Novi mir-371a-5p-posredovani put, koji vodi do povećanja regulacije bag3 u kardiomiocitima kao odgovor na epinefrin, gubi se u takotsubo kardiomiopatiji | stanična smrt i bolest

Novi mir-371a-5p-posredovani put, koji vodi do povećanja regulacije bag3 u kardiomiocitima kao odgovor na epinefrin, gubi se u takotsubo kardiomiopatiji | stanična smrt i bolest

Anonim

teme

  • kardiomiopatije
  • Stanična signalizacija
  • patogeneza

Sažetak

Molekularni mehanizmi koji štite kardiomiocite od smrti uzrokovane stresom, uključujući stresni stres, ključni su za srčanu fiziologiju, a oštećenja ovih zaštitnih mehanizama mogu rezultirati patološkim promjenama. Bcl2-povezani athanogen 3 (BAG3) se eksprimira u kardiomiocitima i sastavni je dio autofagijskog puta potpomognutog kaperanom, neophodnog za homeostazu mehanički izmijenjenih stanica. Ablacija BAG3 u miševa rezultira smrtonosnom kardiomiopatijom ubrzo nakon rođenja, a mutacije ovog gena povezane su s različitim kardiomiopatijama, uključujući stres-induciranu Takotsubo kardiomiopatiju (TTC). Patogeni mehanizam koji vodi do TTC-a nije definiran, ali sugerira se da srce može biti oštećeno prekomjernim prelivanjem epinefrina (epi) u nedostatku zaštitnog mehanizma. Cilj ove studije bio je pružiti više dokaza o ulozi BAG3 u patogenezi TTC-a. Stoga smo sekvencionirali BAG3 gen kod 70 bolesnika s TTC-om i u 81 zdravih davatelja bez odsutnosti procijenjene kardiovaskularne bolesti. Mutacije i polimorfizmi otkriveni u BAG3 genu uključuju učestalu nukleotidnu promjenu g2252c u BAG3 3'-netransuliranom području (3'-UTR) bolesnika Takotsuboa ( P <0, 05), rezultirajući gubitkom vezanja mikroRNA-371a-5p (miR -371a-5p), što je dokazano dvostrukim luciferaznim izvještajnim testovima i argonautnom RNA-induciranom ušutkavanjem složene katalitičke komponente 2 / padajućeg testa. Nadalje, opisujemo novi signalni put u kardiomiocitima koji dovodi do pojačane regulacije BAG3 o izloženosti epi-om uslijed regulacije miR-371a-5p ovisne o ERK-u. Zaključno, prisutnost polimorfizma g2252c u BAG3 3'-UTR određuje gubitak miR-371a-5p vezanja i rezultira izmijenjenim odgovorom na epi, što potencijalno predstavlja novi molekulski mehanizam koji pridonosi TTC patogenezi.

Glavni

Takotsubo kardiomiopatija (TTC), poznata i kao stresna kardiomiopatija ili 'sindrom slomljenog srca', karakterizira prolazna i reverzibilna omamljenost miokarda što dovodi do sistoličkog baloniranja sistolnog lijeva ventrikula (LV) u nedostatku opstruktivne bolesti koronarne arterije. Općenito se javlja kod žena u postmenopauzi i potaknuto je emocionalnim ili fizičkim stresom. 1 Dugoročna prognoza bolesnika s TTC-om povoljna je zbog spontanog oporavka funkcije miokarda. Do danas nije definiran patogeni mehanizam koji dovodi do ove bolesti1, premda se sugerira da srčani mišić može biti oštećen prekomjernim oslobađanjem epinefrina (epi), 2 što sugerira da zaštitni mehanizam možda neće uspjeti kod ovih ispitanika.

Acanogen 3 povezan s Bcl2 (BAG3) član je BAG obitelji kopeperona koji djeluju s domenom ATPaze proteina toplinskog udara 70. 3 U fiziološkim uvjetima, ekspresija BAG3 ograničena je na nekoliko tipova stanica uključujući kardiomiocite. 4, 5, 6 Njezin izraz može se potaknuti različitim stresorima, a smatra se da doprinosi otpornosti na stres. 7, 8, 9 Prisutnost proteina koji štite kardiomiocite od apoptoze izazvane stresom ima presudnu ulogu u patofiziologiji miokarda. Doista, kardiomiociti su intrinzično otporni na apoptozu, dijelom zbog visoke razine endogenih inhibitora kaspaze, 10 anti-apoptotičnih Bcl-2 proteina i pro-preživljavajuće kinaze Akt. 11 U skladu s tim, otkrili smo da se razine BAG3 povećavaju tijekom diferencijacije mioblasta, što sugerira da je njegova biološka uloga relevantna za diferencirane miocite. 5 To se slaže s opažanjem da brisanje Bag3 uzrokuje smrtonosnu kardiomiopatiju ne u embrionima, već u postnatalnim miševima oštećenim Bag3 . 12 Nadalje, utvrđeno je da prigušivanje Bag3 dovodi do vrlo smanjene razine miogenina. 5 Ovi nalazi ukazuju na uključenost proteina BAG3 u kasni razvoj srca i u skladu su s ulogom BAG3 u preživljavanju i integritetu miofibrila u kardiomiocitima. Nekoliko izvještaja povezuje BAG3 mutacije s miopatijom. Selcen i sur. 13 je opisao mutirani oblik BAG3, to jest heterozigota Pro209Leu, koji je uzrokovao ozbiljnu i progresivnu slabost mišića u dječjoj kardiomiopatiji. Pored toga, ne-sinonimni BAG3 jedno-nukleotidni polimorfizmi (SNPs) ili drugi skraćeni BAG3 obrasci koreliraju s poznatom dilatiranom kardiomiopatijom (DCM) 14 i stresnom kardiomiopatijom poznatom i kao TTC. 15 Konačno, dvije heterorozne mutacije gena BAG3 , koje uzrokuju abnormalnu montažu Z- diska i povećanu osjetljivost na apoptozu u kultiviranim kardiomiocitima, identificirane su u bolesnika s obiteljskim DCM. 16 Ovi nalazi, zajedno s našim opažanjem da se BAG3 protein oslobađa iz stresnih kardiomiocita i da ih se može otkriti u serumima bolesnika s kroničnim zatajenjem srca (HF), 6 snažno sugeriraju da BAG3 ima ulogu u regulaciji preživljavanja kardiomiocita u stresnim uvjetima.

U ovom istraživanju opisujemo novi posttranskripcijski put koji vodi do indukcije BAG3 na liječenju epi-ja. MikroRNA (miRNA) su male nekodirajuće RNA koje moduliraju ekspresiju gena nepotpunim baznim uparivanjem svojih kognitivnih ciljnih RNK ​​(mRNA), rezultirajući obično translacijskom represijom. 17 miRNA imaju kritičnu ulogu u normalnom održavanju osnovnih staničnih procesa i njihova deregulacija može utjecati na velik broj molekularnih putova u ljudskim bolestima. 18, 19, 20, 21 Među njima su srčane patologije povezane s miRNA 22, 23, 24, au posljednje vrijeme zabilježene su promjene u razini specifične cirkulirajuće miRNA kod bolesnika s TTC-om. 25 Postoji samo nekoliko studija koja pokazuju kako miRNA također mogu poboljšati translaciju mRNA. 26, 27 Ovdje ćemo opisati posttranskripcijski put koji uključuje vezanje miRNA na 3'-neprevođena regija (3'-UTR) gena BAG3 , što rezultira pojačanom BAG3 ekspresijom. Otkrivamo da epi inducira miR-371a-5p, što rezultira povećanom ekspresijom BAG3 proteina. Također smo pokazali da jedna nukleotidna varijanta u 3'-UTR gena BAG3 , koji se često nalazi kod TTC bolesnika, rezultira izmjenom ovog posttranskripcijskog puta.

Rezultati

BAG3 gen često se mutira kod pacijenata Takotsuboa

Nedavno smo izvijestili o dvije mutacije missense povezane s TTC-om u regiji kodiranja BAG3 u skupini od 29 pacijenata 15 i proširili smo našu studiju skriningom na ukupno 70 žena TTC-ova. Kao kontrolna skupina koristili smo skupinu ženskih davatelja starijih od 50 godina kako bismo smanjili mogućnost da kontrolni davatelji razviju bolest u budućnosti, jer se prijavljena srednja dob početka bolesti kreće od 58 do 75 godina u različitim izvještaji. 28 Sekvencirali smo egzone 2–4 kodirajuće sekvence i cijeli 3'-UTR BAG3 . Nismo bili u mogućnosti dosljedno pojačati ekson 1 (kao što je rečeno prije 29 ) i stoga nismo uključili podatke o ovom egzonu. Tablice koje prijavljuju sve pronađene mutacije sekvenci prikazane su u Dodatnim tablicama S1 i S2.

TTC bolesnici imali su veću učestalost mutacija gena BAG3 u usporedbi sa zdravim davateljima. U stvari, tablica 1 pokazuje da samo 27, 1% analiziranih TTC bolesnika nije mutiralo u BAG3 sekvenci u usporedbi sa 53, 1% zdravih davatelja. Nadalje, 21, 4% TTC bolesnika i samo 12, 3% davatelja pokazali su homozigotnu nukleotidnu promjenu u BAG3 sekvenci. Nadalje, 47, 1% bolesnika sa TTC-om, ali samo 29, 6% kontrolnih skupina imalo je više od jedne mutacije BAG3 i stoga su potencijalno nosili dva izmijenjena alela. Ne možemo isključiti da sekvenciranje preostalog dijela kodirajuće sekvence i 5'-UTR gena BAG3 ne bi dovelo do otkrića dodatnih mutacija u kohorti TTC-a, poboljšavajući na taj način značaj genetske analize.

Tablica pune veličine

Među identificiranim genomskim varijantama, posebno je učestala mutacija u 3'-UTR (g2252c-SNP rs8946) (dopunska tablica S3). Zapravo, 62, 8% TTC bolesnika je nosilo ovu nukleotidnu varijantu, od čega je 12, 8% bilo homozigotno za varijantu g2252c. Suprotno tome, ova mutacija bila je prisutna u samo 45, 6% uzoraka kontrolne skupine i samo 7, 4% je bilo homozigotnih (dvostruka P- vrijednost dobivena Fisher-ovim točnim testom na tablici nepredviđenih događaja 2 × 2 jednaka je 0, 04). Štoviše, unatoč činjenici da su kontrolni uzorci bili od ženskih darivatelja starijih od 50 godina, moguće je da će neke od kontrola koje nose ovu mutaciju, posebno homozigotni slučajevi, razviti simptome ako su izloženi jakom pokretačkom događaju. Stoga smo izveli niz eksperimenata kako bismo utvrdili koji molekulski put varijanta g2252c može potencijalno mijenjati ljudske srčane miocite.

miR-371-5p povećava razinu BAG3 proteina

Da bismo istražili može li promjena nukleotida g2252c utjecati na razinu BAG3 ekspresije mijenjanjem vezivanja regulatornih miRNA, napravili smo in-silikonsku analizu sekvence i identificirali broj potencijalnih miRNA za koje je predviđeno da vežu slijed koji sadrži tu promjenu nukleotida (Dopunska Tablica S4). Među njima je miR-371a-5p (miR-371a) (MI0000779) pokazao najviši prediktivni rezultat i stoga je izabran za daljnja ispitivanja. TargetScan algoritam je identificirao miR-371a-5p-obvezujuće područje na BAG3 3'-UTR kao "slabo očuvano mjesto za miRNA obitelji koje se čuvaju samo kod sisavaca ili kralježnjaka". Štoviše, analiza redoslijeda među vrstama, izvršena pomoću alata za poravnavanje mVISTA, 30 naglašava da samo ljudi imaju ispravno mjesto vezanja na BAG3 3'-UTR za hsa-miR-371a-5p, što nedostaje mišu, štakoru, svinji, čimpanzi i gorila (dopunska slika S1).

Imunoprecipitiranjem argonautnog RNA-induciranog silitirajućeg kompleksa (RISC) katalitičke komponente 2 (AGO2) proteina u stanicama HEK293, koristeći imunoprecipitaciju proteina koji se veže na RNA ili imunoprecipitaciju proteina koji veže RNA, potvrdili smo da se RISC kompleks veže na BAG3 3 ′ -UTR (slika 1a). Pored toga, baza podataka starBase (//starbase.sysu.edu.cn/index.php) koja sačinjava mapu interakcije iz podataka Argonaute CLIP-seq 31, 32 također je pokazala specifično vezivanje miR-371a-5p na BAG3 3'-UTR. Da bismo dodatno eksperimentalno potvrdili da li se miR-371a-5p izravno veže na 3'-UTR BAG3 i procijenili utječe li na vezivanje promjena nukleotida g2252c, izveli smo reportersku analizu dvostruke luciferaze koristeći pMIR-reportere bilo s divljim tipom (wt) ili polimorfna predviđena miRNA ciljana mjesta klonirana nizvodno od gena luciferaze krijesnica ( luc2 ). U ovom je eksperimentu lufijera lufije korištena kao primarni izvjestitelj za praćenje regulacije gena, a Renilla luciferaza (hR luc-neo ) djelovala je kao kontrolni izvještaj za normalizaciju signala. Cos-7 stanice i stanična linija primarne ljudske kardiomiocite odrasle osobe (HCMa) prolazno su transficirane molekulima prekursora za predviđene miRNA ili kodiranom (SCR) kontrolom zajedno s pMIR-reporter plazmidima koji nose bilo wt BAG3 3'-UTR ili BAG3 3'-UTR koji nosi homozigotnu mutaciju g2252c. Naši rezultati pokazuju da je miR-371a-5p povećao aktivnost luciferaze u izvještaču koji je nosio masu BAG3 3'-UTR, ali nije uspio povećati aktivnost reportera u reporteru s mutiranim BAG3 3'-UTR (slike 1b i c). U skladu s ovim nalazom, transfekcija prekursora miR-371a-5p rezultirala je povećanom razinom proteina BAG3 u HCMa stanicama (Slika 1d). Značajno, nisu primijećene promjene u razinama BAG3 mRNA (Slika 1e), što sugerira da je miR-371a-5p djelovao utjecajem na BAG3 prijevod, a ne na stabilnost mRNA BAG3. Uzeto zajedno, ovi podaci pokazuju da miR-371a-5p pojačava ekspresiju proteina BAG3 i da interakcija miR-371a-5p s ljudskim BAG3 3'-UTR kritično ovisi o prisutnosti varijante g2252.

Image

miR-371a-5p regulira ekspresiju BAG3. Da bi se provjerilo mogu li predviđene miRNA vezati BAG3 cilj, izveden je Ago2 / padajući test i pMir dvostruka luciferaza. mRNA iz HEK293 stanica bila je IP s anti-AGO2 antitijelom, a BAG3 mRNA kvantizirana je kvantitativnim RT-PCR ( a ). Podaci su normalizirani na pri-miRNA 15a / 16-1 ekspresiji RNA, a ne IP (INPUT). U donjem dijelu a također je shematski prikaz gena BAG3 . Prikazani su BAG3 mRNA i BAG3 kodirajući niz (crne strelice), hsa-miR-371-5p ciljani slijed (crvena traka) i fragmenti korišteni za qRT-PCR u RIP analizi. Cos-7 ( b ) i HCMa stanice ( c ) kofeficirane su pre-miR-371a-5p (0, 1 nmol / l) (miR-371a-5p) ili SCR kontrolom (scr) i luciferazom krijesnice pMir reporterski plazmid koji sadrži niz luciferazni gen, wt (pmir WT) ili mutirani (g2252c) (pmir mut) BAG3 3'-UTR sekvenca. Razlike aktivnosti luciferaze među uzorcima testirane su 24 sata nakon transfekcije, a Renilla luciferaza kofeficirana je kao kontrola. Podaci predstavljaju sredinu šest eksperimentalnih replika; Prikazani su P- vrijednosti u odnosu na SCR i mutirani slijed. HCMa stanice su transfektirane pre-miR-371a-5p (2 nmol / l) (pre-miR-371a-5p) ili SCR sljedovima (negativna kontrola) i razinom proteina BAG3 ( d ) i mRNA ( e ) su procijenjeni nakon 24 sata. ( d ) Denzitometrijska analiza pet mrlja, normalizirana na odgovarajući intenzitet GAPDH opsega, prikazana je na d (donja ploča). Razine mRNA BAG3, procijenjene RT-PCR-om u stvarnom vremenu, uspoređene su u tri neovisna eksperimenta korištenjem metode relativnog ct-a: količina cilja, normalizirana na količinu endogene kontrole (GAPDH), u odnosu na kontrolni uzorak, dana je 2 –ΔΔCt . Značajnost izračunata pomoću t- testa: *** P <0, 0001, ** P <0, 005 i * P <0, 01; NS, nije značajno

Slika pune veličine

Epi regulira razinu BAG3 putem regulacije miR-371a-5p

Izloženost visokim razinama epi-ja, bilo kao posljedica jakog emocionalnog stresa ili kao posljedica primjene kateholamina ili prisutnosti inhibitora ponovnog unosa inhibitora serotonina / norefinefrina, uključena je u TTC. 33, 34 Stoga smo istražili može li epi modulirati ekspresiju BAG3 proteina u kardiomiocitima odraslih ljudi i može li miR-371a-5p sudjelovati u ovoj regulaciji. U skladu s našim očekivanjima, epi tretman HCMa stanicama rezultirao je povećanjem razine proteina BAG3, ovisno o dozi i vremenu (slike 2a i b). Pod tim eksperimentalnim uvjetima, epi tretman rezultirao je aktiviranjem adrenergičkog odgovora, što pokazuje intracelularno ciklično povećanje AMP (cAMP) (dopunska slika S2), ali još ne i staničnu smrt (dopunska slika S3). Korištenjem selektivnih inhibitora adrenergičkih receptora pokazali smo da regulacija BAG3 ovisna o epi kritično ovisi o stimulaciji stimulacije α 1 receptora (dopunska slika S4). Zanimljivo je da je razina BAG3 mRNA ostala stalna kao odgovor na epi stimulaciju, što ukazuje na posttranskripcijski regulatorni mehanizam u regulaciji ekspresije proteina BAG3 (Slika 2c). Štoviše, liječenje epi-om također je rezultiralo većom ekspresijom miR-371-5p, što ukazuje da ova miRNA može imati ulogu u promatranom BAG3 indukciji kao odgovor na epi (Slika 2d). Da bismo potvrdili da indukcija BAG3 epi doista ovisi o regulaciji miR-371-5p, transficirali smo HCMa stanice anti-miR-371-5p da utišamo endogene miR-371-5p. Transfekcija anti-miR-371-5p, ali ne sa SCR kontrolom, rezultirala je skromnim smanjenjem razine bazalnih proteina BAG3, ali je u potpunosti ukinula indukciju BAG3 proteina epi (slika 2e). Real-time PC-reverzna transkripcija (RT-PCR) potvrdila je da je anti-miR molekula sposobna reducirati ekspresiju miR-371a-5p čak i u prisutnosti epi-ja (slika 2f).

Image

Epi izaziva prekomjernu ekspresiju BAG3 kroz miR-371a-5p. HCMa stanice su tretirane epi HCl (u naznačenim vremenskim točkama ( a ) ili koncentracijama ( b )) i prikupljene. Analiza WB proteina BAG3 prikazana je ( a i b ). Prikazan je jedan od šest neovisnih pokusa, a denzitometrijska analiza eksperimentalnih replika, normalizirana na odgovarajući intenzitet β- aktinskih traka, prikazana je u donjem dijelu a i b . ( c ) Razine BAG3 mRNA nakon epikinetike, procijenjene RT-PCR-om u stvarnom vremenu, normalizirane na količinu endogene kontrole (GAPDH) i u odnosu na kontrolni uzorak, date su sa 2 –ΔΔCt . ( d ) Razine miR-371a-5p otkrivene su RT-PCR-om u stvarnom vremenu: količine transkripta uspoređene su metodom relativnog Ct, pri čemu se količina cilja normalizirala na količinu endogene kontrole (RNU6) i u odnosu na kontrolni uzorak daje se 2 –ΔΔCt . Kako bi se utišala aktivnost miRNA i stvorio prolazni miRNA-371a-5p model knockout-a, kardiomiociti su transfektirani sekvencama anti-miR-371-5p (anti-miR) ili SCR kao negativna kontrola (10 nmol / l) i 24 h kasnije stimulirano epi (500 μ mol / l) tijekom 2 sata ili 15 min. Stanice su potom analizirane od strane WB, da bi se procijenila razina proteina BAG3 ( e ), i RT-PCR u stvarnom vremenu, da bi se procijenila razina miR-371a-5p ( f ), kako je gore opisano. Podaci su reprezentativni za tri neovisna pokusa sa sličnim rezultatima i WB denzitometrijska analiza eksperimentalnih replika, normaliziranih na odgovarajuće intenzitete GAPDH, prikazani su u donjem dijelu e . Značajnost prema SCR ili kontrolnim uzorcima izračunata je pomoću t- testa: *** P <0, 0005, ** P <0, 005 i * P <0, 01; NS, nije značajno

Slika pune veličine

Sljedeće smo ispitivali molekularni put koji vodi do miR-371a-5p indukcije pomoću epi-ja. Zanimljivo je da je tretiranje HCMa stanica epi također rezultiralo fosforilacijom ERK-a otprilike u isto vrijeme kada se opaža porast miR-371a-5p (slike 3a i b, donja lijeva ploča) i liječenje U0126, inhibitorom fosforilacije ERK, blokirana epi-inducirana regulacija razine miR-371a-5p i BAG3 (slika 3b, lijeva i desna strana).

Image

Epi inducira ERK fosforilaciju, translokaciju β- katenina i transkripciju miR-371a-5p, što dovodi do povećanja BAG3. ( a ) HCMa stanice su tretirane epi HCl (500 μ mol / l) i prikupljene u naznačenim vremenskim točkama, a stanični lizati su analizirani WB antitijelima za BAG3, fosforiliranim ERK (pERK1 / 2) i ukupnim ERK (ERK1 / 2). GAPDH korišten je kao kontrola opterećenja; BAG3 i pERK denzitometrijska analiza, normalizirana na odgovarajući GAPDH ili ukupni intenzitet opsega ERK1 / 2, prikazani su u donjem dijelu a . ( b ) Stanice su prethodno tretirane 30 minuta fosfo-ERK inhibitorom U0126 (10 μ mol / l u dimetil sulfoksidu (DMSO)), odnosno otapalom, i dodatnih 15 min (lijevo) ili 2 h (desno) s epi HCl (epi) (500 μ mol / l); stanični ekstrakti su analizirani od strane WB na BAG3, fosforilirani ERK (pERK1 / 2) i ukupni ERK (ERK1 / 2). GAPDH korišten je kao kontrola opterećenja (gornje ploče). Na lijevoj donjoj ploči su prikazane razine ekspresije miR-371a-5p, analizirane RT-PCR u stvarnom vremenu. Količine transkripta uspoređene su korištenjem relativne Ct metode kao što je prethodno opisano. Citosolne ( c ) i nuklearne ( d ) frakcije HCMa stanica prethodno obrađene s U0126 kao što je prethodno opisano, a zatim obrađene epi u naznačenim vremenima, WB su analizirane odvojeno za BAG3, fosforilirani ERK (pERK1 / 2), ukupni ERK (ERK1 / 2) ) i β- katenin. GAPDH i LAMIN A / C korišteni su kao kontrola opterećenja u citosolnoj i nuklearnoj frakciji. Prikazane slike reprezentativne su za tri neovisna pokusa. ( e ) Denzitometrijska analiza β- kateninskih signala, normalizirana na odgovarajući GAPDH (citosol) ili LAMIN A / C (jezgro). Značajnost izračunata pomoću t- testa: * P <0, 01 i ** P <0, 001

Slika pune veličine

Pokazano je da promotorsko područje klastera miR-371-373 sadrži elemente koji vežu TCF / LEF1 i da je P- katenin potreban za Wnt-ovisnu indukciju miR-371-373 klastera. 35 Stoga smo testirali mogućnost da je epi tretman rezultirao translokacijom β- katenina u jezgru. Doista, kao što je prikazano na slikama 3c-e i na slici 4, liječenje epi-om rezultiralo je brzom translokacijom p- katenina u jezgru. To je ovisilo o ERK fosforilaciji, jer je U0126 učinkovito blokirao nuklearnu translokaciju p- katenina (slike 3c-e i slika 4), kao i porast ekspresije BAG3 (slika 3b desna ploča i slika 3c). Konačno, također smo pokazali da BAG3 ko-lokalizira s F-aktinskim filamentima u kardiomiocitima i da je ključan za njihovu ispravnu montažu. U skladu s tim, utišavanje BAG3 u HCMa rezultiralo je izmijenjenom strukturom filamentskih F-aktina kao i smanjenjem nivoa aktina (Slika 5).

Image

Epi inducira β- katenin nuklearnu translokaciju. HCMa su prethodno tretirani s fosfo-ERK inhibitorom U0126 (10 μ mol / l u dimetil sulfoksidu (DMSO)), odnosno s otapalom, te su stimulirani epi 500 μ mol / l u trajanju od 10 minuta. Za indirektnu imunofluorescenciju, stanice su obojene za detekciju p- katenina anti-zečjim Ab-konjugiranim FITC-488. Negativni kontrolni kunički IgG upotrijebljen je umjesto primarnog poliklonalnog antitijela kod kunića za procjenu nespecifičnog bojenja. Hoechst 33342 korišten je za nuklearno bojanje (DAPI). Uzorci su analizirani pomoću konfokalnog mikroskopa (objektiv × 63; šipke = 20 µm)

Slika pune veličine

Image

BAG3 funkcionalna uloga u epi-stimuliranim kardiomiocitima: epi inducira porast BAG3 ekspresije i podržava ko-lokalizaciju BAG3-F-aktina; štoviše, ekspresija BAG3 je bitna za strukturu vlakana F-aktina. HCMa je ​​zasijano 60 × 10 3 stanice / jažici (ploče sa 6 jažica) i 4 sata kasnije je transficirano ljudskom BAG3 shRNA ili hu-shNT bez ciljanog vektora kao negativnom kontrolom (0, 5 µg / jažica), kako bi se utišala tišina BAG3 gen. Nakon 72 sata, stanice su 2 sata stimulirane epi 500 μ mol / l. Za indirektnu imunofluorescenciju, stanice su obojene za detekciju BAG3 pomoću anti-mišjeg FITC-488-konjugiranog Ab. Negativni kontrolni mišji IgG upotrijebljen je umjesto primarnog mAb miša za procjenu nespecifičnog bojenja. Za bojenje F-aktinskih filamenata, stanice su inkubirane s TRITC-konjugiranim Phaloidinom. Hoechst 33342 korišten je za nuklearno bojanje (DAPI). Uzorci su analizirani pomoću konfokalnog mikroskopa (cilj × 60; šipke = 20 µm). Učinkovitost humane BAG3 shRNA u utišavanju BAG3 testirala je i WB. Prikazane slike predstavljaju tri neovisna pokusa i denzitometrijska analiza BAG3 WB signala, normaliziranih na GAPDH. epi, epinefrin; shNT, RNA kratke dlake bez meta; shBAG3, RNA ljudske BAG3 s kratkom dlakom. Značajnost izračunata pomoću t- testa: * P <0, 01 i ** P <0, 001

Slika pune veličine

Uzeti zajedno, ovi podaci pokazuju da u ljudskim kardiomiocitima epi inducira ERK fosforilaciju ovisnu o n-kateninskoj nuklearnoj translokaciji, što rezultira povećanom ekspresijom miR-371-5p, 35 što zauzvrat utječe na razinu ekspresije proteina BAG3. Čini se da je ispravna BAG3 indukcija potrebna komponenta za pravilno sastavljanje sarcomera u kardiomiocitima. Intrigantno, ovaj posttranskripcijski put koji regulira ekspresiju BAG3 proteina mijenja se prisutnošću varijante g2252c u 3'-UTR humanog BAG3, koja je često prisutna u skupini bolesnika s TTC-om, što sugerira da eP-inducirani miR-371-5p i BAG3 može potencijalno predstavljati nove molekularne komponente u patogenezi bolesti TTC bolesti.

Rasprava

Naši podaci pružaju dokaz za novi posttranskripcijski epirirani mehanizam koji uključuje miR-371-5p vezanje za BAG3 3'-UTR koji možda neće uspjeti kod subjekata koji nose BAG3 genomske varijante. TTC ili "sindrom slomljenog srca" karakteriziran je prolaznim i reverzibilnim omamljenjem miokarda što dovodi do sistoličkog balonskog baloniranja LV-a, češći je u žena u post-menopauzi i potaknut je emocionalnim ili fizičkim stresom pretjeranim oslobađanjem epi-ja. 1, 2 U našem predloženom mehanizmu, epi povećava razinu BAG3 proteina izravnim miR-371a-5p vezanjem na 3'-UTR regiju BAG3, što je dokazano dvostrukim luciferaznim testom. Zanimljivo je da SNP rs8946 leži u ovoj regiji, a naši podaci sugeriraju da ova nukleotidna promjena, koja je češće prisutna kod TTC bolesnika, sprečava ili destabilizira vezanje miR-371a-5p na BAG3 3'-UTR. Detaljnije pokazujemo da u kardiomiocitima epi pokreće ERK fosforilaciju što zauzvrat rezultira translokacijom β- katenina u jezgru. Prethodno je pokazano da nuklearni β- katenin surađuje s transkripcijskim faktorom LEF-1, da bi potaknuo ekspresiju miR-371-5p 35 (Slika 6). Zanimljivo je da u mehanizmu koji smo opisali izravno vezanje miR-371a-5p na 3'-UTR BAG3 rezultira povećanom ekspresijom BAG3 proteina, vjerojatno translacijskom regulacijom, što zahtijeva daljnje analize u našim budućim studijama. Iako su miRNA primarno uključene u posttranskripcijsku represiju ciljnog proteina, nakupljanje dokaza pokazuje da miRNA i njihovi proteinski kompleksi također mogu potaknuti ekspresiju gena na posttranskripcijskoj razini pomoću različitih izravnih i neizravnih mehanizama. 26, 27, 36, 37

Image

Epi regulacijski put na BAG3 izrazu. Epi u kardiomiocitima potiče, možda pomoću PKA, 42 ERK fosforilacije. Pokazalo se i da je fosforilirani ERK fosforilat CK2 α , koji potom fosforilira α- katenin, ukidajući njegov inhibitorni učinak na β- katenin kao što je prethodno opisano. 43 P- katenin doista se slobodno translocira u jezgru gdje djeluje kao faktor transkripcije, zajedno s LEF-1, pojačavajući mir-371–373 klastersku transkripciju. 35 Zreli miR-371a-5p veže wt BAG3 3'-UTR poboljšavajući prijevod proteina ( a ). Kada dođe do mutacije homozigote g2252c, miR-371a-5p se više ne može vezati na 3'-UTR BAG3 i ne dobije se povećanje BAG3 kao odgovor na epi ( b )

Slika pune veličine

Na temelju trenutnih saznanja o funkcionalnoj ulozi BAG3 u kardiomiocitima, razumno je pretpostaviti da gubitak regulacije BAG3 može osjetiti kardiomiocite na stresna stanja. U skladu s tim, nedavno je pokazano da je BAG3 neophodan za homeostazu mehanički stresnih stanica, 38, 39 i da je važan sastavni dio puta autopegije potpomognute šperonom (CASA), što dovodi do selektivne lizosomske razgradnje nerazvijenih proteina. U mišićnim stanicama, CASA strojevi su smješteni na Z- disku i čini se da su neophodni za zbrinjavanje neotvorenih mehano-senzora i proteina citoskeleta koje nastaju kao posljedica mehaničke napetosti. Oštećenje CASA strojeva rezultira poremećajem z- diska u kontrakciji mišića. 38, 39 Nadalje, pokazano je da mutacije BAG3 rezultiraju abnormalnim funkcijama mišića i odgovorne su i za mišićnu distrofiju i za kardiomiopatije, dok smanjene razine BAG3 doprinose nastanku bolesti u nepoznatim slučajevima proširenih kardiomiopatija. 40 Nadalje, iscrpljivanje BAG3 uzrokuje smrtonosnu kardiomiopatiju ne u embrijima, već u miševa s nedostatkom postnatalne vrećice 3. 12 U skladu s ovim izvješćima, otkrili smo da utišavanje BAG3 u primarnim kardiomiocitima odraslih ljudi rezultira dramatičnom izmjenom F-aktinskih filamenata. Naše studije mogu sugerirati da su bazne razine BAG3 u TTC bolesnika dovoljne da spriječe promjene mišićnih stanica i da mutacija g2252c u 3 '-UTR BAG3 može potencijalno rezultirati gubitkom sposobnosti ponovnog reguliranja ovog proteina zbog izloženosti visokoj razine epi. Izostanak BAG3 regulacije općenito se može dobro tolerirati; međutim, pod posebno stresnim uvjetima, neuspjeh u reguliranju razine BAG3 na dovoljnoj razini može rezultirati oštećenjem srca i otvorenim kliničkim fenotipom.

Zaključno, identificirali smo novi signalni put koji vodi do regulacije BAG3 kao odgovor na epi u ljudskim kardiomiocitima i taj put može biti manje aktivan kod ispitanika koji prenose nukleotidnu g2252c promjenu u homozigozi i oslabljen je kod onih koji ga nose u heterozygosis. Moguće je da nekoliko kontrolnih slučajeva koji pokazuju ovu mutaciju u homozigozi mogu razviti bolest kasnije u životu samo ako su izloženi jakom emocionalnom stresu ili kao posljedica jatrogene izloženosti kateholaminima. U ispitanika koji su nosili polimorfizam BAG3 g2252c u heterozigozi, moguće je da se na drugom alelu pojavljuju dodatne varijante koje narušavaju funkciju ili regulaciju BAG3 i doprinose poremećenoj funkciji BAG3. Zaključno, značajno povećana učestalost promjene nukleotida g2252c u bolesnika s Takotsuboom pruža neizravne dokaze da varijanta g2252c može predisponirati kardiomiocite na oštećenje uzrokovano epijom i da može imati funkcionalnu ulogu u patogenezi bolesti.

Materijali i metode

Pacijenti i darivatelji

Svi su se pacijenti upisali prema dijagnostičkim kriterijima TTC kliničke klinike Mayo kako slijedi: prolazna akinezija ili diskinezija aplikalnog i / ili srednjeg ventrikularnog segmenta LV; nema angiografskih dokaza o ≥50% stenozi koronarne arterije ili rupturi plaka ili intrakoronarnom stvaranju tromba; nove nepravilnosti elektrokardiograma (EKG) (dinamičke promjene ST-T ili inverzija T-vala); i odsutnost intrakranijalnog krvarenja, feokromocitoma i miokarditisa.

Uzorci krvi prikupljeni su iz Sveučilišne bolnice 'San Giovanni di Dio e Ruggi d'Aragona', Salerno, Italija, u razdoblju od 3 godine od siječnja 2011. do prosinca 2013., te iz bolnice San Luca, Vallo della Lucania, Salerno, Italija, u razdoblju od 3 godine od siječnja 2007. do prosinca 2009. Svi sudionici dali su informirani pismeni pristanak, istraživanje je odobrilo lokalno etičko povjerenstvo i u skladu je s načelima Helsinške deklaracije.

Kohorta pacijenata Takotsubo obuhvaćala je 70 žena (prosječna dob 64, 3 ± 12; u rasponu od 35 do 82 godine). U ukupnoj populaciji, među tipičnim faktorima kardiovaskularnog rizika prevladavala je hipertenzija (55%) u usporedbi s dijabetesom, hiperholesterolemijom i pušenjem. Većina bolesnika (82%) bila je u menopauzalnom stanju. Akutni okidački događaj prije početka TTC-a zabilježen je kod 52 bolesnika (emocionalni i fizički okidač kod 41, odnosno 11 bolesnika). Bol u prsima je bio najčešći simptom u vrijeme prijema u 44 bolesnika (62%). Kod EKG prezentacije, povišenje ST bilo je učestalije (56%) u usporedbi s ne-elevacijom ST (18%) i inverzijom T-vala (26%). Bila je upečatljiva prevalenca apikalnog baloniranja (81%). Varijantni oblici otkriveni su u 13 bolesnika (11 srednje ventrikularnih i 2 bazalna baloniranja). Sistolna funkcija LV-a izrazito je smanjena za 34 ± 8%. Kako je objavljeno u većim serijama bolesnika s TTC-om, akutne komplikacije pojavile su se kod 28% bolesnika. HF je najčešća komplikacija otkrivena u 14 bolesnika, dok je kardiogeni šok dijagnosticiran u 6 bolesnika.

Kao kontrolna skupina, sekvencionirali smo DNK uzorke od 81 zdrave darivateljice, starije od 50 godina, s nedostatkom procijenjene kardiovaskularne bolesti u trenutku uzimanja krvi. Kontrolni uzorci prikupljeni su s Odjela za imunološku transfuziju Sveučilišne bolnice 'San Giovanni di Dio e Ruggi d'Aragona'.

Analiza slijeda

Specifični primeni za BAG3 dizajnirani su da pojačaju PCR exon 2 (Fw5′-AGGAGGGTTCACTTCCCAGT-3 ′, Rw5′-CCCACTGAAGAACAGCCCTA-3 ′), exon 3 (Fw5′-TGCCCTCTACCCTGTGTCTC-3 ′), RW, exon 4 (Isti dio) (Fw5′-TTCCCAGCCTGAAAACAAAC-3 ′, Rw5′-CTGGACTTGACCTGGGACAT-3 ′) i exon 4 (II. dio) (Fw5′-GAGGGACGAGCCGATGTGCG-3 ′, Rw5GTGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGG, GCCGGGGGG, G), exon 4 (Ist dio) (Fw5′-TTCCCAGCCTGAAAACAAAC-3 ′, Rw5′-CTGGACTTGACCTGGGACAT-3 ′) koristeći kao predložak 50 ng genomske DNK (gDNA), pročišćenu od svježe krvi (200 μl), (DNeasy komplet za krv i tkiva; Qiagen, Valencia, Kalifornija, SAD) prikupljene od pacijenata i zdravih davatelja. PCR products (20–100 ng) were sequenced using BigDYE v3.1 (1 μ l; Applied Biosystems, Foster City, CA, USA), SBDD buffer (1.9 μ l; Applied Biosystems), Fw or Rw primer (5 pmol) and water to reach the final volume of 10 μ l, by following the supplier instructions for cycling conditions. The reaction volumes were purified by precipitation with ethanol and NaAc (50 mmol/l), and shipped to the sequencing facility.

Bioinformatička analiza

Sequencing data were analyzed and aligned using ClustalW software (available at www.clustal.org, UCD Dublin, Ireland). We assessed miRNA-binding potential to the BAG3 3′-UTR at position 2252 (±10 bp) using open computational software tools developed by the Segal Lab of Computational Biology (//genie.weizmann.ac.il/), miRBase, miRWalk and TargetScan. Sequence conservation analysis among species was performed using the mVISTA tool. 30

Cell cultures, treatments and transfections

HCMa were purchased both from Sciencell Research Laboratories (San Diego, CA, USA) and Promo Cell GmbH (Heidelberg, Germany), and grown respectively in cardiac myocyte medium supplemented with fetal bovine serum (FBS) (5%), cardiac myocyte growth factors (1%), penicillin/streptomycin solution (1%) (Sciencell Research Laboratories) or myocyte growth medium supplemented with fetal calf serum (5% V/V), human epidermal growth factor 0.5 ng/ml, basic fibroblast growth factor 2 ng/ml, insulin 5 μ g/ml (Promo Cell GmbH) (Supplementary Figure S5).

All experiments were performed on low-passage cell cultures. Cos-7 cells (ECACC 87021302) were cultured in DMEM supplemented with FBS (10%) and penicillin/streptomycin (1%) solution in a 5% CO 2 incubator at 37 °C. Transfections were performed using serum-free media. Cardiomyocytes were seeded 50 000 cells/well (12-well plate for protein expression analysis) or 100 000 cells/well (6-well plate for mRNA and miRNA expression analysis) and transfected with precursor (2, 5 and 10 nmol/l) or inhibitors (1, 10 and 100 nmol/l) of miR-371a-5p or SCR sequences as a negative control (Ambion, Foster City, CA, USA), by using Oligofectamin (Invitrogen). HCMa cells were stimulated with epi HCl (25, 50, 100, 250 and 500 μ mol/l for 5, 10, 15, 30, 60 and 120 min) (Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA) and cells were then collected in the Cell Disruption Buffer provided by the miRVana Paris Kit (Ambion) at the indicated time points. pERK inhibition was obtained by pretreating cells with the pERK inhibitor U0126 (10 μ mol/l) (Calbiochem, San Diego, CA, USA) for 20 min, then epi was added (500 μ mol/l). To assay which epi receptor is involved in the signaling, cells were pretreated for 30 min with α 1 antagonist Prazosin (5 μ M), β 2 antagonist ICI 118–551 (1 μ M), β 1 antagonist Atenolol (10 μ M) and then stimulated for 2 h with epi HCl (500 μ M). Dimethyl sulfoxide (Sigma Aldrich) was used as a solvent control for U0126 and epi receptor antagonists, and its concentrations never exceeded 0.1% v/v. To silence BAG3 expression, HCM cells were seeded 60 000 cells/well (6-well plates) and 4 h later transfected by using 2 μ l of X-treme Gene 9 reagent (Roche, Indianapolis, IN, USA) with 0.5 μ g/well of BAG3-human 29mer shRNA retroviral construct (gene ID=9531; Origene Cat.Nr.TR314524) or HuSH 29-mer shRNA non-effective expression (No target; Origene Cat.Nr.TR30003) for 72 h.

RNA-binding protein immunoprecipitation assay

RIP assay was performed with Magna RIP kit (Millipore, Billerica, MA, USA) according to the manufacturer's instruction. HEK293 cells were lysed and the RNA-associated proteins were immunoprecipitated (IP) with anti-AGO2 Antibody (Millipore, 03-110). The precipitated RNA was retro-transcribed and measured by quantitative real-time PCR (Roche, Universal Probe Library System) by normalization to the non-IP control (Input). Primers were designed using the Universal Probe Library Assay Design Center (Roche). Primers and probes sequences were as follows: U87_BAG3_741F 5′-TCAGCCAGATAAACAGTGTGGA-3′, U87_BAG3_826R 5′-GAGACTGGGACCGCTCAG-3′ with the UPL#87 (Roche) and U77_BAG3_2298F 5′-TCTGCAGCCCTGTCTACTTG-3′, U77_BAG3_2338R 5′-AGACAGTGCACAACCACAGC-3′ with the UPL#77 (Roche).

Plasmids and luciferase assay

BAG3 (NM_004281.3) 3′-UTR, 504-bp long, encompassing the predicted miRNA targeting sequence, was amplified by PCR by using the modified primer pair FW5′-TCATGTATAGAGCT|CCTCTGCCCTGTAAAAATCAGA-3′( Sac I) and RW5′-TCATGTATAA|AGCTTAAAATGTAGCATTAAAGTCATCCAA-3′( Hind III), and gDNA template isolated from a patient carrying the SNP rs8946 in homozygosis or from a donor carrying the wt sequence. PCR products were digested with the suitable restriction enzymes and cloned into the pMIR-REPORT luciferase miRNA expression reporter vector (Ambion) previously digested with Hind III and Sac I. All plasmids were fully sequenced before use. The dual-luciferase method used to assay miRNA binding affinity for the target sequence was the same used by da Costa Martins et al. 41

COS-7 or HCMa cells were seeded 5, 000 cells/well (96-well plate) and transfected with pre-miR-371a-5p, (0.1, 0.5 and 1 nmol/l) or negative control#1 miR precursor molecules, by using Oligofectamine (Invitrogen). Six hours later, cells were co-transfected by using Fugene reagent (Roche) with pMIR-report plasmid (0.15 μ g/well) containing BAG3 3′-UTR (wt or carrying the homozygous SNP) and pRL Renilla luciferase control reporter vector (10 ng/well), which provides constitutive expression of Renilla luciferase and was used for normalization. Firefly luciferase activity was measured 24 h after transfection with a Dual-Glo Luciferase Reporter Assay kit (Promega, Madison, WI, USA) using Renilla luciferase as internal control.

Antibodies and western blotting

Control and treated cells were collected, washed in ice-cold PBS and re-suspended in ice-cold cell disruption buffer (300 μ l). miRVana Paris kit (Ambion) and proteins (10 μ g) were used for western blot (WB) analysis; blots were probed with anti-BAG3 TOS-2 polyclonal antibody (Biouniversa srl, Fisciano (SA), Italy), anti-phospho-p44/42 MAPK (ERK1/2) antibody (Cell Signaling Technology Inc., Danvers, MA, USA, #9101), anti-p44 MAP kinase ERK1 antibody (Cell Signaling Technology Inc., #4372) or anti ERK2 (C-14) antibody (SC-154, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), anti- β -catenin antibody (ab32572, Ambion), anti-GAPDH mouse antibody (sc-47724, Santa Cruz Biotechnology) or anti- β -actin mouse mAb (sc-47778, Santa Cruz Biotechnology). Nuclear and cytoplasmic fractions were prepared from cells using NE-PER Reagent (Thermo Scientific, Rockford, IL, USA). Nuclear fractions were used for WB analysis with anti- β -catenin antibody (ab32572 Ambion), anti-lamin A/C antibody (Cell Signaling Technology Inc.) and anti-GAPDH mouse antibody (sc-47724, Santa Cruz Biotechnology). Immunoreactivity was detected by sequential incubation with horseradish peroxidase-conjugated secondary antibodies (Sigma Aldrich) and ECL detection reagent (GE Healthcare, Amersham Place, Little Chalfont, UK). Signal detection and scanning densitometry of the bands was performed with ImageQuant LAS4000 and ImageQuantTL respectively (GE Healthcare). The results of optical density ratio of target proteins versus either GAPDH, β -actin or lamin A are presented as the mean±SD of at least three different experiments; each experiment run at least on two different gels.

Analysis of cell viability

Cells were incubated for the established times in the absence and in the presence of different concentrations of epi. The number of viable cells was quantified by MTT ([3-(4, 5-dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-diphenyl tetrazolium bromide]) assay. Absorption at 550 nm for each well was assessed using a microplate reader (LabSystems, Vienna, VA, USA).

Apoptosis evaluation

Epi-treated and control cells were collected and then incubated with a propidium iodide (PI) solution (0.1% sodium citrate, 0.1% Triton X-100 and 50 mg/ml of PI) for 30 min at 4 °C. Apoptosis was quantified as the proportion of cells with hypodiploid DNA (sub G0–G1 peak) using flow cytometry (FACScan, Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA). Data were normalized as percentage relative to positive control (doxorubicin).

To analyze Caspase-3 activity, cells (2 × 10 4 ) were lysed in a buffer containing HEPES 50 mM, DTT 1 mM, EDTA 0.1 mM, NP-40 0.1% and CHAPS 0.1%, and protein concentration was determined. Protein aliquots (20 μ g) were incubated with 20 μ M peptide substrate Ac-DEVD-AMC (Pharmingen, San Diego, CA, USA) at 37 °C for 3 h in the lysis buffer. Caspase-3 activity was determined in the cytosolic extracts by analyzing the release of 7-amino-4-methylcoumarin (AMC) monitored by a spectrofluorometer, with excitation wavelength of 380 nm and emission wavelength of 440 nm.

Analysis of intracellular cAMP

cAMP intracellular concentrations were assayed in HCM cells after epi stimulation. HCMa cells (1 × 10 5 ) were seeded in 12-well plates and stimulated with epi at different concentrations (0, 0.5, 5, 50 and 500 μ M) for 15 min. Cells were lysed with 300 μ l of 0.1 M HCl. Lysates were immediately used for a competitive immunoassay (Direct cyclic AMP Enzyme-linked Immunosorbent Assay kit, Enzo Life Sciences, Farmingdale, NY, USA), to measure the intracellular concentration of cAMP. Data were analyzed by using Microplate Manager 4.0 software (Bio-Rad, Hercules, CA, USA).

mRNA/miRNA isolation and real-time RT-PCR

Total RNA isolation (mRNA/miRNA) was performed by using the Ambion mirVana PARIS Kit (Ambion). RNA (1 μ g) was reverse transcribed by using miScriptII Reverse Transcription Kit (Qiagen) and the HiFlex Buffer. Primers were designed to detect transcripts for hBAG3 (NM_004281.3) and hGAPDH (NM_001256799.1). Real-time PCR was performed on Light Cycler480 (Roche) using LightCycler480 SYBR Green Master Mix. For real-time PCR detection of miRNAs, miScript Primer Assays for miR-371a-5p and RNU6, and the miScript SYBR Green PCR Kit (Qiagen) were used. Transcript quantities were compared using the relative Ct method, where the amount of target normalized to the amount of endogenous control (GAPDH or RNU6) and relative to the control sample is given by 2 (–ΔΔCt) . The results are presented as mean SD of the mean of experimental triplicates.

imunofluorescencija

In the first experiment aimed at showing β -catenin nuclear translocation, HCMa were seeded 100 000 cells/well (6-well plate), and 1 day later were pretreated with the pERK inhibitor U0126 and/or stimulated with epi 500 μ mol/l for 15 min. In the second experiment aimed at testing functional effects of BAG3 misregulation, as an in-vitro model of TTC, HCM cells were seeded 60 000 cells/well (6-well plates) and transfected with shBAG3-human retroviral construct or HuSH non-effective expression (No target). Seventy-two hours later, cells were treated with epi 500 μ mol/l for 2 h. Cells were fixed in 3.7% formaldehyde 1 × PBS for 30 min at room temperature, incubated for 5 min with 1 × PBS 0.1 mol/l glycine, then permealized with 0.1% Triton X-100 and incubated with 5% NGS. Following overnight incubation at 4 °C with rabbit anti- β -catenin mAb (1 : 250) (ab32572, Ambion), or mouse anti-BAG-3 mAb (AC-1) (Biouniversa srl, 3 ng/ μ l), coverslips were washed and incubated at room temperature for 45 min with goat anti-rabbit IgG or anti-mouse IgG DyLigth 488-conjugated antibodies (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA, USA) and then washed, and to stain F-actin filaments cells were incubated 40 min at room temperature with TRITC-conjugated Phalloidin (P1951) (Sigma Aldrich, 1 ng/ μ l), then cells washed and incubated with Hoechst 33342 (Sigma Aldrich, 2 μ g/ml) at room temperature for 10 min. Samples were analyzed using a confocal laser scanning microscope (Zeiss LSM510 Meta Confocal Microscope, Carl Zeiss, Jena, Germany). Images were acquired in sequential scan mode by using the same acquisition parameters. LeicaQ9 Confocal software (Leica Microsystems, Wetzlar, Germany), was used for data analysis.

Statistička analiza

The results are presented as mean±SD Statistical analyses were performed using Microsoft Excel (Microsoft, Redmond, WA, USA) and GraphPad software (GraphPad, San Diego, CA, USA). Student's t -test was used to compare two experimental groups and differences were considered significant when P <0.05. Allele frequencies were estimated by direct counting. The significance of the distribution of alleles between the patients and the controls was tested by the χ 2 -method with Fisher's exact probability test ( P -value test). The odds ratio of the risk of stress cardiomyopathy was calculated by the 2 × 2 contingency table.

Dodatna informacija

Word dokumenti

  1. 1.

    Dodatna informacija

Glosar

BAG3

BCL2-associated athanogene 3

TTC

Takotsubo cardiomyopathy

HCMa

human cardiomyocytes adult

SNP

polukleorfizam s jednim nukleotidom

miR-371a-5p

microRNA 371a-5p

RT-PCR

reverse-transcription PCR

3′-UTR

3′-untranslated region

epi

epinephrine

RISC

RNA-induced silencing complex

Ago2

argonaute RISC catalytic component 2

EKG

electrocardiogram

LV

left ventricular

gDNA

genomic DNA

WB

western blotting

POČIVAO U MIRU

RNA-binding protein immunoprecipitation

kamp

ciklički AMP

SCR

scrambled

Supplemental Information accompanies this paper on Cell Death and Discovery website (//www.nature.com/cddiscovery)