Novi estrogen-inducirani gen eig121 regulira autofagiju i pospješuje preživljavanje stanica pod stresom | stanična smrt i bolest

Novi estrogen-inducirani gen eig121 regulira autofagiju i pospješuje preživljavanje stanica pod stresom | stanična smrt i bolest

Anonim

teme

  • autophagy
  • Karcinom endometrija
  • Regulacija gena
  • lizosomi

Sažetak

Prethodno smo identificirali novi estrogen-inducirani gen, EIG121 , kao različito reguliran u endometrioidnom i nondometrioidnom karcinomu endometrija. Funkcija EIG121 bila je nepoznata. Koristeći sustav induciran tetraciklinom, otkrili smo da prekomjerna ekspresija EIG121, ali ne i LacZ, uzrokuje duboku supresiju rasta stanica. Subcelularno frakcioniranje i imunofluroscentno označavanje pokazalo je da je EIG121 transmembranski protein lokaliziran u odjeljcima kasnog plazma membrana, endosom-lizozom. Brisanjem pretpostavljene transmembranske domene ukinuta je membranska povezanost. U stanicama koje su prekomjerno eksprimirale EIG121, citoplazmatske vakuole akumulirane nakon indukcije EIG121, a autofagosomski marker LC3 premješten u točkaste, točkaste strukture. Elektronska mikroskopija otkrila je da se u stanicama prekomjerno eksprimirajućim EIG121 značajno povećavaju autofagosomi. Prekomjerna ekspresija EIG121 također je povećala stanice koje sadrže kisele vezikule i izazvala lizosomalnu razgradnju dugovječnih proteina. U stanicama MCF-7 i EIG121 i LC3 brzo su razgradili lizosomalni mehanizam nakon gladovanja. Pripadanje EIG121 blokirano je degradacijom LC3 izazvano gladovanjem. Sam po sebi obustava EIG121 nije utjecala na preživljavanje stanica. U kombinaciji s gladovanjem ili citotoksičnim agensima, obustava EIG121 uvelike je povećala apoptozu. Naši rezultati sugeriraju da je EIG121 povezan s odjeljcima endosom-lizosom i da može imati važnu ulogu u autofagiji. U nepovoljnim uvjetima, kao što su gladovanje i izloženost citotoksičnim agensima, EIG121 može zaštititi stanice od stanične smrti ureguliranjem putanje autofagije.

Glavni

Koristeći tehnologiju probira ccNA mikroarrayom, ranije smo prijavili identifikaciju novog gena izazvanog estrogenom EIG121. 1 EIG121 je bio prekomjerno izražen kod hiperplazije endometrija i karcinoma endometrioidnog tipa, dvije patološke proliferacije endometrija povezane s neprijavljenom izloženošću estrogenu. Suprotno tome, EIG121 bio je duboko potisnut u papilarni serozni karcinom maternice (UPSC) i zloćudni miješani mullerijski tumor (MMMT), nondometrioidni karcinom endometrija koji su u velikoj mjeri neovisni o izloženosti estrogenu i povezani s nepovoljnim kliničkim ishodima. U skladu s našim opažanjima, neke nedavne studije profiliranja gena endometrijskog karcinoma također su otkrile da EIG121 (KIAA1324) pokazuje najveću razliku u razini ekspresije gena između endometrioidnog karcinoma i UPSC-a i MMMT-a. 2 Ovi intrigantni nalazi sugerirali su nam da EIG121 može imati vrlo različitu ulogu u razvoju karcinoma endometroida u ranoj fazi u usporedbi s napredovanjem naprednijih karcinoma endometrioida ili nondometrioida.

Stanična funkcija EIG121 potpuno je nepoznata, zbog čega je učinkovito istraživanje njegove uloge u raku nepraktično. Korištenjem BLAST pretrage, ljudski gen EIG121 preslikava se u kromosom 1p13.1. Intrigantno je da se njegov izraz izrazito čuva u vrstama tijekom evolucije. Ljudski i glodavni proteini su 90% identični. Niz za sisavce EIG121 vrlo je sličan onom gena nepoznate funkcije kod C. elegans, Xenopus , riba i piletina. Takva homologija među vrstama sugerira da EIG121 ima važnu staničnu funkciju. Stoga smo koristili strategije prekomjerne ekspresije i RNAi za proučavanje uloge EIG121 u staničnoj smrti i rastu. Na naše iznenađenje, EIG121 prekomjerna ekspresija suzbila je rast stanica i inducirala autofagiju, degradativni i reciklirajući mehanizam za uklanjanje i promet glavnih citoplazmatskih komponenti. Koristeći EIG121 siRNA, pokazali smo da autofagija izazvana EIG121 potiče opstanak stanica nakon lišavanja hranjivih tvari i izloženosti citotoksičnim kemoterapijskim sredstvima.

Rezultati

Prekomjerna ekspresija EIG121 dovodi do inhibicije staničnog rasta i apoptoze

Ranije smo primijetili da je EIG121 visoko povišen u karcinomu endometrioidnog tipa. Naši napori da prekomjerno izrazimo EIG121 konstitutivno u Ishikawa (stanična linija endometrijskog karcinoma), stanicama 293T i NIH3T3 nisu uspjeli, dok prekomjerna ekspresija LacZ-a u istoj kralježnici plazmida nije uzrokovala poteškoće. To nam je ukazalo da visoka razina EIG121 može biti otrovna za stanice. Stoga smo prešli na sustav koji inducira tetraciklinom i izolirali klonove stanica T-Rex-293-EIG121 koji eksprimiraju EIG121 na različitim razinama. Prekomjerna ekspresija EIG121 značajno je inhibirala rast stanica, a stupanj inhibicije ovisio je o razini ekspresije EIG121 (Slika 1a). U klonu A, koji izražava najviše razine EIG121, broj stanica smanjen je za preko 75% u usporedbi sa stanicama koje ne izražavaju EIG121.

Image

Prekomjerna ekspresija EIG121 dovodi do inhibicije rasta i apoptoze. ( a ) Odabrane su stanice T-Rex-293 koje eksprimiraju EIG121 na različitim razinama kao odgovor na liječenje tetraciklinom. U gornjoj ploči, klonovi A, U i X, koji izražavaju visoku, srednju i skromnu razinu EIG121, bili su posađeni četverostrukim u ploče sa šest jažica i inkubirani 24 sata ili 48 sati sa ili bez tetraciklina. Stanice su zatim tripsinizirane i prebrojane. Imajte na umu da je film prekomjerno izložen da bi se pokazao signal EIG121 za klon X. ( b ) T-Rex-293-EIG121 klon U ili T-Rex-293-LacZ stanice su posijane u triplikatima, a tetraciklin je dodan za 0 ili 24 h. Profil reprezentativne protočne citometrije predstavlja bojanje annexin-V FITC u osi x i PI u osi y . Kombinirani postotak stanica u donjem desnom kvadrantu (rana apoptoza) i gornjem desnom kvadrantu (kasna apoptoza) predstavlja apoptotske stanice, a gornji lijevi kvadrant predstavlja mrtve stanice. U histogramima je prikazano sredstvo ± SD triplikata; * označava značaj pri P <0, 05 u odnosu na stanice bez indukcije tetraciklina, dok ** označava značaj pri P <0, 01

Slika pune veličine

Da bismo odredili mehanizam odgovoran za promatrani gubitak stanica uzrokovan ekspresijom EIG121, ispitali smo učinke prekomjerne ekspresije EIG121 ili LacZ na apoptozu protočnom citometrijskom analizom stanica obojenih u aneksin V. Kao što je prikazano na slici 1b, čak i srednje razine ekspresije EIG121 značajno povećavaju postotak apoptotskih stanica, dok prekomjerna ekspresija LacZ nije utjecala na apoptozu.

Smrt nekrotičnih stanica mjerena aktivnošću laktatne dehidrogenaze (LDH) koja se oslobađa u medij nije povećana u stanicama prekomjerno eksprimirajućim EIG121 (podaci nisu prikazani).

EIG121 je transmembranski protein povezan s plazma membranom i trans -Golgi / kasni endosom – lizosom

Da bismo stekli uvid u mehanizme koji stoje na osnovi svojstava inhibicije rasta i svojstva promicanja apoptoze EIG121, prvo smo proučavali njegovu staničnu lokalizaciju. Softver za bioinformatiku predviđao je da EIG121 ima pretpostavljenu transmembransku domenu između aminokiselinskih ostataka 911 i 931. Koristeći poliklonalno antitijelo protiv kraja EIG121 C, utvrdili smo da je u stanicama MCF-7 EIG121 uglavnom lokaliziran na plazma membrani i citoplazmi. perinuklearno područje, s citoplazmatskom lokalizacijom, tipično polariziranom na jednu stranu jezgre (slika 2a). U nekim stanicama, čini se da je EIG121 povezan i s citoskeletnim vlaknima. Subcelularno frakcioniranje upotrebom lizata iz MCF-7 stanica, koje izražavaju relativno visoke razine endogenog EIG121, pokazalo je da je EIG121 obogaćen u ekstraktu membrane, ali ne i u nuklearnom ekstraktu ili citosolu (slika 2b). Mutantni protein za deleciju transmembranske domene (EIG121ΔTM) nalazio se uglavnom u citosolu (slika 2b) i mediju za staničnu kulturu (nije prikazan), dok je divlji tip EIG121 i mutant sa delecijom u dometnoj domeni receptora mannose-6-fosfata (EIG121ΔM6PR ) još uvijek su obogaćeni u pripremi membrane (nije prikazano).

Image

EIG121 je transmembranski protein povezan s plazma membranom i endomembranama. ( a ) MCF-7 stanice su uzgajane na pokrivačima i obojene s EIG121 antitijelom. Imajte na umu bojenje plazma membrane i perinuklearnu intracelularnu lokalizaciju EIG121. ( b ) Neobrađene MCF-7 stanice ili stanice Ishikawa transficirane plazmidima koji eksprimiraju divlji tip EIG121 ili mutant EIG121 bez nedostatne dometne transmembranske domene (ΔTM) su uzgajane u ploče od 10 cm i pripremljene su subcelularne frakcije. Te se frakcije odijele na SDS-PAGE gelu, a membrana se ispita s različitim antitijelima

Slika pune veličine

Eksperimenti sa dvostrukim označavanjem otkrili su da je EIG121 djelomično kolokaliziran s receptom za manoza-6-fosfat (M6PR) (slike nisu prikazane) i TGN38, dva trans- Golgi markera i Rab 7 (kasni endosomski marker), ali ne s endoplazmatskim retikulumom (kareticulin ) (slike nisu prikazane) i markere mitohondrija. Pored toga, EIG121 se dobro kolokalizirao s markerima lizosoma, uključujući LAMP1, katepsin B i katepsin D (slika 3). Ovi rezultati pokazuju da je EIG121 transmembranski protein povezan s odjeljcima plazme membrane / trans- golgi / kasni endosom-lizosom. Lokalizacija EIG121 u stanicama T-Rex-293-EIG121 koja pretjerano eksprimira EIG121 slična je onoj endogenog proteina EIG121 u stanicama MCF-7 (podaci nisu prikazani).

Image

EIG121 lokalizira se u odjeljcima kasnog TGN-endosoma-lizosoma. Dvostruko imunofluoresencijalno označavanje endogenog EIG121 (zeleno), zajedno s Rab7, katepsinom D, lizotrakatorom i mitotrakerom (crveno) u stanicama MCF-7

Slika pune veličine

EIG121 inducira citoplazmatsku vakuolizaciju

Stanice T-Rex-293-EIG121 i stanice MDA-231-t-EIG121 (stabilni stanični klonovi dobiveni iz MDA-MB-231 stanica za izražavanje EIG121 na način induciran tetraciklinom) pretjerano eksprimiranje EIG121 sadrže velike vakuole. Citoplazmatske vakuole akumulirale su se 8 sati nakon indukcije EIG121 (nije prikazano). Za 24 sata cijela citoplazma se rastvara vakuolama (slika 4a). Iako u bazalnim uvjetima stanice MDA-MB-231 sadrže neke vakuole, samo je prekomjerna ekspresija EIG121, ali ne i LacZ, uvelike povećala vakuolizaciju (Slika 4a). Moguće je da vakuolizacija možda nije posljedica EIG121, već zbog artefakta prekomjerne ekspresije. Da isključimo ovu mogućnost, transficirali smo stanice ekspresivnim vektorima EIG121, EIG121ΔTM, EIG121ΔM6PR i LacZ. Kako svi ovi konstrukti sadrže V5 epi-oznaku na njihovim C-termininima, primijenili smo V5 antitijelo na transficirane stanice da bismo vizualizirali razine ekspresije egzogenih proteina. Iako su sve stanice eksprimirale V5-fuzijske proteine, samo je ekspresija divljeg tipa EIG121 i EIG121ΔM6PR, ali ne i EIG121ΔTM i LacZ, inducirana vakuolizacijom (Slika 4b).

Image

Prekomjerna ekspresija divljeg tipa EIG121, ali ne i EIG121ΔTM i LacZ, inducira citoplazmatsku vakuolaciju. ( a ) T-Rex-293-EIG121 kloni A stanice, MDA-231-t-EIG121 ili MDA-231-t-LacZ stanice uzgajane su na pokrivačima i tetraciklin je dodan za 0 ili 26 h. Stanice su zatim fiksirane i obojene s H&E. ( b ) Plazmidi koji eksprimiraju divlji tip EIG121-V5, EIG121ΔTM-V5, EIG121ΔM6PR-V5 ili LacZ-V5 fuzijski proteini transficirani su u stanice Ishikawa H, a 48 sati kasnije stanice su fiksirane i obojene pomoću antitijela protiv V5

Slika pune veličine

EIG121 inducira stvaranje autofagosoma

Autofagija je visoko očuvani proces u kojem se neispravni ili višak organela i proteinskih agregata dijeli u vezikule s dvostrukom membranom i isporučuje lizosomima na razgradnju i recikliranje. Autofagija ima važnu ulogu u promicanju preživljavanja tijekom uskraćivanja hranjivih tvari, reguliranju stanične preuređenja tijekom razvoja i diferencijacije, sprečavanju neurodegeneracije i određivanju životnog vijeka. 3, 4 Kako je citoplazmatska vakuolacija znak autofagije, a EIG121 je izražen u lizosomima u kojima je sadržaj autofagosoma degradiran, pretpostavili smo da EIG121 prekomjerna ekspresija uzrokuje autofagiju. Pomoću elektronske mikroskopije, stanice koje prekomjerno eksprimiraju EIG121 imale su obilne dvostruke ili multimembrane vezane strukture koje sadrže prepoznatljive stanične organele i elektronski guste tvari karakteristične za autofagosome i autolysosome (slika 5a). U stanicama koje su inducirane da eksprimiraju LacZ ili nisu inducirane tetraciklinom detektirano je malo autofagosoma (podaci nisu prikazani).

Image

Prekomjerna ekspresija EIG121 inducira stvaranje autofagsosoma i translokaciju autofhagosomskog markera LC3 u vezikule u obliku točke. ( a ) T-Rex-293-EIG121 ili T-Rex-293-LacZ stanice inkubiraju se 24 sata sa ili bez tetraciklina, fiksiraju i zatim pretražuju elektronskom mikroskopijom. Imajte na umu da su u gornjim pločama autofagomi lako otkriveni (strelice), dok je u stanicama koje ne izražavaju EIG121 (donji paneli) formirano nekoliko autofagosoma. ( b ) Stanice klona A T-Rex-293-EIG121 uzgajane su na pokrivačima i 24 sata je dodan tetraciklin u polovinu jažica. Stanice su zatim fiksirane i obojene pomoću antitijela protiv LC3

Slika pune veličine

Indukcija autofagije povezana je s konjugacijom fosfatidiletanolamina (PE) u laki protein-lanac lanca 3-LC (LC3). Konjugirani LC3 prelazi u autofagosome i čvrsto se veže na membranu autofagosoma. 5 Prema tome, LC3 translokacija je pouzdan biomarker autofagije. 6, 7 U stanicama koje ne eksprimiraju EIG121, LC3 je bio ravnomjerno raspoređen u citoplazmi, dok se u stanicama induciranim da eksprimiraju EIG121, ekspresija LC3 odvijala se pretežno u punktnim strukturama u točkama, u skladu s indukcijom autofagije (Slika 5b).

EIG121 pojačava lizosomsku razgradnju dugovječnih proteina

Da bismo kvantificirali opseg autofagije uzrokovane EIG121, mjerili smo razvoj kiselih organela vezikula primjenjujući akridinsko narančasto obojenje, praćeno protočnom citometrijom. Kao i kod drugih acidotropnih boja, crvena fluorescencija nastala akridinskim narančastim bojenjem predstavlja samo autofagosome i lizosome kasnijeg stupnja; 7, stoga, akridinsko narančasto podcjenjivanje podcjenjuje opseg autofagije. Ipak, u usporedbi s kontrolom bez tetraciklina ili stanicama koje prekomjerno izražavaju LacZ, prekomjerna ekspresija EIG121 uvelike je povećala postotak stanica koje su fluorescirale. Prekomjerna ekspresija EIG121 tijekom 24 sata povećala je stanice koje sadrže kisele organele za 40%, dok je 48 sati nakon ekspresije EIG121 broj stanica koje sadrže kisele organele porastao 2, 5 puta (Slika 6a). Kontrole koje pretjerano eksprimiraju LacZ nisu pokazale porast akridinskih narančasto-pozitivnih kiselih organela (Slika 6b).

Image

Prekomjerna ekspresija EIG121 povećava kisele vezikule i razgradnju dugovječnih proteina. T-Rex-293-EIG121 klon A stanice ( a ) ili T-Rex-293-LacZ stanice ( b ) uzgajane su u pločicama sa šest jažica i inkubirane su bez ili s tetraciklinom 24 ili 48 sati. Stanice se zatim inkubiraju u mediju koji sadrži akridin naranče i sakupljaju tripsinizacijom za analizu protočne citometrije. Nacrtane su kratne povećanja stanica koje sadrže kisele vezikule organele. ( c ) Stanice klona A T-Rex-293-EIG121 uzgajane su u pločicama s 12 jažica i inkubirane su u prisustvu ili odsutnosti traciklina tijekom 8 ili 24 sata. Stanice su zatim obilježene u mediju koji sadrži 14 C-valina i gusteni su najprije 3 sata kako bi se iscrpili proteini kratkog vijeka, a zatim još 16 sati. Degradacija dugovječnih proteina predstavljena je radioaktivnošću koja se oslobađala u mediju tijekom posljednjih 16 h (omjer TCA topljive radioaktivnosti u ukupnoj staničnoj radioaktivnosti). Svaka skupina sadržavala je pet replika, a prikazani podaci (prosjek ± SEM) reprezentativni su za tri neovisna pokusa

Slika pune veličine

Kako se sadržaj autofhagosoma na kraju razgrađuje kiselim enzimima unutar lizosoma, sljedeće smo ispitali je li prekomjerna ekspresija EIG121 utjecala na razgradnju lizosomalnog proteina. T-RexEIG121 stanice inducirane su da eksprimiraju EIG121, a zatim su stanični proteini obilježeni sa 14 ° C tijekom 24 sata, nakon čega slijedi 3 sata i preko noći jurnjava. Tijekom početne 3-satne potjere, kratkotrajni proteini razgrađivali su se uglavnom proteosomskim mehanizmom, a medij koji sadrži radioaktivnost bio je odbačen. Dugovječni proteini uglavnom su razgrađivani lizosomalnim enzimima tijekom noći preko noći. Nakon što su izlučeni proteini i stanični ostaci uklonjeni taloženjem triklorooctene kiseline (TCA) iz medija za staničnu kulturu, radioaktivnost koja ostaje u mediju trebala bi odražavati aktivnost razgradnje proteina tijekom razdoblja potjere. EIG121 ekspresija značajno je poboljšala aktivnost razgradnje proteina u stanicama (Slika 6c). U stanicama koje su prekomjerno eksprimirale EIG121 tijekom 8 ili 24 sata, razgradnja dugovječnih proteina značajno se povećala za 30, odnosno 37%.

Tijekom autofagije uzrokovane gladovanjem, EIG121 i LC3 prelaze u iste vezikule i razgrađuju se lizosomskim mehanizmom

Mnogi proteini koji su uključeni u autofagijski ciklus između različitih staničnih odjeljaka ili organela i njihovo obilje, također se mogu kontrolirati. 3 Stoga smo ispitali je li na obilje EIG121 ili staničnu lokalizaciju utjecalo gladovanje, snažni induktor autofagije. Tijekom autofagije, marker autofagosoma LC3 konjugira se s PE i translocira u membrane autofhagosoma i u manjem dijelu autolysosoma. Nakon što se autofagosomi spoje s lizosomima, LC3 na intra-autofhagosomskoj membrani brzo se razgrađuje lizosomalnim proteazama, te se stoga količina LC3-I i LC3-II u određenim vremenskim točkama nakon gladovanja može povećati ili smanjiti, ovisno o različitoj stanici konteksti i duljina gladovanja. 8, 9 Zbog dinamičkih promjena LC3 tijekom autofagije, LC3 se koristi kao surogat marker za autofagiju. Stoga smo također ispitali promjene u endogenom LC3 nakon gladovanja u tim stanicama. Kao što je prikazano na slici 7a, u roku od 30 minuta od gladi, razina EIG121 i LC3 smanjena je za 70%. Nakon 2 sata gladovanja, LC3-I (nekonjugirani oblik) i LC3-II (PE-konjugirani oblik) gotovo su potpuno nestali, dok je smanjenje EIG121 usporilo nakon početnih 30 minuta gladovanja i nikada nije bilo potpuno potpun kao gubitak LC3. Kako je do smanjenja proteina EIG121 i LC3 došlo brzo nakon gladovanja, njihovo smanjenje vjerojatno nastaje zbog razgradnje proteina. Da bismo razlikovali dva glavna mehanizma razgradnje proteina, izgladnjivali smo MCF-7 stanice i tretirali ih bafilomicinom A1 (BafA1), sredstvom koje povisuje lizosomalni pH i inhibira lizosomalnu fuziju i proteosomalnim inhibitorom MG132. BafA1 je u potpunosti blokirao propadanje EIG121 i LC3 uzrokovane gladovanjem, dok je MG132 imao mali učinak, što sugerira da su EIG121 i LC3 degradirali lizosomski mehanizam tijekom gladovanja (slika 7b).

Image

Nakon gladovanja, EIG121 i LC3 kolokaliziraju i obojica se razgrađuju lizosomskim mehanizmom. ( a ) MCF-7 stanice su stradale u HBSS za 0, 0, 5, 1, 2 i 4 h. Zabilježite brzu razgradnju EIG121 i LC3-I i LC3-II pri izgladnjivanju. Ovaj eksperiment je proveden dva puta i svaki put sa svim grupama za liječenje u dva primjerka. ( b ) Degradacija EIG121 i LC3 izazvana gladovanjem blokira lizosomalni inhibitor BafA1. MCF-7 stanice su prethodno obrađene sa BafAl (100 nM) ili MG132 (10 μM) 30 min, prije nego što su izgladnjele 2 sata u HBSS u kontinuiranoj prisutnosti BafAl ili MG132. Ili 50 ili 150 µg staničnih lizata je razrijeđeno pomoću SDS-PAGE gela i ispitivano s EIG121 ili LC3 protutijelima, respektivno. ( c ) Imunofluorescentno bojenje EIG121 i LC3 u različito vrijeme nakon gladovanja. Korišteno je zečje poliklonsko antitijelo protiv LC3. Imajte na umu raspršene vezikularne boje na EIG121 nakon gladovanja. ( d ) Dvostruko obilježavanje EIG121 i LC3 MCF-7 stanica uzgajanih u 10% FBS ili gladovati u HBSS 20 minuta. U ovom eksperimentu korišteno je mišje monoklonsko antitijelo protiv LC3. Strelice označavaju kolokalizirane vezikule LC3- i EIG121

Slika pune veličine

U nepotvrđenim stanicama MCF-7 EIG121 se uglavnom lokalizirao na plazma membrani i citoplazmi u perinuklearnoj regiji, s polarizacijom na jednu stranu jezgre (slika 7c). Suprotno tome, 30 minuta nakon staničnog gladovanja, svijetle vezikularne strukture na EIG121 počele su se raspršiti u staničnoj citoplazmi. Nakon 1 sata gladovanja, postaju očigledniji veći vezikuli na EIG121, dok se intenzitet perinuklearnog bojenja EIG121 znatno smanjio. U neškodiranim MCF-7 stanicama, LC3 je bio ravnomjerno raspoređen u citoplazmi, s povremenim velikim, punktatnim bojenjem u perinuklearnoj regiji (slika 7c). Nakon gladovanja, citoplazmatska LC3 dramatično se smanjila, dok velika mrlja na punktatu nije utjecala.

Rezultati s slika 7a i b sugerirali su da se EIG121 i LC3 susreću s istom sudbinom nakon gladovanja, naime, razgradnjom proteina posredovanom lizosomom. Dalje smo utvrdili da li se ta dva proteina nakon gladovanja kreću u iste vezikule. U tu svrhu je dobiveno različito LC3 antitijelo generirano u miša (MBL International Corporation, Woburn, MA, USA). Kako su se i EIG121 i LC3 razgradili nakon gladovanja u trajanju od 30 minuta, mi smo proučavali moguću kolokalizaciju te dvije osobe prije 30 minuta. Kao što je prikazano na slici 7d, u nestabilnim MCF-7 stanicama, EIG121 je gusto lokaliziran u perinuklearnoj regiji, dok je LC3 ravnomjerno raspoređen u citoplazmi. Nakon gladovanja 20 minuta, raspršene EIG121-pozitivne vezikule snažno su kolokalizirane u velike LC3-ukrašene vezikule.

Pripadanje EIG121 kompromitira autofagiju uzrokovanu gladovanjem i senzibilizira stanice na staničnu smrt uzrokovanu uskraćivanjem hranjivih tvari i izlaganjem citotoksičnim agensima

Da bismo utvrdili je li EIG121 potreban za autofagiju, ispitali smo učinak knockdown-a EIG121 na LC3 propadanje gladi. Otpad EIG121 rezultirao je smanjenjem ekspresije proteina EIG121 za oko 70%, a to je povezano s kompromitiranom razgradnjom LC3 uzrokovanom gladovanjem, što je određeno imunofluorescencijom (IF) (slika 8a) i zapadnim upijanjem (slika 8b).

Image

EIG121 knockdown kompromitira autofagiju uzrokovanu izgladnjivanjem. ( a ) Razgradnja LC3 izazvana gladovanjem uzrokovana EIG121 siRNA. MCF-7 stanice su transficirane kontrolnim ne-ciljanim siRNA ili EIG121 siRNA tijekom 72 sata, a zatim gladovane u HBSS tijekom 2 sata. Stanice su zatim fiksirane i obojene za LC3. ( b ) MCF-7 stanice su transficirane siRNA u duplikatu i gladovane su kao u A, ali stanični lizati su sakupljeni i ispitivani s LC3 ili EIG121 antitijelom Western blottingom. Prikazan je predstavnik jednog od tri neovisna pokusa. Gustoća traka u odnosu na prvu traku nestarnih stanica prikazana je ispod mrlja. Kratice: non, netransficirane stanice (bez siRNA); EIG, EIG121 siRNA; con, kontrolirajte netR ciljanje siRNA

Slika pune veličine

Autofagija potiče opstanak stanica u nedostatku hranjivih tvari i drugim stresnim uvjetima. 4, 10 Hipotetizirali smo da EIG121 doprinosi takvim autofagičkim zaštitnim mehanizmima. Sam poništavanje EIG121 nije utjecalo na preživljavanje stanica (Slika 9a, prvi red), što dokazuju slični obrasci bojenja između kontrolnih i EIG121 siRNA transficiranih stanica pomoću TUNEL testa. Nakon gladovanja u serumu (slika 9a, srednji red) ili tretmana paklitaksela (slika 9a, donji red), propadanje EIG121 uvelike je povećalo postotak stanica podvrgnutih apoptozi. Odcepljena kaspaza 3 nije se otkrila u stanicama MCF-7, ali se odsječena kaspaza 7 značajno povećala u stanicama koje su bile transficirane s EIG121 siRNA. EIG121 knockdown povećao je bazalnu razinu cijepljene kaspaze 7 u usporedbi s netransficiranom kontrolom i ne-ciljanom siRNA kontrolom (Slika 9b). Gubitak seruma (u trajanju od 48 sati, staze 4-6), gladovanje hranjivim tvarima (trake 7–9) i tretmani doksorubicinom (trake 10–15) povećali su cijepljenu kaspazu 7, ali pad EIG121 povećao je ovo povećanje. Ovi rezultati sugeriraju da iscrpljivanje EIG121 ugrožava preživljavanje stanica pod različitim staničnim stresima.

Image

Poništavanje EIG121 smanjuje vitalnost stanica u uvjetima lišavanja seruma ili liječenja citotoksičnim lijekovima. ( a ) MCF-7 stanice su transficirane 48 h kontrolnim neciljanim siRNA ili EIG121 siRNA i inkubirane u mediju sa 10% FBS ili bez seruma 48 sati ili tretirane sa 20 nM paklitaksela (taksol) 16 h. Stanice su zatim fiksirane za TUNEL bojenje. Za svaki eksperiment, apoptotičke stanice (obojene u zeleno) kvantificirane su s total 2000 ukupnih stanica (obojeno plavo), a apoptotički indeks izračunato je dijeljenjem broja apoptotskih stanica na broj ukupnih stanica. ** označava značaj na razini P <0, 01, u odnosu na kontrolne ne-ciljne siRNA skupine. ( b ) MCF-7 stanice su transficirane 48 h kontrolnim neciljanim siRNA ili EIG121 siRNA i zatim obrađene kako je naznačeno. Stanice se rupturiraju, a EIG121, cijepljena kaspaza 7 i p- aktin ispitivaju se uporabom specifičnih antitijela. N, netraficirane stanice (bez siRNA); E, EIG121 siRNA; C, kontrolirajte netRiljanje siRNA

Slika pune veličine

Rasprava

U ovoj studiji pokazali smo da novi gen EIG121 izazvan estrogenom ima ulogu u autofagiji i da ova funkcija može pospješiti opstanak stanica pod uskraćivanjem hranjivih tvari i drugim staničnim stresima. Subcelularna frakcionacija (slika 2) i konfokalna mikroskopija (slika 3) pokazali su da je EIG121 transmembranski protein povezan s odjeljcima plazma membrane, trans- Golgijevom mrežom (TGN), kasnim endosomima i lizozosomima. Stoga smo vrlo sumnjali da EIG121 može imati ulogu u procesima trgovine unutarćelijskim membranama koji uključuju ove organele. Jedan od takvih procesa trgovine ljudima je autofagija. Tijekom autofagije, prekomjerne, stare i nepotrebne makromolekule, uključujući dugovječne proteine ​​i organele, najprije se omotaju dvoslojnom membranom da bi se formirali autofagosomi. Nakon toga, autofagosomi dobivaju lizosomske enzime spajanjem s transportnim vezikulama koje potječu iz TGN-a ili lizosoma. Konačno, zahvaćeni materijali razgrađuju se lizosomalnim enzimima, a aminokiseline i druge male molekule recikliraju se. 3, 11 Brojna istraživanja pokazala su da TGN proteini imaju važnu ulogu u autofagiji. Beclin-1, PtdIns 3-kinaza i ATG9, tri proteina potrebna za autofagiju, lokaliziraju se na TGN u uvjetima hranjivih tvari, ali se redistribuiraju na autofagosome i lizosome tijekom autofagije izazvane gladovanjem. 12, 13, 14 Rab7, proteinski kasni endosom, potreban je za sazrijevanje kasnih autofagosomalnih vakuola. Kako posljednja faza autofagije uključuje fuziju autofagosoma s lizosomima i razgradnju zahvaćenih materijala lizosomalnim enzimima, nema sumnje da su lizosomalni proteini važni za autofagiju. To je dokazano blokadom autofagije primjenom lizosomalnih inhibitora 16, 17 i neispravnim autofagijskim reakcijama u bolestima lizosomskog skladištenja ili nokautom životinjskih modela lizosomalnih proteina. 18, 19

Za vrijeme gladovanja, LC3-I (citoplazmatski) se pretvara u LC3-II (vezan na membranu), a nakon fuzije autofagosoma s lizosomima, intra-autofagosomalni LC3-II brzo se razgrađuje lizosomalnim proteazama. U skladu s ovom idejom, primijetili smo da je nakon gladovanja, EIG121 preraspodijeljen u LC3-pozitivne vezikule, a zatim su i LC3 i EIG121 razgrađeni (Slika 7). Količina staničnih LC3-I i LC3-II u određenoj vremenskoj točki u određenoj ćeliji je vrlo dinamična i ovisi o staničnom kontekstu. Na primjer, LC3-II je povišen u stanicama HEK293 nakon 2 sata inkubacije u KRB glađu, dok isti tretman dovodi do smanjenja i LC3-I i LC3-II u HeLa stanicama. 8 Gladnoća aminokiseline staničnih linija kolorektalnog karcinoma dovodi do povećanja LC3 u stanicama SW620 i WiDr, ali smanjena LC3 u stanicama SW480 i LoVo. 9 U našem istraživanju otkrili smo da je u stanicama MCF-7 LC3-II dominantan oblik LC3 i da su, izgladnjivani, i LC3 i EIG121 brzo razgrađeni (slike 7a i b). Međutim, u stanicama MDA-MB-231 LC3-I je dominantan oblik i tijekom ranog vremenskog razdoblja gladovanja (5 do 30 min) LC3-II raste, dok produljena gladovanja (30 min do 2 h) dovodi do duboke razgradnje LC3 (podaci nisu prikazani). Vjerujemo da se razgradnja LC3 i EIG121 dogodila u lizosomima, kao što je BafA1, sredstvo koje povisuje lizosomalni pH i inhibira fuziju s lizosomima, 16 u potpunosti je ukinulo degradaciju EIG121 i LC3 uzrokovane gladovanjem (Slika 7b). Kako je LC3 prepoznat kao biomarker autofagije, ovdje prikazani rezultati pokazuju da EIG121 ima ulogu u autofagiji izazvanoj gladovanjem i citotoksičnim liječenjem. Međutim, precizna funkcija EIG121 u autofagiji i mehanizam koji stoji na toj funkciji još uvijek nisu jasni i trebali bi biti fokus budućih studija.

Prvo smo opisali EIG121 kao estrogenski inducirani gen koji je bio prekomjerno ekspresioniran u estrogenom ovisnom endometrijskom endometrioidnom adenokarcinomu, ali nije estrogenski neovisan nondeometrioidni karcinom endometrija. 1 Uloga autofagije u karcinomu ostaje kontroverzna. S jedne strane, nedostatak autofagičnih gena, poput beklin-1, otkriven je u različitim rakovima, a miševi s haploinsuficijencijom belin-1 skloniji su tumorigenezi. 20 Supresori tumora poput p53 mogu pozitivno regulirati autofagiju, dok su onkogeni molekuli poput mTOR negativni regulatori autofagije. 21, 22, 23 Ova zapažanja sugeriraju da autofagija suzbija tumorigenezu. S druge strane, poznato je da autofagija potiče preživljavanje normalnih i tumorskih stanica pod stresnim uvjetima kao što su lišavanje hranjivih sastojaka i liječenje citotoksičnim lijekovima i tako može olakšati razvoj tumora i otpornost na terapiju. 24, 25 Ova kontradiktorna zapažanja sugeriraju da uloga autofagije u tumorigenezi može ovisiti o razini proteina koji reguliraju autofagiju, staničnoj vrsti i mikrookolu. Neka nedavna istraživanja pokazuju da normalan rast stanica zahtijeva ravnotežu u autofagičnom putu i da i nedovoljna i prekomjerna razina autofagije mogu inhibirati preživljavanje i pokrenuti staničnu smrt. 4, 26 U ovom istraživanju opazili smo da prekomjerna ekspresija EIG121 dovodi do inhibicije rasta i apoptoze (Slika 1a). Sama destrukcija EIG121 nije utjecala na preživljavanje stanica, ali u kombinaciji s oduzimanjem hranjivih sastojaka ili liječenjem citotoksičnim lijekovima dovela je do masovne stanične smrti (Slika 9). Ovi rezultati sugeriraju da tumorske stanice možda ne ovise o EIG121 kada ima dovoljno hranjivih sastojaka, ali autofagija izazvana EIG121 može potaknuti privremeni opstanak stanica pod stresnim uvjetima. Autofagička aktivnost je najistaknutija u centru ranih tumora mliječne žlijezde, u kojima je ograničena opskrba hranjivim tvarima i kisikom, zbog nedostatka angiogeneze izazvane tumorom. 27 Stoga je moguće da visoke razine EIG121 koje smo prethodno opazili kod hiperplazije endometrija i karcinoma endometrija 1. stupnja doprinose preživljavanju ove rane nenormalne proliferacije, kada je egzogena opskrba hranjivim tvarima izuzetno ograničena, izazivanjem autofagije. U naprednijim endometrioidnim karcinomima i nondometrioidnim karcinomima, jer masivna angiogeneza i signalizacija povišenog faktora rasta mogu podržati rast tumora, EIG121 nije potreban za preživljavanje tumora. U stvari, kontinuirana prisutnost visokog nivoa EIG121 u tim tumorima može dovesti do zaustavljanja rasta i smrti stanica, jer produljena i prekomjerna autofagija doprinosi izvršenju stanične smrti. 28, 29 Nagađamo da se zbog metaboličke katastrofe izazvane prekomjernom autofagijom EIG121 eliminira iz uznapredovalih karcinoma. Iz istog razloga, nismo mogli uspostaviti stabilne stanice koje bi konstitutivno eksprimirale EIG121 na visokim razinama.

Razlog zašto stanice MCF-7 in vitro i karcinom endometroida endometroida niskog stupnja mogu tolerirati relativno visoke razine EIG121 trenutno je nejasan. Moguće je da MCF-7 stanice i tumori endometrija niskog stupnja nose dodatne genetske ili epigenetske promjene koje mogu antagonizirati efekte inhibicije rasta i pro-smrti uzrokovane produljenom i prekomjernom ekspresijom EIG121. Pored toga, uloga EIG121 u raku vjerojatno će biti u fazi razvoja tumora i ovisnog staničnog konteksta. Na primjer, TGF- β je supresor tumora u ranim fazama tumorigeneze, ali potiče napredovanje u kasnijim fazama. 30 Čak i klasični tumor supresor PTEN-a može imati svojstva promicanja tumora u podešavanju dobitaka p53 mutacija. 31 Stoga nije iznenađujuće da EIG121 može imati vrlo različite uloge u ranim karcinomima endometrija u odnosu na napredne tumore i nonndometrioidne tumore.

Činjenica da je EIG121 pozitivno reguliran estrogenom postavlja pitanje uloge estrogena u regulaciji autofagije i funkcije autofagije u tkivima osjetljivim na estrogen. Pokazalo se da steroidni hormoni, poput ekdizona, vitamina D i glukokortikoida, snažno izazivaju autofagiju. 32, 33, 34 Zapravo, autofagija izazvana ekdizonom potrebna je za razgradnju žlijezda slinovnica, tjelesne masti i srednjeg dijela crijeva kako bi se omogućilo preuređivanje tkiva i morfogeneza za transformaciju larvi poput crva u odrasle muhe. 35 Pokazalo se da i selektivni modulatori estrogenskih receptora, uključujući tamoksifen i resveratrol, induciraju autofagiju, 36, 37 i koaktivator PELP1 estrogena receptora translocira u autofagosome nakon liječenja resveratrolom. 38 Moguće je da estrogeni, putem PELP1 ili EIG121, posredovanih putevima, moduliraju samo probavne aktivnosti tkiva endometrija maternice i tkiva mliječne žlijezde kako bi se prilagodila pregradnja tkiva endometrija tijekom menstrualnog ciklusa i laktacije i involucije mliječnih žlijezda.

Glosar

UPSC

papilarni serozni karcinom maternice

MMMT

maligni miješani mullerijski tumor

TGN

trans -Golgi mreža