Dobivanje genoma iz nekultiviranih mikroorganizama iz okoliša pomoću jednoćelijske genomike zasnovane na faksima | protokoli prirode

Dobivanje genoma iz nekultiviranih mikroorganizama iz okoliša pomoću jednoćelijske genomike zasnovane na faksima | protokoli prirode

Anonim

teme

  • Mikrobiologija okoliša
  • Protok citometrija
  • genomika
  • Umnožavanje cijelog genoma

Sažetak

Jednoćelijska genomika moćan je alat za istraživanje genetskog sastava mikroorganizama u okolišu, čija je velika većina teško, ako ne i nemoguće, kultivirati postojećim pristupima. Ovdje predstavljamo sveobuhvatan protokol za dobivanje genoma iz nekultiviranog mikroba iz okoliša putem izolacije visoke ćelije s propusnom jednocelijom pomoću FACS. Protokol obuhvaća očuvanje i prethodnu obradu različitih uzoraka iz okoliša, nakon čega slijedi fizičko razdvajanje, liza, amplifikacija cijelog genoma i identifikacija pojedinačnih bakterijskih i arheoloških stanica na bazi 16S rRNA. Opisani postupak se može izvesti sa standardnom opremom za molekularnu biologiju i FACS strojem. Potrebno je <12 h klupnog vremena tijekom 4-dnog vremenskog razdoblja, a on generira do 1 μg genomske DNK iz pojedinačne mikrobne stanice, što je pogodno za aplikacije nizvodno, kao što su PCR pojačavanje i sekvenciranje pušaka. Potpunost oporavljenih genoma varira s prosjekom od ∼ 50%.

Uvod

Većina svih sekvencioniranih bakterijskih i arhealnih genoma pripada samo četiri bakterijske phyle, što ozbiljno iskrivljuje naše viđenje mikrobne genetske raznolikosti 1 . Ova pristranost dijelom proizlazi iz naše nesposobnosti kultiviranja većine mikroba 2, što je nužan korak za tradicionalno sekvenciranje cijelog genoma. Kroz pristupe neovisne o kultivaciji, naime sastavljanjem i povezivanjem podataka o sekvenciranju metagonomskih pušaka 3, 4 i jednoćelijskim genomikama (SCG) 5, 6, sada se može pristupiti genetskom sastavu nekultiviranih mikroba. Obje metode zaobilaze uobičajeni korak uzgoja i mogu se primijeniti izravno na uzorke iz okoliša. Prirodne populacije koje imaju visok stupanj genomske heterogenosti bit će dostupnije kroz SCG nego metagenomikom, jer se izbjegava umrežavanje više sojeva. Sposobnost dodjeljivanja fragmenata genoma određenoj pojedinoj stanici čini SCG moćnim alatom za istraživanje genetske raznolikosti i metaboličkog potencijala nekultiviranih mikroorganizama iz okoliša.

Primjenjujući ovdje opisani protokol, uspješno smo umnožili genome iz 201 jednostruke stanice koje pripadaju 29 uglavnom neispričanih grana stabla života 1 . To nam je omogućilo da istražimo njihove filogenetske odnose i da otkrijemo nove metaboličke osobine mikrobne tamne materije, skupine bez kultiviranih predstavnika. Referentni genomi generirani SCG-om također olakšavaju interpretaciju metagenomskih skupova podataka. Na primjer, pokazali smo da jednoćelijski genomi iz nekultivirane phyle značajno poboljšavaju filogenetsko sidrenje metagenomskih očitanja 1 . Mapiranje metagenomskih sljedova na jednostanične genome nije primijenjeno samo na provjeru sklopa metagenoma i binninga 7, već i na naknadno poboljšavanje sklopova jednoćelija, kao što je pokazano za SR1 bakterije, atribakterije i arheje oksidacijske u amonijaku 8, 9, 10 . Ostale su studije uspješno koristile regrutaciju fragmenata jednocelijskim genomima za ispitivanje biogeografske raspodjele nekultiviranih morskih svojti 11, 12 . Iako se glavnina studija koja koristi FGS-om omogućen SCG usredotočila se na bakterije i arheje, ovaj se protokol također može prilagoditi mikrobnim eukariotama 13 i sisavcima 14 .

Postoji nekoliko različitih metoda za izolaciju pojedinih stanica za SCG (za pregled, vidi ref. 5), uključujući serijsko razrjeđivanje 15, mikromanipulaciju 16, optofluidike (optičko ugađanje u kombinaciji s mikrofluidikom 17 ) i lasersko snimanje mikrodisekciju uzoraka tkiva 18, Ključne prednosti optofluidika uključuju sposobnost hvatanja stanične morfologije i smanjene količine reakcija unutar mikrofluidnih komora 17 . Glavni nedostatak je niža propusnost u usporedbi s FACS-om. Zbog velike brzine i propusnosti te sposobnosti odvajanja pojedinih stanica okoliša na temelju različitih staničnih svojstava (npr. Veličina, fluorescencija, zrnatost), FACS je postao poželjna metoda izolacije jednoćelija u kontekstu SCG. Glavno ograničenje je nemogućnost vizualnog pregleda stanice i minimiziranje volumena reakcije na raspon nanograma. FACS se također uspješno primjenjuje na populaciju. Nedavni protokol opisuje uporabu FACS-a za obogaćivanje nekultivirane simbiontske populacije19. Obogaćeni bazen simbiontnih stanica može podvrgnuti amplifikaciji cjelokupnog genoma (WGA) nakon čega slijedi sekvencioniranje, dajući skupljanje genoma populacije ili homogeni nacrtni sklop u slučaju klonske populacije.

Ovdje ćemo opisati protokol za dobivanje genoma iz pojedinačnih, nekultiviranih mikroorganizama iz okoliša pomoću slučajne izolacije pojedinih stanica pomoću FACS. Protokol opisuje prethodnu obradu uzoraka iz okoliša, krio konzervaciju i fizičko odvajanje pojedinih stanica, nakon čega slijede liza, WGA genomske DNK i 16S rRNA identifikacija na osnovi gena (Sl. 1).

Image

Radni tijek uključuje pripremu uzorka (korak 1), čuvanje uzoraka (betain, glicerol; korak 2), jednoćelijsku izolaciju (protočna citometrija; koraci 3–12), lizu stanica (alkalna otopina; koraci 13–17), WGA (MDA ; Koraci 18–23) i filogenetski skrining (16S rRNA ili drugi marker geni; Koraci 24–30). Nakon toga, određeni pojačani genomi podvrgavaju se sekvenciranju genoma višestrukih ili sačmarica. Imajte na umu da se za filogenetski skrining koristi samo mali alikvot DNK generiran u WGA i da je filogenetski pregled izborni.

Slika pune veličine

Eksperimentalni dizajn

Čuvanje i priprema uzoraka. Ako se uzorci iz okoliša ne koriste odmah nakon prikupljanja, potrebno je skladištenje radi očuvanja integriteta stanice i njene DNK. Preporučujemo zamrzavanje flash uzorcima u tekućem dušiku s krioprezervansom kao što je betain ili glicerol, koji ne ometaju korake razdvajanja, lize i DNA amplifikacije nizvodno, 1, 11, 20 . Vodeni uzorci bez taloga ne mogu se izravno pomiješati s krioprezervantom. Neakvatički uzorci, kao što su sedimenti, tlo, fekalni uzorci, biofilmi i mulj, mogu zahtijevati dodatnu pripremu uzoraka kako bi se razdvojile stanice i uklonili nećelijske čestice. Općenito je preporučljivo minimizirati duljinu postupanja s uzorkom prije krio konzervacije i ograničiti promjene u ionskoj jačini, pH i temperaturi. Za uzorke sedimenata, tla i fekala preporučujemo vrtloženje sterilnim izotoničnim puferom, nakon čega slijedi kratko centrifugiranje (korak 1A). Ponovljeno pipetiranje kroz štrcaljku može se upotrijebiti za raspršivanje stanica koje sadrže neke mikrobne prostirke. Gusti uzorci biofilma mogu zahtijevati opsežniju mehaničku raščlanjivanje da bi uzorak bio pogodan za protočnu citometriju (korak 1B). Uzorci mulja imaju koristi od koraka centrifugiranja i naknadnog ručnog mljevenja kako bi se biomasa učinila dostupnom (korak 1C). Količine dane u nastavku mogu se povećati ili povećati prema količini biomase prisutnoj u uzorku. U idealnom slučaju, pripremu treba provesti na svježim uzorcima, nakon čega slijedi trenutna krio konzervacija; međutim, moguća je i naknadna obrada krio konzerviranih uzoraka.

Odvajanje jednoćelija. FACS se najčešće koristi visokopropusni pristup za odvajanje uzorka u pojedinačne ćelije 6 . Mikrobne ćelije mogu se identificirati i oporaviti pomoću FACS na temelju njihovog sadržaja DNK (fluorescencija) i raštrkanih signala, koji su povezani s veličinom i zrnatošću stanice. Samo nekoliko pikolitra originalnog uzorka razvrstano je sa stanicom što minimizira rizik od kontaminacije izvanstaničnom DNK. Široka raznolikost poredača stanica, operativnih parametara i uzoraka okoliša onemogućuje jedan detaljan protokol za razvrstavanje stanica. Dolje navedeni protokol opisuje opće savjete za sortiranje stanica iz uzoraka iz okoliša, a uključuje detalje o nekoliko prikladnih automatiziranih sustava za rukovanje tekućinama.

Automatizacija. Otprilike polovina pojedinačnih izoliranih stanica za studiju iznesenu u br. 1 su generirane ručnim postupkom opisanim u protokolu, koji se može prilagoditi većoj propusnosti zbog formata ploče i postavlja se jednostavnije od automatiziranog sustava za upravljanje tekućinom. Automatizirani sustavi za upravljanje tekućinom su, međutim, prikladni za stalne SCG aplikacije i omogućuju pojednostavljen i pouzdaniji tijek rada. Uključili smo izbor tri sustava (vidi Oprema). Kako će skripte biti vrlo specifične za svaki model i konfiguraciju i zahtijevat će prilagođena rješenja, ovdje ih ne uključujemo.

Stanična liza. Svrha koraka lize je razgraditi ovojnicu mikrobnih stanica bez oštećenja kromosomske DNK, uvesti kontaminaciju ili inhibirati kasnije reakcije amplifikacije. Većina studija koje se odnose na jedno ćelije oslanjaju se na postupak alkalne lize koji su prvi opisali Raghunathan i sur . 21, iako su korišteni alternativni ili dopunski tretmani kao što su toplina, smrzavanje-otapanje, deterdženti i liječenje hidroliznim enzimima 6 . Međutim, ove tehnike liziranja nisu univerzalno učinkovite na svim mikrobima, pa se stoga značajan dio genoma ne može dobiti iz nekih uzoraka okoliša. Primjenjujemo metodu alkalne lize u sljedećem postupku.

WGA. Najčešći pristup amplifikacije cijelog genoma je višestruko pomicanje (MDA). Ovu su metodu prvi uveli Dean i sur . 22, a oslanja se na polimerazu Phi29 iz bakterije Bacillus bakteriofaga radi pojačavanja nivoa femtograma u DNK. Ovo izotermalno pojačavanje, koje pomiče žice, daje u prosjeku> 10 kb-dugih amplikona koji se preklapaju, koji su pogodni za sekvenciranje cijelog genoma i de novo sastavljanje, slično podacima o sekvenci iz DNK ekstrakata čistih kultura. Međutim, MDA rezultira neravnomjernom pokrivenošću genoma koja se može djelomično ublažiti metodama mokrog presjeka i bioinformatičkim normalizacijama 1, 20, 23, 24 . Genomsko preuređivanje, ili himere, nastaju tijekom MDA i mogu komplicirati montažu genoma povezivanjem nestalnih kromosomskih područja 15, 25 . Učinak ovih preusmjeravanja može se ograničiti visokim pokrivanjem sekvenci i izbjegavanjem dugačkih knjižnica parova 24 . Preostali izazovi su ograničeni oporavak genoma - u prosjeku se otprilike oko 40–55% jednoćelijskog genoma dobije 1, 11 - i ukupna niska učinkovitost pristupa genomskoj DNK unutar pojedinih stanica, što je dijelom povezano s nemogućnost uspješnog liziranja stanica. Stope uspješnosti lize i MDA uvelike se razlikuju među uzorcima okoliša, u rasponu od <10 do 100% (ref. 1, 11, 16).

Kontaminacija. Reakcije MDA osjetljive su na kontaminaciju DNK prisutnu u uzorku, reagense ili onečišćenje uneseno postupanjem s uzorkom. Učinak kontaminacije DNA može se kontrolirati uspostavljanjem čistih postupaka razvrstavanja stanica 12, 20, 24, 26, dekontaminiranja komercijalno dostupnih MDA reagensa 1, 20, 23, izražavanjem prilagođenog ultračišćenog enzima Phi29 27 ili korištenjem komercijalno prethodno očišćenih MDA setova posebno dizajniran za jednostanične predloške. Smanjenje količine također može ograničiti utjecaj onečišćenja reagensa (Okvir 1). Kako bi se minimiziralo onečišćenje koje je uvedeno u laboratorij, razvrstane jednostanične pločice nikada se ne smiju otvarati izvan čistog PCR poklopca. Da bi se procijenio stupanj potencijalne kontaminacije, preporučuje se uključivanje nekoliko reda ploča negativnih kontrola (korak 11).

Image

Filogenetski probir. Ciljani genomi se obično identificiraju nakon MDA PCR amplifikacijom, sekvenciranjem i filogenetskom analizom marker gena, npr., 16S rRNA gena. Uspješno smo upotrijebili slijedeći set "univerzalnog pirotaga" - naprijed 926wF (5'-AAACTYAAAKGAATTGRCGG3 ') i obrnuto 1392R (5'-ACGGGCGGTGTGTRC3 ') - za arheje i bakterije (tablica 1). Kratki amplikoni gena od 16S rRNA, dobiveni gore navedenim setom prajmera ili iz 'univerzalnih i-tag' primera navedenih u Tablici 1, pružaju, prema našem iskustvu, dovoljno razlučivost za dodjelu taksonomske klasifikacije na razini filma. Za taksonomske zadatke ispod razine filuma prikladniji su amplikoni gena 16S rRNA pune duljine (generirani, na primjer, od para prajmer 27F-YM i 1492R (tablica 1)). Međutim, velika raznolikost gena rRNA među mikrobnim genima čini izazovnim dizajnirati istinski univerzalne primere koji su prikladni za čitav niz različitih mikrobnih svojti. Imajte na umu da je svrha filogenetskog probira odrediti taksonomsku klasifikaciju pojedinih pojačanih genoma (SAG). To će omogućiti odabiranje pojedinačnih ćelija za daljnju obradu, kao što su sekvenciranje multilokuse ili sačmarice. Za filogenetski skrining koristi se samo mali alikvot DNA generiran u WGA, a filogenetski screening nije obvezan.

Tablica pune veličine

materijali

REAGENSI

Priprema i konzerviranje uzoraka

  • Uzorak (na primjer, sediment, tlo, fekalni materijal, biofilm ili zrnati mulj)

  • (Neobavezno) Sterilna, filtrirana puferska otopina, poput 1 × PBS (Calbiochem, OmniPur, kat. Br. 6505)

  • Betain: bezvodni betain (Fisher, kat. Br. AC20424-1000; vidi Postavljanje reagensa)

  • TE, 100 ×, pH 8, 0 (npr. Fluka, kat. Br. 86377; vidi Postavljanje reagensa)

  • Voda Milli-Q (Millipore)

  • Molekularni glicerol (Acros, kat. Br. 15892-0010; vidi Postavljanje reagensa)

  • Sterilna morska voda tretirana UV zrakom (sterilna morska voda; Sigma, kat. Br. S9148-1L)

Odvajanje stanica pomoću FACS

  • Ultračista voda, poput Milli-Q vode (Millipore), ili filtrirana voda molekularne biologije (Fisher, kat. Br. BP2810)

  • Izbjeljivanje za kućanstvo, 3–8% (tež. / Vol.) Otopine natrijevog hipoklorit (Clorox; vidi Postavljanje reagensa)

  • PBS tekući koncentrat, 10 × 4 litre, sterilan (OmniPur, kat. 6505-4L; vidi Postavljanje reagensa)

  • NaCl (Sigma-Aldrich, kat. Br. 71386; vidi Postavljanje reagensa)

  • SYBR zelena fluorescentna mrlja od nukleinske kiseline (npr. Invitrogen SYBR zelena mrlja od nukleinske kiseline; Invitrogen, kat. Br. S-7585)

Jednocelična liza i amplifikacija celim genima putem MDA

  • RepliPHI Phi29 reagens skup 0, 1 µg / μl (Epicenter, kat. Br. RH040210): sadrži Phi29 DNA polimerazu (100 U / μl), Phi29 10 × reakcijski pufer, dNTP otopinu (25 mM svaki dATP, dCTP, dGTP i dTTP) i DTT, 100 mM (nije korišteno u ovom protokolu)

    Kritično

    • Učinkovitost enzima Phi29 može se značajno razlikovati između dobavljača, pa čak i između grupa istog dobavljača. Stoga preporučujemo testiranje uspješnosti svake nove serije.

  • DLB odbojnika (Qiagen, kat. Br. 1031206; vidi Postavljanje reagensa)

    Oprez

    Sadrži kalijev hidroksid, a korozivno je i štetno. Izbjegavajte kontakt s kožom, kontakt očima i gutanje.

  • STOP rješenje (Qiagen, kat. Broj 1032393)

  • Voda bez nukleusa (Fisher Scientific, kat. Br. BP2484-100)

  • Nasumični heksameri, 50 µM (integrirane tehnologije DNA (IDT); vidi Postavljanje reagensa)

  • DMSO (Sigma-Aldrich, kat. Broj D8418-100ML)

  • SYTO 13, 5 mM (Invitrogen, kat. Br. S7575)

  • DTT, 1 M (Sigma-Aldrich, kat. Broj 646563-10X.5ML; vidi Postavljanje reagensa)

  • Bijela (3–8% (tež. / Vol.) Otopina natrijevog hipoklorit)

Filogenetski probir

  • Ultračista voda, poput vode Milli-Q (Millipore) ili druge filtrirane i deionizirane vode (DIW)

  • SsoAdvanced SYBR Green Supermix (Bio-Rad, kat. Br. 172-5264)

  • 926wF temeljni premaz, 10 µM (5′-GAAACTYAAAKGAATTGRCGG-3 ′; IDT)

  • 1392R temeljni premaz, 10 µM (5′-ACGGGCGGTGTGTRC-3 ′; IDT)

  • ExoSAP-IT (Affymetrix, kat. Broj 78201)

OPREMA

Priprema i konzerviranje uzoraka

  • Epruvete za mikrocentrifuge, 2 ml (npr. Eppendorf epruvete Safe-Lock 2, 0 ml, bistre; Eppendorf, kat. Broj 0030 120.094)

  • Mikrocentrifuga (npr. Epcentorf 5424 ventilirana mikrocentrifuga; Eppendorf, kat. Broj 5424 000.410)

  • Vortex (VWR Scientific, Vortex Genie 2)

  • Centrifuga (Eppendorf, kat. 5810R)

  • Standardni svjetlosni mikroskop (Zeiss)

  • Sterilni vrh pamuka (Fisher Scientific, Fisherbrand aplikatori od pamučnog vrha, kat. Br. 23-400-114)

  • Ultrazvučna vodena kupka (npr. Spectralab ultrazvučna kupka za čišćenje; Spectralab Instruments, kat. Broj UCB-30D)

  • Falcon epruveta, 50 ml (Thermo Scientific, kat. Br. 362697)

  • Staklene kuglice, promjera 2 mm (npr. Kuglice od punog stakla, borosilikat, promjera 2 mm; Sigma-Aldrich, kat. Broj Z273627-1EA)

  • Filtrirajte s veličinom pora od 40 µm (npr. Cjedilo BD Falcon stanica 40 µm; BD Biosciences, kat. Br. 352340)

  • Filter, 0, 2 μm (npr. Millipore Millex-FG jedinica filtra za štrcaljku, 0, 2 μm; Millipore, kat. Broj SLFG025LS)

  • Tikvica, 250 ml (Pyrex, kat. Br. 4980)

Zbirka jednoćelija putem FACS-a

  • Razvrstavanje stanica: koristimo Influx (BD Biosciences) ili MoFlo (Beckman Coulter) sa 70 nm mlaznicom i 488 nm ekscitacijskim laserom za otkrivanje i sortiranje prokariotskih stanica označenih DNK bojom SYBR zeleno. Međutim, stanice se mogu sortirati korištenjem raznih mrlja i razvrstavača stanica

  • Očistite PCR haubu UV svjetlom za dekontaminaciju tekućine od plašta, plaštaca i sabirnih cijevi (npr. Labconco, kat. Br. 3970302)

    Oprez

    Izbjegavajte izravno UV izlaganje kože ili očiju. Uvijek nosite odgovarajuću osobnu zaštitnu opremu.

  • Dvije 2-litarske kvarcne tikvice za UV obradu tekućine od omotača

  • Dvije pločice za miješanje i mješalice za UV obradu s tekućinom

  • BD Falcon 40-μm najlonsko celično cjedilo (BD Biosciences, kat. Br. 352340)

  • Polipropilenske cijevi s okruglim dnom, 5 ml: BD Falcon 12 × 75 mm, cijevi za jednokratnu upotrebu (BD Biosciences, kat. Broj 352063)

  • Pall Acrodisc, 32-mm filter špriceva sa 0, 1 µm supornom membranom (Pall, kat. Br. 4651)

  • BD Luer-Lok špric za jednokratnu upotrebu, 10 ml (BD Biosciences, kat. Br. 309604)

  • Optičke pločice s mikro jažicama koje primaju sortirane pojedinačne stanice (npr. LightCycler multiwell pločica 384; Roche, kat. Broj 05102430001)

Jednocelična liza i amplifikacija celim genima putem MDA

  • Spektralin XL-1500 UV poprečni link (Fisher Scientific, kat. Br. 11-992-90)

    Oprez

    Izbjegavajte izravno UV izlaganje kože ili očiju. Uvijek nosite odgovarajuću osobnu zaštitnu opremu.

  • Očistite PCR haubu UV zrakom za dekontaminaciju radnih površina (npr. Labconco, kat. Br. 3970302)

    Oprez

    Izbjegavajte izravno UV izlaganje kože ili očiju. Uvijek nosite odgovarajuću osobnu zaštitnu opremu.

  • Čitač ploča s regulacijom temperature (npr. BMG Labtech FLUOstar Omega) ili termocikler u stvarnom vremenu (npr. Roche LightCycler 480; Roche, kat. Broj 05015243001)

  • (Neobavezno) Robotski držač tekućine, kao što su Bravo (Agilent Technologies), Freedom EVO (Tecan), Echo (Labcyte) ili slično

    Kritično

    • Svaki se korak može izvesti s jednokanalnim ručnim pipetama; međutim, višekanalne pipete ili robotizirani uređaji za rukovanje tekućinom preporučuju se posebno kada radite s pločama s 96 ili 384 jažica.

  • Eppendorf epruvete Safe-Lock, 1, 5 ml (Eppendorf, kat. Broj 0030 120.086)

    Kritično

    • UV tretman mora uvijek biti reagiran s reagensom u Eppendorf Safe-Lock cijevima.

  • Konusne epruvete ozračene gama-5 ml (Daigger, kat. Broj EF3159F)

    Kritično

    • Ako radite s velikim količinama zbog velikog broja reakcija, ove sterilne 5-ml epruvete mogu se koristiti umjesto eppendorf Safe-Lock 1, 5 ml epruvete za rukovanje reagensima.

  • EMD colorpHast pH trake (Fisher Scientific, kat. Broj M95903)

  • Kvarcna ploča (npr. Okruglo posuđe od 210 mm; Quartz Scientific)

  • Aluminijska folija

  • Kutija za led, paketi za led, posuda s folijom (npr. Poklopac kutije za pipete)

Filogenetski probir

  • Standardni termocikler ili termocikler u stvarnom vremenu (npr. Roche LightCycler 480; Roche, kataloški broj 05015243001)

  • Shaker tanjura (npr. MTS 2/4 digitalni shaker; IKA, kat. 0003208001)

  • Optička mikrotitarska ploča (npr. LightCycler Multiwell Plate 384; Roche, kat. Broj 05102430001)

POSTAVKA REAGENTA

Betainska zaliha, ∼ 38% (tež. / Vol.)

  • Otopite 48 g betaina u 80 ml DIW. Donesite volumen do 125 ml pomoću DIW. Otopinu propustiti kroz 0, 1 µm filter. Čuvajte u hladnjaku na 4 ° C do jedne godine i ponovno ga filtrirajte svaki mjesec.

GlyTE

  • Napravite zalihu GlyTE u tikvicu od 250 ml dodavanjem 20 ml 100 × TE (pH 8, 0), 60 ml DIW i 100 ml glicerola molekulskog razreda (glicerol se najbolje prenosi špricom). Prođite ga kroz 0, 1 µm filter. Čuvajte zalihe na -20 ° C do 1 godine.

PBS pufer, 1 ×

  • Razrijedite 10 × sterilnu otopinu PBS-a u omjeru 1:10 u ultračisti vodi, poput Milli-Q vode. Pripremite 4 litre 1 × PBS, 2 litre svaka u dvolitrenim tikvicama. Prije svake uporabe svježe pripremite pufer.

Otopina NaCl, 15 ppt

  • Otopite 105 g izgaranog NaCl u 500 ml UV-tretirane ultračiste vode, a zatim filtrirajte hipersalinsku otopinu kroz 0, 1 µm filter i razrijedite je na 7 litara s ultračistom vodom obrađenom od UV zraka. Prije svake uporabe otopinu svježe pripremite.

    Kritično

    • PBS pufer (1 ×) i 15 ppt NaCl otopina koriste se s uzorcima slatke vode i mora.

Otopina izbjeljivača, 10% (tež. / Vol.)

  • Razrijedite izbjeljivač u domaćinstvu u omjeru 1:10 u ultračisti vodi, kao što je voda Milli-Q (0, 3–0, 8% (w / vol) natrijeva hipoklorit, krajnja koncentracija). Prije svake uporabe svježe napravite 1 litru otopine izbjeljivača.

Voda razreda SCG

  • Ulijte 75 ml vode bez jaja u kvarčno dno posude. Ponovno stavite poklopac posuđa od kvarca i stavite je u pladanj obložen aluminijskom folijom (da biste povećali reflektivnost). UV-zračite ga u spektralin XL-1500 UV unakrsnom povezivaču tijekom 16 sati, a zatim ga alikvotirajte u 1, 5 ml Eppendorf epruvete Safe-Lock, obrađene od UV zraka, samo za jednokratnu upotrebu. Ta voda s razinama SCG može se skladištiti na -20 ° C u neograničenom vremenu.

Lizis pufer D2

  • Liofiliziranom puferu DLB (Qiagen) dodajte 500 µl vode razreda SCG i 45, 5 µl 1 M DTT. Dobro promiješajte vrtloženjem. Pomoću pH trake provjerite je li pH pH 14. Lizisni pufer D2 može se čuvati na -20 ° C 6 mjeseci.

Nasumični heksameri, 0, 5 mM

  • Upotrijebite internetsku stranicu IDT kako biste naložili 10 μmol 'slučajnih heksamera'. Odaberite parametre 'standardno uklanjanje kamenca' i 'randomizacija ručne kombinacije'. Heksameri bi trebali imati fosforotioatne veze između posljednja dva nukleotida na kraju od 3 ′ (5′-NNNN * N * N-3 ′). Resuspendirajte ih u vodi s razinama SCG do 500 µM i alikvotirajte u 1, 5-ml ml epruvete obrađene samo za jednokratnu upotrebu. Alikvoti se mogu čuvati na -20 ° C 1 godinu.

    Kritično

    • Kvaliteta heksamera može se znatno razlikovati između dobavljača, pa čak i između grupa istog dobavljača. Stoga preporučujemo testiranje uspješnosti svake nove serije.

DTT otopina, 1 M

  • Zbog negativnih učinaka oksidacije tijekom vremena, 1 M DTT treba prenijeti u 1, 5-ml ml epruvete obrađene samo za jednokratnu upotrebu. Ako radite razrjeđenja od 1 M DTT, napravite ih s vodom razreda SCG. DTT otopina može se čuvati na -20 ° C 6 mjeseci.

Postupak

Skupljanje uzoraka, priprema i konzerviranje • VRIJEME do 1 h 10 min

  1. Postupci obrade uzoraka razlikuju se ovisno o vrsti uzorka. Obradite uzorke na sljedeći način za uzorak sedimenta, tla ili fekalija (opcija A), uzorak biofilma (opcija B) 1 ili uzorak zrnatog mulja (opcija C) 1 .

    1. Uzorak sedimenta, tla ili fekalije

      1. Pomiješajte g 5 g uzorka s 10–30 ml sterilnog pufera u 50 ml epruveti. Za uzorke tla, fekalne uzorke i slatkovodne sedimente, koristite 1 × PBS kao pufer. Za morske sedimente koristite morsku vodu tretiranu sterilnom filtracijom.

      2. Vortex uzorkovati 30 s pri 16 000 g ili najvišoj postavci.

      3. Centrifugirajte uzorak 30 s na 2500 g na sobnoj temperaturi (25 ° C) da biste uklonili krupne čestice.

      4. Skupite supernatant.

      Vrijeme: 10 min

    2. Uzorak biofilma

      1. Pomoću pamučnog štapića otkidajte biomasu iz čvrstog medija i skupite je u epruvete za mikrocentrifugu koje sadrže sterilno filtriranu izotoničnu otopinu pufera, kao što je 1 × PBS ili morska voda.

      2. Sonicirajte epruvetu sa sakupljenim biofilmom u ultrazvučnoj vodenoj kupelji plutajući epruvetu 10 minuta na zadanoj postavci na sobnoj temperaturi.

      3. Ruku protresite rukom još 5 min.

      4. Ispitajte uzorak pod mikroskopom kako biste uočili učinkovitost disperzije. Ako je potrebno, ponovite korak 1B (ii, iii).

      Vrijeme: 30 min

    3. Granulirani uzorak mulja

      1. Uzorak je oko 5–40 ml tekućeg mulja. Prebacite u epruvetu od 50 ml Falcon-a i napunite do 50 ml volumena sterilno filtriranom izotoničnom otopinom pufera, poput 1 × PBS ili morskom vodom.

      2. Centrifugirajte uzorak tako da formira pelet (npr. 15 min pri 16.000 g ).

      3. Uklonite većinu supernatanta da biste smanjili ukupni volumen tekućine na 15 ml u Falcon epruveti od 50 ml.

      4. Dodajte 0, 1 g staklene kuglice promjera 2 mm u cijev i ručno miješajte pelet 10 minuta.

      5. Ostavite da epruveta stoji 3 minute, a zatim skupite gornju polovicu suspenzije i prebacite je u novu epruvetu.

      6. Staklene kuglice uklonite filtriranjem kroz 40 µm filter za gazu.

      7. Ispitajte uzorak pod mikroskopom kako biste uočili učinkovitost disperzije. Ako je potrebno, ponovite korak 1C (ii – v). Alternativa ručnom mljevenju je raspršivanje uzoraka mulja ultrazvučnom obradom, na primjer, Sonifier II modelom 150 (Branson), kao što je prikazano u Miyauchi i sur . 28 .

      Vrijeme: 1 h

  2. Krioprezervati obrađene uzorke koji sadrže stanice u betainu (opcija A) ili glicerol (opcija B).

    1. Betaine zalihe

      1. Prenesite 200 μl zaliha betaina i 1 ml nefiltriranog uzorka u sterilni kriovaskularni (što rezultira ∼ 6% (w / vol) otopinom betaina).

      2. Bočicu lagano promiješajte i inkubirajte 1 minutu na sobnoj temperaturi.

      3. Smjesu uzorka čuvajte u tekućem dušiku ili na -80 ° C.

      4. Pripremite nekoliko ponovljenih bočica za svaki uzorak. Otkriveno je da ova metoda dobro djeluje na većini uzoraka; međutim, hipersalinski uzorci dali su mali broj sačuvanih stanica.

      Vrijeme: 10 min

    2. GlyTE zalihe

      1. Prenesite 100 μl zaliha GlyTE i 1 ml uzorka u sterilni kriovir.

      2. Bočicu lagano promiješajte i inkubirajte 1 minutu na sobnoj temperaturi.

      3. Smjesu uzorka čuvajte u tekućem dušiku ili na -80 ° C.

      4. Pripremite nekoliko ponovljenih bočica za svaki uzorak. Otkriveno je da ova metoda dobro djeluje na uzorke mora i slatke vode.

        Točka pauze

        • Zalihe Betaina i GlyTE mogu se čuvati na -80 ° C nekoliko mjeseci.

      Vrijeme: 10 min

Priprema FACS-a za sterilne vrste

Vrijeme: 1 d

  1. Pripremite 4 litre 1 × PBS ili 15 ppt NaCl otopine u dvije 2-litarske kvarcne tikvice i počnite miješati magnetskim miješalicama i pločicama unutar čiste kapuljače. Postavite prazan spremnik tekućine u omotaču i preokrenuti poklopac unutar haube tako da UV zrači na unutarnjim površinama. Zatvorite poklopac i pokrenite preko noći UV izlaganje. Predlažemo da jedan rezervoar posvetite čišćenju tekućine od omotača. Nakon izlaganja UV zraku, pažljivo dodajte tekućinu za plašt u spremnik dok je još uvijek u čistoj haubici. Uštedite najmanje 10 ml čiste tekućine u ovojnici za kasniju upotrebu tijekom sortiranja.

    Kritični korak

    • Čista tekućina za razvrstavanje stanica i omotač neophodni su za uspješno jednostanično sortiranje i MDA. Fluidne linije na staničnom razvrstavanju mogu se dekontaminirati izvlačenjem izbjeljivača kroz instrument, dok se tekućina u omotaču može dekontaminirati UV postupkom. Otkrili smo da instrument ostaje čist najmanje 3 d nakon dekontaminacije, sve dok se koristi čista tekućina u omotaču. Otkrivamo i da je ovaj postupak pogodan za dekontaminaciju istih fluidnih vodova više puta za više od jedne upotrebe, te nije potrebno zamijeniti fluidne vodove između čistih slojeva razvrstavanja.

  2. Napunite drugi spremnik sa 1 litrom 10% (tež. / Vol.) Izbjeljivača (0, 3–0, 8% (tež. / Vol.) Natrijevog hipoklorit, krajnja koncentracija) i provucite ga kroz sorter ćelija 2 sata kako bi se dekontaminirala tekuća cijev.

  3. Odložite bilo koji preostali izbjeljivač i isperite omotač sterilnom vodom. Procijedite 1 litru sterilne vode kroz sortiranje stanica 30 minuta da biste isprali tekućinu u epruveti.

Odvajanje stanica protočnom citometrijom

Vrijeme: 1 d

  1. Ugradite spremnik čistom tekućinom za plahte i započnite s vođenjem vrste. Slijedite postupak naveden u FACS-ovom priručniku za centriranje struje, podešavanje lasera i detektora te podešavanje i izračunavanje kašnjenja pada.

  2. Prije sortiranja, UV-obrade mikrotitarske ploče tretirajte otvoreno (bez pokrova) 10 min. Svakoj jažici dodajte 1 μl UV-obrađenog 1 × TE pufera po jažici. UV ploče ponovo obradite, ovaj put s poklopcem, još 10 min.

    Kritični korak

    • Nedavno smo otkrili da TE pufer može biti izostavljen i da razvrstavanje u suhim pločama ne utječe na daljnju primjenu. Kada obavljate "suhu sortu", volumen sterilne vode u WGA glavnom smjesu treba povećati za 1 μl po jažici kako bi se ukupna zapremina konstantna.

  3. Da biste izbjegli začepljenje mlaznice bilo kojom vrstom agregata, filtrirajte svaki uzorak odgovarajućim filtrom (npr., 40 µm najlonska mrežica kada koristite mlaznicu od 70 µm).

  4. Obojite stanice sa 1 × SYBR zelenom fluorescentnom mrljom nukleinske kiseline 15 minuta u mraku na 4 ° C. SYBR Green isporučuje se u koncentraciji 10 000 ×, a mi ga koristimo u konačnoj koncentraciji od 1 ×, što iznosi 10 000 puta razrjeđivanje.

    Kritični korak

    • U ovom se koraku može koristiti široka raznolikost mrlja od nukleinske kiseline, a neke djeluju bolje od drugih za određene uzorke.

  5. Pokrenite obojeni uzorak i ciljajte željenu populaciju mikroba pomoću sortiranja vrata (Sl. 2).

    Kritični korak

    • Može biti izazovno pronaći ciljanu populaciju u nekim uzorcima okoliša. Na primjer, uzorci s visokom gustoćom stanica (> 10 6 stanica po ml) i niskim pozadinskim signalom pokazuju izrazitu mikrobnu populaciju (Sl. 2b), dok uzorci sedimenta obično pokazuju manje jasno definirani cilj (Sl. 2d, e), Možda ćete biti od koristi usporediti obojene i nezaslađene uzorke kada identificirate ciljanu populaciju. Također se može zahtijevati razrjeđivanje uzoraka (osigurati da razrjeđivač, poput čiste tekućine u omotaču, bude tretiran UV zračenjem).

    Rješavanje problema

  6. Poredajte ciljne stanice u mikrotiterske pločice koje su tretirane UV zračenjem, koje sadrže 1 μl 1 × TE pufera po jažici. Preporučujemo razvrstavanje ćelija prema slici 3, koja uključuje četiri stupca negativnih kontrola (bez predloška). Da biste izbjegli zajedničko razvrstavanje> 1 ćelije, koristite strogu masku sortiranja i nisku stopu događaja.

    Kritični korak

    • Za uzorke s očekivanom visokom koncentracijom izvanstanične DNK ili nekomercijalnim događajima, za razrjeđivanje ove vanćelijske DNA može se upotrijebiti dvostupanjska vrsta. Prvo razvrstajte najmanje 10 000 ciljnih stanica u 1 ml UV-obrađene 1 × PBS. Zatim isperite liniju uzorka u trajanju od 1 minute tekućinom za omotač, kroz 5 minuta unesite 10% (tež. / Vol.) Otopinu izbjeljivača kroz liniju uzorka i ponovo je isperite 5 minuta. Nakon toga, sortirane stanice ponovno obojite s 1 × SYTO i upotrijebite kao izvorni uzorak za taloženje FACS-a u mikrotitarske pločice.

  7. Pokrijte tanjure sterilnom folijom i čuvajte ih na –80 ° C. Ploče se nikada ne smiju otvarati izvan čistog PCR poklopca prije nego što ispustite MDA.

    Točka pauze

    • Poredane ćelije mogu se čuvati na -80 ° C nekoliko mjeseci.

Image

( a ) Shematski nacrt razvrstavača stanica aktiviranog fluorescencijom. Uzorak okoline je raspoređen u tankom toku koji se kreće jedna po jedna ćelija ispred lasera i detektora, a stanice koje se zanimaju naknadno se odvajaju u jažice mikrotitarske pločice, dok se neželjeni dio uzorak ide na otpad. ( b - e ) Tok citometrije protoka i sortiranje prozora (crveni obrisi). ( b ) zrnasti mulj iz bioreaktora, pripremljen kako je opisano u koraku 1C. ( c ) Uzorak biofilma, pripremljen kako je opisano u koraku 1B. ( d, e ) Uzorak morskog sedimenta ( d ) i uzorak slatkovodnog sedimenta ( e ), oba pripremljena kao što je opisano u koraku 1A. Os x pokazuje bočni rasipanje (SSC), a osi y prikazuje relativnu zelenu fluorescenciju uzoraka obojenih zelenim sipkama SYBR na valnoj dužini od 531 nm.

Slika pune veličine

Image

( a ) MDA kinetika za ploču od 384 jažice sortirane pojedinačne stanice s pozitivnim (100 stanica po jažici) i negativnim (bez predloška) kontrola. ( b ) Izgled ploče za MDA koji pokazuje jažice s uspješnim pojačanjem (uspjeh se mjeri fluorescentnom vrijednošću iznad 10 proizvoljnih jedinica (au) u ovom slučaju). ( c ) Raspored ploča za kvantitativni PCR u stvarnom vremenu (qPCR) koji prikazuje jažice s uspješnom amplifikacijom gena 16S rRNA. Sivi izvori ne pokazuju pojačanje. Zelene, pozitivne kontrole (100 stanica); crvene, kontrole bez predloška; žute, pojedinačne stanice.

Slika pune veličine

Jednocelična liza

Vrijeme: 2 h

  1. Prije izvođenja radova obrišite sve čiste površine, pipete i opremu s izbjeljivačem od 10% (tež. / Vol.). UV obradite čistu kapuljaču 60 minuta s opremom iznutra.

    Kritični korak

    • It is essential to prepare as sterile an environment as possible when you are performing single-cell amplification. UV treatment of all equipment and disposables are recommended, followed by wiping with 10% (wt/vol) bleach, if applicable. It is recommended to have a dedicated area reserved for single-cell work only, in a separate location free of DNA, with separate equipment.

  2. Thaw lysis buffer D2 and STOP buffer (as prepared in Reagent Setup). The amount of lysis buffer added for each reaction should be calculated as follows: the cell in TE and the lysis buffer should be at a 1:1 ratio. At the same time, the final concentration of lysis buffer in the whole MDA reaction should be approximately 6–7% (vol/vol). The same amount of STOP buffer should also be added. For this example, a single cell was sorted into 1 μl of TE. A volume of 1 μl of lysis buffer should be added to obtain a final concentration of 6.7% in an MDA reaction of 15 μl. Calculate how much is needed based on the number of reactions, and then transfer the appropriate volume of both buffers to separate 1.5-ml Eppendorf Safe-Lock microcentrifuge tubes.

    Kritični korak

    • The following protocol describes performing MDA in 15-μl reactions. These reaction volumes may be adjusted up or down according to the parameters or requirements of individual experiments.

    Kritični korak

    • Another important consideration is that the larger the well that the single cell has been sorted into, the larger the reaction volume must be for the lysis buffer to completely cover the bottom of the well and to ensure a complete lysis of the cell.

  3. Place the tubes of lysis and STOP buffers in a small, foil-lined container (eg, a pipette tip-box lid). UV-treat them in the Spectraline XL-1500 UV cross-linker for 60 min.

  4. To each well (of the plates from Step 12) containing a sorted single cell, add 1 μl of lysis buffer D2. Spin down the plate at 1, 000 g for 1 min and incubate them for 5 min at room temperature.

  5. Add 1 μl of STOP buffer to each well. Spin down the plate at 1, 000 g for 1 min. If you are not adding MDA master mix immediately, store the lysed cells at 4 °C for no more than 1 h.

Pojačanje cjelovitih genoma

Timing: 20 h (overnight)

  1. Under a clean PCR hood, thaw the following reagents for making the MDA master mix: Phi29 10× reaction buffer, 25 mM dNTP solution, 0.5 mM hexamers, 1 M DTT, DMSO, SYTO 13 and SCG-grade water. Do not thaw Phi29 DNA polymerase.

  2. Gently mix all reagents by vortexing and spinning them down in a microcentrifuge. Each 15 μl of MDA reaction contains 0.4 μl of Phi29 enzyme, 1.5 μl of Phi29 10× reaction buffer, 0.24 μl of dNTP solution (25 mM), 1.5 μl of hexamers (0.5 mM), 0.15 μl of DTT (1 M), 0.75 μl of DMSO, 0.0015 μl of SYTO 13 and 7.46 μl of SCG-grade water. Prepare enough master mix for all reactions, adding Phi29 DNA polymerase at the end. Mix by vortexing, and prepare aliquots of the master mix in 1.5-ml Eppendorf Safe-Lock microcentrifuge tubes (with a maximum aliquot volume of 1 ml). See Box 1 for information about how to carry out lower-volume MDA reactions.

    Kritični korak

    • Do not add SYTO 13 to the master mix at this point, as UV irradiation will degrade the dye.

    Kritični korak

    • Do not let the MDA master mix warm to a temperature above 30 °C. The Phi29 enzyme becomes inactivated at temperatures above 30 °C.

  3. UV-treat the tubes of master mix in a reflective container on ice for 30–90 min in the Spectraline UV cross-linker, as described previously 23 . Arrange the tubes to rest ∼ 8 cm below the UV bulb.

    Kritični korak

    • Because UV irradiation will raise the temperature within the UV cross-linker, it is important to UV-treat the MDA master mix on ice to avoid Phi29 enzyme deactivation.

  4. After UV treatment, add SYTO 13 (0.0015 μl per reaction) to the master mix to obtain a final concentration of 0.5 μM. Vortex and spin down the mixture.

  5. To the lysed cells from Step 17, add the 12 μl of MDA master mix to each well. Cover the plate with an optical seal and spin it down at 1, 000 g for 1 min. Incubate the plate at 30 °C for 16 h in the Roche LightCycler 480 or similar real-time thermocycler or plate reader. Figure 3a, b exemplifies the MDA kinetics and plate layout for a 384-well plate.

    Rješavanje problema

  6. Heat-inactivate the Phi29 enzyme by incubating the completed MDA reaction at 65 °C for 10 min.

    Kritični korak

    • Although previous reports suggest debranching of the MDA products with S1 nuclease before sequencing 15, we do not recommend this step. Our previous results suggest that S1 debranching has no effect on the chimera rate 12, and we routinely sequence and phylogenetically screen single-cell MDA products without debranching.

    Točka pauze

    • The amplified DNA is ready for phylogenetic screening and sequencing (Steps 24–30), and it can be stored for several months at −80 °C. However, freezing the MDA product results in a nonhomogenized DNA product upon thawing, and thus we suggest moving directly to phylogenetic screening when possible. Please note that the purpose of the phylogenetic screening is to determine the taxonomic classification of the SAGs. This will allow single cells of interest to be selected for further downstream processing, such as multilocus or shotgun sequencing. Only a small aliquot of the DNA generated in the WGA is used for phylogenetic screening, and phylogenetic screening is optional.

Phylogenetic screening

Timing: 3 h

  1. Make a 1:20 dilution of the MDA product in nuclease-free water. Mix it thoroughly by hand-pipetting up and down. If a large number of samples precludes hand-pipetting, mix the samples in a plate shaker for 15 min at the highest setting.

    Kritični korak

    • The MDA product is highly viscous. It is crucial to ensure that it is mixed thoroughly. Robotic instrumentation may also be helpful with pipette mixing.

  2. Transfer 1 μl of diluted MDA product as template to an optical microtiter plate (eg, LightCycler multiwell plate 384).

  3. Thaw the following reagents on ice for the 16S rRNA gene PCR: SsoAdvanced SYBR Green Supermix, 10-μM 926wF primer and 10-μM 1392R primer. Alternate primers are listed in Table 1.

    Kritični korak

    • Minimize the exposure of SsoAdvance SYBR Green Supermix to direct light.

  4. Gently mix all reagents by vortexing and spinning down. Each 10-μl PCR contains 3.6 μl of nuclease-free water, 5 μl of SsoAdvance SYBR Green Supermix (2×), 0.2 μl of 926wF primer (10 μM), 0.2 μl of 1392R primer (10 μM) and 1 μl of diluted MDA product as template. Prepare a sufficient amount of master mix for all reactions. Mix the reactions by vortexing and spinning down.

  5. To each well of 1 μl of diluted MDA product template, add 9 μl of master mix. Seal the plate with optical seal and spin down at 1, 000 g for 1 min.

  6. In a real-time thermocycling instrument, PCR-amplify the samples by using the cycling program recommended by the PCR kit manufacturer's instructions (Fig. 3c). Incorporating a melt curve step into the cycling program will aid in the analysis of PCR products.

    Rješavanje problema

  7. Purify and sequence PCR products to identify the single-cell genomes. We clean up PCR products by using ExoSAP-IT according to the manufacturer's instructions, and we then Sanger-sequence them via an outside service. We amplify and sequence the 16S rRNA gene for the taxonomic classification of our single cells, as the 16S (or SSU) rRNA is considered the gold standard in bacterial and archaeal classification 29, and databases and online tools facilitating the taxonomic identification are readily available 30, 31 .

Rješavanje problema

Savjeti za rješavanje problema nalaze se u tablici 2.

Tablica pune veličine

Vrijeme

Steps 1 and 2, day 1, sample collection, preparation and preservation: up to 1 h 10 min

Steps 3–5, day 1, preparation of FACS for sterile sort: 1 d (overnight)

Steps 6–12, day 2, cell separation by flow cytometry: 1 d

Steps 13–17, day 3, single-cell lysis: 2 h

Steps 18–22, day 3, whole-genome amplification: 20 h (overnight)

Step 23, day 4, Phi29 enzyme deactivation: 10 min

Steps 24–29, day 4, phylogenetic screening: 3 h

Step 30, day 4, PCR product purification for sequencing: 1 h

Očekivani rezultati

This protocol enables recovery of amplified genomes from single cells found in a wide variety of environmental samples. The number of successfully amplified single cells can vary substantially between samples, and sample-specific preparation may be necessary for best results. In our experience, freshwater and marine samples yield the highest percentages of successfully amplified genomes (up to 40%), whereas success rates for soil samples tend to be low (<10%). Possible reasons for the high variability in genome amplification success between different sample types include resistance to lysis by some taxa and the presence of inhibitors of the MDA reaction. The successful single-cell amplification generally yields 100–200 ng/μl DNA, which can be directly used for multilocus or whole-genome sequencing without the need for re-amplification. Amplified single-cell genomes can also be used for the fabrication of DNA microarrays of select organisms of interest, which allows microarray-based monitoring of uncultivated microbes in various ecosystems and/or laboratory enrichments 32 . For sequenced single cells, the genomes recovered are, on average, 40–55% complete, ranging from a few percent to greater than 90%. This variation may be attributed to incomplete cell lysis restricting the access of the Phi29 enzyme to the DNA, partial degradation of the template DNA before MDA and/or bias of the amplification reaction. Performing combined assemblies of closely related single cells allows estimated genome recoveries approaching completeness 1, 8, 10 .

komentari

Slanjem komentara slažete se s našim Uvjetima i smjernicama zajednice. Ako ustanovite da je nešto zloupotrebno ili nije u skladu s našim uvjetima ili smjernicama, označite to kao neprimjereno.