Ekscitotoksičnost posredovana nmda receptorima ovisi o koaktivaciji sinaptičkih i ekstrasynaptičkih receptora | stanična smrt i bolest

Ekscitotoksičnost posredovana nmda receptorima ovisi o koaktivaciji sinaptičkih i ekstrasynaptičkih receptora | stanična smrt i bolest

Anonim

teme

  • Stanična smrt
  • Stanična signalizacija
  • Ionski kanali zatvoreni u ligandu
  • Neurološki poremećaji

Sažetak

Prekomjerna aktivacija N-metil-D-aspartata (NMDAR) povezana je s neurodegeneracijom. Trenutačna prevladavajuća teorija sugerira da sinaptički i ekstrasynaptički NMDAR (syn- i ex-NMDAR) nameću suprotstavljene učinke na sudbinu stanica, a smrt neuronskih stanica uglavnom je posredovana aktivacijom ex-NMDAR-a. Međutim, nekoliko dokaza dokazuje ograničenje ove teorije. Ovdje smo pokazali da aktiviranje NMDAR dvosmjerno regulirane sudbine stanica poticanjem proživljavanja ili signalizacije pro-smrti. Iako je preferencijalno aktiviran sinh-NMDAR s niskom dozom NMDAR i stimulirao izvanstanični signal-regulirani kinaza ½ – cAMP-reagirajući element za preživljavanje neurotrofičkog faktora koji provodi preživljavanje, veće doze progresivno aktivirale sve veću količinu ex-NMDAR zajedno sa syn -NMDAR i pokrenut program smrti ćelije. Zanimljivo je da sam aktiviranje syn- ili ex-NMDAR nije uzrokovalo mjerljivu staničnu smrt. Dosljedno tome, aktiviranje same syn- ili ex-NMDAR potaknulo je preživljavanje, ali ne i signalizaciju pro-smrti. Zatim smo otkrili da memantin, koji je prethodno identificiran kao bivši NMDAR blokator, inhibira intracelularnu signalizaciju posredovanu syn- ili ex-NMDAR. Istodobna blokada syn- i ex-NMDAR amantualiziranom NMDAR smrtom ovisnom o dozi ovisna je o dozi. Nadalje, dugotrajno, ali ne i kratkotrajno liječenje NMDA-om visoke doze ili nedostatkom kisika i glukoze pokrenulo je staničnu smrt i potisnulo signalizaciju o preživljavanju. Ovi podaci impliciraju da aktivacija sin- ili ex-NMDAR sama nije neurotoksična. Stupanj ekscitotoksičnosti ovisi o veličini i trajanju sy- i ex-NMDAR koaktivacije. Napokon, ispitivanje u cijelom genomu pokazalo je da aktiviranje syn- i ex-NMDAR dovodi do značajnog preklapanja, a ne do suzbijanja transkripcijskih odgovora.

Glavni

N-metil-D-receptorski receptori (NMDAR) posreduju ekscitacijski neuronski prijenos. Pored njihovih fizioloških funkcija, novi dokazi upućuju na njihovu uključenost u ekscitotoksičnost. Stanična smrt izazvana napadajem ili ishemijskim moždanim udarom pripisuje se NMDAR prekomjernoj aktivaciji. 1, 2 Nenormalna NMDAR aktivnost je također povezana s neurodegenerativnim poremećajima, poput Alzheimerove, Huntington-ove i Parkinsonove bolesti. 3 Dakle, zaključeno je da, iako je odgovarajuća NMDAR aktivacija ključna za preživljavanje neurona i fiziološke funkcije, pretjerana aktivacija doprinosi patološkim promjenama, uključujući staničnu smrt. 4

Budući da se NMDAR nalaze i na sinaptičkim i na ekstrasynaptičkim mjestima, 5, 6 pokušava se utvrditi da li dvije NMDAR populacije imaju različitu ulogu u preživljavanju i smrti neurona u fiziološkim i patološkim uvjetima. 7 Uticajna studija pokazala je da aktiviranje sinaptičkog NMDAR (syn-NMDAR) s bikukulinom stimuliranom signalom proživljavanja, takvom aktivacijom proteina koji se veže za cAMP, u uzgojenim neuronima. 8 Naknadna primjena NMDAR agonista (tj. Glutamata) u kupelji isključila je CREB signalizaciju i pokrenula smrt neurona. Zaključeno je da, budući da inkubacija kupke s glutamatom aktivira globalni NMDAR (uključujući i sinaptičku i ekstrasynaptičku populaciju), sudjelovanje ekstrasynaptičkog NMDAR-a (ex-NMDAR) pretvorilo je preživljavanje u smrt. Pojačana ex-NMDAR aktivnost je također povezana s neurodegeneracijom poput Huntington-ove bolesti. 9

Iako trenutna prevladavajuća teorija postulira da aktiviranje ex-NMDAR-a djeluje suprotno syn-NMDAR-u i izaziva staničnu smrt, 7 neke studije sugeriraju ograničenje ove teorije. Prvo, aktivacija ex-NMDAR nije uključena samo u patološki proces, već i u normalne moždane funkcije. 10, 11 Drugi, mlađi i razvijajući se neuroni uglavnom eksprimiraju ex-NMDAR 12 i otporni su na staničnu smrt uzrokovanu NMDA ili glutamatom. 13, 14 Štoviše, u ganglijskim stanicama mrežnice nedostaje ekscitotoksičnost NMDA i glutamata, 15 kojima nedostaje syn-NMDAR, a struja NMDAR posredovana je receptorima na ekstrasynaptičkim mjestima. 16, 17 Ovdje smo se potrudili da izoliramo sy- i ex-NMDAR i odredili smo njihove funkcije u sudbini stanica. Iznenađujuće, otkrili smo da sama aktiviranje syn- ili ex-NMDAR-a nije uzrokovala smrt stanice ovisne o NMDAR-u, već aktivirala signalizaciju pro-preživljavanja. Nadalje pružamo nove dokaze koji pokazuju da je stupanj ekscitotoksičnosti ovisne o NMDAR povezan s veličinom i trajanjem syn- i ex-NMDAR koaktivacije. Nadalje, podaci iz mikroračunske analize pokazali su da aktivacija syn- i ex-NMDAR ima preklapanje, ali ne i suprotstavljene učinke na genomske odgovore.

Rezultati

NMDAR dvosmjerno regulira signalizaciju za preživljavanje i intracelularnu homeostazu Ca 2+

Prethodna ispitivanja pokazuju da aktivacija NMDAR dvosmjerno regulira unutarćelijske odgovore povezane s preživljavanjem neurona. 18 Ovdje smo 30 minuta stimulirali neurone u različitim koncentracijama NMDA i ispitivali unutarćelijske odgovore povezane sa sudbinom neurona. U skladu s prethodnim studijama, 18, 19, otkrili smo da niža koncentracija NMDA (pri 15 i 20 µM ) uguliranoj fosforilaciji izvanstanične kinaze ½ (ERK1 / 2), a viša NMDA deaktivira ERK1 / 2 (slika 1a). NMDA je također dvosmjerno regulirala transkripciju neurotrofičkog faktora gena koji preživljava za preživljavanje ( Bdnf ) (slika 1b). Nadalje, niska doza NMDA aktivirala je molekule za preživljavanje CREB i AKT; velike doze ih isključuju (slike 1c i d). U korelaciji, NMDA je aktivirala aktiviranje pro-smrti molekule kaspaze-3 (slike 1c i d) i smrt neurona (slike 1e i f) na način ovisan o dozi. Povećavanje koncentracija NMDA također je postupno pokrenulo više oslobađanja laktatne dehidrogenaze iz oštećenih neurona (dopunska slika 1).

Image

NMDA dvosmjerno regulira unutarćelijsku signalizaciju, staničnu smrt i homeostazu kalcija. DIV 14 kortikalni neuroni su stimulirani s NMDA (na 15, 20, 30, 40 i 50 µM, kako je naznačeno). Uzorci su sakupljeni 30 min ( a i c ) ili 60 min ( b ) nakon stimulacije, te su ispitani fosforilacija ERK1 / 2 ( a ), transkripcija Bdnf ( b ) i fosforilacija CREB, AKT i aktivirano oblik kaspaze-3 ( c ). Razina p-CREB, p-AKT i aktivirane kappaze-3 kvantificirana je i izražena kao prosjek ± SEM u ( d ). Za e i f, DIV 14 neurona podvrgnuti su 30-minutnom tretmanu NMDA u različitim koncentracijama (u μM kako je naznačeno). Neposredno nakon tretmana neuroni su isprani prethodno zagrijanim medijem i održavani u kondicioniranom mediju plus MK801. Neuroni su zatim fiksirani 20 h kasnije i obojeni DAPI ( e ). ( f ) postotak stanične smrti izazvan NMDA-om u različitim koncentracijama kvantificiran je i izražen kao prosjek ± SEM Kondenzirano nuklearno bojanje pomoću DAPI korišten je za određivanje stanične smrti. Za d i f, analiza ANOVA otkrila je značajne učinke koncentracije NMDA. Različita slova označavaju različite SNK skupine s 2+ i u živim neuronima određeno je kalcijem. DIV 14 neurona stimulirani su s 15 ( g ), 20 ( h ), 30 ( i ), 40 ( j ) i 50 µM ( k ) NMDA kako je naznačeno. Prikazani su reprezentativni tragovi pojedinih neurona. Postotak neurona, u kojima se Ca2 + i nije vratio na početnu razinu nakon povlačenja NMDA, kvantificiran je i prikazan u l . Trajanje NMDA stimulacije (tj. 30 min) označeno je linijama u g - k

Slika pune veličine

Preopterećenje Ca 2+ i gubitak homeostaze Ca 2+ uzrokovano prekomjernom aktivacijom NMDAR-a usko je povezano sa smrću neurona. 20 Mjerenjem unutarćelijskog Ca2 + (Ca 2+ i ) u živim neuronima, otkrili smo da NMDA uzrokuje povišenje Ca2 + i na način ovisan o dozi (slike 1g – k). Kad se NMDA povukla nakon 30-minutne stimulacije, Ca 2+ i ostao je povišen i nije se vratio na početnu razinu u više neurona liječenih s višim koncentracijama NMDA (Slika 1l). Gubitak homeostaze Ca 2+ u korelaciji je sa staničnom smrću. Postotak ćelijske smrti povećao se u neuronima liječenima višom koncentracijom NMDA (Slike 1e i f). Neuroni koji su tretirani s 15 µM NMDA nisu pokazali značajnu disregulaciju Ca2 + (slika 1 g) i staničnu smrt (slike 1e i f). Ovi podaci pokazuju da sve veća količina NMDA aktivira više receptora, što doprinosi programskom prelasku iz preživljavanja u staničnu smrt.

Aktivacija syn-NMDAR sama aktivira signalizaciju za preživljavanje, ali ne i smrt

Zašto inkubacija kupke s NMDA u različitim koncentracijama dovodi do različitih reakcija neurona? Jedna je mogućnost da postoji prag aktivacije NMDAR, nadmašivanje koje će pokrenuti program smrti. Druga je mogućnost da NMDA s malim dozama uglavnom aktivira syn-NMDAR; visoka doza NMDA aktivira više receptora, uključujući bivši NMDAR, što je prethodnim studijama sugerirano kao glavni uzrok smrti stanica. 7 Ovdje pokazujemo da su bicukulari i 15 µM NMDA imali slične učinke. Poznato je da bikukulin, antagonist receptora GABA A, aktivira syn-NMDAR blokirajući inhibiciju sinapse i tako dovodi do oslobađanja glutamata iz presinaptičkih terminala. 22 Prvo, bicukularan tretman aktivirao je CREB i AKT, ali ne kaspazu-3 (slika 2a). Bicuculline je također regulirao ERK1 / 2 fosforilaciju (slika 2b) i Bdnf transkripciju (slika 2c). Drugo, 30-minutno liječenje bicukularom nije uzrokovalo smrt stanica koje se može otkriti (slika 2d). Dugotrajno 24-satno liječenje bicukulanom ili 15 µM NMDA također nije uspjelo izazvati smrt (slika 2e).

Image

Aktivacija syn-NMDAR potiče signalizaciju za preživljavanje. DIV 14 kortikalni neuroni su tretirani bicukullinom 30 min ( a i b ) ili 60 min ( c ). Razine p-CREB, p-AKT i aktivirane kaspaze-3 određene su Western blotom i prikazane u a . Kvantifikacija (prosjek ± SEM) iz tri neovisna pokusa prikazana je na desnoj ploči a . Razina p-ERK1 / 2 ( b ) i Bdnf mRNA ( c ) određena je Western blotom i RT-PCR. ( d i e) Nije bilo značajne stanične smrti neurona koji su tretirani bicukulinom tijekom 30 minuta ( d ), ili bicukularom ili 15 µM NMDA tijekom 24 sata ( e ). NS, nije značajno

Slika pune veličine

Aktivacija ex-NMDAR-a sama ne uzrokuje smrt neurona, nego aktivira signalizaciju za preživljavanje

Da bismo odredili funkciju ex-NMDAR, koristili smo dobro prihvaćenu metodu za blokiranje syn-NMDAR liječenjem neurona bicuculline-om i MK801. Budući da bicukulin samo aktivira syn-NMDAR, a MK801 nepovratno blokira otvorene kanale, djelovanje s bicukularom plus MK801 blokiralo bi syn-NMDAR. Stoga bi se svi sljedeći odgovori posredovani s NMDAR-om pripisali bivšem NMDAR-u. Bicukulin i MK801 uzrokovali su prolazni priliv Ca 2+ posredovan syn-NMDAR (dopunska slika 2A). Nakon uklanjanja bicukulline / MK801, naknadna primjena bicuculline više nije inducirala mjerljivi priliv Ca 2+ (dopunska slika 2B). Neuroni koji su liječeni bicukulanom / MK801 nisu pokazali CREB aktivaciju (dopunska slika 2C). Nakon bicukulline / MK801 tretmana, naknadni bicuculline nije povećao CREB fosforilaciju (p-CREB) (dopunska slika 2D). Ovi rezultati pokazuju da je djelovanje s bicukulanom / MK801 dovoljno blokiranom syn-NMDAR.

Nakon bicukulline / MK801 i naknadnog ispiranja, ispitali smo promjene Ca2 + i primjenjujući povećanu koncentraciju NMDA. Otkrili smo da je NMDA od 15 do 50 μM progresivno inducirala sve veće stupnjeve povišenja Ca 2+ i (Slike 3a-e). To ukazuje da su veće doze NMDA aktivirale više ex-NMDAR-a.

Image

Aktivacija ex-NMDAR ne uzrokuje disregulaciju Ca2 + i i neuronske stanice. ( a - e), kortikalni neuroni DIV 14 prvo su 2 minute tretirani bicukularom i MK801, a potom su isprani obilato puferiranom otopinom. Tragovi snimanja kalcijem pokazuju povišenje Ca2 + i naknadnom primjenom NMDA na 15 ( a ), 20 ( b ), 40 ( c ) i 50 µM ( d ) kako je naznačeno. Kvantifikacija relativnih promjena (tj. Razine Ca 2+ i na početnoj razini, na kraju primjene NMDA i nakon povlačenja NMDA) prikazana je u ( e ). NS, nije značajno. '*' označava P <0, 05 između početne vrijednosti i NMDA tretmana; '#' označava P <0, 05 između NMDA i povlačenja. ( f) DIV 14 neurona prvo su prethodno tretirani s bikukulinom i MK801 tijekom 2 minute, nakon čega je uslijedilo opsežno ispiranje s kondicioniranim medijem. Nakon toga, neuroni su inkubirani s NMDA u različitim koncentracijama (kako je naznačeno) 30 minuta. Neuroni su fiksirani 20 sati nakon tretmana i obojeni DAPI. Stanična smrt određena je pojavom kondenziranog nuklearnog bojenja.

Slika pune veličine

Primijetili smo da, nakon što je blokirao syn-NMDAR, NMDA na 20 do 50 μM više nije uzrokovala disregulaciju Ca2 + . Nakon povlačenja NMDA, povišeni Ca 2+ i smanjio se prema osnovnoj razini (slike 3b-e). Ovi podaci sugeriraju da samo aktiviranje ex-NMDAR-a ne remeti homeostazu Ca2 + . Dosljedno, nije primijećena značajna stanična smrt s neuronima stimuliranim višim NMDA nakon tretmana bicukulanom / MK801 (Slika 3f). Nadalje, s blokiranim syn-NMDAR, NMDA ili glutamat od čak 1 mM nisu mogli uzrokovati mjerljivu smrt (Dopunska slika 3A). Nadalje, nakon što su blokirali syn-NMDAR, inkubacija 100 µM NMDA ili 100 µM glutamata tokom 24 sata nije uspjela izazvati smrt (dopunska slika 3B). Budući da prethodna zapažanja sugeriraju da bikukularna obrada ima zaštitni učinak na stanicu uzrokovanu NMDA-om, 23 zapitali smo se da li prisutnost bicukullina tijekom 2-minutne prethodne obrade s bicuculline / MK801 ima sličan učinak. Međutim, nismo primijetili nikakav zaštitni učinak od 2-minutne bicukulline prethodne obrade (dopunska slika 4). Zajedno, pokazujemo da sama aktiviranje syn- ili ex-NMDAR nije bila dovoljna da uzrokuje mjerljivu staničnu smrt i disregulaciju Ca2 + . Aktivacija syn-NMDAR zajedno s povećanom uključenošću ekstrasynaptičkog receptora, kao u slučajevima kada su neuroni tretirani povećanom koncentracijom NMDA (Slike 1e i f), bila je neurotoksična.

Da bismo dalje utvrdili funkciju ex-NMDAR u patološkim uvjetima, koristili smo lišavanje kisika i glukoze (OGD) kao model staničnog ishemijskog moždanog udara. 24 75-minutni OGD inducirao je 73, 6% stanične smrti (slika 4a). Nakon što je blokirao syn-NMDAR, OGD nije uzrokovao značajnu smrt (slika 4a). Dosljedno, OGD je uzrokovao smanjenje p-CREB-a i p-AKT-a zajedno s povećanjem aktivnosti kaspaze-3 (Slika 4b). Nakon blokiranja syn-NMDAR, OGD regulirani p-CREB i p-AKT bez povišenja kaspaze-3 (Slika 4b). Svjesni smo mogućih NMDAR neovisnih mehanizama u OGD-u. Prema našem eksperimentalnom postavljanju, 2 h OGD uzrokovao je tešku staničnu smrt sa ili bez preradom bicukulanom / MK801 (dopunska slika 5). Kada se trajanje OGD-a smanjilo na 75 min, postoji jasna funkcionalna uključenost NMDAR-a. Naši podaci pokazuju da ova faza koja uključuje NMDAR nije osjetljiva na OGD kada su blokirani sinaptički receptori.

Image

Blokiranje sinaptičkih receptora rezultira rezistencijom na OGD. DIV 14 neurona prvo su tretirani bicukulinom i MK801 u trajanju od 2 minute, oprali opsežno i podvrgnuti 75-minutnom OGD. ( a ) Stanična smrt utvrđena je 20 h kasnije DAPI bojenjem. ( b ) Neuronski ekstrakti su sakupljeni odmah nakon OGD-a i analizirani na p-CREB, p-AKT i aktiviranu kaspazu-3 Western blot-om. '*' označava P <0, 05 u usporedbi s kontrolom; '#' označava P <0, 05 u usporedbi s OGD skupinom

Slika pune veličine

Da bismo tražili izravne dokaze zašto ekstrasynaptička aktivacija nije uspjela izazvati smrt, stimulirali smo neurone u različitim koncentracijama NMDA nakon što su blokirali sinaptičke receptore. U neuronima koji su prethodno tretirani bicukulinom / MK801, NMDA pri 15 µM nije uzrokovala značajnu fosforilaciju CREB-a, AKT (slika 5a) i ERK1 / 2 (slika 5b), kao i Bdnf transkripciju (slika 5c). To je u skladu s rezultatom na slici 3a, koji pokazuje da 15 µM NMDA nije uspio značajno aktivirati ex-NMDAR i pokrenuti priliv Ca2 + . Aktivacija ex-NMDAR višim koncentracijama NMDA (na 20, 30, 40 ili 50 µM ) potaknula je ove signalne putove povezane sa preživljavanjem (slike 5a-c), bez aktiviranja kaspaze-3 (slika 5a) i oslobađanja laktatne dehidrogenaze ( Dopunska slika 6). Ovi rezultati daju molekularne mehanizme koji podržavaju da aktivacija ex-NMDAR-a sama nije dovoljna da uzrokuje smrt.

Image

Aktivacija ekstrasynaptic receptora potiče signalizaciju proživljavanja. DIV 14 neurona prvo su prethodno tretirani s bicukulanom i MK801 u trajanju od 2 minute ( a, b i c ) ili 15 μM NMDA i MK801 u trajanju od 3 minute ( d - i ), isprani i tretirani različitim dozama NMDA, kako je naznačeno 30 minuta ( a, b, h i i ) ili 60 min ( c ). Neposredno nakon tretmana NMDA, uzorci su prikupljeni i analizirani na razinu p-CREB ( a i h ), p-AKT ( a i h ), aktiviranu kaspazu-3 ( a ), p-ERK1 / 2 ( b ), i Bdnf transkripcija ( c ). Smrt neuronske stanice analizirana je 20 sati nakon NMDA tretmana bojenjem DAPI ( i ). ( d – g) Slika kalcijema pokazuje promjene Ca2 + i u neuronima koji su tretirani s 15 µM NMDA zajedno s MK801 tijekom 3 minute ( d ). Nakon 5-minutnog pranja naneseno je 15 µM NMDA ( e ), ili bicukulline ( f ), ili 50 µM NMDA ( g ) (što je naznačeno linijom za vrijeme nanošenja). Prikazani su tragovi kalcijema na pojedinim neuronima. Statističku razliku ( P <0, 05) otkrila je ANOVA za podatke u a i h . Različita slova označavaju različite SNK skupine s a, i a h . NS, nije značajno

Slika pune veličine

Budući da smo primijetili da bikukularni i 15 µM NMDA imali slične učinke na sudbinu stanica i unutarćelijsku signalizaciju, slijedili smo blokirane receptore koji su osjetljivi na 15 µM NMDA. Neuroni su prvo tretirani s 15 μM NMDA i MK801 (slika 5d). Naknadna primjena 15 µM NMDA (slika 5e) nije uspjela uzrokovati detekciju povišenja Ca 2+ i, što ukazuje da su receptori osjetljivi na 15 µM NMDA učinkovito blokirani. Iako naknadna primjena bicukulina nije uspjela izazvati priliv kalcija (slika 5f), naknadna primjena 50 μM MNDA učinila je (slika 5 g). Ovi podaci pokazuju da, nakon prethodne obrade s 15 μM NMDA i MK801, nije bilo dostupnog syn-NMDAR, a naknadna primjena 50 μM NMDA uglavnom je aktivirala ex-NMDAR. Nadalje, nakon 15 µM NMDA / MK801, naknadna primjena 50 µM (ali ne 15 µM ) NMDA uzrokovala je povećanje regulacije p-CREB i p-AKT (slika 5h) bez izazivanja značajne stanične smrti (slika 5i) i laktatne dehidrogenaze otpuštanje (dopunska slika 7). Zajedno, predlažemo da aktiviranje bilo syn- ili ex-NMDAR-a nije dovoljno za promicanje stanične smrti. Prebacivanje unutarćelijskog programa iz pro-preživljavanja u pro-smrt može zahtijevati određeni stupanj koaktivacije NMDAR na obje subcelijske lokacije.

Memantin blokira unutarćelijsku signalizaciju posredovanu ili sin- ili ex-NMDAR

Memantin, nekonkurentski antagonist NMDAR niskog afiniteta, korišten je za liječenje umjerene do teške Alzheimerove bolesti. 25 Neke elektrofiziološke pretrage implicirale su da memantin preferirano utječe na bivši NMDAR (Xia i sur. 26, ali također pogledajte Wroge i sur. 27 ), premda kako memantin utječe na unutarćelijsku signalizaciju povezanu s preživljavanjem i smrću ostaje nejasno. Da bismo testirali njegove učinke na syn-NMDAR-signalizaciju, liječili smo neurone bicukulanom u prisutnosti različitih koncentracija memantina. Memantin na 1 µM marginalno potisnut bicukullin-stimuliranim p-CREB (slika 6a). Fosforilacija CREB značajno je i potpuno blokirana memantinom od 10 i 100 μM. Slično tome, memantin je također blokirao porast p-CREB-a izazvanog 15 μM NMDA na način ovisan o koncentraciji (Slika 6b). Zatim smo otkrili da su memantin na 1 i 10 μM granični i djelomično blokirani p-CREB pokrenut ex-NMDAR, (Slika 6c). Memantin na 100 µM potpuno je blokirao p-CREB stimuliran ex-NMDAR aktivacijom (Slika 6c). Ovi podaci impliciraju da memantin neselektivno blokira i sinaptičke i ekstrasynaptičke receptore.

Image

Memantin blokira unutarćelijsku CREB signalizaciju posredovanu ili sin- ili ex-NMDAR. DIV 14 neurona stimulirani su s bicukullinom ( a ), ili 15 µM NMDA ( b ), ili 100 µM NMDA nakon 2-minutne obrade s bicuculline / MK801 ( c ). Memantin u različitim koncentracijama istovremeno se primjenjuje sa stimulansima. Trideset minuta nakon stimulacije, uzorci su prikupljeni, a razina p-CREB određena je Western blot-om. ( d ) Memantin blokira staničnu smrt posredovanu NMDAR-om na način ovisan o dozi. Različite doze memantina primjenjene su sa 100 µM NMDA tijekom 30 minuta. Dvadeset sati nakon uklanjanja NMDA, stanična smrt utvrđena je obojenjem DAPI. Statističku razliku ( P <0, 05) otkrila je ANOVA. Različita slova označavaju različite SNK skupine s

Slika pune veličine

Zatim smo istražili učinke istodobne blokade sinaptičkih i ekstrasynaptičkih receptora (tj. Memantinom) na ekscitotoksičnost ovisnu o NMDAR-u. Memantin na 1 µM lagano je smanjio smrt neurona izazvanu NMDA (72, 1 ± 5, 6% nasuprot 66, 2 ± 5, 1%, P <0, 05). Memantin na 10 µM je uvelike oslabio staničnu smrt (32, 4 ± 4, 2%), a 100 µ M memantin reducirao je staničnu smrt do kontrolne razine (5, 4 ± 2, 9 u odnosu na 4, 5 ± 3, 2% u kontroli) (Slika 6d). Ovi rezultati zajedno s podacima na slici 1 impliciraju da stupanj smrti uzrokovan NMDA-om ovisi o veličini koaktivacije NMDAR-a na obje subcelijske lokacije.

Privremena koaktivacija syn- i ex-NMDAR ne uzrokuje staničnu smrt

Utvrđeno je da OGD aktivira masovno oslobađanje glutamata i izaziva smrt prekomjernom aktivacijom NMDAR. Međutim, takve štete izazvane uvredom mogu ovisiti o trajanju OGD-a. Iako je 75-minutni OGD uzrokovao značajnu smrt (slika 4), kratkotrajni OGD tijekom 30 minuta nije učinio (Slika 7a). Intrigantno, 30-minutni OGD je regulirao aktivnost ERK1 / 2, CREB i AKT bez aktiviranja kaspaze-3 (slika 7b). Ovi podaci podržavaju važnost „kratkog terapijskog vremenskog razdoblja“ za liječenje ishemijskog zastoja, a također sugeriraju da kratkotrajna koaktivacija syn- i ex-NMDAR nije toksična. Zatim smo ispitali kako je kratkotrajna inkubacija s NMDA-om utjecala na smrt. Koristili smo 15 µM NMDA za preferencijalno aktiviranje syn-NMDA i 50 µM NMDA za koaktivaciju i sin-i ex-NMDAR. Kao što je prikazano na slikama 7c i e, 2- do 10-minutna stimulacija s 15 µM NMDA uzrokovala je značajnu p-CREB regulaciju. Međutim, iako kratka (2- do 4-minutna) stimulacija s 50 µM NMDA neregulisanog p-CREB-a, dulja stimulacija (više od 6 min) nije uspjela aktivirati CREB (Slike 7d i e). Kao što je prikazano na slici 1c, 30-minutna inkubacija sa 50 μM NMDA značajno je deaktivirala CREB. U skladu s tim, inkubacija s 50 μM NMDA tijekom 4 minute nije uzrokovala značajnu smrt, ali je trajala dulja inkubacija (Slika 7f). Produženjem trajanja uvrede NMDA na 60 min, 20 µM, ali ne i 15 µM, NMDA je počela deaktivirati CREB (dopunska slika 8). Dok je stimulacija s 20 µM NMDA tijekom 30 minuta uzrokovala blagu citotoksičnost (slika 1f), 24-satna stimulacija rezultirala je teškom staničnom smrću (dopunska slika 9). Ovi podaci govore da smrt ćelija posredovana NMDAR-om ovisi i o veličini i trajanju sinativacije sinaptičkih i ekstrasynaptičkih receptora.

Image

Kratkoročne uvrede s OGD ili NMDA s visokim dozama ne uzrokuju smrt stanica, već potaknu signalizaciju za preživljavanje. DIV 14 neurona podvrgnuti su 30-minutnom OGD ( a i b ), ili su obrađeni sa 15 ( c i e ) ili 50 µM NMDA ( d i e ) 2, 4, 6, 8 i 10 min. Uzorci su sakupljeni odmah nakon tretmana i ispitani na nivo p-ERK1 / 2, p-CREB, p-AKT i aktivirane kaspaze-3 ( b ), ili p-CREB ( c i d ). Kvantifikacija p-CREB nakon tretmana NMDA prikazana je u ( e ). Analiza ANOVA otkrila je značajnu razliku ( P <0, 05) između različitih skupina. Slova a1 i b1 (a1 a i f) Neuroni su isprani kulturom medija nakon tretmana OGD ili NMDA. Neuroni su obojeni s DAPI 20 sati kasnije, a stanice kondenziranim nuklearima su brojene da bi se utvrdila stanična smrt. Jednosmjerna ANOVA i post-hoc analiza SNK otkrila je značajnu razliku ( P <0, 05) među različitim skupinama s

Slika pune veličine

Aktivacija syn- i ex-NMDAR dovodi do preklapanja genskih odgovora

Iako su prethodne studije sugerirale da syn- i ex-NMDAR izaziva suprotstavljene učinke, naši podaci pokazali su da oboje potiču signalizaciju za preživljavanje i uključuju transkripciju CREB ciljnog gena Bdnf . Nadalje smo utvrdili kako su profili ekspresije širom genoma regulirani NMDAR na različitim mjestima. Upotrebom lažne stope otkrića od 25% kao praga, identificirali smo regulirane i regulirane gene iz Affymetrix GeneChip (Affymetrix, Santa Clara, Kalifornija, SAD) Rat Gene 1, 0 ST Arrays. Aktivacija syn-NMDAR-a regulirala je ekspresiju 226 gena i smanjila 750 gena (dopunska tablica 1). Nakon ex-NMDAR aktivacije, 29 gena je bilo regulirano, a četiri gena su regulirana (dopunska tablica 2). Zanimljivo je da je aktiviranje syn- i ex-NMDAR pokrenulo preklapanje, a ne suprotstavljanje genomskim odgovorima (slika 8a). Preko 60% gena koje je regulirao ex-NMDAR također je regulirano syn-NMDAR (Slike 8a i b). Dva gena su regulirana i sin- i ex-NMDAR (slika 8c). Podaci iz mikroračuna također su pokazali da je ekspresija Bdnf regulirana i od strane syn- i ex-NMDAR (slika 8b). TRANSFACT analiza koaktiviranih gena otkrila je da i sy- i ex-NMDAR mogu potaknuti transkripcijske faktore kao što su CREB, ATF, KROX, E2F i SRF (slika 8b).

Image

Aktivacija syn- i ex-NMDAR dovodi do preklapanja, ali ne i oprečnih genskih odgovora. Promjene u ekspresiji na razini genoma nakon aktivacije syn- ili ex-NMDAR ispitivane su korištenjem nizova Affymetrix GeneChip Rat Gene 1.0 ST. ( a ) Vennov dijagram koji prikazuje broj gena koji se preklapaju i koji su regulirani ili smanjeni od strane i sin- i ex-NMDAR. Neregulisani geni posredovani syn-NMDAR-om ne preklapaju se s reduciranim genima ex-NMDAR-om; downregulirani geni posredovani syn-NMDAR ne preklapaju se s neureguliranim genima ex-NMDAR. ( b ) Popis preklapajućih reguliranih gena i njihovi pretpostavljeni faktori transkripcije. ( c ) Popis preklapajućih reguliranih gena i njihovi pretpostavljeni faktori transkripcije

Slika pune veličine

Rasprava

Od otkrića sudjelovanja NMDAR u neurodegeneraciji, identificirani su brojni molekularni determinanti stanične smrti stimuliranjem neurona s NMDAR agonistima. Intrigantno, neuroni često ne pokazuju isti odgovor na različite koncentracije agonista. Chandler i sur. 18 je pokazalo da je NMDA pri 10 ili 20 µM povećala aktivnost ERK1 / 2, ali 100 µM NMDA je uzrokovalo smanjivanje regulacije. U skladu s dvosmjernom regulacijom molekule za preživljavanje ERK1 / 2, pokazali smo da je visoka, ali ne mala doza NMDA pokrenula staničnu smrt. Iako većina studija pretpostavlja da tretman NMDA kupelji ili glutamatom uzrokuje smrt aktivacijom ex-NMDAR, pružamo nove dokaze koji pokazuju da stupanj ekscitotoksičnosti posredovane NMDAR-om ovisi o veličini i trajanju syn- i ex-NMDAR koaktivacije.

Jedan nov i iznenađujući nalaz ove studije je da nismo pronašli očigledne uzročne učinke ex-NMDAR aktivacije na smrt. To je u suprotnosti s prevladavajućom hipotezom, naglašavajući da ex-NMDAR doprinosi ekscitotoksičnosti isključivanjem isključenja signala za preživljavanje. 7, 8, 28 Pažljivom kontrolom aktivacije NMDAR na različitim mjestima pokazali smo da blokiranje syn-NMDAR ablirajuće stanične smrti nakon visoke doze NMDA ili OGD. Podržavajući, nakon blokiranja syn-NMDAR, aktiviranje raspoloživog ex-NMDAR stimuliralo je ERK1 / 2-CREB- Bdnf pro-preživljavanje. To je u skladu s nedavnom studijom, koja je pokazala da 50 μM glutamat nije uspio izazvati smrt nakon tretmana s bicukulanom / MK801. 27 Prethodna studija također je pokazala da djelomična redukcija syn-NMDAR umanjuje smrt uzrokovanu OGD-om. 29 Nadalje, Gao i sur. 30 pokazuje da aktivnost ERK1 / 2 nije suzbijena ex-NMDAR aktivacijom. Činjenica da su nezreli neuroni u razvoju ili stanice mrežnice ganglion, koji uglavnom eksprimiraju ex-NMDAR, 12 16, 17, otporni su na staničnu smrt uzrokovanu NMDA ili glutamatom 13, 14, 15 u skladu je s našim zaključkom.

Važna podrška štetnoj ulozi ex-NMDAR-a je učinak preživljavanja memantina, za koji je otkriveno da preferira blokiranje ex-NMDAR-a. 26 Međutim, to se temelji na pretpostavci da primjena kupelji od 100 µM NMDA aktivira samo ex-NMDAR. Nedavno su Wroge i kolege 27 pokazali da memantin značajno oslabljuje trenutne posredovanje i od strane syn- i ex-NMDAR-a. Pokazujemo da memantin i u malim (npr. 1 ili 10 μM ) i visokim dozama (npr. 100 μM ) blokira CREB aktivaciju posredovanu ili syn- ili ex-NMDAR. Njegovi učinci na syn-NMDAR konzistentni su s prethodnim izvještajima, pokazujući da memantin djelomično inhibira indukciju LTP-a i učenja, koji ovise o syn-NMDAR funkciji. 31 Budući da istovremeno blokiranje syn- i ex-NMDAR memantinskom suzbijanom ekscitotoksičnosti ovisi o dozi, zaključujemo da veličina koaktivacije ovih receptora određuje stupanj umiranja stanica.

Iako smo pokazali da syn-NMDAR aktivacija nije uzrokovala smrt, ne možemo isključiti štetne učinke syn-NMDAR prekomjerne aktivacije u nekim ekstremnim uvjetima. Na primjer, blokiranje uklanjanja sinaptički oslobođenog glutamata TBOA (inhibitorom transportera glutamata) pretjeruje s hipoksičnom ekscitotoksičnom smrću. 27 U kokulturama koje sadrže 95% neurona i 5% glija, promicanje preokreta unosa glutamata uzrokuje značajnu staničnu smrt putem syn-NMDAR aktivacije. 32

Drugi važan nalaz ove studije je da ćelijska smrt posredovana NMDAR-om također ovisi o trajanju ko-aktivacije syn- i ex-NMDAR. Kratkoročno OGD ili kratko izlaganje ekscitotoksičnoj dozi NMDA nije bilo djelotvorno da uzrokuje smrt. Umjesto toga, kratkotrajna koaktivacija syn- i ex-NMDAR pokrenula je reakcije pro-preživljavanja. Jedna je mogućnost da ove kratke uvrede ne dovedu do potpune koaktivacije syn- i ex-NMDAR-a. Slike 3b-d pokazuju da je porast Ca2 + i potaknut ex-NMDAR aktivacijom bio postupan, a ne tako brz kao onaj pokrenut globalnom NMDAR aktivacijom (Slike 1g – k). Značajna komponenta takvog postupnog porasta dogodila se u 5–10 min, nakon primjene 20, 40 i 50 µM NMDA (na što ukazuju sive strelice na slikama 3b-d). Postepeno povišenje Ca 2+ i perzistiralo je do 30 min nakon primjene 50 μM NMDA (slika 3d). To implicira da bivši NMDAR mogu biti sporo reagirajući receptori, čija bi puna aktivacija mogla trebati produljenu izloženost ligandu. Stoga, kada su dostupni i sinaptički i ekstrasynaptički receptori, OGD ili inkubacija u kupki s visokim NMDA (npr. 50 μM ) može najprije brzo aktivirati sinaptičke receptore zajedno s malom populacijom bivših NMDAR-a, a zatim postupno aktivirati sve veći broj ex-NMDAR-a. NMDAR. Takva značajka ex-NMDAR-a može pomoći neuronima da pobjegnu od smrti tijekom sub-oštećenja i kratkoročnih uvreda.

Iako je bilo pokušaja da se utvrdi kako programiranje čitavog genoma reagira na aktivaciju NMDAR, ovo je prvo istraživanje mikroarkija koje izolira ulogu syn- i ex-NMDAR. Studija Hong i suradnika 33 ispitala je ograničeni broj gena (tj. 1152) pomoću prilagođenog mikroračunanja. Postoji minimalno preklapanje genskih promjena u usporedbi njihovog ispitivanja s našim, možda zato što su oni uglavnom ispitivali kasne reakcije do 24 sata nakon NMDA stimulacije. Druga studija Zhang i sur. 34 uspoređuje rane genomske promjene potaknute bicukulanom i 20 µM glutamata, koji isključuju samo CREB bez izazivanja akutne nekroze. Korištenjem različitog neuronskog tipa (tj. Hipokampalnih neurona), Zhang i sur. 34 su pronašli suprotstavljene učinke bicukullina i 20 μM glutamata na transkripcijske odgovore. Međutim, studija je također otkrila da se značajne količine promjena koje su potaknule 20 µM glutamata (53/106 regulisanih gena i 10/51 regulisanih gena) preklapaju s onima koje pokreću bicukulline. Ovdje jasno pokazujemo da aktiviranje syn- i ex-NMDAR nije dovelo do suprotstavljenih genskih odgovora. Preklapanje u ekspresijskim promjenama bilo je značajno, u skladu s tim syn- i ex-NMDAR i aktiviranim CREB signalizacijom i određenim CREB ciljanim genima.

Otkrili smo da syn-NMDAR pokreće promjene u značajno više gena od ex-NMDAR. To je u skladu s tim, u usporedbi sa širim funkcijama mozga koje posreduje syn-NMDAR, ex-NMDAR ima ograničene uloge. Određene fiziološke funkcije ex-NMDAR-a uključuju se u pojačavanje sinaptičke signalizacije i vremenske koordinacije sinaptičkog paljenja. 10, 11 Ex-NMDAR može poslužiti i kao rezerva za bočno uključivanje ovisno o aktivnosti u sinapse. 35, 36 Različiti genomske reakcije koje pokreću syn- i ex-NMDAR mogu se pripisati razlici u gustoći receptora i regulatornom svojstvu. Na primjer, sin- i ex-NMDAR različito se reguliraju fosforilacijom kalcija i tirozina. 12 Diferencijalna interakcija s mrežom skela i sastavom recepcijske podjedinice, zajedno s različitim varijantama spajanja, može dovesti do izrazite povezanosti s različitim unutarćelijskim kaskadama. 37, 38 Stanične i molekularne determinanti zahtijevaju daljnje istraživanje.

Materijali i metode

Primarna neuronska kultura

Primarni kortikalni neuroni dobiveni su od postnatalnog dana 0 štakora Sprague Dawley, kao što je prethodno opisano. 39 Institucionalni odbor za njegu i upotrebu životinja na Michigan State University odobrio je postupke korištene u ovoj studiji. Kulture su održavane u Neurobasal A, dodatku 1 × B27 (Invitrogen, Carlsbad, Kalifornija, SAD), 100 jedinica / ml penicilina, 0, 1 mg / ml streptomicina i 0, 5 mM glutamina. Trećina medija punila se svaka 3 dana tijekom kultiviranja. Neuroni na DIV (dani in vitro ) 14 korišteni su za eksperimente.

Neuronska stimulacija

Sve stimulacije izvršene su nakon 30-minutne obrade s 20 µM CNQX (Sigma, St Louis, MO, SAD) i 5 µM nifedipinom (Sigma), koji blokiraju glutamatne receptore koji nisu tipa NMDA i napon L-tipa. kalcijevi kanali od zatvorenih vrata. NMDAR koagonistički glicin (2 μM) primijenjen je sa stimulansima. Da bi se postigla globalna aktivacija NMDAR-a, neuroni su stimulirani s NMDA u različitim koncentracijama (kako je naznačeno). Da bi se stimulirao syn-NMDAR, primijenjeno je 50 µM bikukulina. Kako bi stimulirali ex-NMDAR, neuroni su prvo tretirani s 50 µM bicukularom i 10 µM MK801 u trajanju od 2 minute, isprani tri puta prethodno zagrijanim kondicioniranim medijem, te zatim inkubirani u kondicioniranom mediju s 50 µM NMDA (ili u drugim koncentracijama kako je naznačeno ). Svi su lijekovi primijenjeni izravno na medij, a neuroni su održavani na 37 ° C sa 5% CO2 tijekom svih tretmana.

Western blot i kvantifikacija

Nakon stimulacije (30 min ili kako je naznačeno), uzorci su sakupljeni u 60 μl pufera SDS uzorka (10 mM Tris-HCl pufer, pH 6, 8, 10% glicerol, 2% natrijev dodecilsulfat, 0, 01% bromofenol plava i 5% β - merkaptoetanol) i kuhana na 100 ° C 10 min. Ekstrakti (od oko 8 × 105 stanica) su odvojeni sa 10% SDS-PAGE, preneseni u nitrocelulozne membrane i blokirani s 5% nemasnog mlijeka u PBS-T (PBS, 0, 1% Triton X-100) 30 min na sobnoj temperaturi. Membrane su zatim inkubirane s primarnim antitijelima protiv fosforiliranog ERK1 / 2 (p-ERK1 / 2; 1: 1000; Cell Signaling Technology, Beverly, MA, USA), fosforiliranim CREB (p-CREB u Ser133; 1: 1000; Upstate, Lake Placid, NY, USA), fosforilirani AKT (p-AKT kod Ser473; 1: 1000; stanična signalizacija) i cijepljena kaspaza-3 (1: 1000, stanična signalizacija) u PBS-T preko noći na 4 ° C. Nakon opsežnog ispiranja i inkubacije s kozjim peroksidaza konjugiranim antitijelima od zeca (1: 5000; Pierce, Rockford, IL, SAD), signali su detektirani hemiluminiscencijskom metodom (SuperSignal West Pico, Pierce, Rockford, IL, SAD), U svrhu normalizacije, membrane su oduzete i ponovno ispitivane protutijela protiv p- aktina (1: 10.000; Sigma, St Louis, MO, SAD). Za dobivanje signala u linearnom rasponu korišteno je nekoliko vremena ekspozicije. Zavoji su kvantificirani korištenjem softvera Scion Image Beta 4.0.2 (Scion Corp. Frederick, dr. Med.).

Polkvantitativni RT-PCR

Za mjerenje transkripcije Bdnf egsona, stimulirane agonistom , kontrolni i stimulirani neuroni su lizirani, a ukupna RNA je pročišćena pomoću TRIzol metode (Invitrogen). CDNA je sintetizirana iz 0, 5 μg ukupne RNA uporabom kompleta za obrnutu transkripciju (SuperScript, Invitrogen) i podvrgnuta PCR-u. Primeri koji se koriste za mRNA koja sadrži ekson 4 sadrži Bdnf: 5 '-CTCCGCCATGCAATTTCCAC-3' (naprijed) i 5 '-GCCTTCATGCAACCGAAGTA-3' (obrnuto). Ovi su prajmeri proizveli PCR proizvod od 274 bp. PCR amplifikacija GAPDH upotrebom 5'-TCCATGACAACTTTGGCATTGTGG-3 'i 5'-GTTGCTGTTGAAGTCGCAGGAGAC-3 'korištena je kao unutarnja kontrola. Broj ciklusa za Bdnf exon 4 i GAPDH bio je 26, odnosno 20. Polkvantitativni RT-PCR proizvodi analizirani su agaroznom elektroforezom i kvantitativno utvrđeni softverom Scion Image.

Kalcijeva slika uzgajanih neurona

Povišenje Ca2 + i potaknuto NMDAR aktivacijom određeno je snimanjem kalcija u živim neuronima. Nakon inkubacije s fura-2 AM (3 μM ) tijekom 30 minuta, kulture su smještene u perfuzijsku komoru postavljenu na invertirani mikroskop Nikon Eclipse TE-2000U (Nikon Instruments, Inc. Melville, NY, SAD). Kulture su zatim natopljene puferiranom otopinom (147 mM NaCl, 5, 3 mM KCl, 1 mM MgCl 2, 2 mM CaCl 2, 10 mM HEPES, 26, 1 mM NaHCO 3, 0, 5 mM natrijevog piruvata i 30 mM glukoze) koja sadrži CNQX i nifedipin na 32–34 ° C za uklanjanje izvanstanične boje. Brzina protoka perfuzije bila je 1-2 ml / min. Pojedinačni neuron je praćen tijekom stimulacije s NMDA ili bicukulanom, zajedno s glicinom, CNQX-om i nifedipinom. Osvjetljenje je osiguralo brzi valni duljni prekidač Sutter DG-5, a fluorescentne slike stečene su CCD uređajem Roper Coolsnap Cascade 512B ohlađenim (Photometrics, Tucson, AZ, SAD). Razine Ca 2+ i izračunate su iz omjera korekcije pozadine korigirane fura-2 (520 nm) pri dvije valne duljine pobude (340 i 380 nm). Za prikupljanje i analizu slike korišten je Metamorph / Metafluor.

Analiza NMDAR posredovane stanične smrti

Neurone su stimulirali NMDA (koncentracije kao što je naznačeno) ili bicukullin zajedno s glicinom, CNQX i nifedipinom tijekom 30 minuta (ili kako je naznačeno). Zatim je otopina zamijenjena toplim kondicioniranim medijem koji sadrži 1 μM MK801, što je spriječilo dodatnu smrt neurona zbog prekomjernog oslobađanja glutamata iz mrtvih neurona. Neuroni su fiksirani s 4% paraformaldehida 20 h nakon 30 min NMDA ili bicukullinom tretmanom i obojeni s DAPI (1 µg / ml). Slike su snimljene pomoću invertiranog Nikon fluorescentnog mikroskopa (Nikon Instruments, Inc. Melville, NY, USA). Ravnomjerno obojena jezgra ocijenjena su kao zdravi održivi neuroni, dok su jezgra sa kondenziranim obojenjem korištena kao pokazatelj za staničnu smrt. Broj neurona je izračunat u šest nasumično izabranih polja po jažici (ukupno oko 120–180 neurona), a ispitane su i dvije jažice po stanju iz tri odvojena pokusa.

OGD-inducirana smrt stanica

OGD-inducirana stanična smrt korištena je kao model staničnog ishemijskog udara kao što je prethodno opisano. 24 Prvo je medij za kulturu zamijenjen otopinom bez glukoze (147 mM NaCl, 5, 3 mM KCl, 1 mM MgCl 2, 2 mM CaCl 2, 10 mM HEPES, 26, 1 mM NaHCO 3, 0, 5 mM natrijevog piruvata). Zatim je neuronska kultura stavljena u komoru hipoksije (Billups-Rothenberg, Inc., Del Mar, Kalifornija, SAD) koja je opskrbljena sa 95% N2 i 5% CO2 na 37 ° C. OGD je okončan uklanjanjem kulture iz komore hipoksije i zamjenom pufera bez glukoze sa miješanim medijem (1: 1 mješavina svježeg i kondicioniranog medija s 1 μM MK801). Stanična smrt utvrđena je obojenjem DAPI 20 h nakon OGD.

Analiza mikrorasta

Za određivanje promjena u ekspresiji cijelog genoma nakon aktivacije syn- ili ex-NMDAR korišteni su nizovi Affymetrix GeneChip Rat Gene 1.0 ST. Ukupna RNA ekstrahirana je 2 sata nakon nosača (kontrola za syn-NMDAR skupinu, n = 3), bicukullina (syn-NMDAR grupa, n = 3), bicukullina plus MK801 (kontrola za bivšu NMDAR skupinu, n = 6), i bicukularan plus MK801, nakon čega slijedi 50 μM NMDA (ex-NMDAR grupa, n = 5) tretman, i korišten je za analizu mikroračunanja.

Analiza podataka

Podaci (prikazani kao prosjek ± SEM) analizirani su jednosmjernom ANOVA-om i post-hoc student-newman-keuls (SNK) za višestruku usporedbu. Student-ov t- test korišten je za procjenu važnosti između dvije skupine.

Dodatna informacija

Datoteke slika

  1. 1.

    Dopunska slika 1

  2. 2.

    Dopunska slika 2

  3. 3.

    Dopunska slika 3

  4. 4.

    Dopunska slika 4

  5. 5.

    Dopunska slika 5

  6. 6.

    Dopunska slika 6

  7. 7.

    Dopunska slika 7

  8. 8.

    Dopunska slika 8

  9. 9.

    Dopunska slika 9

Excel datoteke

  1. 1.

    Dopunska tablica 1

  2. 2.

    Dopunska tablica 2

Word dokumenti

  1. 1.

    Dopunske figure i tablice Legenda

Glosar

BDNF

moždani neurotrofni faktor

CREB

protein koji veže elemente za cAMP

ERK 1/2

izvanstanične signalno regulirane kinaze ½

omata

N-metil-D -aspartatni receptor

OGD

nedostatak glukoze i kisika

Dodatne informacije nalaze se u ovom radu na web stranici Cell Death and Disease (//www.nature.com/cddis)