Novi inhibitor hsp70 sprečava intoksikaciju stanica staničnim iota toksinom aktin adp-ribozilirajućim klostridijumom perfringensom | znanstvena izvješća

Novi inhibitor hsp70 sprečava intoksikaciju stanica staničnim iota toksinom aktin adp-ribozilirajućim klostridijumom perfringensom | znanstvena izvješća

Anonim

teme

  • Molekularni pratioci
  • Kemijski alati
  • Toksikologija

Sažetak

Hsp70 proteini obitelji su skloni proteinski pomaci koji su uključeni u široki raspon staničnih putova. Članovi ove obitelji komuniciraju s ključnim čimbenicima u transdukciji signala, transkripciji, kontroli staničnog ciklusa i reakciji na stres. Ovdje smo razvili prvi inhibitor niske molekularne težine Hsp70 koji cilja specifično mjesto vezanja peptida ljudskog Hsp70. Nakon što smo pokazali da inhibitor modulira funkciju Hsp70 u stanici, upotrijebili smo inhibitor da po prvi put pokažemo da stres-inducirani kaperon Hsp70 djeluje kao molekularna komponenta za ulazak bakterijskog proteina toksina u stanice sisavaca. Farmakološka inhibicija stanica zaštićenih Hsp70 od intoksikacije binarnim aktinom ADP-ribozilirajućim jod toksinom iz Clostridium perfringens , prototipa obitelji enterotoksina iz patogenih Clostridia i inhibira translokaciju njegove enzimske komponente kroz stanične membrane u citosol. Ovaj nalaz nudi početnu točku za nove terapijske strategije protiv određenih bakterijskih toksina.

Uvod

Pomoć u savijanju i restrukturiranju polipeptidnih lanaca glavno je obilježje presavijanja pomoćnih proteina koji također pružaju podršku za održavanje pravilno presavijenih klijentovih proteina u stanici. U nekim se slučajevima mreža sklopivih pomoćnih proteina koja uključuje peptidil prolil cis / trans izomeraze (PPIaze) i proteini toplinskog udara (Hsps) sastavi kao multimerni kompleksi koji omogućuju koordiniranu interakciju s proteinima klijenta poput steroidnih hormonskih receptora, tumorskog suprestora p53, RNA- inducirani prigušivački kompleksi koji sadrže AGO proteine ​​i jednolančane male RNK ili ionske kanale poput kalijevog kanala kašnjenja ispravljača ovisnog o naponu (HERG) ili regulatora provodljivosti cistične fibroze (transmembranski cistični fibroza) 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 . Za glavne igrače obitelji PPIase, ciklofilin i FK506-vezujući proteini (FKBP), ciklosporini i FK506 derivati, respektivno, služe kao visoki afinitet, inhibitori niske molekularne mase u funkciji ovih enzima 8, 9 . Stoga nude svestrane alate za procjenu fiziološke uloge proteinske mreže koja se sakuplja u živim stanicama, a pružaju jasan pokazatelj kemijskog načina djelovanja ovih enzima u stanici 4, 10, 11 . Zbog nedostatka specifičnih inhibitora malih molekula, čini se da je Hsp70 sklopiva pomagala, posebno poznata po zaštiti od stresa, manje pogodna za sličan farmakološki pristup.

Hsp70 proteini tvore očuvanu obitelj molekularnih chaperona. Sastoje se od N-terminalne domene vezivanja nukleotida od oko 44 kDa povezane s oko 25 kDa C-terminalnom vezom supstrata za supstrat i jedinstvene su jer, kako primjerice protein protein E.coli Hsp70 DnaK, dvije katalitičke domene čine svoje funkcionalne karakteristike, ATPazna domena upravlja ATP vezanjem jer vezanje nukleotida izaziva strukturne preuređenja u ATPazi kao i u domeni vezivanja supstrata koje omogućuju interdomeinsku komunikaciju i promoviraju visoke stope isključivanja supstrata 12, 13 . Domena koja veže supstrat prolazno djeluje s izloženim područjima mnoštva djelomično presavijenih ili nerazvijenih supstralnih proteina kako bi izvršili svoju funkciju kapenera za promicanje i reguliranje nakupljanja proteina. Bakterijski Hsp70 protein DnaK identificiran je kao sekundarna amidna peptidna veza cis / trans izomeraza (APIase), koja selektivno ubrzava cis / trans izomerizaciju nelinskih peptidnih veza 14 . Ova aktivnost nalazi se u domenu vezivanja supstrata, a smatra se da pomaže savijanje procesa povećanjem fleksibilnosti peptidnog lanca oko krute sekundarne amidne funkcionalnosti. Poput DnaK-a, i njegovi ljudski ortolozi Hsp70 i Hsc70 tvore ključne komponente u sakupljanju i održavanju funkcionalnih proteina u stanici.

Hsp70s čovjeka smatra se staničnim zaštitnim sustavom protiv staničnog stresa i stoga je presudan za opstanak stanica. Također, proteini Hsp70 uključeni su u kontrolu biološke aktivnosti velikog broja klijentovih proteina poput receptora za steroidne hormone, kinaze i transkripcijskih faktora. Iako se mnogo može otkriti o ulozi Hsp70s već je poznato da su oni uključeni u regulaciju staničnog ciklusa, transdukciju signala i apoptozu 15, 16 . Važno je da Hsp70 pomaže u posredovanju translokacije proteina kroz membrane. Na primjer, mitohondrijalni Hsp70 posreduje premještanje polipeptida u mitohondrije ubrzanjem razvlačenja i entropskim povlačenjem 17 .

Značajno je da su istraživanja o prenosu i prenosu unutarćelijskih membrana raznih medicinski značajnih bakterijskih ADP-ribozilirajućih toksina primjenom farmakoloških inhibitora PPIaza i proteina toplotnog udara 90 (Hsp90) pokazala da ti faktori ćelije domaćina igraju važnu ulogu u unosu enzimatski aktivnih podjedinica tih toksina prelazi u citosol stanice domaćina 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28 . Zapravo je ciljana farmakološka inhibicija pojedinih kapelona / PPIaza stanica domaćina spriječila translokaciju toksina u citosol i zaštitila stanice od intoksikacije. Sastav drugih multimernih kompleksa sklopivih pomoćnih proteina sugerira naše sudjelovanje u putu transporta toksina Hsp70. Nažalost, izravnu identifikaciju ove uloge Hsp70 ometa nedostatak specifičnih inhibitora Hsp70.

Prije su pokazali da su oligopeptidi bogati prolinima, pirokokoricinom usmjereni na supstancu koja veže supstrat DnaK i time ometaju njegovu aktivnost APIase 29 . Smanjenje molekularne mase ovog tipa inhibitora APIase može se postići razvijanjem niza masnih aciliranih (4-aminoalkilbenzoil) -L-aminokiselina 30 . Vrsta deterdženta masnih aciliranih inhibitora spriječila je karakterizaciju slabe inhibicije Hsp70 in vitro . Stoga je zahtijevalo razvoj novog inhibitora da detaljnije istraži način djelovanja Hsp70.

Glavno, spajanje između obje domene Hsp70s, ATPaze i domene vezivanja supstrata trebalo bi pružiti dobru priliku za blokiranje Hsp70 funkcija inhibitorima male molekularne težine usmjerenima protiv aktivnog mjesta ATPaze. Stoga je u pretraživanju inhibitora Hsp70s dizajnerska studija zasnovana na strukturi identificirala submikromolarne vezive afiniteta džepa koji se veže za ATP, kao što su 3'-sulfogalaktolipidi 31, 32 . Uz to, probir identificiranih inhibitora aktivnosti ATPaze DnaK koji dijele jezgru dihidropirimidina 33 . Drugi pristup zasnovan na strukturi, počevši od adenozina, identificirao je malu molekulu VER-155008 koja se veže na džep za vezanje ATP Hsp70 s konstantom disocijacije 0, 3 μM 34 . Inhibira i ostale članove obitelji Hsp70 kao što je pokazano za Hsc70 i endoplazmatski retikulum Hsp70 Grp78 35 .

Međutim, Hsp70s su vrlo dinamični i konformacijski prijelazi povezani s afinitetom supstrata također se događaju neovisno o nukleotidnom statusu proteina 13 . Uz to, Hsp70 kojem nedostaje ATPazna domena može osigurati određenu razinu zaštite stanica od toplinskog stresa, a pokazalo se da smanjuje agregaciju nuklearnih proteina izazvanih toplinom, iako je protein izbrisan ATPazom manje učinkovit kao divlji tip Hsp70 36, 37, Prema tome, ciljanje na Hsp70 supstrat vezivanja malih molekula stvara privlačnu alternativu za potpuno blokiranje njegove aktivnosti. Za humani Hsp70, otkriveno je da 2-feniletilnesulfonamid (PES) predstavlja inhibitor njegove kapelene funkcije 38 . Inhibira Hsp70-potpomognuto ponovno savijanje luciferaze 39 . U početku se pokazalo da Hsc70 ili Grp78 nisu u mogućnosti komunicirati s PES 38 . Kasnije je ustanovljeno da PES nije specifičan za Hsp70 izoformu i čini se da ne pokazuje afinitet prema mjestu vezanja za peptid Hsp70 39, 40 . Uzeto zajedno, do sada nema dostupnog specifičnog inhibitora koji izravno cilja domenu vezivanja supstrata ljudskog Hsp70.

Zaključno, ciljanje proteina obitelji Hsp70 malim molekulama je od velikog interesa, jer su članovi ove obitelji uključeni u široki raspon staničnih putova i interakciju s velikim brojem različitih proteina, uključujući ključne čimbenike u transdukciji signala, transkripciji, kontrola ciklusa, reakcija na stres i transport membrane. U ovom istraživanju identificirali smo kapesen Hsp70 koji inducira stresom djeluje kao molekularna komponenta ulaznog puta binarnog aktina ADP-ribozilirajućeg jota toksina iz Clostridium (C.) perfringensa . Farmakološka inhibicija Hsp70 spriječila je pH-utjecaj translokacije enzimske komponente ovog toksina preko staničnih membrana u citosol čime je štitio stanice od intoksikacije. To je postignuto razvojem novog inhibitora niske molekularne težine Hsp70 koji je posebno usmjeren na mjesto vezanja za peptid Hsp70. Procjena svojstava inhibitora male molekule ukazivala je na inhibiciju in vitro pomoć Hsp70 posredovanu presavijanju, kao i in vivo povećavajući osjetljivost stanica na apoptozu.

Rezultati

Karakterizacija inhibicije Hsp70 spojem 1

Da bi se identificirao selektivni inhibitor male molekule APIasease mjesta Hsp70, biblioteka spojeva je pregledana na inhibiciju inhibicije Hsp-potpomognutog ponovnog nanošenja denaturirane luciferaze krijesnica . Taj je napor doveo do identifikacije derivata 9-aminoakridizinija 1 kao inhibitora funkcije Hsp70 foldaze.

Spoj 1 snažno je inhibirao pomoćno djelovanje Hsp70 sa IC50 vrijednošću od 45 ± 4 µM, što je određeno smanjenjem prinosa nativnog proteina iz luciferaze denaturirane GdmCl svjetlosnim luciferazom u testu ponovnog sakupljanja potpomognutog Hsp70 (Tabela 1, sl. 1a). ATPazna aktivnost Hsp70 ostala je neizmijenjena u koncentracijama do 200 µM od 1 (Dodatne informacije, Sl. S1). Da bi se procijenila selektivnost inhibitora u odnosu na različite izoforme Hsp70 iz porodice chaperona, 1 je dodatno analizirana na inhibiciju Hsc70 potpomognutog ponovnog nanošenja luciferaze leptira. Spoj 1 pokazao je značajnu specifičnost prema Hsp70. Utvrđeno je da je inhibicija Hsc70 8-puta manje učinkovita u usporedbi s Hsp70.

Tablica pune veličine

Image

( a ) Inhibicijski učinak 1 na reaktivaciju luciferaze denaturirane s GdmCl od Hsp70. Pregrijavanje je započeto razrjeđivanjem 2, 08 µM rastvorene luciferaze u pufer za ponovno umetanje koji sadrži Hsp70 (zatvoreni krugovi) ili Hsc70 (otvoreni krugovi). Nacrtana linija izračunata je korištenjem ICso od 45 µM za Hsp70 i 363 µM za Hsc70. Svaka podatkovna točka predstavlja prosjek dupliciranih određenja koja su se razlikovala ne više od 10%. ( b ) Derivat 1 u interakciji s Hsp70, ali ne i Hsc70 u staničnom lizatu HeLa. Affigel-10 zrnca koja su prethodno inkubirana sa 1 inkubirana su sa HeLa staničnim lizatom. Vezani proteini su analizirani pomoću SDS-PAGE i imunoblotingom koristeći anti-Hsp70 i anti-Hsc70 antitijela, respektivno. Kao kontrole upotrijebljene su kuglice za kontrolu opterećenja i kuglice 10 sa 1 koji nisu inkubirani s 1 . ( c ) Vezanje peptida dobivenih s Hsp70 na p53 inhibirano je 1 . Vezanje je detektirano inkubiranjem celulozno vezanog peptidnog niza pmer-1212-peperida izvedenih p53 samo Hsp70 (gornja ploča), a inhibicija vezivanja uočena je u dodatnoj prisutnosti 1 (donja ploča). ( d ) Peptidni NRLLLTG natjecao se sa spojem 1 za vezanje na Hsp70. Analiza je izvedena u tri primjerka natjecateljskim eksperimentom na temelju fluorescencije. Kontinuirane linije predstavljaju najbolje uklapanje podataka u model jednog mjesta vezanja. Trake pogrešaka predstavljaju SD. ( e ) Izotermalna titracija Hsp70 s 1. Gornja ploča: neobrađeni podaci o titraciji; donja ploča: integrirane entalpije. Otopina od 20 µM Hsp70 (početna koncentracija) titrirana je na 20 ° C sa 200 µM 1 i stavljena je na model vezanja na jednom mjestu, što rezultira K D od 5, 6 ± 3, 1 µM, sa stehiometrijom N = 1, 1, ΔH ITC = 1, 3 ± 0, 3 kcal mol –1, a TΔS ITC = 8, 3 kcal mol –1 . ( f ) Učinak derivata akridizinija na opstanak stanica pomoću klonogenog testa. Za EC50 utvrđeno je da iznosi 11, 2 µM za 1 i 13, 1 µM za 3 .

Slika pune veličine

Suprotno tome, alkilamino supstituirani derivat akridizinija 2 koji inhibira Hsp70 s vrijednosti ICso od 127 ± 7 µM inhibira Hsc70 sa 10-puta povećanim afinitetom u usporedbi s Hsp70 (Tablica 1). Za usporedbu je također uključen sulfanil-supstituirani derivat 3, koji se razlikuje od 1 samo u supstituentu na položaju 9 prstena akridizinija, ali to nije značajno inhibiralo pomoćno djelovanje Hsp70 na previjanje proteina. Stoga se derivat 3 može upotrijebiti za Hsp70-inertnu kontrolu. Dakle, stanični učinci koji nastaju samo primjenom 1, ali ne i primjenom 3 vjerojatno su posredovani inhibicijom Hsp70, dok su biološki odgovori na oba spoja vjerojatno posljedica nuspojava koje nisu povezane s inhibicijom Hsp70.

Da bi se potvrdilo da li se 1 može vezati na endogeni Hsp70, pokušani su izravno analizirati stanične ciljeve 1 u staničnom lizatu. HeLa stanični lizati se inkubiraju sa 1 spojenom na zrnca-afigel-10. Nakon opsežnog ispiranja, kompleksi 1 sa staničnim proteinima analizirani su imunoblotingom koristeći specifična antitijela anti-Hsp70 i anti-Hsc70 koja ne pokazuju unakrsnu reaktivnost. Dokazi za interakciju Hsp70 / ( 1 ) među Hsp70 obitelji u stanici uspostavljeni su detekcijom Hsp70, ali nije utvrđena količina Hsc70 vezana za matriks 1 (slika 1b).

Vezanje 1 na mjesto vezanja peptida Hsp70

Dalje smo istražili da li rekombinantni Hsp70 veže 1 preko svog vezivnog mesta za C-terminalni peptid, što je identično katalitičkom rascepu APIasease u Hsp70 kapepenu DnaK 14 . Ovo proteinsko područje tvori kanal definiran petljicama napravljenim od beta sendvič strukture domene 41 koja se veže za supstrat C-terminala. Novo ispitivanje konkurencije uspostavljeno je dizajniranjem biblioteke preklapajućeg 12-metarsko oligopeptida vezanog na matriksu poznatog proteina koji veže Hsp70 p53 42 . Vezanje Hsp70 na biblioteku vezanog za peptid vezano na matricu korišteno je da bi se otkrilo da li Hsp70 trpi gubitak afiniteta u prisustvu 1 (Sl. 1c). Peno skeniranje oligopeptida pokazalo je šest glavnih područja vezivanja Hsp70 koja obuhvaća sekvence proteza 23 WKLLPENN 30, 107 YGFRLGF 113, 215 SVVVPYE 221, 251 ILTIITL 257, 329 TLQIRGR 335 i 376 STSRHKK 382 . U prisustvu 1 Hsp70 vezanje za pet od šest interaktivnih regija je ukinuto. Ovaj rezultat pokazao je sposobnost 1 da istisne 12-mer peptide iz Hsp70 / peptidnog kompleksa kompetitivnim vezanjem na isto mjesto Hsp70 (Sl. 1c). Samo vezanje Hsp70 na peptide regije p53 107 YGFRLGF 113 ostalo je neoštećeno, što ukazuje na alternativno mjesto vezanja za peptide koji obuhvaćaju ovu sekvencijalnu regiju neovisnu od 1 .

Dodatno smo analizirali vezanje 1 na Hsp70 pomoću fluorescentnog ispitivanja konkurencije 43 . Sve veće količine peptida NRLLLTG (NR peptid) primijenjene su u otopinu Hsp70 vezano na 1 . Pokazalo se da se NR peptid veže na mjesto vezanja za peptid Hsp70 39, 43 . Interakcija Hsp70 i 1 rezultirala je smanjenjem fluorescentnog signala od 1. Porast fluorescencije nakon dodavanja 1 pokazao je sposobnost NR peptida da istisne spoj 1 iz kompleksa Hsp70 / 1 (Sl. 1d). Konkurentski test pokazao je ICso vrijednost od 11, 5 ± 3, 8 µM za NR peptid koja je slična KD od 9 µM već opisanom za NR peptid 43 .

Za određivanje termodinamičkih parametara reakcije asocijacije između Hsp70 i 1, izvedeni su ITC eksperimenti. Titracija 20 µM Hsp70 sa 200 µM 1 obavljena je na 20 ° C i pH 7, 8 (Sl. 1e). Otkrila je entalpiju vezanja ΔH ITC od 1, 3 ± 0, 3 kcal mol -1, TΔS ITC od 8, 3 kcal mol -1 i ΔG ITC od - 7, 0 kcal mol -1, što rezultira konstantom disocijacije K D od 5, 6 ± 3, 1 µM. Pozitivni ΔH i pozitivni TΔS pokazali su da je povezanost Hsp70 s 1 entalpično poremećena, ali entropijski pogođena. Pozitivan entropski doprinos nagovještava zakopavanje površine dostupne otapalu na vezivanje, jer oslobađanje naručenih molekula vode u rastvoru otapala često pridonosi povoljnom entropskom doprinosu interakciji.

Citotoksičnost inhibitora Hsp70

Da bi se ispitao utjecaj inhibicije Hsp70 u živim stanicama sisavaca, određena je citotoksičnost povezana s primjenom derivata akridizinija.

Prvo, različite stanice ljudskih stanica, uključujući stanice maternice (HeLa), bubrege (HEK-293), debelo crijevo (HT-29) i neuroblastom (SH-SY5Y), analizirane su pomoću MTT testa za citotoksično djelovanje 1 i 3 ( Tablica 2). Oba spoja inhibiraju opstanak stanica ovisno o staničnoj liniji koja se koristi s vrijednostima EC50 u sličnom rasponu, što ukazuje da je citotoksičnost spojeva neovisna o Hsp70. Međutim, stanična održivost Vero stanica nije oslabljena tijekom kraćeg vremena inkubacije, tj. 2-5 h (Dodatne informacije, Sl. S2).

Tablica pune veličine

Da bismo procijenili dugoročnu citotoksičnost spojeva, analizirali smo učinak 1 i 3 na preživljavanje HeLa stanica u klonogenom testu (Slika 1f). HeLa stanice su razmnožene nakon inkubacije s povećanom koncentracijom oba spoja tijekom 28 sati na 37 ° C. Kolonije formirane od preživjelih HeLa stanica brojene su nakon inkubacije od 2 tjedna, a preživljavanje je izračunato u usporedbi s kontrolnim stanicama. Dobivena krivulja doza-odgovor omogućila je procjenu vrijednosti ICso od 11, 2 µM za 1 i 13, 1 µM za 3 (Sl. 1f). Kraće izlaganje spojevima rezultiralo je smanjenom osjetljivošću stanica. Slična stanična osjetljivost prema 1 i 3 ukazuje da inhibicija Hsp70 ne pridonosi dugoročnoj citotoksičnosti. HPLC analize lizata nakon 24 h inkubacije stanica pružile su dokaze da spojevi nisu samo propusni za stanice, već su i kemijski stabilni u tim uvjetima (Dodatne informacije, Sl. S3).

Uzeti zajedno, naši rezultati pokazuju neke citotoksične učinke akridizinijevih spojeva neovisnih o inhibiciji Hsp70. Citotoksični efekti pojavili su se nakon relativno dugog razdoblja inkubacije od 28 resp. 48 h pod odgovarajućim eksperimentalnim uvjetima. Slična sposobnost spojeva 1 i 3 da se vežu za DNK 44, 45, 46, sugerira citotoksičnost povezana sa svojstvima spojeva DNA. Međutim, ovi citotoksični učinci ograničavaju primjenu spojeva za intracelularnu inhibiciju Hsp70 na koncentracije u nižem mikromolarnom rasponu i vrijeme inkubacije ne duže od 24 h.

Utjecaj 1 na lokalizaciju Hsp70 nakon toplotnog udara

Dalje smo ispitali sposobnost akridizinijum spojeva na staničnu morfologiju i subcelularnu raspodjelu Hsp70 u stanicama HeLa pod normalnim i toplotnim stresom.

Otkrili smo da prisustvo 1 inducira snažnu citoplazmatsku vakuolizaciju HeLa stanica nakon toplinskog stresa što je identificirano faznom kontrastnom mikroskopijom (Slika 2). Ni HeLa stanice u odsutnosti 1 niti u prisutnosti 3 nisu pokazale usporedivu tvorbu vakuola.

Image

Hsp70 lokaliziran u svim HeLa stanicama 37 ° C lokaliziran u nukleole nakon toplinskog udara 1 sat na 42 ° C. Izloženost stanica derivatu 1 akridizinija inhibirala je relokalizaciju Hsp70 nakon toplotnog udara, dok neaktivni acridizinijum derivat 3 nije utjecao na preseljenje Hsp70 u nukleole nakon toplotnog udara. Stanice su fiksirane i označene antitijelima na Hsp70 (zeleno). DNA je obojena DAPI (plava).

Slika pune veličine

Poznato je da Hsp70 mijenja toplinsku struju. Citoplazmatska distribucija Hsp70 opažena na 37 ° C se mijenja, što rezultira nukleolarnom lokalizacijom na 42 ° C (Sl. 2). Prisutnost 1 nije promijenila lokalizaciju Hsp70 na 37 ° C. Međutim, 1 je izazvao dramatičnu ponovnu distribuciju Hsp70 u cijelo jezgro na 42 ° C, nakon čega je nukleolarna akumulacija nestala. Kontrolni spoj 3 nije promijenio staničnu raspodjelu niti na 37 ° C niti pri 42 ° C.

Zaključno, prisutnost 1 zabranjuje nakupljanje Hsp70 u nukleolu tijekom toplinskog stresa. Ovo sugeriše da 1 inhibira ciljanje Hsp70 proteina supstrata koji se akumuliraju u nukleolu u uvjetima toplinskog stresa.

Indukcija apoptoze i zaustavljanje staničnog ciklusa

Zbog poznatog učešća Hsp70 u apoptozi, analizirali smo utjecaj inhibicije Hsp70 na apoptozu HeLa stanica. Profili aktivacije kaspaze 3 i 7 utvrđeni su Western blot analizom (Sl. 3a). Otkriveno je da primjena 0, 4 µM staurosporina rezultira cijepanjem obje propaspare, dok 0, 1 µM staurosporin nije rezultirao značajnim cijepanjem. Međutim, primijećeno je kombinirano davanje 0, 1 µM staurosporina i mikromolarne koncentracije 1 inducirajući sinergistički učinak u cijepanju oba, propapaze 3 i 7 i istodobnom stvaranju aktivnih fragmenata kaspaze.

Image

Za indukciju apoptoze u HeLa stanicama 1 potreban je ko-stimulus, poput staurosporina. ( a ) Analiza proteolitičkog cijepanja proenzima kaspaze-3, proenzima kaspaze-7 i poli (ADP-riboze) polimeraze (PARP). Spojene HeLa stanice bile su izložene 1, 3 ili staurosporinu ili kombinaciji derivata akridizinija i staurosporina. Kombinacija 1 i staurosporina povećala je proteolitičko cijepanje koje ukazuje na apoptozu. Proteini staničnih lizata su otopljeni pomoću SDS-PAGE i analizirani imunoblotingom. ( b ) Aktivacija kaspaze 3/7 tijekom apoptoze u prisutnosti derivata akridizinija i staurosporina. Citosolni ekstrakti su inkubirani s kaspaza 3/7 specifičnim supstratom Ac-DEVD-pNA, a apsorpcija p-nitroanilina proteolitički oslobođeno aktivnom kaspazom 3/7 izmjerena je na 405 nm. Staurosporin je primijenjen u 0, 1 µM (+) ili 0, 4 µM (++), koncentracija 1 bila je 177 µM (+) ili 355 µM (++), a koncentracija 3 bila je 320 µM (++). 1 i staurosporin povećali su proteolizu što ukazuje na aktivnu kaspazu 3/7.

Slika pune veličine

Čak i u koncentracijama do 10 µM 1 pojačana je indukcija apoptoze pomoću staurosporina (Dodatne informacije, Sl. S4a). Pored toga, aktivnosti kaspaza 3 i 7 mjerene su korištenjem kolorimetrijskog ispitivanja i pokazale su rezultate slične onima dobivenim Western blotiranjem (Sl. 3b). Primjena kombinacije staurosporina / 3 ili 1 ili 3 sama nije rezultirala značajnim cijepanjem propaspaza. Također treba imati na umu da prisutnost suprotnih BF 4 - ili Br - u kombinaciji sa staurosporinom nije imala značajnog utjecaja na stvaranje aktivnih fragmenata kaspaze (Dodatne informacije, Sl. S4b). Među endogenim proteolitičkim supstratima koji se posebno cijepaju tijekom apoptoze je poli (ADP-riboza) polimeraza (PARP) 47 . Rascjep PARP od 116 kDa s istodobnim stvaranjem produkta cijepanja PARP od 24 kDa izazvan je kombiniranom primjenom staurosporina i 1, dok sam spoj primijenjen u istim koncentracijama nije imao učinka. Ovi rezultati pokazuju da primjena 1 osjetljivih stanica na apoptotsku uvredu dok sama po sebi nije inducirala apoptozu. Nadalje, nalaz da spoj 1 modulira dobro poznatu staničnu funkciju Hsp70, tj. Anti-apoptotički učinak, poslužio je kao dokaz koncepta funkcionalnosti spoja 1 u živim stanicama.

Dalje smo procijenili učinak 1 staničnog ciklusa na kultivirane HeLa stanice pomoću protočne citometrijske analize. Stanice HeLa u eksponencijalno rastu izložene su 25 µM tijekom 1 h. Ovaj tretman nije rezultirao promjenama u raspodjeli faza staničnog ciklusa (Slika 4). Ponavljanje eksperimenta s nametnutim zaustavljanjem staničnog ciklusa pokazalo je značajan utjecaj inhibicije Hsp70 na stanični ciklus. Dok su gotovo sve kontrolne stanice koje su tretirane timidom akumulirane u G1 / S, > 20% dodatnih inhibiranih Hsp70 stanica ostalo je u G2 / M. Suprotno tome, gotovo sve kontrolne stanice tretirane nocodazolom nakupljene su u G2 / M, dok se stanice koje inhibiraju Hsp70 nisu akumulirale u fazi G2 / M, već su pokazale raspodjelu faza nalik neobrađenim stanicama. Analiza subcelularne raspodjele Hsp70 stanica liječenih timidinom i nokododazolom pokazala je da dodatna prisutnost 1 nije promijenila difuznu raspodjelu proteina u jezgri i citoplazmi (Dodatne informacije, Sl. S5). Primjerno, primjena spoja 1 nije utjecala na količinu Hsp70 u stanicama HeLa (Dodatne informacije, Sl. S6).

Image

Primjena 1 inducira zaustavljanje G1 u stanicama HeLa. HeLa stanice su predinkubirane 1 sat na 37 ° C u prisutnosti 0, 4% DMSO ili 25 μM 1 . Nakon toga, stanice su tretirane s timidinom, nokodazolom ili razrjeđivačem 20 sati prije žetve. HeLa stanice analizirane su na DNK sadržaj protočnom citometrijom. Označeni su položaji vrhova G1 (1) i G2 / M (2). Eksperiment je izveden tri puta s istim rezultatima.

Slika pune veličine

Uzeto zajedno, kod 1 je otkriveno da zaustavlja fazu zaustavljanja staničnog ciklusa iako sam spoj nije utjecao na profil staničnog ciklusa.

Farmakološka inhibicija Hsp70 u stanicama sprječava transport enzimske komponente internaliziranog C. perfringens iota toksina kroz membrane i tako štiti stanice od intoksikacije

Nakon demonstriranja specifičnosti povezane s Hsp70, inhibicijske učinkovitosti, podnošljivosti u stanicama domaćina sisavaca i sposobnosti da mijenjaju funkcije Hsp70 u stanici, eksperimentira u prisutnosti akridizinijevih spojeva kako bi istražili je li Hsp70 uključen u translokaciju Ia, enzimske komponente C. perfringens iota toksin, u stanice domaćina, postalo je moguće.

Budući da enzimske komponente klostridijalnog binarnog aktina ADP-ribozirajući toksini međusobno djeluju s Hsp90 i PPIazama i u živim stanicama 18, 19, prvo smo analizirali da li ti toksini fizički djeluju s Hsp70 i / ili Hsc70. Stoga je provedena dot blot analiza kako bi se provjerilo da li se enzimske enzime iz toksina C. botulinum C2 (C2I) i iota toksina (la) izravno vežu na Hsp70 in vitro . Pročišćeni Hsp70 i Hsc70 uočeni su na nitroceluloznoj membrani nakon čega slijedi prekrivanje biotin-C2I ili la.

Rezultat prikazan na slici 5 pokazao je izravno vezanje Hsp70 ili Hsc70 na C2I i la. Ove interakcije bile su specifične jer se enzimske komponente nisu vezale za nerelevantni C3bot protein ili na membranu i nije bilo signala kada se umjesto biotina-C2I ili biotin-Ia primijenio pufer (Sl. 5). Zanimljivo je da PPIase FKBP12 nije vezao C2I ili Ia.

Image

( a ) Smanjivanje količine pročišćenih proteina Hsp70, Hsc70, Hsp90 (za pozitivnu kontrolu) i FKBP12 i C3bot (za negativnu kontrolu) usisava se u vakuumu na nitroceluloznu membranu pomoću dot blot sustava. Membrana je blokirana s PBS-T koji sadrži 5% nemasnog suhog mlijeka i inkubiran je s C2I, la (200 ng ml -1 ) ili s PBS-T za kontrolu tijekom 1 sata. Nakon ispiranja, vezane komponente enzima otkrivene su streptavidin-POD pomoću ECL sustava (gornja ploča). Uspješna imobilizacija pročišćenih proteina potvrđena je obojenjem Ponceau S (donja ploča). ( b ) Denaturirana komponenta enzima Ia pokazuje jače vezanje za Hsp70 i Hsc70 u usporedbi s matičnim oblikom. Eksperiment je izveden kao što je opisano u a) osim što je jedan dio laka inkubiran u 6 M gvanidinijum hidrokloridu (denaturiran Ia) prije prekrivanja, dok je drugi dio laka inkubiran u PBST (nativno Ia).

Slika pune veličine

Nadalje, istraživali smo interakciju Hsp70 i Hsc70 s denaturiranom enzimom komponentom Ia toksina. Denaturacija je izvedena inkubacijom la u 6 M gvanidinij hidrokloridu. Denaturirana enzimska komponenta pokazala je značajno jače vezivanje u odnosu na nativni oblik na Hsp70 i Hsc70 kao i na kontrolni Cyp40, što je pokazano ranije 24 . Napominjemo, vezanje denaturiranog la je još uvijek bilo specifično jer nije postojao signal koji se mogao detektirati za interakciju s C3bot, a koji je služio kao negativna kontrola (nije prikazano).

Potaknuti ovim rezultatom, testirali smo je li Hsp / Hsc70 funkcionalno uključen u pH-ovisnu translokaciju Ia kroz stanične membrane, kao što smo ranije primijetili za Hsp90 i PPIaze. U tu svrhu, Vero stanice prethodno su tretirane bafilomicinom A1 da inhibiraju normalno unošenje totaksina. Pored toga, neke stanice su tretirane s općim inhibitorom aktivnosti ATPaze Hsp70s, VER-155008, a neke druge s radičikolom inhibitorom Hsp90. Translokacija Ia iz staničnog vezanog jod toksina ispitivana je u prisutnosti i odsutnosti VER-155008 ili radikokola oponašajući pH-transport Ia kroz endosomske membrane na staničnoj površini. Iota toksin bio je vezan na stanice pri 4 ° C i izložen je kiselom mediju da aktivira ubacivanje Ib u citoplazmatsku membranu gdje tvori trans-membranske pore koje služe za premještanje Ia preko citoplazmatske membrane stanica u citosol. Premješteni Ia ADP-ribozilat aktin i na taj način rezultira zaokruživanjem stanica, specifičnom krajnjom točkom za nadziranje Ia translokacije. Zaokružene su samo stanice tretirane jod toksinom i izložene kiselom medijumu (Sl. 6a). Važno je da je nakon prethodnog tretmana s VER-155008 postojalo značajno manje okruglih stanica, usporedivo sa stanicama koje su prethodno tretirane radikokolom (Sl. 6a), što ukazuje da je ATPazna aktivnost Hsp70s presudna za pH-premještanje Ia preko staničnu membranu. Budući da VER-155008 (kao i radikokol) nije imao utjecaja na enzimsku aktivnost Ia (sl. 6c) niti na vezanje iota toksina na stanice (slika 6b), ovi rezultati snažno sugeriraju da Hsp70 olakšava translokaciju Ia iz kiselih endosoma u citosol tijekom normalnog unosa toksina.

Image

( a ) Za ispitivanje translokacije toksina, Vero stanice su prethodno inkubirane s VER-155008 ili radikokolom (Rad) u kombinaciji s bafilomicinom A1 (BafA1) i za kontrolu samo sa BafA1 u trajanju od 30 minuta na 37 ° C. Nakon vezanja jod toksina (200 ng ml -1 la i 200 ng ml -1 lb) na 4 ° C, stanice su izazvane toplim kiselim sredstvom kako bi se omogućilo izravno premještanje Ia preko citoplazmatske membrane u citosol stanice stanice domaćina. Za kontrolu, stanice su inkubirane s neutralnim medijem. Nakon toga, stanice su dalje inkubirane na 37 ° C i praćena je stanična morfologija. Postotak zaobljenih stanica određen je prema slikama snimljenim nakon 2, 75 h inkubacije. Vrijednosti su date kao srednje ± SD (n = 3). ( b ) Inhibicija aktivnosti Hsp70 ne utječe na vezivanje receptora jod toksina. Nakon inkubacije s VER-155008 ili Radom (za kontrolne stanice su ostale neobrađene), Vero stanice su ohlađene na 4 ° C i dodan je jod toksin 30 min (200 ng ml -1 -1 Ia i 200 ng ml -1 Ib), Nakon ispiranja, stanični vezan jod toksin detektiran je analizom ADP-ribosiltransferaze aktivnosti stanično povezane Ia in vitro zapadnim upijanjem. ( c ) Inhibicija Hsp70 ne ometa enzimsku aktivnost la in vitro . ( d ) Hsc / Hsp70 inhibitor VER-155008 inhibira intoksikaciju Vero stanica sa C. perfringens iota toksinom. Slike prikazuju morfološke promjene izazvane toksinom nakon 4, 5 h liječenja toksinom.

Slika pune veličine

Stoga smo istražili ulogu Hsp70 tijekom unosa jod toksina u Vero stanice i testirali učinke VER-155008 kao i 1 na intoksikaciju stanica totaksinom. Obrazloženje da farmakološka blokada daje izravne dokaze za funkcionalno sudjelovanje, Vero stanice prethodno tretirane s VER-155008 ili 1, dovode u pitanje jod toksin, a zaokruživanje stanica uzrokovano toksinom analizirano je kao krajnja točka za unos enzimskog aktivnog Ia u citosol. Kao što je prikazano na slici 6d, prethodna obrada stanica s VER-155008 imala je inhibitorni učinak na intoksikaciju stanica totaksinom. Slično radikoliku, koji je korišten za pozitivnu kontrolu, prethodna obrada stanica sa 100 µM 1 značajno je odgodila zaokruživanje stanica uzrokovanih toksinom u svim ispitivanim vremenskim točkama (slika 7a). Pod eksperimentalnim uvjetima korištenim u ovom istraživanju, nema dokaza da spoj 1 može blokirati Ib pore u membranama Vero stanica (nije prikazan). Važno je da neaktivni analog 3 inhibitora Hsp70 1 nije imao usporedivi inhibicijski učinak na intoksikaciju Vero stanica joda toksinom u koncentraciji do 200 µM (Sl. 7b). Nadalje, primjena NR peptida, koji se veže na mjesto vezanja za peptid Hsp70 i sprječava interakciju Hsp70 s proteinima klijenta, u mediju za kulturu nije utjecala na intoksikaciju Vero stanica joda toksinom (nije prikazano), što ukazuje da je vanćelijski Hsp70 ne igra ulogu u unosu tota tota.

Image

( a ) Utjecaj 1 na intoksikaciju Vero stanica sa C. perfringens iota toksinom. Vero stanice prethodno su se inkubirale 30 minuta na 37 ° C sa 100 µM 1 i za kontrolu s 10 µM radikokolom (Rad) ili su ostale neobrađene za kontrolu. Nakon toga dodan je jod toksin (50 ng ml -1 la i 100 ng ml -1 lb) i stanice su dalje inkubirane na 37 ° C. Slike prikazuju morfološke promjene nakon 2 sata liječenja toksinom. Za kvantitativnu analizu, postotak zaobljenih ćelija određen je prema slikama snimljenim u naznačenim vremenskim točkama. Vrijednosti su date kao srednje ± SD (n = 3). ( b ) Neaktivni analog 3 inhibitora 1 Hsp70 ne utječe na intoksikaciju Vero stanica joda toksinom. Vero stanice prethodno su se inkubirale 30 minuta na 37 ° C sa 100 µM 1, 100 µM 3 ili 200 µM3 ili su ostale neobrađene (kontrola). Nakon toga dodan je jod toksin (50 ng ml -1 la i 100 ng ml -1 lb) i stanice su dalje inkubirane na 37 ° C. Slike prikazuju morfološke promjene nakon 4 sata liječenja toksinom. Za kvantitativnu analizu, postotak zaobljenih ćelija određen je prema slikama snimljenim u naznačenim vremenskim točkama. Vrijednosti su date kao srednje ± SD (n = 3).

Slika pune veličine

Zajedno smo identificirali i okarakterizirali novi spoj koji djeluje kao specifičan inhibitor Hsp70 u živim stanicama sisavaca. Upotrebom ovog inhibitora uspjeli smo identificirati Hsp70 kao novog partnera funkcionalne interakcije enzimske komponente binarnog aktina ADP- ribozilirajućeg toksina C. perfingens . Nadalje, pokazali smo prvi put da je aktivnost Hsp70 stanica domaćina sisavaca ključna za stanični unos toksina bakterijskog proteina, jer Hsp70 olakšava isporuku enzimske komponente internaliziranog toksina kroz stanične membrane u citosol.

Rasprava

U stanici se često može naći da Hsp70 chaperoni surađuju s Hsp90, molekularnim chaperonom od posebnog značaja za homoeostazu proteina. Zajedno s koperoronima i PPIazama, oni tvore komplekse višekaperona koji su važni za aktivaciju, savijanje, subcelularnu lokalizaciju i sazrijevanje proteina njihovih klijenata. Ranije smo izvijestili da Hsp90 i članovi dviju obitelji PPIaza, naime ciklofilini i proteini koji vežu FK506 (FKBP), olakšavaju unutarstanični membranski transport enzimskih komponenata internaliziranih klostridijalnog binarnog aktina ADP-ribozilirajućih toksina iz kiselih endosoma u citosol stanice domaćina. Stoga se postavilo pitanje uključuje li postupak translokacije toksina kompletnu mašineriju za potpomognuto savijanje proteina, uključujući Hsp70 kapelene.

Da bismo procijenili učinke Hsp70 na translokaciju toksina u stanicama živih sisavaca, potražili smo mali inhibitor molekule Hsp70 usmjeren na njegovo mjesto vezanja za peptid. Kako smo već pokazali identitet mjesta vezanja za peptid i mjesto APIasea za bakterijski Hsp70 homolog DnaK 14, 30, korišten je test temeljen na kataliziranoj reaktivaciji denaturirane luciferaze 48 u prisutnosti rekombinantnog ljudskog Hsp70. Na temelju ovog ispitivanja, derivat akridizinija 1 s molekularnom masom od 282 Da identificiran je iz malobrojne biblioteke spojeva kao specifičnog inhibitora Hsp70 koji pokazuje vrijednost ICso od 45 ± 4 µM. ITC mjerenja otkrila su vrijednost K D od 5, 6 ± 3, 1 µM za Hsp70 / 1 kompleks. Spoj nije utjecao na ATPaznu aktivnost Hsp70, ali je ukinuo vezanje Hsp70 na peptide izvedene p53 za koje se zna da imaju afinitet na mjesto vezanja za peptid Hsp70 42 i izravno se natječe s NR peptidom za vezanje na Hsp70 (slika 1d). Stoga se može pretpostaviti da povezivanje derivata akridizinija istovremeno blokira mjesto vezanja za peptid Hsp70.

Da bismo analizirali može li 1 modulirati poznatu staničnu funkciju Hsp70, ispitali smo njezin učinak u programiranoj staničnoj smrti. Primjena samog inhibitora Hsp70 na stanice bez stresa nije imala značajnog utjecaja na apoptozu. Međutim, u skladu s anti-apoptotičkim funkcijama Hsp70, mogli bismo pokazati da su 1 stanice koje su bile tretirane staurosporinom osjetljivije na indukciju apoptoze. Taj je učinak ocijenjen aktivacijom i proformnim cijepanjem efektorskih kaspaza 3 i 7.

Značajno je da je Hsp70 poznati negativni regulator apoptoze koji interferira s djelovanjem različitih apoptotskih ključnih proteina. Stoga je pronađeno da Hsp70 djeluje u obliku faktora-1 koji aktivira proteptozu apoptoze i tako inhibira aktivaciju kaskade kaspaze 49 . Prekomjerna ekspresija Hsp70 inhibira apoptozu i sprječava aktivaciju kaspaze pri različitim staničnim naponima, uključujući akumulaciju pogrešno savijenih proteina, prisutnost reaktivnih vrsta kisika ili oštećenje DNK 50, 51 . Sukladno našim rezultatima, iscrpljivanje Hsp70 antisenskim konstrukcijama ili primjena siRNA povećala je osjetljivost stanica na apoptotičke podražaje 52, 53 . Hsp70 vezni peptid ADD70 izveden iz faktora koji inducira apoptozu AIF usmjeren je prema osjetljivim stanicama humanog karcinoma na peptidne stanice na kemoterapijska sredstva staurosporin i cisplatin 54 . Također stanice ATPase usmjerene na Hsp70 i Hsc70 inhibitore VER-155008 osjetljive na karcinom debelog crijeva HCT116 umiru u kombinaciji s drugim lijekovima 34 . Uzeto zajedno, ovo sugerira da onemogućavanje Hsp70 inhibicijom bilo peptidne vezivanja ili ATPazne aktivnosti ili iscrpljivanjem proteina rezultira smanjenjem citoprotekcije, a time i snižavanjem praga učinkovitosti protiv apoptotskih podražaja. Za razliku od 1, pokazalo se da PES koji djeluje na C-terminalnom dijelu Hsp70 39 inducira apoptotsku kapaza-ovisnu staničnu smrt neovisnu o vanjskim podražajima 38 . Ovi rezultati ukazuju na razlike u biokemijskom načinu djelovanja 1 i PES, jer potonji spoj ne pokazuje afinitet prema mjestu kanonskog vezanja za peptid Hsp70 39, 40 . Stoga je ovdje opisani pristup omogućio identifikaciju derivata akridizinija kao prvih spojeva male molekulske težine usmjerenih na mjesto vezanja za peptid Hsp70.

Da bismo dalje karakterizirali učinke 1 na Hsp70 funkcije u živim stanicama, istražili smo implikacije davanja 1 za unutarstaničnu lokalizaciju Hsp70. Poznato je da Hsp70 pokazuje difuznu citoplazmatsku i nuklearnu lokalizaciju na fiziološkoj temperaturi u asinhronoj populaciji stanica 55 . Nakon toplinskog stresa, pokazano je da migrira do jezgre i povezuje se s jezgrama. Za nukleolarnu lokalizaciju, pokazalo se da supstrat vezivanja supstrata igra presudnu ulogu 55 . Smatra se da se Hsp70 akumulira u nukleolima zajedno s denaturiranim supstratima kako bi se pomoglo savijanje tijekom oporavka stresnih stanica 56 . Zanimljivo je da je 1 ukinula povezanost Hsp70 s jezgrama. To sugerira suzbijanje stvaranja Hsp70 kompleksa s denaturiranim supstratnim proteinima s obzirom da ti kompleksi čine preduvjet nukleolarne lokalizacije Hsp70 56 . Značajno je 1 inducirana stanična vakuolizacija u uvjetima toplinskog stresa. Slično, pokazalo se da PES inducira citoplazmatsku vakuolizaciju 38 . Istraživanja vakuolizacije izazvana inhibicijom Hsp90 u kombinaciji s proteasomskom blokadom dovode do pretpostavke da stresori koji promiču akumulaciju pogrešno savijenih proteina mogu imati potencijal da induciraju staničnu vakuolizaciju 57 . Budući da se Hsp70 translocira u jezgru i jezgre, ne samo pod stresnim uvjetima, već i tijekom S-faze 55, analizirali smo utjecaj 1 na stanični ciklus. Iako je neučinkovit za preraspodjelu Hsp70, 1 je spriječio nakupljanje stanica izazvanih timidinom u S fazi kao i zaustavljanje stanica nokododazolom u fazi G2 / M staničnog ciklusa.

Otkrivši da 1 služi kao specifičan farmakološki inhibitor Hsp70 u živim stanicama, iskoristili smo 1 kako bismo istražili da li osim Hsp90 i PPIaze, Hsp70 ima ulogu i za unos bakterijskih toksina ADP-ribosilirajućih proteina u stanice sisavaca. U tu svrhu, prethodno smo tretirali stanice inhibitorom 1 Hsp70 prije primjene iota toksina C. perfringens i pratili zaokruženje stanica uzrokovanih toksinom u usporedbi sa stanicama koje su tretirane iota toksinom u odsutnosti inhibitora. Slično kao nakon primjene radikola, specifičnog inhibitora Hsp90, stvaranje zaobljenih stanica koje ukazuju na intoksikaciju je snažno smanjeno, što implicira da je manje enzimatske aktivne komponente la dostiglo citosol stanice domaćina u prisutnosti inhibitora 1 . Treba napomenuti da 1 nije imao citotoksični učinak na Vero stanice pod odgovarajućim eksperimentalnim uvjetima. Usporedba učinaka ciljanih Hsp70 1 i Hsp70 inert 3 u živim stanicama sisavaca omogućila je razliku između alternativnih reakcijskih načina spojeva. Općenito, svojstva vezanja DNA opisana su za različite derivate kinolizinija58. Pokazalo se je da derivati ​​akridizinija 1 i 3 interkaliziraju u dupleksnu DNA, što može dovesti do genotoksičnih učinaka. Međutim, kako je sposobnost vezanja na DNA vrlo slična za oba spoja 1 i 3 44, 45, 46, različiti učinci 1 i 3 u živim stanicama podrazumijevaju Hsp70 način djelovanja u inhibiciji intoksikacije i isključuje ne- specifične učinke kao što su povišenje endosomskog pH. Dakle, inhibicija Hsp70 izravno je ukazivala na važnost nekontroliranog mjesta vezanja peptida za prisutnost funkcionalnog toksina u citosolu ciljnih stanica.

Eksperimenti s točkovnim mrljama uključivali su enzimske komponente C2 i jota toksine kao partnere za interakciju i Hsp70 i Hsc70 in vitro . U našim ranijim studijama potvrdili smo da se samo ADP-ribozilirajući toksini i njihove izolirane domene ADP-ribosiltransferaze vežu na pročišćene kaperone / PPIaze u testu dot-blot blokade, ali ne i na transportne podjedinice (npr. C2IIa 24 ), enzimske podjedinice bakterijskih proteinskih toksina koji su a ne ADP-ribosiltransferaze kao što je letalni faktor antraksa 59 . Nadalje, denaturirani oblik enzimske komponente iota toksina pokazao je jače vezivanje u odnosu na nativni oblik. Ovaj rezultat je vjerodostojan, jer se enzimska komponenta mora barem djelomično razviti kako bi se translocirala kroz uske pore formirane vezanjem / translokacijskom komponentom u citosol stanice domaćina. Poznato je da Hsp70 djeluje i sa neobrađenim proteinima i vjerojatno djeluje s premještajućom, tj. Nerazvijenom komponentom enzima u stanici. Pojačano vezanje enzimskih komponenti u neobrađenoj konformaciji primijećeno je i za ostale faktore stanica domaćina, poput FKBP51 i Cyp40 23, 24 . Vjeruje se da peptidna domena koja veže izolaciju nosi funkciju Hsp70 36, 37 pune duljine. Međutim, djelovanje Hsp70 tijekom translokacije toksina zahtijevalo je i funkcionalno mjesto vezanja peptida i radno mjesto ATP-aze. Slijedom toga, inhibicija aktivnosti ATPaze Hsp70s od strane VER-155008 pokazala je inhibicijski učinak na intoksikaciju totaksinom sličnim 1 . Ranije smo izvijestili da inhibicija Hsp90 sprječava transport ovisnog o pH enzimskih komponenti iota toksina i s njim povezanih binarnih toksina preko endosomskih membrana i na taj način sprečava njihovu translokaciju iz zakiseljenih endosomskih vezikula u citosol, ali ne utječe na ranije korake toksina unos ili na enzimske aktivnosti toksina 18, 19 . Ovdje smo prvi put pokazali da ciljana farmakološka inhibicija Hsp70 sprječava translokaciju enzima podjedinice internaliziranog bakterijskog proteinskog toksina, naime C. perfringens iota toksina, ovisnog o pH, kroz stanične membrane, što implicira ulogu Hsp70 u translokacija ovog toksina iz lumena zakiseljenih endosoma u citozol stanice domaćina. Ovaj rezultat također isključuje povišenje endosomskog pH kao potencijalnog razloga za inhibiranu staničnu intoksikaciju. Međutim, farmakološka inhibicija Hsc / Hsp70 nije ometala enzimsku aktivnost toksina ili vezanje toksina za receptore stanične površine.

Nadalje, farmakološka inhibicija Hsp70 također je zaštitila stanice sisavaca od intoksikacije daljnjim binarnim klostridijalnim aktinom ADP-ribozilirajućim toksinima, uključujući C. botulinum C2 toksin i C. difficile CDT (neobjavljeni rezultati), sugerirajući uobičajeni mehanizam translokacije membrana ovisan o Hsp70 za ovu obitelj toksina 28 .

Zaključno smo identificirali i okarakterizirali novi specifični inhibitor male molekule Hsp70 koji selektivno inhibira mjesto vezanja proteina Hsp70 pružajući mogućnost istraživanja novih staničnih funkcija Hsp70 u živim stanicama, na primjer u kontekstu intoksikacije bakterijskim toksinima. Prema našem saznanju, rezultati ove studije su prvo opažanje da je stanica domaćina Hsp70 presudna za citotoksični način djelovanja bakterijskog proteina toksina olakšavanjem prenosa unutarćelijske membrane njegove enzimatske aktivne komponente u citosol ciljanih stanica sisavaca.

metode

Rekombinantni C2I protein je pročišćen i aktiviran kako je opisano prije 60 . Rekombinantni C3bot je pročišćen kako je opisano ranije 61 . Ia i Ib pripremljeni su kao što je ranije opisano 62 . Rekombinantni proteini Hsp70, Hsc70 i Hsp90 su pročišćeni kako je opisano 63, 64 . Derivati ​​acridiziniuma 1-3 pripremljeni su prema objavljenim protokolima 65 . Karakterizacija spojeva koji uključuju podatke NMR može se naći u literaturi 44, 46, 65 . VER-155008 kupljen je od tvrtke Sigma-Aldrich.

Analiza ponovnog nanošenja luciferaze

Pokusi ponovnog prepletanja izvedeni su kako su opisali Szabo i sur. 66 . Ukratko, luciferaza iz Photinus pyralis (Promega) inkubirana je jedan sat u puferu za denaturaciju (30 mM Tris / HCl, pH 7, 4, 5 mM DTT, 6, 0 M GdmCl) na 10 ° C pri krajnjoj koncentraciji 2, 08 µM. Pregrijavanje je započet razrjeđivanjem denaturirane luciferaze u pufer za renaturaciju (10 mM MOPS, pH 7, 8, 50 mM KCl, 1 mM ATP, 5 mM MgCl2, 1 µM BSA, 1, 5 µM Hsp70, 160 nM DnaJ) do konačne koncentracije 10, 4 nm na 10 ° C. Nakon jednog sata ponovnog savijanja aktivnost luciferaze određena je luminometrom (Luminoskan Ascent) upotrebom pufera za ispitivanje luciferaze (20 mM trikina, pH 7, 8, 5 mM MgCl 2, 0, 1 mM EDTA, 3, 3 mM DTT, 270 µM koenzima A, 500 µM D- luciferin, 500 µM ATP). IC50 vrijednosti izračunate su za model natjecanja za jednu lokaciju sa SPSS Sigmaplot 8.0.

Hsp70 potpomognuto ponovno nanošenje luciferaze upotrijebljeno je za ispitivanje interne biblioteke od 3300 prirodnih spojeva u potrazi za inhibitorima Hsp70. Spojevi su otopljeni u DMSO i upotrebljeni u koncentraciji od 5 µg / ml. Spojevi se inkubiraju 10 minuta u puferu za renaturaciju prije nego što je započeta reakcija ponovnog punjenja.

Određivanje aktivnosti ATPaze

Različite koncentracije od 1 inkubiraju se s 0, 5 µM Hsp70 60 minuta na 37 ° C u 40 mM HEPES puferu pH 7, 6, 50 mM KCl, 11 mM MgCl2, 1 mM ATP. Dobiveni fosfat detektiran je prema Bartolommei i sur. 2013. 67 .

Analiza vezivanja peptida

Vezivanje peptida dobivenih s Hsp70 na p53 procijenjeno je korištenjem celulozno vezanog peptida. Preklapanje 12mer peptida koji obuhvaćaju p53 sekvencu povezanu preko (β-Ala) 2 razmaka na celulozne membrane, automatski je sintetizirana Fmoc kemije koristeći Autospot Robot ASP 222 (Gilson) 68 . Peptidni niz inkubiran je sam sa 500 nM Hsp70 ili uz dodatnu prisutnost 50 μM 1 u 10 mM Tris pH 7, 6, 150 mM NaCl, 0, 05% Tween 20 i 5% saharoze 60 minuta na sobnoj temperaturi. Vezani protein analiziran je Western blottingom i imunodetekcijom korištenjem monoklonskog anti-Hsp70 antitijela (Biomol). Fluorescentni eksperimentalni pokusi pratili su postupak dobiven od Aprile i sur. 43 koristi konkurenciju peptida NRLLLTG i spoja 1 za vezanje mjesta vezanja peptida za Hsp70. Nakon inkubacije Hsp70 (9, 4 µM) i 1 (1, 25 µM) u 20 mM Tris pH 7, 8, 150 mM KCl, 5 mM MgCl2 na 20 ° C, dodane su sve veće količine peptida NRLLLTG. Za analizu pomicanja fluorescentnog liganda, izmjeren je intenzitet fluorescencije pri ekscitaciji i emisijskim valnim duljinama od 300 i 568 nM.

ITC eksperimenti provedeni su pomoću VP-ITC (MicroCal). Prije eksperimenta, svi su puferi filtrirani kroz filtrirne membrane s veličinom pora od 0, 2 μm (Whatman) i degasirani. Proteinske otopine su dijalizirane na ispitivanom puferu (u 20 mM Tris pH 7, 8, 150 mM KCl, 5 mM MgCl2). U tipičnom eksperimentu, 300 μl 200 µM otopine 1 titriralo se u 15 µl stupnjevima do 20 µM otopine Hsp70 na 20 ° C. Brzina miješanja instrumenata postavljena je na 310 RPM, a način dobivanja povratnih informacija postavljen je na "high". Kako se signal iz prve injekcije obično ne može upotrijebiti za analizu podataka, u tom je koraku titrirano samo 2 μl, a točka podataka je izostavljena. Izmjereni podaci analizirani su korištenjem softvera "Origin" (MicroCal).

Stanična kultura

Stanice HeLa, HEK-293 i SH-SY5Y stanice uzgajane su u DMEM-u uz dodatak 10% fetalnog goveđeg seruma. HT-29 stanice uzgajane su u McCoy-ovom mediju 5A uz dodatak 10% fetalnog goveđeg seruma. Vero stanice afričkog zelenog majmuna uzgajane su u MEM koji sadrži 10% termalno inaktiviranog fetalnog seruma teleta (FCS), 1, 5 g / l natrijevog bikarbonata, 1 mM natrijum-piruvata, 2 mM L-glutamina i 0, 1 mM nebitnog amino kiseline na 37 ° C i 5% CO2. Stanice se odvajaju pomoću tripsina i ponovo se reseciraju ne više od 20 puta.

Za ispitivanje sposobnosti formiranja kolonije HeLa kolonije nakon tretiranja inhibitorom Hsp70 klonogenskim testom, 1, 3 × 10 4 HeLa stanice po jažici posijane su na ploče sa 6 jažica i ostavile su se da se prianjaju 42 sata na 37 ° C. Stanice su tretirane s različitim koncentracijama (0.08 do 250 μg / ml) inhibitora Hsp70 tijekom 18 sati u tri primjerka. Nakon toga, stanice su se odvojile, osiromašile i presadile u 85 mM petrijeve posude. Nakon 14 d inkubacije, kolonije su fiksirane 4% formaldehidom u PBS-u, obojene 0, 25% kristalno ljubičastim PBS-om i izbrojene.

Za ispitivanje HeLa stanice, stanice HEK-293, stanice HT-29 i stanice SH-SY5Y nakon tretiranja MTT testom inhibitorom Hsp70, 440 stanica po jažici je posijano na pločice s 96 jažica i ostavljeno je da se prianjaju 18 sati pri 37 ° C. Stanice su tretirane s različitim koncentracijama (0.08 do 250 µg / ml) inhibitora Hsp70 tijekom 48 sati u četvorostrukom. Nakon toga, dodan je MTT do krajnje koncentracije 0, 3 mg / ml, a stanice su inkubirane dodatna 2 sata. Nakon uklanjanja medija, dodano je 100 μl DMSO i 25 μl 100 mM glicinskog pufera, pH 10, 5. Na kraju je utvrđena apsorbancija na 570 nM. Apsorbancija koja odgovara netretiranim kontrolnim stanicama pretpostavila se kao 100% održivost stanica.

apoptoza

Analiza apoptoze izvedena je korištenjem imunoblotske analize proteolitičkog cijepanja kapaze-3 proenzima, kaspaze-7 proenzima i PARP. Stanice spojenih HeLa bile su izložene 177 ili 355 µM od 1, 320 µM od 3 ili 0, 1 ili 0, 4 µM staurosporina ili kombinaciji jednog od derivata 9-aminoakridizinija i staurosporina, kako je naznačeno. Nakon inkubacije od 45 min ili 4 h, stanice su uzete radi dobivanja lizata u puferu za liziranje (50 mM HEPES pH 7, 4, 150 mM NaCl, 50 mM KCl, 10 mM MgCl2, 0, 4 mM EGTA, 0, 5% (v / v) NP- 40, 0, 1% (v / v) CHAPS, 10% (w / v) saharoza, 0, 5 mM PMSF, 1 mM DTT, 0, 5% (w / v) molibdat).

Nakon 10% SDS-PAGE elektroforeze, proteini su preneseni u nitrocelulozne membrane. Membrane su inkubirane miševim monoklonskim antitijelom protiv kaspaze 3 (3G2, stanična signalizacija), anti-kaspaz 7 mišjim monoklonskim antitijelom (Stressgen) ili anti PARP mišjim monoklonskim antitijelom (Ab-3, Calbiochem), a potom odgovarajućim sekundarnim antitijelima konjugiranim s hrenovom peroksidazom. ECL hemiluminiscentni koktel (Amersham) korišten je za razvoj imunoblota.

Aktivnost kaspaze 3/7 analizirana je in vitro proteolitičkim cijepanjem određenih supstrata. Stanice spojenih HeLa (1 × 106 stanica) bile su izložene 177 ili 355 µM od 1, 320 µM 3 ili 0, 1 ili 0, 4 µM staurosporina ili kombinaciji jednog od derivata akridizinija i staurosporina kako je naznačeno. Nakon 4 h inkubacije, stanice su uzete za dobivanje lizata u puferu za lizu 2 (50 mM HEPES pH 7, 4, 150 mM NaCl, 50 mM KCl, 10 mM MgCl2, 0, 4 mM EGTA, 0, 5% (v / v) NP-40, 0, 1% (v / v) CHAPS, 10% (w / v) saharoze, 0, 5 mM PMSF, 1 mM DTT). 800 µl staničnih ekstrakata smješteno je u smanjene plastične kivete i inkubirano je 10 minuta na 25 ° C. Nakon toga doda se supstrat kaspaza-3/7 Ac-DEVD-pNA, čime se dobije konačna koncentracija od 28 uM. Oslobađanje p-nitroanilina izmjereno je otkrivanjem apsorpcije na 405 nm tijekom 30 minuta.

Analiza staničnog ciklusa

Stanice HeLa u eksponencijalno rastu inkubiraju se 1 sat na 37 ° C u prisutnosti 0, 4% DMSO ili, dodatno, 6, 9 µg / ml (25 µM) 1 . Nakon toga, stanice su tretirane s timidinom (2 mM), nokodazolom (1, 3 μM) ili razrjeđivačem 20 sati prije žetve. Sakupljene HeLa stanice su fiksirane etanolom, obojene propidijevim jodidom i analizirane na sadržaj DNA protočnom citometrijom koristeći Becton Dickinson FACSort. Eksperiment je izveden tri puta s istim rezultatima.

Konfokalna mikroskopija

Stanice HeLa koje su uzgajane u 8-jažnim pločicama s ikidi (ibidi) inkubirale su se 3 sata na 37 ° C ili tijekom toplotnog šoka 2 sata na 37 ° C i 1 sat na 42 ° C. Medij je sadržavao 0, 4% DMSO ili dodatno 100 µg / ml Hsp70 inhibitora. Nakon toga, stanice su isprane PBS-om, fiksirane u 4% formaldehidu, permeabilizirane metanolom, zasićene s 2% glicina i blokirane u 0, 4% BSA u PBS-u. DNA je obojena s DAPI, Hsp70 obojena je mišjim anti Hsp70 antitijelom i FITC-konjugiranim antitijelesnim mišjim protutijelom. Konačno, stanice su vizualizirane Nikon Confocal C1 mikroskopom.

Analiza interakcije između toksina i imobiliziranog Hsp70 pomoću dot blot sustava

Serijska razrjeđenja proteinskih pročišćenih proteina Hsp70, Hsc70, Hsp90 (za pozitivnu kontrolu) i FKBP12 i C3bot (za negativnu kontrolu) usisana su u vakuumu na nitroceluloznu membranu koristeći Bio-Rad dot blot sustav prema uputama proizvođača. Izvršeno je obojenje Ponceau S, a zatim je membrana blokirana 5% nemasnim suhim mlijekom u PBS koji je sadržavao 0, 1% Tween-20 (PBS-T). Potom se membrana isječe i sonira 1 sat sa biotinom obilježenim C2I ili Ia (200 ng / ml), koji su ili prethodno inkubirani 1 sat u 6 M gvanidinijum hidrohloridu za denaturaciju enzimskih komponenti ili u PBST da bi se zadržala zavičajna konformacija. Nakon opsežnog ispiranja, povezani proteini su detektirani streptavidin-peroksidazom pomoću ECL sustava. Uspješna imobilizacija pročišćenih proteina potvrđena je obojenjem Ponceau S.

Eksperimenti intoksikacije i analiza enzimske aktivnosti, stanično vezivanje i membranski transport toksina C. perfringens

Za ispitivanja citotoksičnosti, stanice su posijane u posudama za kulturu i inkubirane u MEM plus FCS sa odgovarajućim toksinom. Stanice su vizualizirane nakon naznačenih vremena inkubacije upotrebom Zeiss Axiovert 40CFI mikroskopa s Jenoptik naprednom C10 CCD kamerom. Promjene uzrokovane toksinom u staničnoj morfologiji (tj. Zaokruživanje stanica) analizirane su i postotak okruglih stanica određen je sa slika kako je opisano ranije 23 .

Test translokacije toksina proveden je kao što je opisano prije 69 . Ukratko, Vero stanice su prethodno inkubirane s bafilomicinom A1 da se spriječi unošenje toksina preko endosomskog puta i odgovarajućih inhibitora, tj. VER-155008 ili radikokola. Nakon toga, stanice su ohlađene na 4 ° C i dodan je jod toksin 20 min na 4 ° C da se omogući vezanje toksina. Nakon toga uslijedio je kiseli impuls, tj. Dodavanje toplog kiselog medija, što je omogućilo enzimskoj komponenti da direktno prelazi preko citoplazmatske membrane u citosol stanice stanice domaćina. Stanice su dalje inkubirane na 37 ° C i stanična morfologija je praćena kao što je prethodno opisano.

Za analizu in vitro enzimske aktivnosti la, 20 μg inhibitora proteaze lipa stanica koji sadrži lizate prethodno je inkubiran sa odgovarajućim inhibitorima Hsp70 ili Hsp90 u trajanju od 30 minuta na 37 ° C. Nakon toga, dodana je enzimska komponenta la, kao i NAD + označen biotinom, ko-supstrat za ADP-ribozilaciju, a uzorci su inkubirani 20 minuta na 37 ° C. Zatim su uzorci denaturirani na 95 ° C s puferom Laemmli uzorka da se zaustavi enzimska reakcija, a zatim podvrgnuti SDS-PAGE, nakon čega je provedena Western Blot analiza kako bi se utvrdio biotinski obilježen, tj. ADP-ribozilirani aktin.

Za analizu količine joda toksina vezanog na površini Vero stanica tretiranih s odgovarajućim Hsp70 ili Hsp90 inhibitorima, stanice su prethodno inkubirane s VER-155008 ili radikokolom 30 min na 37 ° C. Stanice su ohlađene do 4 ° C i dodan je jod toksin dodatnih 30 minuta na 4 ° C da se omogući vezanje. Nakon opsežnog ispiranja, stanice su lizirane i inkubirane 30 minuta kod 37 ° C sa etiketom NAD + bio obilježenom biotinom. Nakon toga, uzorci su podvrgnuti SDS-PAGE, a ADP-ribozilirani aktin analiziran je Western blot-om streptavidin-peroksidazom. Količina ADP-riboziliranog aktina izravno je u korelaciji s količinom jota toksina vezanog na stanicu i na taj način omogućava otkrivanje spoja Ia. Usporedne količine zamijeljenog proteina potvrđene su Ponceau S obojenjem blot membrane.

dodatne informacije

Kako citirati ovaj članak : Ernst, K. i sur. Novi inhibitor Hsp70 sprječava intoksikaciju stanica staničnim jota toksinom ADP-riboziliranjem Clostridium perfringens perfringens . Sci. Rep. 6, 20301; doi: 10.1038 / srep20301 (2016).

Dodatna informacija

PDF datoteke

  1. 1.

    Dodatna informacija

komentari

Slanjem komentara slažete se s našim Uvjetima i smjernicama zajednice. Ako ustanovite da je nešto zloupotrebno ili nije u skladu s našim uvjetima ili smjernicama, označite to kao neprimjereno.