Nk stanice su nefunkcionalne u hroničnoj mijelonskoj leukemiji kod ljudi prije i na liječenju imatinibom i u bcr – abl-pozitivnim miševima | leukemija

Nk stanice su nefunkcionalne u hroničnoj mijelonskoj leukemiji kod ljudi prije i na liječenju imatinibom i u bcr – abl-pozitivnim miševima | leukemija

Anonim

Sažetak

Iako se BCR – ABL + matične stanice u kroničnoj mijeloidnoj leukemiji (CML) opiru uklanjanju ciljanom farmakoterapijom kod većine bolesnika, imunološki učinci grafta naspram leukemije mogu izliječiti bolest. Osim citotoksičnih T stanica, prirodne stanice ubojice (NK) mogu imati ulogu u imunološkoj kontroli CML. Ovdje smo istražili funkcionalnost NK stanica u bolesnika s CML-om i na transgeno inducibilnom BCR-ABL modelu miša. U usporedbi s kontrolama, udjeli NK-stanica u limfocitima su smanjeni tijekom dijagnoze CML-a i nisu se oporavljali tijekom remisije izazvane imatinibom tijekom 10–34 mjeseca. Funkcionalni eksperimenti otkrili su ograničenu in vitro ekspanziju NK stanica kod bolesnika sa CML i smanjeni degranulacijski odgovor na ciljne stanice K562 i tijekom dijagnoze i tijekom terapije imatinibom. U skladu s rezultatima u ljudskom CML-u, relativni broj NK1.1 + NK stanica je smanjen nakon indukcije BCR-ABL ekspresije u miševa, a oštećenja su nastala nakon BCR-ABL reverzije. Povrh toga, ugrožena degranulacija ciljano proširenim BCR – ABL + NK stanicama. Zaključujemo da je CML povezan s kvantitativnim i funkcionalnim oštećenjima unutar NK-staničnog odjeljka, što se reproducira induciranom BCR-ABL ekspresijom kod miševa. Daljnji će rad biti usmjeren na prepoznavanje mehanizama nedostatka NK-stanica u CML-u i na razvijanju strategija za iskorištavanje NK-stanica za imunoterapiju.

Uvod

Na temelju kritične uloge aktivnosti BCR-ABL kinaze u kroničnoj mijeloidnoj leukemiji (CML) , 1, 2 inhibitora tirozin kinaze (TKI) postali su lijek prve linije za bolest kronične faze. 3, 4, 5, 6 Iako ciljana farmakoterapija učinkovito potiče i održava remisije, molekularna bolest često traje, 5, 6, 7 i TKI se mogu prekinuti bez relapsa samo u podskupini bolesnika. 8 Doista, primitivne mirne leukemijske matične stanice odupiru se uklanjanju pomoću TKIs 9, 10, 11, 12 i tako predstavljaju potencijalni izvor napredovanja bolesti. Za razliku od TKI-ova, alogenska transplantacija matičnih stanica može iskorijeniti bolest kod većine bolesnika. Ovaj se učinak uglavnom pripisuje reakcijama grafta naspram leukemije, što je ilustrirano izvanrednom učinkovitošću infuzije limfocita donora u ponovnom izazivanju trajnih odgovora u relapsnoj bolesti. 14 Osim citotoksičnih T stanica, prirodne stanice ubojice (NK) uključene su u imunološku kontrolu CML. 15, 16, 17 Studije in vitro pokazale su najmanje umjerenu lizu hematopoetskih progenitornih stanica bolesnika s CML-om, uključujući miroljubivu CD34 + pod-populaciju, alogenskih NK-stanica. 18, 19 Ono što je važno, nekompatibilnost receptora imunoglobulina sličnih ubojica nije bila bitna za anti-leukemijske učinke posredovane NK-stanicama u 19, a autologno aktivirane NK stanice mogle su učinkovito suzbiti rast malignih hematopoetskih progenera in vitro. 20, 21 Štoviše, u nedavnom kliničkom ispitivanju kojim se procjenjuje postojanost remisije nakon zaustavljanja imatiniba, veći broj perifernih NK-stanica povezan je sa smanjenim rizikom od ponovne pojave. 22 Ova zapažanja postavljaju pitanje zašto autologne NK stanice u CML nisu u stanju spriječiti leukemogenezu ili eliminirati zaostalu bolest.

Iako većina autolognih NK stanica u kroničnoj fazi CML nije izvedena iz zloćudnog klona, 23, 24 neke studije navode da su NK stanice bolesnika s CML smanjene u broju i imaju ograničenu citoliznu sposobnost. 25, 26 Ova su istraživanja izvedena tijekom napredovanja bolesti prije uvođenja imatiniba, a pacijenti su prethodno liječeni hidroksiurejom. Funkcija NK-stanica u neliječenih bolesnika s kroničnom CML fazom nije sustavno obrađena. Nadalje, liječenje TKI-ima može imati dodatne učinke na staničnu imunološku funkciju. Pokazano je da su složene imunološke interakcije za inhibitor katraz širokog spektra dasatinib, uključujući imunosupresivne i promotivne učinke na funkcije T-stanica i NK-stanica. Pokazano je da 27, 28, 29 Imatinib inhibira funkcije T-stanica 30, 31, ali ne i citotoksičnost NK-stanica i lučenje citokina. 29 Ono što je važno, usprkos imunosupresivnim aktivnostima prijavljenim za oba lijeka in vitro , zabilježeno je da se razvijaju funkcionalni odgovori T-ćelija kod bolesnika s CML na imatinib, 32, 33, 34 i klonalnu limfoproliferaciju kod nekih bolesnika na dasatinibu i da su povezani s povoljnim kliničkim odgovori. 35, 36, 37, 38 Stoga su potrebne dodatne in vivo studije da bi se utvrdili učinci TKI-a na imunološke efektorske stanice.

Ovdje izvješćujemo da NK stanice bolesnika s novodijagnosticiranim CML imaju duboke kvantitativne i funkcionalne nedostatke te da te abnormalnosti ostaju tijekom remisije izazvane imatinibom. Miševi s mijeloproliferacijom sličnom CML, inducirani BCR-ABL ekspresijom u HSC-u, imali su slične promjene unutar svog podskupina NK-stanica. Zajedno, naši rezultati podržavaju ulogu aberantne aktivnosti tirozin kinaze u disfunkciji NK-stanica u CML-u, koja se samo djelomično može spasiti TKI tretmanom.

Pacijenti i metode

Pacijenti i zdravi davatelji

Za analizu subpopulacije limfocita i fenotipa NK-stanica, regrutovano je 40 bolesnika s CML-om sa Sveučilišta Stanford i Sveučilišne bolnice u Muensteru. Uzorci cijele krvi dobiveni su na dijagnozi i / ili na liječenju imatinibom. Uzorci krvi od 36 zdravih davatelja poslužili su kao kontrola. Odobrenje za studiju pribavljeno je od Panel za ljudska subjekta u medicinskim istraživanjima sa Sveučilišta Stanford i Etičkog odbora Sveučilišta u Muensteru. Informirani pristanak dobiven je od svih pacijenata u skladu s Helsinškom deklaracijom.

Inducibilni transgeni model miša BCR – ABL +

Ranije je opisana generacija tet-off inducibilnog transgeničnog soja miša SCLtTAxBCR-ABL. 2 Ukratko, transaktivatorski protein tTA je stavljen pod kontrolu gena matičnih stanica leukemije mišjih stanica (SCL). Umrežavanje SCLtTA miševa s TRE – BCR – ABL miševima 39 omogućilo je inducibilnu ekspresiju P210 BCR – ABL u stanicama hematopoetskih matičnih stanica i potomstava. 2 Za potvrdu mijeloproliferativne bolesti nakon indukcije BCR-ABL, stanice slezene i koštane srži (BM) analizirane su brojem i diferencijalom bijelih krvnih stanica. 2 Istraživanje na životinjama odobrile su lokalne vlasti Sjeverne Rajne-Vestfalije.

Protok citometrija

Za analizu humanih limfocita, mononuklearne stanice periferne krvi pročišćene su centrifugiranjem gradijentom gustoće, resuspendirane u RPMI 1640 medijumu (Invitrogen, Darmstadt, Njemačka), dopunjene 10% fetalnim telećim serumom i 2 m ML-glutaminom (RPMI kulturno sredstvo ). PBMC su obojeni anti-humanim antitijelima obilježenim fluorescencijom protiv sljedećih molekula: CD3, CD4, CD8, CD19, CD56, CD16, NKG2D, NKG2A, NKG2C i CD94 30 minuta na sobnoj temperaturi. Sva antitijela su iz BD Biosciences, Heidelberg, Njemačka. Stanice su analizirane upotrebom FACSCanto ili FACSAria citometra (BD Biosciences). Za imunofenotipizaciju mišjih limfocita izolirane su BM i stanice slezine kao što je prethodno opisano 2 i obojene fluorescentno konjugiranim antitijelima na mišjim CD45 / B220, CD3, CD4, CD8 i NK1.1 u trajanju od 30 minuta na sobnoj temperaturi.

Kvantitativni PCR preokrenut u stvarnom vremenu

NK stanice negativno su odabrane iz slezene i BM stanica korištenjem kompleta za izolaciju NK-stanica (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Njemačka), a RNA je izolirana korištenjem RNeasy Mini Kit (Qiagen, Hilden, Njemačka), nakon čega slijedi komplementarna sinteza DNA upotrebom reverzna transkriptaza virusa moloneyjeve mišje leukemije iz Promege (Mannheim, Njemačka). Za otkrivanje p210 BCR – ABL transkripata, korišteni su u stvarnom vremenu TaqMan test (Eurogentec, Köln, Njemačka) i PCR master (TaqMan Universal PCR Master Mix, Applied Biosystems, Weiterstadt, Njemačka) u kombinaciji s ABI 7500 Fast Real- vremenski PCR sustav (primijenjeni biosustavi), kako je prethodno opisano. 12 Kao unutarnji standard korišten je nivo ekspresije gliceraldehid-3-fosfat dehidrogenaze.

In vitro ekspanzija NK stanica

Za ekspanziju humanih NK stanica, PBMC su se inkubirali na 1 × 106 po jažici u pločicama s kulturom od 24 jažice u prisutnosti 40 IU / ml rekombinantnog humanog IL-2 (Proleukin, Chiron, Emeryville, CA, USA) u RPMI medij za kulturu i stimuliran jednom sa 0, 75 × 106 oštećenim (120 Gy) K562-mb15-41BBL staničnim stimulatorima 10 dana, kao što je opisala grupa Dario Campana. 40 Da bi se proširile mišje NK stanice, pročišćene NK stanice inkubirane su u pločicama s kulturom od 24 jažice do 2 × 106 po jažici u mediju za RPMI kulturu, dopunjeno sa 25 IU / ml rekombinantnog mišjeg interleukina-2 (Immunotools, Friesoythe, Njemačka ). Stanice su kultivirane tokom 14 dana, sa srednjim promjenama svaka 2 dana.

CD107a test

Odgovori degranulacije procijenjeni su protočnom citometrijskom analizom CD107a ekspresije nakon 4-satne kobbakcije s ciljanim stanicama osjetljivim na NK-stanice. Za mišje NK stanice korištene su YAC-1 / NIH-3T3 (ljubazni poklon A Johannsen, Lausanne, Švicarska) kao ciljne stanične linije, dok su ljudske NK stanice testirane na stanice K562 (ATCC, Manassas, VA, SAD). Miševna stanična linija mioblasta C2C12 (ljubazni poklon A Santel, Berlin, Njemačka) i humana mijeloidna stanična linija ML-2 (ATCC) korišteni su kao kontrolni ciljevi. Kokubacije su izvedene u omjeru stimulatora i reaktora 1: 1 u prisutnosti anti-mišjeg antitijelovog ili anti-humanog CD107a antitijela (BD Biosciences) označenog fikoetrinom i 2 μM monensina (Sigma, München, Njemačka). Nakon ispiranja, NK stanice obojene su antitijelom NK-1-PE-Cy7 i CD3-AF647, odnosno antitijelima CD56-PE-Cy7 i CD3-FITC protiv čovjeka, nakon čega je slijedila protočna citometrijska analiza.

Analiza citotoksičnosti

Za ispitivanja oslobađanja od 51 Cr, različiti broj NK stanica koinkutiran je u tri primjerka s 2500 ciljnih stanica označenih sa 100 μCi 51 Cr / 1 × 106 6 stanica (fitoketrin primijenjeni biosustavi) u ukupnom volumenu od 200 μl u 96- ploča za jažicu na 37 ° C i 5% C02. Supernatanti su skupljeni, a radioaktivnost je brojena u gama brojaču. Maksimalno oslobađanje određeno je lizijom ciljnih stanica s Triton X.

statistika

Podaci su analizirani opisno pomoću Box-and-Whisker-ovih crteža. Kutija odgovara 25. / 75. postotku. Zvižduci su crtani od krajeva okvira do 5. i 95. postotka vrijednosti podataka. Mann-Whitney U- test korišten je za ispitivanje da li se medijani u svakom skupu vrijednosti značajno razlikuju. P- vrijednost <0, 05 smatrana je statistički značajnom. Sve statističke analize trebaju biti istraživačke i ne potvrđuju. Nije izvršena prilagodba za višestruko testiranje. Statističke analize provedene su korištenjem PASW Statistics 18 za Windows (SPSS Inc., Chicago, IL, USA).

Rezultati

NK stanice smanjuju se među limfocitima u bolesnika s CML-om i ne oporavljaju se liječenjem imatinibom

U ispitivanje je uključeno četrdesetak bolesnika s CML-om (dopunska tablica 1). Srednja dob iznosila je 49 godina (raspon 9–68 godina), a medijan broja bijelih krvnih stanica u dijagnozi je bio 76 500 / μl (raspon 5000–554 000 / µl). Svi bolesnici liječeni su imatinibom u dozi od 400 do 800 mg / danu. Sve u svemu, 31 od 36 ispitanih pacijenata postiglo je glavne ili cjelovite molekularne odgovore koji su bili podvrgnuti kontinuiranom liječenju imatinibom do 96 mjeseci praćenja, a 5 je pacijenata postiglo djelomične ili potpune citogenetske odgovore. Kao kontrolni uzorci upotrijebljeni su uzorci krvi iz 36 zdravih skupina (srednja dob 45 godina, 24–77 godina).

Za ispitivanje perifernog odjeljka limfocita u CML-u, pojedine podpopulacije kvantificirane su limfocitima periferne krvi protočnom citometrijom. Relativni broj CD3 + T stanica, CD8 + T stanica, CD4 + T i B stanica nije se značajno razlikovao između novo dijagnosticiranih bolesnika i zdravih kontrolnih skupina, a nisu utvrđene značajne razlike između uzoraka prije liječenja i remisije (Slika 1a). Međutim, relativni udjeli CD3-CD56 + NK stanica u bolesnika s CML-om prije liječenja značajno su smanjeni u usporedbi s kontrolama (medijan 5, 1%, raspon 2, 7–12, 6% u usporedbi s 11, 0%, raspon 3, 0–19, 8%) ( P = 0, 002). Ponovljena analiza uzoraka remisije na liječenju imatinibom pokazala je trajno smanjenje udjela NK-stanica među ukupnim limfocitima (srednji 8, 1%, raspon 2, 1–16, 0%, P = 0, 003) (Slika 1a).

Image

Relativni udjeli NK stanica među limfocitima su smanjeni u bolesnika s CML-om i prije liječenja i na imatinibu. ( a ) Relativni udjeli pojedinih podpopulacija limfocita unutar vrata limfocita u pred-tretmanu i remisiji uzoraka periferne krvi od bolesnika s CML-om u usporedbi s kontrolama. Podaci dobiveni tretmanom imatinibom temelje se na jednom do šest praćenih uzoraka po pacijentu (ukupno 48 uzoraka). Nisu prikazani odmetnici. ( b ) Uzdužno praćenje CD3-CD56 + NK stanica kao relativni udio ukupnih limfocita u devet bolesnika s CML tijekom liječenja imatinibom. Crte označavaju srednji postotak (ravna linija) NK stanica, a niži prvi kvartil (isprekidana linija) kod zdravih davatelja.

Slika pune veličine

Longitudinalna analiza provedena je na devet pacijenata koji su odabrani iz naše skupine radi dostupnosti najmanje tri praćenja uzoraka tijekom remisije izazvane imatinibom. Relativni broj NK-ćelija među limfocitima je ostao ispod normalne kontrole u većini uzoraka, bez ikakvog trenda oporavka tijekom 34 mjeseca remisije (Slika 1b).

Zatim smo istražili da li numeričko oštećenje odjeljka NK-stanica u CML-u prati fenotipske promjene. Površinskom ekspresijom CD16, NK stanice mogu se podklasificirati u prevladavajuću podskupinu CD56lowCD16hi NK koja predstavlja visoko citolitičku NK staničnu pod-populaciju i CD56hiCD16 niske NK stanice koje proizvode citokine. 41 Nisu pronađene razlike u relativnim omjerima podskupina CD56lowCD16hi i CD56hiCD16low NK-stanica između uzoraka prije tretmana i remisije u usporedbi s kontrolama (Slika 2a). Na primjer, aktiviranje receptora na NK stanicama, na primjer, NKG2D, može prevladati inhibitorne signale i biti uključeno u anti-leukemijske učinke u CML-u. 19 Udjeli stanica koje eksprimiraju NKG2D među NK stanicama bili su usporedivi između bolesnika s CML-om tijekom dijagnoze i kontrola (Slika 2b). Nadalje, udjeli NK stanica koje eksprimiraju inhibitorni receptor CD94 / NKG2A ili aktivirajući receptor CD94 / NKG2C nisu varirali između pacijenata i kontrolnih skupina. Suprotno tome, NKG2D ekspresija je značajno smanjena kod bolesnika na imatinibu u usporedbi s obje zdrave kontrole ( P = 0, 003) i tijekom dijagnoze ( P = 0, 02).

Image

Podtipovi NK-stanica i ekspresija receptora u bolesnika sa CML-om. ( a ) CD56lowCD16hi i CD56hiCD16low podskupina NK-stanica među CD3-CD56 + stanicama kod bolesnika s CML-om tijekom dijagnoze i na liječenju imatinibom u usporedbi sa zdravim kontrolama. ( b ) Udio NKG2D + stanica i CD94 + stanica među CD3-CD56 + NK stanicama (lijeva ploča) i površinska ekspresija NKG2D (desni panel) kod 19 bolesnika s CML-om u dijagnozi i 36 bolesnika na liječenju imatinibom u usporedbi s 36 zdravih kontrolnih skupina. Udio NKG2C i NKG2A + stanica je određen između CD94 + CD56 + stanica (dopunska slika 1).

Slika pune veličine

NK stanice u bolesnika s CML funkcionalno su oslabljene i tijekom dijagnoze i tijekom liječenja imatinibom

Da bismo se pozabavili funkcionalnošću NK stanica u CML-u, istraživali smo njihovu sposobnost širenja nakon in vitro stimulacije i oslobađanje citolitičkih granula kao odgovor na ciljeve osjetljive na NK-stanice. Otkriveno je da stimulacija PBMC-a s ozračenim K562 stanično modificiranim stanicama izražava membranu vezanu za IL-15 i 41BB u prisutnosti rekombinantnih humanih IL-2 niskih doza (40 IU / ml) koji induciraju učinkovitu i selektivnu NK-stanicu ekspanzija iz periferne krvi zdravih davatelja 40 i bolesnika u remisiji akutne leukemije. 42 In vitro stimulacija s ozračenim K562-mb15-4 1BBL u omjeru 0, 75: 1, nakon čega je uslijedila 10-dnevna in vitro ekspanzija u prisutnosti rekombinantnog ljudskog IL-2 (40 IU / ml) rezultirala je srednjim 37-puta ( 8–64 puta) porast CD3 − CD56 + NK stanica u zdravih davatelja i srednja čistoća 94% (92–96%) CD3 − CD56 + NK stanica unutar stimulirane skupne populacije (Slika 3a). Apsolutni srednji broj 4, 1 × 10 6 (0, 8–6, 4 × 10 6 ) NK stanica generiran je iz 1 × 106 6 PBMC-a na 10. dan. Nasuprot tome, kod pet bolesnika s novo dijagnosticiranim CML-om, proliferacija NK-stanica je značajno smanjena, srednja 5-kratna ekspanzija (raspon 0–27 puta) i medijan kulture prinosa 0, 5 × 106, raspon 0, 0–4, 0 × 10 6 / ml ( P = 0, 01). Nakon liječenja imatinibom, širenje NK-stanica do stimulacije ostalo je značajno oslabljeno (28-srednji medijan, raspon 4–45 puta), s medijanom prinosa NK-stanica 2, 8 × 10 6, raspon 1, 1–5, 4 × 10 6 ( P = 0, 005) (slika 3b).

Image

Proliferacija NK stanica smanjena je kod bolesnika s CML-om i na liječenju imatinibom. ( a ) Selektivno obogaćivanje CD3-CD56 + NK stanica iz PBMC-a 10. dana nakon stimulacije ozračenim K562-mb15-4 1BBL u omjeru 0, 75: 1 u prisutnosti rekombinantnog ljudskog IL-2 (rhIL-2) (40 IU / ml). Reprezentativni primjer 36. ( b ) Ukupni broj NK-stanica 10. dana nakon ekspanzije iz periferne krvi zdravih davatelja, bolesnika s CML-om u dijagnozi i na liječenju određen je Trypan plavim isključenjem održivih stanica i izračunavanjem prema postotku CD3− CD56 + stanice protočnom citometrijom. ( c, d ) ekspanzija NK-stanica iz periferne krvi tri zdrava davatelja u prisutnosti 1, 2, 5 i 10 µM imatiniba ( c ), i šest bolesnika s CML-om na liječenju imatinibom bilo u odsutnosti ili u prisutnosti 1 µM imatinib in vitro ( d ). Apsolutni broj NK stanica izračunao se nakon 10 dana ekspanzije kao gore.

Slika pune veličine

Zatim smo istražili da li je neuspjeh da se NK stanice oporave na normalan broj u remisiji bolesnika posredovao negativnim izravnim učincima imatiniba na proliferaciju NK-stanica. Iako su visoke koncentracije imatiniba (5 i 10 µM) značajno oslabile in vitro ekspanziju NK-stanica (slika 3c), doza od 1 µM koja predstavlja relevantnu razinu u plazmi u bolesnika koji su imali dnevni imatinib 43 nije značajno utjecala na in vitro proliferaciju NK stanice i zdravih davatelja (slika 3c) i bolesnika s CML-om koji su pod in vivo tretmanom imatiniba (slika 3d).

Zatim smo usporedili reakcije degranulacije s NK-stanično-osjetljivom ciljnom staničnom linijom K562 pomoću regulacije CD107a koja daje osjetljiv parametar za aktivaciju NK-stanica. 44 Kao što se očekivalo, podudaranje NK stanica proširilo se od zdravih davatelja sa K562 stanicama što je rezultiralo snažnim odgovorima degranulacije s medijanom od 21, 0% (9, 8–33, 0%) CD107a-eksprimirajućih stanica unutar vrata CD3-CD56 + NK-stanica, dok NK- stanično rezistentna leukemija stanična linija ML-2 nije uspjela inducirati NK-staničnu aktivaciju (Slike 4a i b). Suprotno tome, NK stanice koje su se proširile od bolesnika s novo dijagnosticiranim CML-om imale su značajno niže reakcije degranulacije (medijan 1, 0%, raspon 0, 0–6, 6%, P = 0, 02) i one se nisu vratile na normalnu razinu remisije tijekom liječenja imatinibom (medijan 9, 6%, raspon 3, 6–45, 6%, P = 0, 026). Da bismo isključili da je nedostatak imatiniba tijekom in vitro ekspanzije možda omogućio NK stanicama bolesnika s CML-om djelomično vraćanje funkcionalnosti, dodatno smo analizirali NK stanice proširene u prisutnosti imatiniba. Usporedni rezultati dobiveni su bez obzira na prisutnost ili odsutnost 1 μM imatiniba u kulturi za vrijeme širenja (slika 4b, lijeva i središnja ploča). Nadalje, da isključimo da su funkcionalni deficiti posljedica in vitro stimulacije i širenja NK-stanica, reproducirali smo eksperimente s NK stanicama izravno izoliranim iz periferne krvi. Iako su reakcije degranulacije neproširenih NK stanica općenito veće, značajno smanjena sekrecija CD107a ponovo je pronađena u bolesnika s CML-om u usporedbi sa zdravim davateljima (slika 4b, desna ploča). Nije utvrđena značajna povezanost izlučivanja CD107a i odgovora na bolest u vrijeme analize (Slika 4c). Za razliku od smanjenih reakcija degranulacije, izravna citoliza otpuštanja K562 od 51 Cr nije bila pod utjecajem različitih omjera efektora do cilja u bolesnika na liječenju imatinibom (slika 4d, dopunska slika 2). Opet, prisutnost ili odsutnost 1 μM imatiniba u kulturi za vrijeme širenja NK-stanica nije utjecala na rezultate (slika 4d, središnja ploča), a neproširene NK stanice zdravih davatelja i pacijenata također su bile jednako učinkovite (slika 4d, desna ploča). Stoga su NK stanice bolesnika s CML-om i tijekom dijagnoze, i tijekom liječenja imatinibom značajno smanjile reakcije degranulacije, a in vitro ekspanzija ne uspijeva vratiti punu funkcionalnost. U tim eksperimentima, pomoću ciljano osjetljivog na NK-stanične stanice K562, smanjena degranulacija izlučivanjem CD107a ne prevodi se u oštećenu izravnu citolizu.

Image

Odgovor aktivacije NK-stanica je smanjen u bolesnika s CML-om i u liječenju imatinibom. ( a ) Ekspresija CD107a na CD56 + NK stanicama određena je protočnom citometrijom nakon 4-satne kobbacije NK stanica s ciljanim stanicama osjetljivim na NK (stanice) K562) i kontrolnim (ML2) ciljnim stanicama na efektoru do cilja (E: T) omjer 1: 1. Reprezentativni eksperiment od 36. ( b ) Postotak NK-stanica koje eksprimiraju CD107a nakon 4-satne stimulacije stanicama K562 kod zdravih davatelja i bolesnika s CML-om tijekom dijagnoze i na liječenju imatinibom. NK stanice su ili proširene u odsutnosti (lijeva ploča) ili prisutnosti 1 μM imatiniba (središnja ploča), ili bez prethodnog širenja (desna ploča). ( c ) CD107a ekspresija NK stanica proširila se od bolesnika koji su liječili imatinib CML kao odgovor na stanice K562 prema reakciji bolesti u vrijeme analize. ( d ) Citoliza ciljanih stanica K562 od strane NK stanica šest zdravih davatelja i šest bolesnika s CML na liječenju imatinibom određena je u testu oslobađanja od 51 Cr. Prikazani su rezultati za omjer učinak-cilj od 10: 1. NK stanice su ili proširene u odsutnosti (lijeva ploča) ili prisutnosti 1 μM imatiniba (središnja ploča), ili bez prethodnog širenja (desna ploča).

Slika pune veličine

BCR-ABL ekspresija u mišjim hematopoetičkim ćelijama smanjuje omjer NK-stanica u limfoidnom odjeljku

Da bismo istražili je li oštećen NK-stanični odjeljak u CML posljedica BCP-ABL-inducirane mijeloproliferacije koja karakterizira bolest, pozabavili smo se količinom i funkcionalnošću NK stanica u dvostrukom transgeničnom mišjem modelu ljudskog CML-a. 2, 12 SCLtTA / BCR-ABL transgenični miševi inducirano i reverzibilno eksprimiraju BCR-ABL pod kontrolom 3'hancera mišjeg SCL gena. 2, 12 U roku od 4 tjedna od indukcije BCR-ABL, svi miševi ( n = 11) razvili su bolest sličnu HML-u kronične faze, uključujući splenomegaliju (medijan 335 mg vs 108 mg u kontrolnim miševima negativnim BCR-ABL, P = 0, 001 ) i neutrofilija u BM i slezini (nije prikazano). Težina slezene dalje se povećala na srednju vrijednost od 544 mg ( P = 0, 001) tijekom produžene BCR-ABL indukcije, ukupno 8 tjedana. Nakon ponovne primjene tetraciklina, FML-tip sličan CML-u potpuno je vraćen (srednja težina slezene 129 mg, P = 0, 14 u usporedbi s neinduciranim kontrolnim miševima). Stoga, ovaj model doista omogućava izravno rješavanje uloge aberantne BCR-ABL ekspresije u matičnim stanicama hematopoeze na odjeljku mišjih NK stanica. Zbog ograničenog ukupnog broja NK stanica koje se mogu oporaviti iz periferne krvi ovih miševa, usredotočili smo se na slezene i BM NK stanice. BCR-ABL ekspresija je inducirana u 14 miševa povlačenjem tetraciklina, dok je 14 miševa nastavljeno primati tetraciklin i služio je kao kontrola. Suprotno ljudskom CML, 23, 24, 45 NK stanica iz svih BCR – ABL + miševa izrazilo je BCR – ABL transkript.

Subpulacije limfocita slezene u BCR – ABL negativnim i BCR – ABL miševima induciranim uspoređene su protočnom citometrijom. Relativni udjeli CD3 + T stanica, CD4 + T ćelije, CD8 + T stanice i B stanice nisu se razlikovali nakon indukcije BCR – ABL u usporedbi s BCR – ABL negativnim kontrolama (Slika 5). Suprotno tome, u skladu s rezultatima u ljudskom CML-u, relativni udjeli NK1.1 + NK stanica među ukupnim slezenskim limfocitima značajno su smanjeni u BCR – ABL-induciranim miševima nakon 4 i 8 tjedana (2, 3–9, 8% (medijan 7, 1) %) i 2, 6–10, 4% (medijan 8, 4%), u usporedbi s 9, 7–16, 9% (medijan 14, 8%) u zdravim kontrolama, P = 0, 02 i P = 0, 01) (Slika 5). Nakon reverzije BCR-ABL ekspresije, broj slezenih NK-stanica ostao je na razinama otkrivenim u BCR-ABL + miševima. Promjene unutar odjeljka limfocita kod BCR-ABL preokrenutih miševa također su uključivale T- i B-limfocite. Kao posljedica povećanih udjela CD4 + i CD8 + T stanica i značajno smanjenog broja B stanica, omjer T- prema B stanicama značajno je porastao u BCR – ABL revertiranim miševima (Slika 5).

Image

Udio NK1.1 + NK stanica je smanjen u stanicama slezene od miševa izazvanih BCR-ABL i ne oporavljaju se nakon reverzije. Relativni udjeli podskupova limfocita slezene protočnom citometrijom unutar vrata limfocita (B220 + B stanice, CD3 + T stanice, NK1.1 + NK stanice) ili kao frakcija CD3 + T stanica (CD4 + i CD8 + T stanice) u 14 BCR – ABL + miševa nakon indukcije bilo 4 ( n = 9) ili 8 tjedana ( n = 5), kod 14 neinduciranih, BCR-ABL negativnih kontrolnih miševa, te u 4 miševa BCR-ABL + nakon 4 tjedna BCR-ABL reverzije nakon 4 tjedana indukcije.

Slika pune veličine

BCR-ABL ekspresija smanjuje reakciju degranulacije mišjih NK stanica

Za procjenu proliferativnih i funkcionalnih svojstava NK stanica iz BCR – ABL + miševa, NK stanice negativno su odabrane iz slezinih limfocita, što rezultira čistoćom od 93% (89–97%) NK1.1 + NK stanica. Pročišćene NK stanice kultivirane su u prisutnosti IL-2 pod prethodno prikazanim uvjetima da induciraju snažnu in vitro proliferaciju mišjih NK stanica. 46 Za razliku od ograničenih in vitro stopa ekspanzije humanih NK stanica (slika 3b), slezene NK1, 1 + NK stanice BCR – ABL + miševa i kontrolnih miševa proširile su se s jednakom brzinom tijekom 14-dnevnih kultura (Slika 6a). Ovi su pokusi reproducirani s NK stanicama mišjeg BM-a, i opet su pokazali usporedive stope ekspanzije između BCR-ABL + i kontrolnih miševa (Slika 7a). Tijekom ekspanzije, čistoća eksperimentalnih i kontrolnih kultura održavana je na 96, 5% (90–97%) i 95% (89–97%) NK stanica. Analogno našim eksperimentima s ljudskim CML NK stanicama (slike 4a i b), odgovor degranulacije na podudaranje s ciljno staničnim linijama osjetljivim na NK stanicu YAC-1 / NIH-3T3 ocijenjen je kao parametar za aktivaciju NK-stanica. NK stanice koje su proširene iz pročišćene populacije slezene i BM NK stanice korištene su za ove eksperimente. Da bi se iz analize isključili ne-NK limfociti, vrata su postavljena na stanice NK1.1 + CD3-negativne (Slika 6b). Pozadinska degranulacija kao odgovor na C2C12 kontrolne ciljne stanice (slika 6c) oduzima se za svaki uzorak. U usporedbi s NK stanicama izoliranim i proširenim iz BCR – ABL negativnih kontrolnih miševa, degranulacijski odgovor slezinskih NK stanica iz BCR – ABL + miševa nakon 4 i 8 tjedana indukcije na YAC-1 / NIH-3T3 stanice je značajno smanjen (medijan 30.1 % (2, 0–31, 2%) i 22, 1% (20, 5–30, 1%) vs 38, 6% (20, 7–50, 0%) u zdravim kontrolama, P = 0, 008 i P = 0, 007) (Slika 6d). Analogni rezultati dobiveni su s NK stanicama proširenim iz BM BCR-ABL + i kontrolnim miševima (Slika 7b). Stoga, ekspresija BCR-ABL u odjeljku hematopoetskih stanica rezultira numeričkim smanjenjem i funkcionalnim oštećenjem NK stanica.

Image

In vitro ekspanzija NK ćelija mišice slezene u prisutnosti IL-2 zadržava se nakon indukcije BCR-ABL, dok je aktivacijski odgovor smanjen. ( a ) Pročišćene stanice slezene NK1.1 + proširene su s 11 BCR-ABL + miševa nakon indukcije bilo 4 ( n = 6) ili 8 tjedana ( n = 5), ili nakon BCR-ABL reverzije ( n = 4), i u 11 BCR-ABL-negativnih kontrolnih miševa tijekom 14 dana kokulturom s IL-2 (razlike nisu statistički značajne). ( b ) Čistoća NK1.1 + NK stanica nakon 14-dnevnog širenja određena protočnom citometrijom. ( c ) Detekcija NK-stanica koje eksprimiraju CD107a nakon 4-satnog podudaranja NK stanica s ciljanim staničnim linijama YAC-1 / NIH-3T3 u usporedbi s kontrolnom staničnom linijom C2C12. Reprezentativni primjer. ( d ) NK stanice su ekspandirane iz slezenskih limfocita kako je detaljno opisano u ( a ), a postoci NK-stanica koje eksprimiraju CD107a određeni su protočnom citometrijom nakon 4-satne kohibicije s YAC-1 / NIH-3T3 stanicama pri 1: 1 omjer efektor-cilj (E: T).

Slika pune veličine

Image

In vitro ekspanzija mišjih BM stanica u prisustvu IL-2 zadržava se nakon indukcije BCR-ABL, dok je aktivacijski odgovor smanjen. ( a ) Pročišćene stanice BM NK1.1 + proširile su se iz BCR-ABL +, BCR-ABL revertirane i kontrolne miševe 14 dana u prisutnosti IL-2 (razlike nisu statistički značajne). ( b ) NK stanice su ekspandirane iz BM limfocita iz 8 miševa BCR-ABL + nakon indukcije 4 ili 8 tjedana ili nakon BCR-ABL reverzije, te iz BCR – ABL negativnih kontrolnih miševa, a postoci NK stanica koje eksprimiraju CD107a su određena protočnom citometrijom nakon 4-satne koubbacije sa stanicama YAC-1 / NIH-3T3 u omjeru 1: 1 između efektora i cilja (E: T).

Slika pune veličine

Rasprava

Unatoč osjetljivosti primitivnih CML stanica na autologne NK stanice in vitro, imunološki nadzor 20, 47, 48 očito ne može kontrolirati zloćudni klon. Početna izvješća o nedostatnoj funkciji NK-stanica u CML 45, 49 bili su zbunjeni prethodnom kemoterapijom ili interferonom-α, koji može imati dugotrajno djelovanje na imunološki sustav i napredni status bolesti kod mnogih bolesnika. Ovdje pokazujemo da neliječeni pacijenti s novo dijagnosticiranim HML-om kronične ili ubrzane faze imaju i smanjeni broj NK-stanica i funkcionalno neispravne NK-stanice. Funkcionalno oštećenje uključuje smanjenu in vitro proliferaciju kao odgovor na stimulaciju i oslabljene reakcije degranulacije na ciljane stanice osjetljive na NK-stanice. Naše opažanje da izravna citoliza K562 stanica nije bila umanjena unatoč smanjenoj degranulaciji izlučivanjem CD107a, može se objasniti izuzetnom osjetljivošću ove stanične linije prema lizi NK-stanica. Iako će se detaljni funkcionalni profil CML NK stanica morati riješiti u budućim studijama, uključujući autologne CML ciljne stanice, naši podaci pružaju snažne dokaze da je NK-stanični odjeljak u CML promijenjen i samom bolešću i liječenjem imatinibom.

Jedno potencijalno objašnjenje disfunkcionalnih NK stanica u CML-u je njihova izloženost malignom okruženju koje uključuje stanične proizvode ili negativne signale BCR – ABL + CML stanica. Pretpostavljeno je da reaktivne kisikove vrste nastale cirkulacijom klonskim granulocitima pokreću NK-staničnu apoptozu, međutim, CML stanice in vitro konstitutivno ne inhibiraju NK stanice . 50 Alternativno, BCR – ABL + stanice unutar odjeljka hematopoetskih stanica mogu negativno i selektivno utjecati na diferencijaciju nemalignih progenitora prema NK stanicama. 45

Analiza in vitro podudarnosti ne može adekvatno oponašati ove interakcije. Stoga, da bismo istražili ulogu zloćudnog mikro okruženja u nedostatku NK-stanica in vivo , koristili smo inducibilni model miševa koji odražava CML-sličnu mijeloproliferaciju pomoću BCR-ABL kinazne aktivnosti u hematopoetskim matičnim stanicama. 23 Snaga ovog modela je u tome što on usko simulira in vivo uvjete u bolesnika s CML-om, zajedno s kontrolnom populacijom koja se razlikuje samo po nedostatku BCR-ABL ekspresije. Štoviše, reverzija BCR-ABL omogućuje oponašanje cjelovitih remisija. Zapravo, analogno našim nalazima kod bolesnika s CML-om, NK stanice miševa sa bolešću sličnom CML-u nakon indukcije BCR-ABL ekspresije smanjene su u broju i pokazale su oštećene reakcije degranulacije. To potvrđuje da ekspresija BCR-ABL kinaze u hematopoetskom odjelu ima snažne učinke na stvaranje i funkciju NK stanica. Značajno je da je u ljudskom CML i na modelu miševa selektivno pogođen odjeljak NK-stanica, dok su brojevi T- i B-stanica bili usporedivi sa zdravim davateljima i miševima negativnim na BCR-ABL.

Unatoč sličnostima između miševa koji su uzrokovani BCR-ABL i bolesnika s CML, interpretacija rezultata zahtijeva razmatranje nekoliko upozorenja. Prvo, klonalno porijeklo NK stanica bilo iz BCR – ABL-pozitivnih ili negativnih hematopoetskih matičnih stanica može značajno utjecati na rezultate. Većina ljudskih NK stanica u kroničnoj fazi CML ne potiče iz malignog klona. 23, 24, 45 Suprotno tome, uprkos bliskoj sličnosti mieloproliferativnog fenotipa BCL-ABL-induciranih SCLtTAxBCR-ABL miševa s ljudskom bolešću, ekspresija transgena ispod mišjeg SCL gena 3 'proizvoda u miševima uključuje NK-stanični odjeljak, Dakle, iako aberantna aktivnost kinaze unutar podskupina NK stanica ne objašnjava nedostatke uočene u ljudskom CML-u, možda je doprinijela oštećenju NK stanica u BCR – ABL + miševima.

Drugo, slezensko i BM podrijetlo NK stanica u mišjem modelu možda nisu reprezentativni za periferni odjeljak NK-stanica kod ljudi. Poteškoće u dobivanju odgovarajućeg broja NK-stanica iz periferne krvi miševa i ograničena dostupnost BM-a od pacijenata s CML-om onemogućile su izravnu usporedbu odgovarajućih odjeljaka. Međutim, izuzetne sličnosti između naših otkrića kod slezene i BM limfocita kod miševa sugeriraju da je utjecaj izvora NK stanica ograničen.

Druga zabrinutost je da bi in vitro ekspanzija NK stanica za dobivanje odgovarajućeg broja stanica za funkcionalne eksperimente mogla zbuniti rezultate. Doista, pokazalo se da su profili genske ekspresije pretrpjeli znatne promjene tijekom in vitro ekspanzije NK-stanica. 51 Međutim, komparativni funkcionalni eksperimenti s neširiranim nasuprot proširenim NK stanicama nekih zdravih davatelja i bolesnika s CML potvrdili su rezultate dobivene proširenim NK stanicama i osporavaju veliki učinak in vitro ekspanzije na funkcionalnost NK-stanica.

Tijekom prethodnih izvještaja o staničnoj imunološkoj disfunkciji u CML-u, uvođenje TKI-a u liječenje dodalo je još jednu razinu složenosti. Postoji nevjerojatna razlika između dominantnih imunosupresivnih učinaka imatiniba in vitro , 30, 31 i razvoja funkcionalnih T-staničnih odgovora u bolesnika s CML-om liječenih ovim lijekom. 32, 33, 34 Štoviše, mehanizmi koji stoje na osnovi klinički važne klonske limfoproliferacije kod nekih bolesnika koji se nalaze u skupini s dasatinibom nisu otvoreni. 35, 36, 37, 38 Stoga in vivo imunološki učinci TKI-ja na CML zaslužuju daljnju studiju. Longitudinalna analiza podpopulacija limfocita u bolesnika s CML-om na imatinibu bila je podvrgnuta jednom prethodnom izvješću. Nađeno je da je imunoprofil sličan onom zdravih kontrola ponovno uspostavljen na imatinibu, međutim, odjeljak NK-stanica nije detaljno analiziran. Ovdje pokazujemo da liječenje imatinibom ne uspijeva vratiti punu funkcionalnost NK-stanica CML-a. NK stanice ostale su smanjene u broju, a njihovi in vitro proliferativni odgovori i izlučivanje granula na moćan poticaj aktivacije se nisu oporavili. Nadalje, ekspresija NKG2D receptora smanjena je tijekom remisija izazvanih imatinibom. Smanjena ekspresija NKG2D na NK stanicama povezana je s oslabljenom funkcijom NK-stanica u bolesnika s rakom 53 i stoga može biti uključena u imunološki bijeg. Oštećena degranulacija otkrivena je s matičnim stanicama NK-a i nakon prethodne ekspanzije bilo u prisutnosti ili odsutnosti imatiniba, tako da se ne može nadoknaditi snažnim aktivacijskim poticajem izvan mikrookoline koja sadrži imatinib. Prema tome, oštećenja hematopoetskih stanica prekursora inducirana leukemijskim klonom mogu ostati i nakon uklanjanja većine BCR-ABL + stanica. Alternativno ili dodatno, inhibicija izvan-ciljanih kinaza imatinibom u imunološkim efektorskim stanicama može izazvati slične promjene u zloćudnom okruženju.

Kod miševa, povratni BCR-ABL nije uspio rekonstituirati normalne brojeve NK stanica u kontrolnih miševa i tako oponašao trajne promjene primijećene u ljudskom CML-u na imatinibu. To doista sugerira da poremećaj imunoloških stanica u prisutnosti malignog klona može trajati i dalje od remisije. Međutim, podpopulacije limfocita pretrpjele su još dublje promjene promjenom BCR-ABL reverzijom, sada uključujući T i B stanice koje nisu primijećene u ljudskom sustavu. Stoga ponovno moramo uzeti u obzir sposobnost modela miševa da u potpunosti odražava ljudsku bolest.

Povećavanje autolognih NK-staničnih odgovora može biti učinkovita strategija liječenja u minimalnoj zaostaloj bolesti u CML-u. Zapravo, u pilot kliničkom ispitivanju u kojem se procjenjuje postojanost potpune molekularne remisije nakon zaustavljanja imatiniba, zabilježeni su niži broj perifernih NK-stanica prije prestanka primjene imatiniba kao faktor rizika koji je značajno povezan s naknadnim relapsom. 22 Važno je da ljudske leukocitne NK-stanice identične leukocitima ciljaju ne samo podjelu CML stanica, već i mirovanje CD34 + hematopoetskih podpopulacija leukemijskog klona, ​​a osjetljivost ove kritične pod-populacije na lizu može se povećati liječenjem bortezomibom. 18 Prednosti u odnosu na strategije zasnovane na T-stanicama su nedostatak istodobne toksičnosti zbog bolesti cijepljenja naspram domaćina i potreba da se identificiraju antigeni specifični za leukemiju. Važno je da kulturološki uvjeti koji sadrže IL-2 omogućavaju učinkovito pročišćavanje BCR-ABL-pozitivnih potomaka 54 i na taj način pomažu u izbjegavanju rizika od kontaminacije ćelijama autolognih proizvoda od leukemije.

Nažalost, duboke funkcionalne nedostatke koji postoje tijekom liječenja imatinibom vjerojatno će ozbiljno ugroziti antileukemijsku aktivnost autolognih transfuzija NK-stanica. Doista, prethodni pokušaji upotrebe autologno aktiviranih NK stanica nisu uspjeli spriječiti relaps nakon autologne transplantacije matičnih stanica. 55 Ovdje pokazujemo da čak i optimizirana podražajna i citokinska stanja koja induciraju NK stanice s moćnim citolitičkim odgovorima i na AML 56 i na solidne tumore 57 sama po sebi ne mogu prevladati funkcionalne oštećenja NK-stanica u CML-u. Potrebne su preciznije strategije za poboljšanje funkcionalnosti autolognih NK stanica u CML-u. Alternativno, usvajanjem prijenosa in vitro ekspandiranih alogenskih NK stanica ostaje mogućnost da se u CML-u potaknu i povećaju učinci grafta naspram leukemije bez rizika od bolesti grafta prema domaćinu. 18 Identificiranje mehanizama nedostatka NK-stanica u CML-u i detaljne interakcije pojedinih TKI-ova s ​​imunološkim podskupinama i njihovim preslikanjem mogu pomoći u identificiranju lijekova ili kombiniranih strategija koje podržavaju terapeutske autologne reakcije NK-stanica.

Dodatna informacija

Datoteke Powerpoint

  1. 1.

    Dopunska slika 1

Datoteke slika

  1. 1.

    Dopunska slika 2

Word dokumenti

  1. 1.

    Dopunske slikovne legende

  2. 2.

    Dopunska tablica 1

    Dodatne informacije prate rad na web stranici Leukemia (//www.nature.com/leu)