Nukleolarni protein csig potreban je za funkciju p33ing1 u uv-induciranoj apoptozi | stanična smrt i bolest

Nukleolarni protein csig potreban je za funkciju p33ing1 u uv-induciranoj apoptozi | stanična smrt i bolest

Anonim

teme

  • apoptoza
  • Nucleoproteins

Sažetak

Gensko inhibirani protein (CSIG) staničnog starenja, nukleolarni protein s ribosomalnom L1 domenom u svom N-terminusu, može vršiti ne-ribosomske funkcije za regulaciju bioloških procesa, poput stanične starenja. Ovdje smo opisali prethodno nepoznatu funkciju za CSIG: promocija apoptoze kao odgovor na ultraljubičasto (UV) zračenje uzrokovano CSIG uregulacijom. Identificirali smo p33ING1 kao obvezujući partner koji komunicira s CSIG-om. Nakon UV zračenja, p33ING1 povećava ekspresiju proteina, translocira se u nukleolus i veže CSIG. p33ING1 zahtijeva da njegovo nukleolarno ciljano područje sekvence djeluje na CSIG i pojačava stabilnost CSIG proteina, što je bitno za aktiviranje nizvodnih efektora, X proteina povezanih s Bcl-2, za promicanje apoptoze. Prema tome, naši podaci impliciraju da p33ING1 – CSIG os funkcionira kao novi pro-apoptotički regulator kao odgovor na oštećenje DNK.

Glavni

Nukleolus je mjesto za sintezu rRNA i skupljanje ribosoma u stanici. Nedavna istraživanja pokazala su da se nukleolus pojavio kao vrlo složen i višenamjenski regulatorni odjeljak. 1, 2 Nukleolus je izuzetno osjetljiva struktura koju treba nadzirati; on reagira na stanični apoptotički stres poput zračenja ili izloženosti citotoksičnim agensima. 3, 4 nukleolarni proteini kao što su nukleofosmin (NPM / B23), nukleostemin, L11, Net1 i ARF (proizvod alternativnog okvira za čitanje CDKN2A lokusa) imaju važnu ulogu u tim ne-ribosomskim funkcijama, uključujući regulaciju rasta i smrti stanica, stres reakcije, mitoza i stanični ciklus; tek razumijemo. 3, 4

Protein inhibiran staničnim genskim proteinima (CSIG) (RSL1D1 / PBK1 / L12) protein je prvo kloniran od strane nekoliko laboratorija, uključujući i naš. To je nukleolarni protein koji ima ribosomalnu L1 domenu u N-terminusu i domenu bogatu lizinom u svom C-terminusu. 5 Ovaj protein može odgoditi stanično starenje inhibicijom transformacije fosfataze i tensin homolog proteina (PTEN). 5 Također može regulirati nukleolarnu lokalizaciju nukleostemina kroz fizičku interakciju pomoću njegovog C-kraja. 6 Može li CSIG modulirati odgovor na pro-apoptotičke podražaje za sada nije poznato.

Proteinski složeni slojevi između nukleola i nukleoplazme važni su za mnoge ne-ribosomske procese. 4, 7 Kretanje proteina uglavnom je izvan nukleola, a ne kao oštećenje DNA. 8 Čini se da je malo proteina ciljano na nukleole nakon oštećenja; poznati primjeri uključuju p33ING1, RelA, DEDD, protein toplinskog šoka-70 (Hsp70) i ​​PML, koji migriraju iz nukleoplazme ili citoplazme. 9, 10, 11, 12, 13 Zabilježeno je da se supresija tumora p33ING1 smanjila kod tumora dojke, želuca i limfoide. 14 p33ING1 potiče apoptozu, a njegovo kretanje prema nukleolu povećava apoptozu nakon ultraljubičastog (UV) zračenja. 12, 15, 16 p33ING1 posjeduje nukleolarni ciljni niz (NTS); mutacija u ovom slijedu smanjila je apoptotsku funkciju p33ING1 nakon UV tretmana. 12 ARF protein, koji se lokalizira pretežno u nukleolu, fizički se povezuje s p33ING1 i uzrokuje zaustavljanje staničnog ciklusa u nedostatku UV stresa. 17 Međutim, ARF kreće od nukleola do nukleoplazme kao odgovor na UV - u smjeru suprotnom kretanju p33ING1. 18, 19 Zašto p33ING1 protein cilja nukleolus radi promicanja apoptoze kao odgovora na UV, nije jasno.

Ovdje izvještavamo da pojačana ekspresija proteina CSIG senzibilizira stanice na apoptozu izazvanu UV zračenjem. p33ING1 cilja nukleolus i stabilizira CSIG protein nakon UV zračenja. Ovdje pokazujemo da p33ING1 treba svoje NTS-ove da bi komunicirali s CSIG-om, što je potrebno za stabilizaciju proteina CSIG i apoptozu ovisnu o p33ING1 nakon UV stresa. Također, pad CSIG ekspresije smanjuje apoptozu ovisnu o p33ING1 nakon UV zračenja. Naši rezultati pružaju novi mogući molekularni mehanizam koji stoji u osnovi regulacije apoptoze nakon UV zračenja.

Rezultati

CSIG potiče apoptozu izazvanu UV zračenjem

Mnogi nukleolarni proteini reagiraju na oštećenje DNK. 3 Da bismo ispitali utječe li CSIG na sposobnost stanica da podvrgnu apoptozu kao odgovor na genotoksični stres, inicijalno smo analizirali razine ekspresije CSIG nakon oštećenja DNA. Kad su stanice HEK293 bile tretirane UV, etopozidom, niskim i visokim koncentracijama cisplatina i doksorubicina da se inducira genotoksični stres, stanice su nakon tretmana značajno regulirale CSIG (Slika 1a). Da bismo dalje istražili moguću ulogu CSIG u apoptozi uzrokovanoj UV-om, transficirali smo stanice HEK293 kontrolnim vektorom ili plazmidom koji eksprimira CSIG divljeg tipa i podvrgli smo stanice UV-obradi (slika 1b). Apoptoza je bila prikazana dvostrukim obojenjem Annexin-V i PI; postotak frakcije sub-G1 analizom FACS; i kondenzacija kromatina obojenjem 4, 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI). Rezultati su pokazali da prekomjerna ekspresija CSIG-a ne inducira apoptozu u nedostatku oštećenja DNK (slika 1c). Međutim, nakon UV tretmana, CSIG je povećao populaciju apoptotskih stanica (slika 1d, dopunska slika S1b). Prekomjerna ekspresija CSIG također je povećala populaciju apoptotskih stanica nakon liječenja doksorubicinom (dopunska slika S1). Također su prikazani profili staničnog ciklusa; prekomjerna ekspresija CSIG neznatno je smanjila postotak G 1- faze i povećala broj stanica S-faze i G2 / M faze, ali nije bilo značajne razlike u usporedbi s kontrolama, kako u tretmanu bez UV, tako i kod UV zračenja (Slike 1c i d).

Image

CSIG senzibilizira stanice na UV-induciranu apoptozu. ( a ) Stanice HEK293 tretirane su s 50 J / m 2 UV, etopozidom (50 µM ) i niskim (1 µ g / ml) i visokim (10 µg / ml) koncentracijama cisplatina i doksorubicina (2 µM ), Nakon 6 h, stanice su sakupljene za Western blot analizu. Tubulin je korišten kao kontrola opterećenja za analizu western blota. Relativno obilje CSIG-a mjereno je denzitometrijom i izraženo porastom nabora u odnosu na kontrolne stanice. ( b ) HEK293 stanice su transficirane plazmidima za CSIG ili prazni kontrolni vektor. Stanice su lizirane i testirane Western blottingom na ekspresiju CSIG i p- aktina. ( c ) HEK293 stanice su transficirane plazmidima za CSIG ili prazni kontrolni vektor, a 48 sati kasnije sakupljeni su za apoptotičke testove. ( d ) Stanice HEK293 transficirane su plazmidima za CSIG ili prazni kontrolni vektor, a 36 sati kasnije ozračene su s 50 J / m2 UVC i kultivirane tokom 24 sata. Plutajuće i adhezivne stanice sakupljene su za apoptotičke testove. Za analizu AnnexinV – FITC i PI, stanice obojene od AnnexinV ili oba bojila smatrane su apoptotičkim. Za analizu staničnog ciklusa, stanice su sabrane, fiksirane i obojene pomoću PI. Vodoravne šipke označavaju područja kvantificirana za određivanje udjela stanica s naznačenim sadržajem DNK. M1 označavaju apoptotičke stanice s sadržajem sub-G1 DNA. Vrijednosti su srednje vrijednosti ± SD * P ≤0, 05. Kondenzacija kromatina vizualizirana je DAPI bojenjem i analizirana imunofluorescentnom mikroskopijom. Stanice koje su bile kondenzirane, fragmentirane i svijetle, smatrale su se apoptotskim stanicama

Slika pune veličine

Ultraljubičasto zračenje može izazvati i CSIG i p33ING1 ekspresiju proteina

Otkrili smo da indukcija proteina CSIG nakon UV nije ovisna o statusu p53 (podaci nisu prikazani). U tom procesu mogu sudjelovati i drugi proteini. p33ING1 je sumnjivi supresor tumora, koji potiče apoptozu na način ovisan o p53 ili o-ovisan. 15, 20, 21, 22, 23 Zračenje zračenjem cilja p33ING1 na nukleolus radi promicanja apoptoze; CSIG se primarno lokalizira u nukleolu, 5, 12, a CSIG povećana UV-inducirana apoptoza (Slika 1). Da bi se utvrdilo postoji li funkcionalni odnos CSIG sa p33ING1 u UV-induciranoj apoptozi, ispitivane su njihove stanične lokalizacije i uzorci ekspresije.

Podćelijske raspodjele CSIG i p33ING1 određene su konfokalnim analizama visoke rezolucije. Rezultati su pokazali da se CSIG protein lokalizira pretežno u nukleolu (Slika 2a gornja ploča). Endogeni p33ING1 uglavnom se distribuirao u jezgri bez liječenja i skupljao se unutar nukleolusa nakon UV zračenja. Ektopijski eksprimirani p33ING1 povećao je njegovu distribuciju i u jezgri i u nukleolusu bez UV zračenja; nakon UV zračenja, egzogeni p33ING1 skupio se unutar nukleola. U velikoj mjeri, CSIG se kolokalizirao i s endogenim i s egzogenim proteinom p33ING1 u nukleolusu nakon UV zračenja (slika 2a donja ploča). Ovi podaci sugeriraju fiziološku vezu između CSIG i p33ING1 nakon UV zračenja.

Image

Ekspresija proteina i kolokalizacija CSIG sa p33ING1 nakon UV zračenja. ( a ) Reprezentativne slike stanica obojenih za p33 (zeleno) i CSIG (crveno) neizravnom imunofluorescencijom. Lokalizacija endogenog CSIG imunostanirana je anti-CSIG antitijelom, nakon čega je slijedila analiza konfokalne mikroskopije. Nukleoli su prikazani na slikama diferencijalnog interferencijskog kontrasta (DIC) (gornja ploča). HEK293 stanice su transficirane kontrolnim vektorom ili ekspresijskim vektorom za p33, ostavljene neobrađene ili ozračene UV; Nakon 6 sati, stanice su imuno obojene anti-p33 i anti-CSIG antitijelima, nakon čega je slijedila analiza konfokalne mikroskopije (donja ploča). Prikazane su reprezentativne slike. Nuklei su vizualizirani pomoću DAPI bojanja, a slike su prekrivene (Spajanje). Bijele strelice označavaju lokalizaciju proteina nakon UV zračenja. ( b ) HEK293, HeLa, HCT116 p53 + / +, HCT116 p53 - / -, stanice RKO i RKO-E6 ozračene su s 50 J / m 2 UV; 6 h kasnije stanice su sakupljene odvojeno za Western blot analizu CSIG, p33, p53 i tubulina. ( c ) Stanice HEK293 su ozračene s 50 J / m2 UV i stanice su sakupljene u različitim vremenskim točkama kako je naznačeno. Imunoblotska analiza provedena je korištenjem anti-CSIG, anti-p33, anticiklin A, anticiklin B, anticiklin D1 i antitubulinskih antitijela

Slika pune veličine

Prethodne studije izvijestile su da p33ING1 povećava ekspresiju proteina nakon oštećenja DNA u nekim staničnim linijama. 20, 24 Također, razina proteina CSIG povećava se nakon tretmana oštećenja DNK (slika 1). Dakle, analizirali smo može li UV zračenje inducirati ekspresiju proteina p33ING1 i CSIG u staničnim linijama s različitim statusom p53. Rezultati su pokazali da se CSIG i p33ING1 istovremeno induciraju nakon UV zračenja u HEK293 (deregulacija p53), HeLa (nedostatak p53), HCT116 p53 + / + (p53 divlji tip) i HCT116 p53 - / - (p53 nula), ali ne i RKO (p53 divlji tip) i RKO-E6 (p53 nedostatak), stanice. Ovi rezultati pokazuju da su UV inducirani CSIG i p33ING1 izrazi, koji su bili neovisni o p53 (Slika 2b). Osim UV zračenja, p33ING1 i CSIG istodobno su izazvani tretmanima oštećenja DNA, uključujući visoku koncentraciju cisplatina, etopozida i doksorubicina (dopunska slika S2).

Za daljnje proučavanje profila ekspresije proteina CSIG i p33ING1 nakon UV zračenja, analizirali smo izraze CSIG i p33ING1 u različitim vremenskim točkama nakon UV zračenja. Rezultati su pokazali da je obrazac ekspresije p33ING1 paralelno CSIG nakon UV zračenja (Slika 2c). Ekspresija proteina CSIG i p33ING1 brzo se inducira već 2 sata nakon UV zračenja, dostigla je svoj vrhunac u 8-10 sati i pala 12 sati kasnije. Da bi se utvrdilo da li je ista kinetika CSIG-a i p33ING1 nakon UV tretmana posljedica zaustavljanja staničnog ciklusa, detektirani su i izrazi ciklin A, ciklin B i ciklin D1, koji su ukazivali na različitu fazu staničnog ciklusa. Rezultati su pokazali da indukcija razine CSIG i p33ING1 nakon UV tretmana nije u skladu s bilo kojom fazom napredovanja staničnog ciklusa (Slika 2c).

p33ING1 inhibira razgradnju proteina CSIG nakon UV zračenja

Da bismo izravno odredili povezanost regulacije CSIG i p33ING1 nakon UV zračenja, stanice HEK293 transficirane su CSIG ili p33ING1 plazmidima, a zatim podvrgnute UV zračenju. Ispitane su razine proteina CSIG u uvjetima prekomjerne ekspresije p33ING1, i obrnuto. Western blot analiza pokazala je da p33ING1 inducirana endogena CSIG ekspresija, a indukcija CSIG ostaje najmanje 24 sata nakon UV zračenja (slika 3a, dopunska slika S3a), dok prekomjerna ekspresija CSIG nije mogla povećati razinu p33ING1 nakon UV (slika 3b). Da bi se ispitalo je li indukcija CSIG proteina p33ING1 nakon UV zračenja rezultat povećane CSIG transkripcije, procijenjene su razine CSIG mRNA. Pod istim uvjetima kao i transfekcija p33ING1, u kojoj je CSIG protein značajno induciran, razina mRNA CSIG-a samo je blago porasla (podaci nisu prikazani), što ukazuje da p33ING1 može utjecati na razinu proteina CSIG putem drugih mehanizama. Da bismo ispitali je li indukcija CSIG-a p33ING1 posljedica povećane stabilnosti proteina CSIG, tretirali smo stanice inhibitorom proteasoma MG-132; dodavanje MG-132 dovelo je do povećanja razine proteina CSIG (slika 3c). Također, p33 povećao je CSIG protein smanjujući njegovu sveprisutnost nakon UV zračenja (Slika 3d). Proveli smo testove poluživota CSIG u stanicama kontrole i p33ING1-prekomjerne ekspresije. Nakon UV zračenja, činilo se da je endogeni CSIG nestabilan nakon 10 h potjeranja u kontrolnim stanicama (t1 / 2 = 16, 9 h). Međutim, u prisutnosti prekomjerne ekspresije p33ING1, CSIG protein je postao stabilniji, a njegova razina proteina čini se da je nestabilna nakon 18 sati potjere (t1 / 2 = 20.5 h) (Slika 3e, Dopunska slika S3b). Ispitali smo i poluživot CSIG proteina u kontroli malih interferirajućih RNA (siRNA) - i p33ING1-specifičnih siRNA-transficiranih stanica nakon UV zračenja. Obaranje proteina p33ING1 destabiliziranog CSIG proteina nakon UV tretmana; činilo se da je endogeni CSIG nestabilan nakon 5 h potjere u p33 knockdown ćelijama (slika 3f).

Image

p33ING1 prekomjerna ekspresija povećava CSIG stabilnost proteina nakon UV tretmana. HEK293 stanice su transficirane kontrolnim vektorom ili vektorom koji eksprimira FLAG-označen-p33 ( a ) ili FLAG-označen-CSIG ( b ); stanice se zatim ostave neobrađene ili zrače 50 UV / m 2 UV. Stanice su skupljene 3, 6, 12 i 24 sata nakon ozračivanja, a zapadne mrlje provedene su za otkrivanje CSIG i p33 ekspresije. ( c ) stanice HEK293 su transficirane kontrolnim vektorom ili vektorom koji eksprimira p33; stanice su tada obrađene sa UV. Nakon 24 sata, prikupljeni su za ekspresiju proteina CSIG Western blot-om (lijeva ploča). HEK293 stanice su ne tretirane (srednja ploča) ili su ozračene UV zračenjem pri 50 J / m2, a zatim su vraćene 24 sata (desna ploča). Stanice su zatim tretirane s MG-132 (15 μM, 4 h), a razine CSIG su određene Western blottingom. p53 korišten je kao pozitivna kontrola. ( d ) stanice HEK293 kotransficirane su kontrolnim ili p33ING1 plazmidom i HA označenim ubikvitin plazmidom; 36 sati kasnije, stanice su ozračene sa 50 J / m 2 UV. Nakon 10 sati, stanice su tretirane s MG132 (15 μM ) 4 sata. Stanice su lizirane i IP sa CSIG antitijelom, zatim Western blot koristeći CSIG i ubikvitin antitijela. Također izbrišite unos koristeći ubikvitin, CSIG, p33 i tubulinska antitijela. ( e ) kontrolni vektor pcDNA3.1 ili pcDNA3.1-p33 transficirani su u stanice HEK293 kako je naznačeno. 36 sati nakon transfekcije, stanice su podvrgnute UV zračenju i tretirane cikloheksimidom (CHX, 100 µg / ml) naznačeno vrijeme. Razine proteina CSIG analizirane su Western blottingom. Razine p27 određene su kao pozitivna kontrola. ( f ) Kontrolna siRNA ili specifična siRNA protiv p33 su transficirane u stanice HEK293 kako je naznačeno. 48 sati nakon transfekcije stanice su podvrgnute UV zračenju i tretirane s CHX (100 µg / ml) naznačeno vrijeme. Razine proteina CSIG analizirane su Western blottingom. Razine p27 određene su kao pozitivna kontrola. izračunato je t1 / 2 CSIG proteina i navedeno je ispod svake grupe

Slika pune veličine

p33ING1 surađuje s CSIG-om

p33ING1 može stabilizirati razine p53 kroz interakciju s njom u različitim staničnim linijama. 25, 26, 27 Pokazavši da p33ING1 povećava stabilnost proteina CSIG i da su se kolocenizirali subcelularno u nukleolusu nakon UV zračenja, istražili smo da li p33ING1 u interakciji s CSIG-om radi stabiliziranja razine proteina.

In vitro pokusni testovi pomoću pročišćenih GST fuzijskih proteina otkrili su specifičnu interakciju između GST-CSIG i in vitro- prevedenog p33ING1, sugerirajući izravnu interakciju CSIG-p33ING1 (Slika 4a). Povezanost između ova dva proteina in vivo proučena je imunoprecipitacijom (IP), nakon čega je slijedila zapadnja blotina. Koristeći ukupne proteinske ekstrakte iz stanica zaraženih konstrukcijom p33ING1, specifičnim antitijelom protiv CSIG-a koji se koristi u IP-u, uspjeli smo otkriti i CSIG i p33ING1 u imunokompleksu. Interakcija je bila specifična, što pokazuje i uporaba nesrodnog seruma. Asocijacija se također može primijetiti u obrnutom eksperimentu, koristeći IP protutijelo protiv p33ING1, što ukazuje da se dva proteina mogu udružiti u stanici (Slika 4b). Slični rezultati dobiveni su korištenjem H1299 stanica (podaci nisu prikazani). Da bismo potvrdili da li se uočena interakcija dogodila između endogenih proteina, proveli smo IP eksperimente u netransfektiranim 2BS stanicama. Koristeći ekstrakte nuklearnih ili citoplazmi proteina, za IP je korišteno specifično antitijelo protiv CSIG. Western blotting otkrio je specifičan pojas koji se kombinirao s p33ING1 u CSIG imunoprecipitatu ekstrakata nuklearnih proteina, što ukazuje na interakciju između endogenog proteina p33ING1 i CSIG u jezgri. Nismo otkrili drugi nukleolni protein, ARF, koji navodno pod tim uvjetima posreduje nukleolarnu lokalizaciju p33ING1 u p33ING1 / CSIG kompleksu (Slika 4c). Nakon UV zračenja, povezanost između p33ING1 i CSIG se povećala (slika 4d). Podaci zajedno pokazuju da CSIG fizički djeluje na p33ING1 in vitro i in vivo .

Image

p33ING1 surađuje s CSIG-om. ( a ) CSIG je eksprimiran kao GST fuzijski protein i inkubiran je in vitro prevedenim p33. GST ili GST – CSIG proteini su istaloženi s glutation-sefarozom, a koprecipitacija p33 određena je Western blottingom antitijelom protiv p33. ( b ) Stanice HEK293 su transficirane s p33. 48 sati nakon transfekcije, cijeli stanični ekstrakti su imunoprecipitirani anti-CSIG (gornja ploča) ili anti-p33 antitijelo (donja ploča). Analiza Western blotta izvedena je s anti-CSIG i anti-p33 antitijelima kako je naznačeno. ( c ) Nuklearni ili citoplazmatski ekstrakti iz stanica 2BS imunoprecipitirani su anti-CSIG antitijelom (gornja ploča). Stanični lizati su učitani kao kontrola (donja ploča). Analiza Western blotta izvedena je s naznačenim antitijelima. HDAC1 i a -tubulin služili su za ocjenu kvalitete nuklearnih i citoplazmatskih ekstrakata. ( d ) Cjeloviti ekstrakti stanica HEK293 prije i 6 sati nakon UV zračenja (50 J / m 2 ) imunoprecipitirani su antitijelom protiv CSIG (lijeva ploča). Stanični lizati su učitani kao kontrola (desna ploča). Također, provedena je i Western blot analiza sa anti-CSIG i anti-p33 antitijelima. Lizati nabijeni na gel bili su 5% od one koja se koristila u IP-ima, a nesrodni serum (NC) poslužio je kao negativna kontrola u ovim IP eksperimentima

Slika pune veličine

Područje p33ING1 NTS potrebno je za vezanje i stabiliziranje CSIG proteina

Nakon što smo utvrdili da p33ING1 i CSIG koegzistiraju u istom kompleksu, istražili smo koje domene su uključene u interakciju p33ING1-CSIG. Konstruirali smo deletacijske mutante oba proteina, izrazili ih u stanicama HEK293 i testirali njihovo vezanje pomoću Co-IP. CSAG-označeni CSIG (aminokiseline 1-490), CSIG-NT (aminokiseline 1-22) ili CSIG-CT (aminokiseline 261–490) izraženi su u stanicama HEK293 i imunoprecipitirani anti-FLAG antitijelima. Western blotting otkrio je da p33ING1 asocira na FLAG-CSIG i FLAG-CSIG-CT. FLAG označeni CSIG-NT nije se značajno povezao s p33ING1. Povezanost se također može primijetiti u obrnutom eksperimentu, koristeći anti-p33ING1 antitijelo za IP (slika 5a). S druge strane, u stanicama HEK293 izraženi su FLAG-označeni p33 (aminokiseline 1–279), p33-NT (aminokiseline 1–212) i p33-CT (aminokiseline 70–279) i imunoprecipitirani s anti-FLAG antitijelima, Western blotting otkrio je da su oba mutanta za brisanje p33ING1 bila sposobna komunicirati s CSIG; povezanost se može primijetiti i u obrnutom eksperimentu, koristeći anti-CSIG antitijelo za IP (slika 5b). Ovo područje interakcije p33ING1 obuhvaćalo je lamin domenu interakcije i signal nuklearne lokalizacije (NLS).

Image

p33ING1 komunicira s CSIG proteinski C-terminalnom regijom bogatom lizinom. ( a ) Shematski prikaz mutirana za brisanje CSIG-a, brojevi pokazuju položaj aminokiselina u CSIG-u (gornji). FLAG označeni mutantima CSIG pune duljine i delecijom kotransfektirani su p33 plazmidom u stanicama HEK293. IP pokusi su provedeni sa anti-FLAG (lijevo) ili anti-p33 (desno) antitijelom. Analiza Western blotta izvedena je s anti-FLAG i anti-p33 antitijelima. ( b ) Shematski prikaz mutanata za brisanje p33, brojevi pokazuju položaj aminokiselina u p33 (gornji). PIP, protein-motiv koji djeluje na PCNA; PB, djelomična bromodomena; LID, domena lamin interakcije; PHD, biljna homeodomena; i PBR, višebazična regija. FLAG-označeni mutanti p33 cijele duljine i kotransfektirani su CSIG plazmidom u stanicama HEK293. IP pokusi su provedeni sa anti-FLAG (lijevo) ili anti-CSIG (desno) antitijelom. Analiza Western blotta izvedena je s anti-FLAG i anti-CSIG protutijelima

Slika pune veličine

Navodno p33ING1 posjeduje dvije različite četiri aminokiselinske sekvence u svom NTS-u unutar NLS regije, usmjeravajući protein na nukleolus. 12 Pokazali smo da su CSIG i p33ING1 kolokalizirani u nukleolu (Slika 2a). Da bismo ispitali je li NTS regija p33ING1 potrebna za vezanje CSIG-a, konstruirali smo točkaste mutacije ili deletirani mutant NTS regije u p33ING1 (slika 6a), a zatim istražili njihovu nukleolarnu lokalizaciju i interakciju s CSIG-om. Kao što je prikazano na slici 6b, p33 / Q153P, p33 / Q153P / K185N / K186E i p33Δ142–194 mutanti regije NTS bili su oslabljeni u sposobnosti da ciljaju p33ING1 na nukleolus. Kroz IP CSIG iz stanica koje eksprimiraju divlji tip p33, p33 / Q153P, p33 / Q153P / K185N / K186E i deletirani mutant p33Δ142–194, otkrili smo da se divlji tip p33 koimunoprecipitirao u većoj mjeri sa CSIG-om nego što su to učinila dva mutanta p33 / Q153P i p33 / Q153P / K185N / K186E, i mutant za brisanje NTS regije p33Δ142-194 potpuno su ukinuli vezanje između p33ING1 i CSIG (slika 6c). Ovi rezultati pokazuju da je nukleolus ciljana domena p33ING1 ključna za vezanje CS-proteina CSIG proteina.

Image

p33ING1 zahtijeva da se njegova NTS regija veže i stabilizira CSIG protein. ( a ) Shematski prikaz p33 i njegovih mutanta u NTS regiji. Prikazane su brisanje ili točkaste mutacije NTS-a. ( b ) Stanice su transficirane ekspresijskim vektorima koji kodiraju divlji tip p33, p33 / Q153P, p33 / Q153P / K185N / K186E i p33Δ142-1944. Nakon 36 h, stanice su obojene anti-p33 antitijelom (zeleno) i anti-CSIG antitijelom (crveno) analiziranim konfokalnom mikroskopijom. Nuklei su prikazani plavom bojom (DAPI bojenje). ( c ) Stanice HEK293 transficirane su divljim tipom p33, p33 / Q153P, p33 / Q153P / K185N / K186E i p33Δ142–194 plazmidima. IP eksperimenti su provedeni s anti-CSIG antitijelom ili nesrodnim serumom (NC). Analiza Western blotta izvedena je s naznačenim antitijelima. Stanice lizata su učitane kao kontrola. ( d ) Kontrolni vektor, vektori koji eksprimiraju p33 ili p33Δ142-194, transficirani su u stanice HEK293 kako je naznačeno. 36 sati nakon transfekcije, stanice su podvrgnute UV zračenju i tretirane cikloheksimidom (CHX, 100 µg / ml) naznačeno vrijeme. Razine proteina CSIG analizirane su Western blottingom. Razine p53 određene su kao pozitivna kontrola. Niže su navedene analize denzitometrije p33, CSIG i p53 proteina različitih skupina

Slika pune veličine

Sljedeće smo istražili treba li p33ING1 ovoj regiji kako bi povećao stabilnost proteina CSIG nakon UV zračenja. Otkrili smo da divlji tip p33ING1 povećava stabilnost proteina CSIG nakon UV zračenja; ovaj je učinak ukinut kada je mutirani p33Δ142–464 mutant za brisanje (slika 6d).

p33ING1 zahtijeva CSIG protein za povećanje apoptoze nakon UV zračenja

X-protein (Bax) povezan s Bcl-2 i HSP70, koji reguliraju apoptozu, identificirani su kao izravni ciljevi p33ING1. 15, 28, 29 Ranije smo izvijestili da CSIG može regulirati translaciju PTEN proteina. 5 Da bi se utvrdilo da li je CSIG potreban za funkciju p33ING1 nakon UV zračenja, stanice HEK293 transficirane su divljim tipom p33, p33 / Q153, p33 / Q153 / K185N / K186E ili mutantom brisanja p33Δ142-194, i razinama ekspresije CSIG i njihove ciljni geni su ispitani nakon UV tretmana. prekomjerna ekspresija p33ING1 povećala je razinu proteina CSIG i povisila njegovu ekspresiju Bax-a nakon UV zračenja, dok se HSP70 i PTEN ekspresija nisu znatno promijenili. U usporedbi s efektima divljeg tipa p33ING1, prekomjerna ekspresija CSIF-a s defektnim mutantima p33 / Q153, p33 / Q153 / K185N / K186E, posebno mutant za brisanje p33Δ142–194, smanjila je porast CSIG i Bax izraza, dok HSP70 i PTEN izrazi nije se puno promijenilo (slika 7a). Slični rezultati dobiveni su korištenjem HeLa stanica (dopunska slika S4a). Bax je inducirao otpuštanje apoptotskih stimulatora, kao što je citohrom c u citoplazmu, što predstavlja kritični korak u apototičkom putu mitohondrija. Kao mutirani p33, ali ne i p33Δ142–194 mutantni, inducirani CSIG i Bax izraz, slijedeće smo odredili učinke p33 i p33Δ142-194 na Bapto ovisnu apoptozu u mitohondrijama nakon UV zračenja. Rezultati su pokazali da p33, ali ne i mutant p33Δ142–194, inducira Bax ekspresiju i distribuciju na mitohondrije, što se poklapa s povećanom translokacijom citokroma c u citoplazmu u usporedbi s kontrolnim vektorom nakon UV tretmana (Slika 7b). U skladu s ovim rezultatima, prekomjerna ekspresija p33ING1 povećane UV-inducirane apoptoze, kao što pokazuje rascjepkana poli (ADP-riboza) polimeraza (PARP), dvostruko obojenje u Annexin-V i PI. Opet su ti učinci smanjeni ekspresijom p33ING1 mutanta (slike 7b i c). Stoga, p33ING1 zahtijeva da njegov NTS slijed djeluje na CSIG, povećava stabilnost CSIG proteina i aktivira ciljni gen Bax nakon UV zračenja.

Image

p33ING1 zahtijeva CSIG protein za aktiviranje ekspresije ciljanog gena i promicanje UV-inducirane apoptoze. ( a ) Stanice HEK293 transficirane su kontrolnim vektorom ili vektorom koji eksprimira divlji tip p33, p33 / Q153P, p33 / Q153P / K185N / K186E ili p33Δ142-194. U 36 sati nakon transfekcije, stanice su podvrgnute UV zračenju, a 12 sati nakon UV tretmana provedena je Western blot za otkrivanje promjena u CSIG i ciljanih proteina p33 i CSIG. ( b ) stanice HEK293 transficirane su kontrolnim vektorom, divljim tipom p33 i p33Δ142-194; stanice su tada bile podvrgnute UV obradi. Proteinski ekstrakti su podijeljeni u frakcije citosola i mitohondrija i analizirani su Western blot-om antitijelima protiv citokroma c i Bax. Kvaliteta frakcioniranja provjerena je posebnim subcelularnim markerima ( β -akktin kao marker specifičan za citoplazmu i COX IV protein kao marker specifičan za mitohondrije). ( c ) Stanice HEK293 su transficirane kontrolnim vektorom ili vektorom koji eksprimira divlji tip p33, p33 / Q153P, p33 / Q153P / K185N / K186E ili p33Δ142-194. 36 sati nakon transfekcije stanice su podvrgnute UV zračenju. Nakon 12 h, apoptozu je analizirao Aneksin V – FITC i PI dvostruko obojenje, a zatim FACS. ( d ) Vektori koji eksprimiraju p33, CSIG i siRNA protiv CSIG transfektiraju se sami ili u kombinaciji u stanice HEK293. U 36 sati nakon transfekcije, stanice su podvrgnute UV zračenju, a 24 sata nakon UV tretmana provedena je Western blot za otkrivanje promjena u ciljanim proteinima p33 i CSIG naznačenim antitijelima. ( e ) Vektorski eksprimirani p33 je transfektiran sam ili u kombinaciji sa siRNA protiv CSIG-a u HEK293. Stanice su zatim podvrgnute UV obradi. Proteinski ekstrakti su podijeljeni u frakcije citosola i mitohondrija i analizirani su Western blot-om antitijelima protiv citokroma c i Bax. Kvaliteta frakcioniranja provjerena je specifičnim subcelularnim markerima β- aktinom i COX IV proteinom. ( f ) Apoptozu je analizirao Aneksin V – FITC i PI dvostruko obojenje, a zatim FACS. Postotak apoptotskih stanica je kvantiziran. Vrijednosti su srednje vrijednosti ± SD iz neovisnih pokusa. * P ≤ 0, 05

Slika pune veličine

Da bi se direktno utvrdilo da li p33ING1 zahtijeva CSIG protein za aktiviranje ciljanog gena i promociju apoptoze nakon UV zračenja, stanice HEK293 transficirane su vektorima koji eksprimiraju p33ING1 i CSIG, ili siRNA specifičnom za CSIG, samostalno ili u kombinaciji, nakon čega slijedi UV zračenje. Kao što je prikazano na slici 7d, prekomjerna ekspresija CSIG povećala je Baxovu ekspresiju. Prekomjerna ekspresija p33ING1 povećala je razinu CSIG-a i ekspresiju ciljanog gena Bax do mjere koja je bila usporediva s kotransfekcijom s CSIG-om. Srušenje CSIG proteina značajno je smanjilo aktivaciju Baxa uvođenjem p33ING1, što sugerira da je CSIG neophodan za signalizaciju p33ING1. Nadalje, prekomjerna ekspresija CSIG i p33ING1 nisu promijenili HSP70 i PTEN izraze. Slični rezultati dobiveni su korištenjem HeLa stanica (dopunska slika S4b). Da bismo dalje utvrdili učinak obaranja CSIG na apoptozu ovisnu o Baxu u mitohondrijama induciranu p33ING1, ispitali smo mitohondrijsku raspodjelu Baxa i otpuštanje citokroma c u citoplazmu nakon UV-a. Kao što je prikazano na slici 7e, padom CSIG smanjena je indukcija mitohondrijalne Bax ekspresije i translokacija citohroma c u citoplazmu uvođenjem p33.

U skladu s ovim rezultatima, prekomjerna ekspresija p33ING1 i CSIG pojačana UV-inducirana apoptoza, određena cijepljenom kaspazom 3, cijepljenim PARP-om i dvostrukim obojenjem od Aneksina-V i PI. Analiza apoptoze kotransfekcijom p33ING1 i CSIG bila je usporediva s transfekcijom samo s p33ING1 ili CSIG, dok je srušavanje CSIG proteina poništilo učinak p33ING1 (slike 7d i f). Prekomjerna ekspresija p33ING1 nije povećala stabilnost CSIG proteina i apoptozu bez UV tretmana (dopunska slika S5). Uzeto zajedno, ovi rezultati pokazuju da je p33ING1-CSIG funkcija u UV-induciranoj apoptozi i CSIG potreban za signalizaciju p33ING1 nakon UV zračenja.

Os p33ING1-CSIG funkcionira u diferenciranim apoptotičkim odgovorima mladih i starih 2BS stanica nakon UV zračenja

Prethodno smo pokazali da su u ljudskim diploidnim 2BS fibroblastima starosjedioci fibroblasti otporniji od mladih fibroblasta na apoptozu. 30, 31 Ovdje smo pokazali da su mlade 2BS stanice bile osjetljivije od senescentnih stanica na UV-induciranu apoptozu, što pokazuje i cijepanje PARP-a (slika 8a). Na temelju gornjih rezultata, hipotetizirali smo da osa p33ING1-CSIG ima ulogu u diferencijacijskim apoptotičkim odgovorima 2BS stanica tijekom replikativne starenja. Da bi se proučila ta mogućnost, ekspresije CSIG i p33ING1 u ranom prolazu (mlade, ∼ 20 populacije udvostručenih (pdl)) i kasnim prolaznim (starosjedila, p 60 pdl) 2BS stanica ispitivane su od Western blot-a. Kao što je prikazano na slici 8b, u usporedbi s stanicama 2BS s ranim prolazom (mlade, Y), ustanovili smo da su razine CSIG i p33ING1 u stanicama 2BS s kasnim prolazom (senescentne, S) značajno smanjene. Ekspresija p16 INK4a je pokazatelj 2BS stanica koje su podvrgnute replikativnom starenju. Zatim smo analizirali ekspresiju i staničnu lokalizaciju CSIG i p33ING1 u mladim i starosjedilačkim 2BS stanicama nakon UV zračenja. Kao što je prikazano na slici 8c, protein CSIG i p33ING1 povećali su se u roku od 6 sati i ostali su na relativno visokim razinama nakon UV zračenja u mladim 2BS stanicama, dok su u starosnim stanicama 2BS, razina CSIG i p33ING1 smanjena nakon UV. Koristeći imunocitohemiju, otkrili smo da se nakon UV zračenja p33ING1 kolokalizirao intenzivno CSIG-om u nukleolus u mladim stanicama 2BS; međutim, u starosnim stanicama 2BS, razina ekspresije i nukleolarna kolokalizacija p33ING1 i CSIG su se smanjile (slika 8d). p33ING1 je olakšao UV-induciranu apoptozu, dok je CSAG-ova ekspresija uništavala efekte p33ING1 u 2BS stanicama (Slika 8e). Ovi rezultati sugeriraju da p33ING1-CSIG os može imati ulogu u diferenciranom apoptotičkom odgovoru mladih i starih 2BS stanica nakon UV zračenja.

Image

Izrazi i kolokalizacija CSIG-a i p33ING1 kod mladih i starosjedivih humanih diploidnih 2BS fibroblasta nakon UV zračenja. ( a ) Mlade i starosjedilačke 2BS stanice tretirane su s 50 J / m 2 UV ili mock tretmanom, a ekspresija PARP pune duljine i cijepanja otkrivena je Western blot analizom. ( b ) Analiza zapadnog blotta razine CSIG i p33 u ranom prolazu (mlade, p 20 pdl, Y) i kasnom prolazu (starije, p 60 pdl, S) 2BS stanica. p16 služio je kao pokazatelj stanične starenja, a α -tubulin kao kontrola opterećenja. ( c ) Mlade i starije 2BS stanice ozračene su s 50 J / m2 UV i stanice su sakupljene u različitim vremenskim točkama kako je naznačeno. Imunoblotska analiza provedena je korištenjem antitijela anti-CSIG, anti-p33 i anti-tubulina. ( d ) Mlade i starije 2BS stanice ozračene su s 50 J / m 2 UV 24 sata nakon UV zračenja; stanice su imuno obojene anti-p33 i anti-CSIG antitijelima, nakon čega je slijedila analiza konfokalne mikroskopije. Prikazane su reprezentativne slike. Nuklei su vizualizirani pomoću DAPI bojanja, a slike su prekrivene (Spajanje). Kvantitativna analiza nukleolarne distribucije p33ING1 bila je brojenjem tri polja (najmanje 100 stanica po polju). ( e ) 2BS stanice inficirane su p33 samostalno ili u kombinaciji shCSIG, zatim su stanice tretirane s 50 J / m 2 UV, 12 h kasnije otkriveni su apoptotski brojevi stanica. Vrijednosti su srednje vrijednosti ± SD iz neovisnih pokusa. * P ≤ 0, 05

Slika pune veličine

Rasprava

Sada postoji uvjerljiv niz dokaza koji pokazuju da, pored puta ribogeneze, nukleolarni proteini imaju važnu ulogu u regulaciji prijelaza staničnog ciklusa, proliferaciji stanica i apoptozi. 4, 5 Namijenili smo utvrđivanju je li nukleolarni protein CSIG uključen u apoptozu izazvanu oštećenjem DNA i prvi put otkrili da se CSIG inducira nakon UV zračenja, a prekomjerna ekspresija CSIG povećava apoptotičke stanice. Iako CSIG ne inducira apoptozu u nedostatku oštećenja DNA, on potiče apoptozu nakon UV zračenja (Slika 1). Ultraljubičasto zračenje stvara DNK lezije koje ometaju metabolizam DNK, aktivirajući neke proteine ​​koji reguliraju zaustavljanje ili apoptozu staničnog ciklusa. Oštećenja na visokoj razini mogu nadvladati sposobnost mehanizma za popravak uklanjanja lezije poput 6–4PP, a može dovesti i do zaustavljanja staničnog ciklusa u fazi G2 / M, što često prethodi nastanku apoptoze. Nemogućnost popravljanja oštećenja izazvanog replikacijom tijekom vremena pokreće apoptozu. Ovdje smo pokazali da CSIG može blago smanjiti stanice faze G1 i povećati stanice S-faze i G2 / M faze, nakon UV zračenja; međutim, nije bilo značajne razlike u usporedbi s kontrolom. Ovi rezultati sugeriraju da se funkcija CSIG-a nakon UV zračenja odnosi na apoptozu, a ne na kontrolu staničnog ciklusa.

Najčešći izoform ING1 je p33ING1; agensi koji oštećuju DNA mogu povećati ekspresiju p33ING1 u određenim staničnim linijama. 20, 24 Iako p33ING1 i p53 imaju funkcionalnu važnost u određenom biološkom procesu, 22 postoje studije koje pokazuju da bi p33ING1 mogao djelovati na p53 neovisnu funkciju u apoptozi ili inhibiciji rasta stanica. 23, 32 Prethodno istraživanje pokazalo je da UV stres može translocirati protein p33ING1 iz nukleoplazme u nukleolus, premda dvije različite četiri aminokiselinske sekvence u NTS regiji; ova translokacija p33ING1 je bitna za UV-induciranu apoptozu. 12 Međutim, mehanizam kojim nukleolarno ciljanje p33ING1 potiče apoptozu nije jasan.

Otkrili smo da su proteini p33ING1 i CSIG visoko kolokalizirani u nukleolu nakon UV stresa, a indukcija ekspresije p33ING1 odgovara nukleolarnom proteinu CSIG nakon UV zračenja (Slika 2). Što je još važnije, potrebno je da se NTS područje p33ING1 veže i poveća stabilnost proteina CSIG, što je zauzvrat bitno za p33 posredovanu apoptozu (slike 3, 4, 5, 6 i 7). Ovdje pokazujemo da je CSIG potreban za funkciju pro-apoptoze p33ING1. Ekspresija p33ING1 ciljanog gena nizvodno, Bax , kontrolira CSIG u apoptozi uzrokovanoj UV-zrakom (slika 7).

Nakon oštećenja DNA, neki nukleolarni proteini mogu regulirati apoptozu ovisnu o p53 inhibicijom Mdm2, poboljšavajući p53 translaciju i poboljšavajući translokaciju p53 u mitohondrije. 33, 34 Stoga bi mogući mehanizam regulatorne ekspresije Baxa pomoću CSIG mogao biti aktiviranje p53, što dovodi do Bax-ove aktivacije nakon UV tretmana. Neki drugi nukleolarni proteini imaju pro-apoptotičke funkcije koje uključuju regulaciju Bax, Bcl-2, kaspaznu aktivnost ili receptore stanične površine. 33, 34 Podskup nukleolarnih proteina može izravno upravljati transkripcijom gena ili funkcionalno modulirati regulatore transkripcije. 34 Navodi se da CSIG pojačava transkripciju gena uPA (aktivator plazminogena aktivatora tipa urokinaze). 35 protein p33ING1 je stehiometrijska komponenta HAT i HDAC kompleksa, a p33ING1 može regulirati transkripciju gena prepoznavanjem H3K4me3. 36, 37 Stoga je također moguće da CSIG može sam ili surađivati ​​s p33ING1 radi reguliranja ekspresije ciljanog gena, a nakon UV zračenja mogu se poboljšati regulatorne funkcije CSIG ili p33ING1 – CSIG na nižim ciljevima. Nekoliko je mogućih regulatornih mehanizama ovog postupka i potrebne su dodatne studije kako bi se utvrdili mogućnosti.

Gornja zapažanja dovela su do predloga modela pro-apoptotičke funkcije osi p33ING1 – CSIG nakon UV zračenja. Ovom modelu u prilog idu i naši nalazi u humanim diploidnim 2BS fibroblastima, u kojima p33ING1 – CSIG os može funkcionirati u različitom apoptotičkom odgovoru mladih i starosjedilačkih 2BS stanica nakon UV tretmana (Slika 8). Ukratko, naša studija uspostavlja novu funkciju pro-apoptoze CSIG-a i njegovu vezu s p33ING1 nakon UV zračenja.

Dodatna informacija

PDF datoteke

  1. 1.

    Dopunska slika S1

  2. 2.

    Dopunska slika S2

  3. 3.

    Dopunska slika S3

  4. 4.

    Dopunska slika S4

  5. 5.

    Dopunska slika S5

Word dokumenti

  1. 1.

    Dopunske slikovne legende

Glosar

CSIG

stanični inhibirani genski protein

Bax

X-protein povezan s Bcl-2

PTEN

fosfataza i protein proteina tenzina

ARF

proizvod s alternativnim okvirom za čitanje lokusa CDKN2A

NLS

signal nuklearne lokalizacije

NTS

nukleolarni ciljni niz

HSP70

protein toplinskog šoka-70

PARP

poli (ADP-riboza) polimeraza

COX IV

citokrom c oksidaza IV

uPA

aktivator plazminogena tipa urokinaze

IP

imunoprecipitaciju

siRNK

mala interferirajuća RNA

Dodatne informacije prate rad na web stranici Cell Cell and Disease (//www.nature.com/cddis)