Nogo-c regulira apoptozu kardiomiocita tijekom mišjeg infarkta miokarda | stanična smrt i bolest

Nogo-c regulira apoptozu kardiomiocita tijekom mišjeg infarkta miokarda | stanična smrt i bolest

Anonim

teme

  • apoptoza
  • Stanična signalizacija
  • ishemija
  • Infarkt miokarda

Sažetak

Infarkt miokarda nastaje zbog nedovoljne koronarne opskrbe krvlju, što dovodi do oštećenja miokarda i na kraju zatajenja srca. Molekularni mehanizmi povezani s gubitkom kardiomiocita tijekom infarkta miokarda (MI) i srčanih bolesti povezanih s ishemijom još uvijek nisu u potpunosti razjašnjeni. Nogo-C je protein endoplazmatskog retikuluma koji se sveprisutno eksprimira u tkivima, uključujući u srcu, međutim, srčana funkcija Nogo-C još uvijek nije poznata. U ovoj studiji otkrili smo da je Nogo-C bio reguliran u mišjim srcima nakon MI, a hipoksični tretmani također su povećali razinu proteina Nogo-C u kardiomiocitima. Prekomjerna ekspresija Nogo-C posredovana adenovirusom dovela je do kardiomiocitne apoptoze, dok je oborenje Nogo-c shRNA-kardiomiocitima zaštićeno od stanične apoptoze izazvane hipoksijom. Važno je da su nogo-C nokaut-miševi pokazali poboljšanu srčanu funkciju, manje infarktno područje i manje apoptotičkih stanica nakon MI. Nadalje, otkrili smo da miR-182 negativno regulira ekspresiju Nogo-C i da je snižen tijekom MI, izražavajući miR-182 u kardiomiocitima zaštićenim hipoksijom i nogo-C posredovanom apoptozom stanica. Naši rezultati pokazuju da je povećana srčana ekspresija Nogo-C dovoljna i potrebna za ishemiju izazvanu kardiomiocitnu apoptozu i srčanu disfunkciju, što sugerira da deregulacija Nogo-C miRNA može biti potencijalni terapeutski cilj za srčane bolesti povezane s ishemijom.

Glavni

Infarkt miokarda (MI) uzrokuje oštećenje miokarda i na kraju dovodi do zatajenja srca, vodećeg uzroka smrti u svijetu. 1, 2 MI karakterizira nedovoljna koronarna opskrba krvlju, a produljena ishemija tijekom MI uzrokuje gubitak kardiomiocita zbog apoptoze i nekroze. 3 Iako su prijavljeni različiti signalni putevi koji su uključeni u apoptozu kardiomiocita, uključujući reaktivne kisikove vrste (ROS), protein kinazu C, MAPK i nuklearni faktor kB, 4, 5, 6, 7, molekularni mehanizmi povezani s MI i ishemijom povezanim srcem bolesti još nisu u potpunosti shvaćene.

Proteini inhibitora rasta neurita (Nogo) pripadaju familiji proteina retikulona, ​​za koju je karakterističan motiv ciljanja endoplazmatskog retikuluma na karboksi terminalu. 8 Nogo gen kodira tri spojne izoforme, Nogo-A, Nogo-B i Nogo-C. Nogo-A je membranski protein koji se eksprimira uglavnom u središnjem živčanom sustavu poput oligodendrocita i neurona, a služi kao faktor inhibicije rasta i ograničava ponovno proširenje aksona. 9, 10 Nedavno je Nogo-A također pronađen kao važan negativni regulator razvojne angiogeneze u središnjem živčanom sustavu. 11 Nogo-B je kraća izoforma od Nogo-A, izražena sveprisutno u tijelu. 12 U perifernom živčanom sustavu, Nogo-B se eksprimira u Schwannovim stanicama, a interakcija Nogo-B i njegovog receptora na neuronima posreduje aksonsko grananje, što ukazuje na ulogu u pretjeranom klijanju aksona nakon ozljede perifernog živca. 13 U perifernim krvnim žilama, Nogo-B regulira migraciju endotelnih stanica tako što posreduje vaskularno preuređivanje nakon lezija. 14 A kod bolesnika s plućnom arterijskom hipertenzijom, Nogo-B se povećava i uzrokuje preveliku proliferaciju glatkih mišićnih stanica pluća zbog supresije apoptoze stanica. 15 Unatoč ovim važnim funkcijama in vitro studija, nogo-A ili Nogo-B knockout miš pokazuje relativno normalne fenotipe. 16 Nogo-C je najkraći protein u obitelji Nogo, a izražava se u mnogim tkivima, uključujući jetru, neuron, vaskularne stanice glatkih mišića, skeletne mišiće i srce. 17 Kod transgeničnih miševa koji izražavaju Nogo-C u Schwannovim stanicama, ozljeda išijatskog živca uzrokuje kasne regeneracije aksona i smanjeni oporavak motoričkih funkcija. 18 U karcinomu jetre, razina proteina Nogo-C negativno je povezana s veličinom i prognozom tumora. 19, 20 Međutim, uloga proteina Nogo-C u srčanoj patogenezi nije istražena.

Budući da je za Nogo proteine ​​objavljeno da posreduju više ćelijsku apoptozu, 21, 22, 23, a apoptoza je uobičajena značajka srčanog infarkta, tada pretpostavljamo da Nogo-C može imati ulogu u posredovanju apoptoze kardiomiocita tijekom srčanog infarkta. U ovom istraživanju, koristeći kombinaciju in vitro i in vivo pristupa, istraživali smo ulogu Nogo-C u MI i ishemijskih kardiomiocita. Pronašli smo neregulisanu razinu proteina Nogo-C u MI srčanim tkivima i hipoksičnim kardiomiocitima. Izbrisanjem Nogo-C sačuvane su srčane funkcije nakon MI. Naša studija prvi put daje dokaze in vivo da Nogo-C ima glavnu ulogu u regulaciji srčane funkcije i može poslužiti kao potencijalni terapijski cilj za kliničko liječenje MI.

Rezultati

Ekspresija nogo-C pojačana je u MI srca i hipoksičnim kardiomiocitima

Nogo-C se sveprisutnije eksprimira u mišjim tkivima, uključujući srce, što je naznačeno njegovom shemom izraza (podaci nisu prikazani). Da bismo razumjeli patološku ulogu Nogo-C u srcu, provjerili smo razinu ekspresije u MI. Imunohistokemijsko bojenje Nogo-C antitijelom pokazalo je da je Nogo-C reguliran u graničnoj zoni infarkta 24 sata nakon LAD (slika 1a). Rezultat Western blot-a potvrdio je porast razine proteina Nogo-C u graničnoj zoni MI, na što ukazuje 2, 3-puta povećanje mišjeg srca MI, nego kod lažne kontrole (Slika 1b). Zatim smo testirali je li hipoksija potaknula razinu proteina Nogo-C u kultiviranim neonatalnim kardiomiocitima pomoću dva pristupa. Prvo smo liječili kardiomiocite CoCl2, spojem koji se obično koristi kao induktor hipoksije zbog njegove uloge u induciranju i stabiliziranju faktora 1 α (HIF-1a) koji inducira hipoksiju. CoCl 2 (600 µM tijekom 24 h) uzrokovao je porast razine proteina Nogo-C na 3, 2 puta više nego u kontrolnim stanicama nosača (slika 1c). Zatim smo kultivirali kardiomiocite u hipoksičnom inkubatoru s plinom koji sadrži 94% N2, 1% O2 i 5% CO 2 tijekom 12 sati, i otkrili smo da liječenje hipoksije također povećava Nogo-C do 3, 3 puta u usporedbi s kardiomiocitima uzgojenim u normoksiji (Slika 1d). Zajedno, ovi rezultati pokazali su da se protein Nogo-C mijenjao tijekom hipoksije ili MI, što sugerira da Nogo-C može imati ulogu u patogenezi srčanih bolesti povezanih s hipoksijom.

Image

Nogo-C je reguliran u MI srcima i hipoksičnim kardiomiocitima. ( a ) Bojenje hematoksilinom / eozinom i imunohistokemijskim bojenjem Nogo-C lakom i MI mišjih srca, bojenje IgG kao kontrolom. ( b ) Western blot i prosječni podaci koji pokazuju razinu proteina Nogo-C u lažnim i MI mišjim srcima 24 sata nakon operacije. n = 6–7 miševa. ( c ) i ( d ) Razine proteina nogo-C u neonatalnim kardiomiocitima štakora, koje su 24 h ( c ) tretirane CoCl 2 (600 µM ) ili inkubacijom hipoksije (1% O2), tijekom 12 h ( d ). n = 6 neovisnih pokusa. * P <0, 05 nasuprot lažnoj skupini ili kontrolnim stanicama

Slika pune veličine

Kardiomiocitoza izazvana nogo-C apoptozom

Zatim smo istražili je li promjena funkcije kardiomiocita posredovane proteinom Nogo-C. Transfekcija neonatalnih kardiomiocita štakora s adenovirusom koji sadrži Nogo-C cDNA (Ad-Nogo-C) uzrokovala je povećanu staničnu razinu Nogo-C proteina (Slika 2a). Prekomjerna ekspresija nogo-C povećane apoptoze kardiomiocita, što pokazuje ispitivanje protočne citometrije, s LR (LR kvadrant označava postotak ranih apoptotičkih stanica na obojenim stanicama Alexa 488) od 17, 53 ± 3, 085% u stanicama koje eksprimiraju Ad-Nogo-C i 6, 4 ± 1, 112% u vektorskim kontrolnim stanicama, i UR (UR kvadrant označava postotak stanica kasnih apoptotskih stanica na Alexa 488 i stanice obojene propidijum jodidom) od 9, 982 ± 1, 045% u stanicama Ad-Nogo-C i 7, 373 ± 1, 134% u kontroli (Slika 2b). Apoptotski učinak Nogo-C na kardiomiocite potvrđen je i TUNEL-om bojenja, s 2, 2 puta povećanom apoptotičkom brzinom u adeno-Nogo-C stanicama u odnosu na kontrolne stanice (Slika 2c). Stoga, naši rezultati sugeriraju da je Nogo-C dovoljan da inducira apoptozu kardiomiocita.

Image

Nogo-C regulira apoptozu kardiomiocita. ( a ) Western blot koji pokazuje razinu proteina Nogo-C u neonatalnim kardiomiocitima štakora transficiranim s Ad-Nogo-C na 50 MOI ili Ad-laz u trajanju od 48 h. n = 3 neovisna pokusa. ( b ) Analiza protočne citometrije i ( c ) bojenje TUNEL-om koji pokazuje apoptotičke stope neonatalnih kardiomiocita štakora transficiranih Ad-Nogo-C ili Ad-lazom. n = 3 neovisna eksperimenta za analizu protočne citometrije; i n = 6 neovisnih pokusa za TUNEL bojenje. Linija skale = 25 μ m. ( d ) Western blot koji pokazuje razinu nogo-C proteina u novorođenim kardiomiocitima štakora transficiranim s Ad-sh-Nogo-C na 50 MOI ili Ad-scramble u trajanju od 48 h. n = 3 neovisna pokusa. ( e ) Analiza protočne citometrije i ( f ) bojenje TUNEL-om koji pokazuje apoptotske stope neonatalnih kardiomiocita štakora zaraženih Ad-sh-Nogo-C ili Ad-scramble kao odgovor na stimulaciju CoCl 2 (600 µM ). n = 6 neovisnih pokusa. Linija skale = 25 μ m. * P <0, 05 nasuprot kontrolnim stanicama kodiranja. # P <0, 05 nasuprot kodriranju + CoCl2 stanice

Slika pune veličine

Zatim smo istražili može li smanjena razina proteina Nogo-C zaštititi kardiomiocite od apoptotskih podražaja inficiranjem kardiomiocita adenovirusom koji sadrži Nogo-C RNA kratku dlaku (shRNA) (Ad-sh-Nogo-C) do uništavanja proteina Nogo-C (Slika 2d), Analiza protočne citometrije pokazala je da je nogo-C padom zaštićena apoptoza kardiomiocita inducirana CoCl2, od 12, 61 ± 3, 44% do 6, 103 ± 1, 166% (LR) i 13, 21 ± 2, 47% do 7, 315 ± 1, 637% (UR) (Slika 2e). Slično tome, bojanje na TUNEL pokazalo je da oborenje Nogo-C smanjuje kardiomiocitnu apoptozu izazvanu CoCl 2 s 25, 8% na 13, 3% (Slika 2f). Svi naši rezultati pokazali su da je Nogo-C dovoljan i potreban za apoptozu kardiomiocita.

Izbacivanje Nogo-C zaštićenih miševa od srčane disfunkcije izazvane MI

Da bismo razumjeli in vivo funkciju Nogo-C, generirali smo Nogo-C - / - miševe tehnikom TALEN za brisanje Nogo-C specifičnog egsona 1c (slike 3a i b). U osnovi, omjeri srčane mase prema tjelesnoj težini i težini srca prema duljini tibije u miševa Nogo-C - / - slični su onima u kontrolnih miševa u dobi od 8 tjedana (slika 3c). Također, unutarnji promjer lijeve klijetke (LVID) / debljina stražnje stijenke lijeve komore (LVPW) nije pokazao razliku između Nogo-C - / - i kontrolnih miševa (Slika 3d). Područje kardiomiocita obojenjem hematoksilinom / eozinom i ultra-struktura tansmisijskim elektronskim mikroskopom slični su u srcima Nogo-C - / - i kontrolnih miševa (slike 3e i f). Štoviše, nogo-C nokaut nije promijenio srčanu funkciju kao što je otkriveno ehokardiografijom (tablica 1) i elektrokardiografskom analizom (slika 3 g). Ovi podaci sugeriraju da brisanje Nogo-C ne utječe na morfologiju srca i funkcioniranje u bazalnim uvjetima.

Image

Generacija i karakterizacija Nogo-C Knockout miša. ( a ) Shematski dijagram konstrukcije miša Nogo-C - / - mišem TALEN tehnikom. ( b ) Western blot pokazuje razinu proteina Nogo-C u srcima divljih vrsta i miševa Nogo-C - / - . ( c ) Omjer težine srca prema tjelesnoj težini (lijevo) i omjer dužine i težine tibije srca (HW / TL) (desno) 8-tjednih mužjaka WT i Nogo-C - / - miševa. n = 11 miševa. ( d ) Bojenje hematoksilinom i eozinom, koje prikazuju komore srca 8-tjednih muških WT i Nogo-C - / - miševa (lijevo), i dijastole LVID prema LVPW omjeru (desno). Linija skale = 0, 5 cm. n = 6. ( e ) Slika presjeka 8-tjednih muških WT i Nogo-C - / - srčanih mišića bojenjem hematoksilinom i eozinom (lijevo) i prosječnim podacima (desno). WT, n = 70 stanica (od 4 miševa); Nogo-C - / -, n = 63 stanice (od 5 miševa). Povećala: 400X. ( f ) Reprezentativne TEM slike 8-tjedna muškog WT i Nogo-C - / - miša srca. Linija mjerila = 0, 5 μ m. ( g ) Elektrokardiografske slike muških 8 tjedana WT i Nogo-C - / - miševa (lijevo) i statistički podaci za P-amptitude, PR-interval i QT-interval (desno). n = 4–5 miševa

Slika pune veličine

Tablica pune veličine

Zatim smo istražili mogući utjecaj nedostatka Nogo-C na srčanu funkciju tijekom MI. Iako je analiza ehokardiografije pokazala u velikoj mjeri smanjenu frakciju izbacivanja (EF) i promjenu frakcijske površine (FAC) kod kontrolnih miševa nakon MI (EF: 67, 26 ± 3, 148% naspram 23, 51 ± 3, 694%, FAC: 50, 9 ± 2, 992% naspram 15, 44 ± 2, 338%, prije i nakon MI), nogo-C nokautom značajno je poboljšana srčana funkcija nakon MI na 44, 61 ± 4, 164% (EF) i 30, 49 ± 2, 77% (FAC) (slika 4a). Infarktna veličina (miša) srca miša Nogo-C - / - također se smanjila u usporedbi s divljim psima poslije MI (Slika 4b). Razine laktatne dehidrogenaze (LDH) u mišjem serumu Nogo-C - / - nakon MI rezervirane su za usporedbu s povećanim razinama kontrolnih legla nakon MI (1004 ± 76, 79 u Nogo-C - / - mišu u odnosu na 1740 ± 289, 9 u kontrolnih miša nakon MI) (slika 4c), što ukazuje da nokaut nogo-C ima zaštitni učinak na ozljedu srca izazvanu MI. Nadalje smo ispitali kardiomiocitnu apoptozu obojenjem TUNEL-om nakon MI i otkrili da nogo-C nokautom štiti apoptozu kardiomiocita, od 10, 64 ± 2, 25% u kontrolnim srcima nakon MI do 2, 907 ± 1, 163% u srcima Nogo-C - / - (Slika 4d). Skupno, ovi podaci podržavaju zaštitnu ulogu nogo-C nokautom od oštećenja srca izazvanog MI.

Image

Nogo-C nokaut štiti srce miša od ozljede MI. ( a ) Tipičan primjer M-načina ehokardiograma divljih vrsta i Nogo-C - / - miša srca s (MI) ili bez (lažne) LAD ligacije u trajanju od 24 sata (lijevo), te prosječni podaci EF (srednji) i FAC ( pravo). n = 6 miševa za svaku skupinu. * P <0, 05 nasuprot lažnim divljim miševima; # P <0, 05 nasuprot MI miševima divljih vrsta. ( b ) Reprezentativni trifeniltetrazolijev klorid (TTC) koji obaruje slike sekvencijalnih srčanih rezova (lijevo) i prosječne podatke veličine TTC infarkta (desno) WT i Nogo-C - / - miševa nakon LAD ligacije tijekom 24 sata. n = 4 miševa, * P <0, 05 nasuprot divljim miševima. ( c ) Serumske LDH aktivnosti divljih vrsta i Nogo-C - / - miševi sa ili bez LAD ligacije tijekom 24 sata. n = 5–11 miševa. * P <0, 05 nasuprot WT srama; # P <0, 05 nasuprot WT MI. ( d ) Bojenje TUNEL-om koje pokazuje apoptotičke stanice u graničnom dijelu MI od WT i Nogo-C - / - srca miša 24 sata nakon LAD ligacije (lijevo) i prosječne podatke (desno). n = 4 miševa. Linija skale = 25 μ m. * P <0, 05 nasuprot divljim vrstama miševa

Slika pune veličine

MiR-182 negativno regulirao ekspresiju Nogo-C tijekom MI

MiRNA imaju kritičnu ulogu u srčanim patološkim procesima. U ovom istraživanju pokušali smo identificirati moguću miRNA koja regulira ekspresiju gena Nogo-C tijekom MI. Analizom silikona predviđa se da miR-182 cilja 3 'neprevedena regija (3'UTR) Nogo-C (slika 5a). Važno je da je ekspresija miR-182 značajno smanjena u srcu tijekom MI (slika 5b) ili u kardiomiocitima tretiranim CoCl2 (slika 5c). Prekomjerna ekspresija miR-182 dramatično je smanjila ekspresiju Nogo-C proteina u kardiomiocitima (Slike 5d i e). Pored toga, miR-182 smanjio je nogo-C3'-UTR luciferaznu reportersku aktivnost (slika 5f), što dalje potvrđuje da je Nogo-C ciljni gen miRNA-182.

Image

miR-182 regulira ekspresiju Nogo-C. ( a ) Analiza Nogo-C 3'UTR regije predviđa miR-182 kao regulator. PCR podaci koji pokazuju ekspresiju miR-182 u MI srcima ( b ) ili kardiomiocitima tretiranim CoCl2 ( c ). ( d ) Izražavanje miR-182 u kontroli i miR-182 mimično transficiranih neonatalnih kardiomiocita štakora. ( e ) Western blot (lijevo) i prosječni podaci (desno) koji pokazuju razine nogo-C proteina u kontroli i miR-182 prekomjerno ekspresirajući neonatalne kardiomiocite štakora. ( f ) Aktivnost reportera luciferaze štakora Nogo-C3 'UTR u stanicama transficiranim miR-182 mimikom ili kodiranom miRNA mimikom u trajanju od 48 h. ( g ) Analiza protočne citometrije koja pokazuje apoptotske stope neonatalnih kardiomiocita štakora transficiranih sa ili bez miR-182 mimike kao odgovor na stimulaciju CoCl 2 (600 µM ) ili prekomjernu ekspresiju Nogo-C. n = 6 neovisnih pokusa. * P <0, 05 u odnosu na kontrolne stanice. # P <0, 05 nasuprot CoCl2 ili Nogo-C ćelijama prekomjerne ekspresije

Slika pune veličine

Da bi se provjerilo je li miR-182 imao ulogu u apoptozi izazvanoj nogo-C kardiomiocitima, kardiomiociti su kofeficirani miR-182 i Ad-Nogo-C, ili transficirani miR-182 u prisutnosti CoCl2. Iako je prekomjerna ekspresija Nogo-C ili liječenje CoCl2 inducirana kardiomiocitna apoptoza, prekomjerna ekspresija miR-182 zaštićenih stanica bilo od nogo-C ili CoCl2-inducirane apoptoze, kako je testirano protočnom citometrijom (Slika 5g). Zajedno, naši rezultati pokazuju da miR-182 ima važnu ulogu u srčanim bolestima vezanim uz hipoksiju negativno regulirajući ekspresiju Nogo-C.

Rasprava

Nogo obitelj proteini su duboko uključeni u više staničnih procesa. Pored dobro proučanih funkcija u živčanom sustavu, naša današnja studija otkrila je da je Nogo-C determinantan igrač u apoptozi povezanoj s ishemijom kardiomiocita tijekom MI. Postoji nekoliko linija koje podupiru naše pojmove. Prvo, nogo-C protein se povećava u MI srcu i u hipoksičnim stimulusima izazvanim apoptotskim kardiomiocitima. Drugo, prekomjerna ekspresija Nogo-C sama po sebi je dovoljna da inducira kardiomiocitnu apoptozu, dok oborenje Nogo-C sprečava hipoksiju izazvanu apoptozu. Treće, in vivo knockout nogo-C (Nogo-C - / - ) sačuvao je srčanu funkciju i štitio kardiomiocite protiv apoptoze nakon MI. Najzad, identificirali smo Nogo-C ciljni gen miR-182, koji negativno regulira Nogo-C i smanjuje se tijekom MI.

Apoptoza je važno obilježje koje vodi do srčane disfunkcije nakon MI i ishemijskih bolesti srca. 24, 25 Stoga je ispitivanje molekularnih mehanizama na kojima stoji apoptoza korisno za bolje razumijevanje MI, pa čak i za pružanje terapijskih ciljeva za liječenje MI. U našem trenutnom istraživanju otkrili smo da su i mRNA i proteini razine Nogo-C poviše regulirani u MI srcima, a protein Nogo-C uglavnom se povećavao u graničnom području infarktske zone gdje se većina apoptotičkih stanica obogatila, što sugerira moguću ulogu nogo- C u patogenom procesu apoptoze kardiomiocita. Zapravo, prekomjerna ekspresija Nogo-C u kardiomiocitima uzrokovala je staničnu apoptozu, a obustava Nogo-C inhibirala hipoksiju izazvanu apoptozu uzrokovanu hipoksijom. Naši nalazi da Nogo-C regulira staničnu apoptozu u srcu općenito se slažu s nalazima Nogo-A, jedne od spojnih izoforma Nogo-C, u kardiomiocitima. 23 Iako je izrazito izražen u središnjem živčanom sustavu, za Nogo-A se također navodi da se regulira u ljudskim srcima dilatirane kardiomiopatije i neonatalnih kardiomiocita štakora podvrgnutih hipoksiji / reperfuziji i padom nogo-A inhibirane hipoksije / reperfuzije izazvane apoptoze kardiomiocita izazvanom inhibicijom puta smrti smrti povezan sa mitohondrijom, akumulacije ROS-a i dijastolne abnormalnosti kalcija. 23 Strukturno, Nogo-C dijeli transmembransku domenu i C-terminalnu domenu s Nogo-A, dok nedostaje N-terminalna domena koju sadrži protein Nogo-A. 26, 27 Dakle, moguće je da zajedničke domene koje dijele dva nogo proteina doprinose apoptotskim efektima, jednakim inhibitornom učinku regeneracije u živčanom sustavu. 18 Međutim, točni molekularni mehanizmi apogoze izazvane nogo-C kardiomiocitima trebaju daljnje istraživanje.

Naši gornji rezultati o prethodnim studijama Nogo-C i drugih o Nogo-A pokazuju da povećani Nogo proteini tijekom MI ili ishemijske srčane bolesti mogu pridonijeti srčanom disfunkciji reguliranjem apoptoze kardiomiocita. Da bismo bolje razumjeli patofiziološki značaj Nogo-C u srcu, stvorili smo Nogo-C nokaut model miša, prvi Nogo-C nokaut model po našem saznanju. Naše funkcionalno istraživanje in vivo na Nogo-C nula miševima pruža čvrste dokaze koji potvrđuju našu hipotezu da je iscrpljivanje nogo-C zaštićene apoptoze kardiomiocita u srcu MI, u velikoj mjeri smanjeno IR, i što je najvažnije, očuvana srčana funkcija nakon ozljede MI, sugerirajući da Nogo- C može služiti kao terapeutski cilj za liječenje MI ili srčanih bolesti povezanih sa ishemijom. Naša današnja studija o zaštitnom učinku nogo-C nokauta u srcu općenito se slaže s Nogo-A nokaut modelom miša. 23 Iako je nogo-C nokautom štitio srce od oštećenja MI, nije pokazao srčani fenotip na bazalnoj razini, što sugerira da je Nogo-C ili neophodan za normalne funkcije ili da u srcu postoje suvišni putovi. Naši preliminarni podaci otkrili su da su razine mRNA ostalih dvaju članova Nogo obitelji, Nogo-A i Nogo-B, povećane u mišjim srcima Nogo-C, što sugerira da povišeni Nogo proteini mogu barem djelomično pružiti kompenzacijsku funkciju u Nogo-C KO srcima, U tom pogledu, zaštitni učinak nogo-C nokauta neovisnog o kompenzatorno povećanom Nogo-A sugerira da Nogo-C i Nogo-A mogu različito regulirati apoptozu kardiomiocita. Doista, nogo-A inducirana kardiomiocitna apoptoza putem mitohondrije ovisnog puta 23, dok Nogo-C nije imao utjecaja na mitohondrije (podaci nisu prikazani).

MikroRNA (miRNA) imaju presudnu ulogu u patogenezi različitih srčanih bolesti, uključujući MI, post-infarktnu fibrozu i zatajenje srca. 28, 29, 30, 31, 32, 33 U mišjim i ljudskim srcima, izraz ekspresije miRNA u pograničnom području infarktnog područja izmijenjen je nakon MI i tijekom naknadne srčane fibroze. 32 Smanjena regulacija miRNA, posebno obitelj miR-29, uklonila je ciljne gene koji kodiraju proteine ​​povezane s fibrozom, uzrokujući post-infarktnu fibrozu i srčanu disfunkciju. 34 U trenutnoj studiji predvidjeli smo, prema 3'UTR području Nogo-C, da je Nogo-C ciljni gen miR-182. In vitro ekspresija miR-182 smanjila je razinu proteina Nogo-C i Nogo-C 3'-UTR luciferaraznu aktivnost, što potvrđuje naše predviđanje da miR-182 negativno regulira ekspresiju Nogo-C. Štoviše, ekspresija miR-182 je smanjena u graničnom području infarktnog srca i u hipoksičnim kardiomiocitima, što sugerira da miR-182 može biti uključen u patološke procese MI i ishemijske srčane bolesti. Za MiR-182 prijavljeno je da sudjeluje u regulaciji više fizioloških i patoloških procesa, uključujući razvoj i degeneraciju mrežnice, 35, 36 karcinoma, 37, 38, 39, 40 upala, 41, 42 i hipertrofiju srca. 43 Suprotno tome, miR-182 je pokazao supresijsku funkciju tumora kod nekih vrsta karcinoma, kao što je glioblastoma, 44 dok je ongogeno djelovanje bio prikazan i kod drugih vrsta karcinoma, kao što je adenokarcinom pluća. 45 U našem istraživanju otkrili smo da miR-182 štiti kardiomiocite od Nogo-C i apoptoze izazvane hipoksijom. Nejasno je zašto miR-182 različito funkcionira na rast stanica ili apoptozu kod karcinoma ili u srcu, a tkivni specifični efekti mogu biti mogući razlog ove razlike. Međutim, kako je miR-182 reguliran za vrijeme MI i ishemijskog srca još nije jasno i zaslužuje daljnje istraživanje.

Ukratko, naša je sadašnja studija utvrdila da je nogo-C protein bio reguliran u MI srcu i hipoksičnim kardiomiocitima, povećana apogoza inducirana Nogo-C kardiomiocitima i prigušivanje Nogo-C zaštićenih kardiomiocita od apoptoze izazvane hipoksijom. Nokaut Nogo-C zaštitio je srce od ozljede MI i očuvao rad srca. Nadalje, utvrdili smo da je miR-182 negativan regulator Nogo-C, a smanjivanje miR-182 može pridonijeti povećanju Nogo-C i srčanoj disfunkciji tijekom MI. Naši nalazi otkrivaju kritičnu ulogu Nogo-C u srcu i tako osvjetljavaju razvoj terapijskih ciljeva za srčane bolesti povezane s ishemijom.

Materijali i metode

MI model modela

Sve postupke sa životinjama odobrio je Institucionalni odbor za brigu i upotrebu životinja Pekinškog zdravstvenog znanstvenog centra. MI model modela uspostavljen je s muškim miševima C57BL / 6 u dobi od 8-12 tjedana kako je ranije opisano. 46 Miševima je anestezirana intraperitonealna injekcija pentobarbital natrija (60 mg / kg). Izložen je četvrti interkostalni prostor preko lijevog prsa, a srce je brzo istisnuto iz torakalnog prostora, LAD ispod vrha lijevog prednjeg zida bio je vezan 6 sterilnim svilenim šavom. Lažni subjekti prošli su istu operaciju, osim što LAD nije bio ligiran. Dvadeset i četiri sata nakon operacije, ehokardiografija je obavljena s Vevo 710 RMV-707B (VisualSonics, Toronto, Ontario, Kanada), a srca su sakupljena i pripremljena za eksperimente.

Generacija Nogo-C nokaut modela miša

Nogo-C nokaut miševi (Nogo-C - / - ) generirani su TALEN tehnikom u pozadini C57BL / 6. Ukratko, 8 baznih para egsona 1c Nogo gena, usitnjeno je da inducira mutaciju pomaka okvira, što rezultira skraćenim proteinom, koji može biti podložan propadanju bez smisla. Napad nogo-C potvrđen je western blotom i sekvenciranjem gena.

Imunohistokemijski test bojenja

Uzorci srca učvršćeni su s 4% paraformaldehida i utisnuti parafinskim voskom. Odjeljci su perfuzirani u 3% H202 da bi se očistila endogena peroksidaza i mikrovalno miješali u puferu natrijevog citrata (1 mM, pH 6). Klizači su blokirani u 1% BSA tokom 30 minuta na 37 ° C, a potom su testirani s anti-Nogo-C antitijelom (1: 100) preko noći na 4 ° C i 30 min konjugiranim sekundarnim antitijelom s hren peroksidazom na 37 ° C,

Izolacija i kultura neonatalnih kardiomiocita štakora

Neonatalni kardiomiociti štakora izolirani su i uzgojeni kao što je prethodno opisano. 22 Ukratko, ventrikuli štakorki Sprague-Dawley postnatalno 1 do 2 dana digestirani su u otopini HBSS (KCl 0, 4 g / l, KH 2 PO 4 0, 06 g / l, NaHCO 3 0, 35 g / l, NaCl: 8 g / l, Na 2 HPO 4 12H 2O 0, 12 g / l, glukoza 1 g / l, pH 7, 4) koji sadrži 0, 1% tripsina (Invitrogen, Carlsbad, Kalifornija, SAD) i 0, 05% kolagenaze tipa II (Worthington, Lakewood, CO, SAD). Stanice su pripremljene prije 2 sata i supernatant koji sadrži pročišćene kardiomiocite je sakupljen, ponovno posađen i uzgojen sljedećih 48–72 h prije transfekcije adenovirusa.

Izgradnja adenovirusa

CDNA pune duljine Nogo-C pojačana je PCR pomoću primera: 5'-CACCATGGACG GACAGAAGAAACA-3 '(naprijed) i 5'-TCAATCTGCTTTGCGCTTCAATCC-3 '(obrnuto), pojačani proizvod je zatim umetnut u pENTR / TEV / D-TOPO vektor (Invitrogen). Novoizgrađeni proizvod je rekombiniran s pAd / CMV / V5-DEST vektorom (Invitrogen). Ciljni niz za Nogo-C-shRNA bio je 5'-GGCAGATCGTGGCAAGAAAA-3 '. Sekvenca Nogo-C-shRNA umetnuta je u pENTR TM / U6 vektor, a zatim je rekombinirana s pBLOCK-iT TM 6-DEST vektorom. Adenovirus je proizveden Adenovirusnim ekspresijskim sustavom (Invitrogen) i pročišćen pomoću Vivapure AdenoPACK20RT Kit (Sartorius, Göttingen, Njemačka).

imunoblatin

Protein je ekstrahiran iz mišjeg miokarda ili izoliranih kardiomiocita s Roth liziranim puferom (HEPES 50 mM, NaCl 150 mM, EDTA 5 mM, EGTA 5 mM, NaF 20 mM, Triton X-100 1%, pH 7.4) uz dodatak 100X koktela inhibitora proteaze (Sigma, Santa Clara, Kalifornija, SAD). Ukupno 40–100 ug proteina je zatim razdvojeno pomoću SDS-PAGE i preneseno u PVDF membrane. Membrane su ispitivane s naznačenim primarnim antitijelima (Nogo-C ili α -tubulin), a zatim su inkubirane sa sekundarnim antitijelima (IgG konjugiran peroksidazom s hrenom, IgG iz ZSGB-BIO, Peking, Kina). Imunobloti su ocijenjeni pomoću Chemi Doc XRS + instrumenta (Bio-RAD, Hercules, CA, SAD).

MiRNA test

MicroRNA test detektiran je pomoću prajmera matične petlje kupljenog od Ribobio (Guangzhou RiboBio, Guangzhou, Kina). Za normalizaciju je korišćena U6 mala nukleolarna RNA (Guangzhou RiboBio). Slijed rno-mir-182 bio je 5′-ACGCGGGUCUAGCUGCCGGAGGCCUCCCACCGUUUUUGGCAAUGGUAGAACUCACACACCGGUA-3 ′. Mimici Rno-mir-182 (Guangzhou RiboBio) transficirani su na neonatalne kardiomiocite štakora s lipofektaminom 3000 (Invitrogen).

Dvostruki test izvješća luciferaze

Nogo-C3'-UTR sekvence su umnožene pomoću PCR s prajmerima: 5 '-GCGCTCGAGAAAAGC CCCAAACAGAAGT-3' (naprijed) i 5 '-AATGCGGCCGCAAACACTAAACACAAACAT-3' (obrnuto). PCR proizvodi su tada konstruirani u pmiR-RB-REPORT plazmid (Guangzhou RiboBio) koji sadrži dva izvjestitelja, renila luciferazu (hRluc) za ocjenu ekspresije i luciferazu krijesnice (hluc) kao internu kontrolu za korelaciju količine. Hela stanice su transfektirane sa 100 ng Nogo-C 3'UTR reporter plazmidom i 2 μg rno-miR-182 mimičnog ili praznog vektora. Stanice su sakupljene 48 sati nakon transfekcije i analizirane pomoću dualnog sistema ispitivanja luciferaze (Promega, Madison, WI, USA). Aktivnost luciferaze ispitana je luminometrom Veritas (Turner BioSystems, Sunnyvale, CA, SAD). Aktivnost renila luciferaze svakog uzorka normalizirana je u aktivnost luciferaze krijesnica.

Stanični test smrti pomoću TUNEL obojenja i protočne citometrije

Stanična apoptoza određena je testom TUNEL (terminalna deoksiribonukleotidil-transferaza (TDT), dUTP-digoxigenin nick end) primjenom in situ stanice za detekciju smrti (Roche, Indianapolis, IN, SAD), ili pomoću aneksija V / propidijum konjugiranog fluoresceinskim izotiocijanatom. jodidna dvostruka bojna protočna citometrija primjenom Priloga-V-FITC za otkrivanje apoptoze (Dojindo Laboratories, Kumamoto-ken, Japan).

Analize transmisijske elektronske mikroskopije

Srca su fiksirana s 2% putara glutaraldehidin natrij kakodilata (0, 1 M, pH 7, 2) na 4 ° C preko noći i naknadno fiksirana 1 sat u 1% osmiumtetroksidu. Digitalne su slike nabavljene elektronskim mikroskopom za elektronski mikroskop i meko snimanje visokog kontrasta JEM-1230 (JEOL, Tokio, Japan).

TTC bojenje

Miševi su ubijeni anestetikom 24 sata nakon operacije MI. Srca su zamrznuta na -20 ° C 20 min, a zatim su odsječene na kriške debljine 5 mm. Pet kontinuiranih kriški od vrha do mjesta okluzije inkubirano je u trifeniltetrazolijum-kloridu (TTC) na 37 ° C tokom 5 minuta. Nakon fiksacije s 4% paraformaldehida preko noći, svaka je kriška izvagana ( w ) i fotografirana digitalnim fotoaparatom. Područja infarkta označena su kao područje koje nije obojeno TTC-om. IR i veličinu lijeve komore (LV) ocijenili su Photoshop. Postotak infarktne ​​površine izračunat je kao IR / LV = (∑IR (po kriški) × w (po kriški) ) / (∑LV (po kriški) × w (po kriški) ).

LDH test

Krv od jednog mililitara u venama prikupljena je štrcaljkom iz desnog ventrikula, a potom centrifugirana na 3000 o / min tijekom 15 minuta, 4 ° C. Uzorci seruma poslani su u klinički laboratorij Treće bolnice na Pekingu na analizu razine LDH.

Statistička analiza

Podaci su predstavljeni kao srednja ± SEM Statistička značajnost razlika između skupina analizirana je s parnim t- testom ili jednosmjernom ANOVA-om, a zatim SNK-om (Student-Newman-Keuls) kada su uspoređene više od dvije skupine. P <0, 05 se smatra statistički značajnim.

Glosar

MI

infarkt miokarda

ROS

reaktivne vrste kisika

3'UTR

3 neprevedene regije

TUNEL

terminalno deoksiribonukleotidil-transferaza (TDT) posredovano dUTP-digoxigenin nick end označavanjem

AV

aneksin V

TTC

trifeniltetrazolijev klorid

IR

infarktna veličina

LV

lijeva klijetka

LAD

laktat dehidrogenaza

shRNA

kratka ukosnica RNA

Mirna

mikrornk

LVID

unutarnji promjer lijeve klijetke

LVPW

debljina stražnje stijenke lijeve klijetke

EF

izbacivanje frakcija

FAC

frakcijska promjena područja

HW / BW

omjer težine srca i tjelesne težine

HW / TL

omjer duljine srca prema tibiji

ON

hematoksilin / eozinom