase-3 (red) staining patterns were acquired using a confocal laser scanning microscope (Fluoview FV1000).

Analiza podataka i statistika

Images of ethidium bromide-stained gels and western blots were scanned and analyzed by densitometry using a computer based on the Sigma Gel System (SPSS). Density values were expressed as mean±SEM Comparisons between treated groups and controls were done by Student's t -test to determine the significance of differences between relevant treatment groups. In every case, the acceptance level of statistical significance was P <0.05.

Dodatna informacija

Datoteke slika

  1. 1.

    Dopunska slika 1

  2. 2.

    Supplementary Figure 2a

  3. 3.

    Supplementary Figure 2b

Word dokumenti

  1. 1.

    Dopunske slikovne legende

Glosar

FAS

fetal alcohol syndrome

AdipoR

adiponectin receptor

AMPK

adenosine monophosphate-activated protein kinase

P7

postnatal day 7

GD

gestational day

DMEM

Dulbecco's modified Eagle's medium

FJB

Fluoro-Jade B

PI

propidium iodide

PARP-1

poly [ADP-ribose] polymerase 1

TUNEL

terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick-end labeling

PVDF

polyvinylidene difluoride

FBS

fetalni goveđi serum

MTT

3-[4, 5–dimethylthiazol–2–yl]-2, 5-diphenly tetrazolium bromide

Dodatne informacije nalaze se u ovom radu na web stranici Cell Death and Disease (//www.nature.com/cddis)