Orai1 doprinosi uspostavljanju fenotipa otpornog na apoptozu u stanicama karcinoma prostate | stanična smrt i bolest

Orai1 doprinosi uspostavljanju fenotipa otpornog na apoptozu u stanicama karcinoma prostate | stanična smrt i bolest

Anonim

teme

  • apoptoza
  • Kalcijevi kanali
  • Mehanizmi bolesti
  • Rak prostate

Sažetak

Molekularna priroda kalcijevih (Ca2 + ) ovisnih mehanizama i ionski kanali koji imaju veliku ulogu u apoptozi stanica raka i dalje su predmet rasprave. Ovdje pokazujemo da nedavno identificirani protein Orai1 predstavlja glavnu molekularnu komponentu endogenih ulaza Ca 2+ u skladištu (SOCE) u stanicama karcinoma prostate (PCa) kod ljudi, i čini glavni izvor priliva Ca 2+ koji stanica koristi da izazove apoptozu. Smanjena regulacija Orai1, a samim tim i SOCE, štiti stanice od različitih putova koji izazivaju apoptozu, poput onih induciranih thapsigarginom (Tg), faktorom nekroze tumora α i cisplatinom / oksaliplatinom. Transfekcija funkcionalnih Orai1 mutanata, poput R91W, mutanta selektivnosti i L273S, mutantnog zavojnog zavojnice, u stanice je značajno smanjila i SOCE i brzinu Tg-inducirane apoptoze. Ovo sugerira da je za njegovo pro-apoptotičko djelovanje potrebno funkcionalno povezivanje STIM1 s Orai1, kao i selektivnosti Orai1 Ca 2+ kao kanala. Također smo pokazali da je apoptozna rezistencija androgenih neovisnih PCa stanica povezana s padom regulacije ekspresije Orai1, kao i SOCE. Orai1 spašavanje, nakon Orai1 transfekcije stanica lišenih steroidima, ponovno je uspostavio trgovinski kanal struje i vratio normalnu stopu apoptoze. Dakle, Orai1 ima ključnu ulogu u pokretanju apoptoze, bez obzira na stimuluse koji izazivaju apoptozu, i u uspostavljanju fenotipa otpornog na apoptozu u stanicama PCa.

Glavni

Rani i ključni događaji u apoptozi danas se znaju pojaviti u mitohondrijama i endoplazmatskom retikuluu (ER), gdje je oslobađanje citohroma c iz mitohondrija i kalcija (Ca 2+ ) iz ER u citosol neophodan za apoptozu kod mnogih slučajeva. 1 Bez obzira na podražaje izazvane apoptozom, smrtonosni priliv Ca2 + predstavlja nužno stanje apoptoze. Zapošljavanje tri glavna apoptotička mehanizma ovisna o Ca2 +, mitohondrijalnom, citoplazmatskom i ER, već su prikazani (za preglede, vidi Prevarskaya i sur. , 2 Pinton i sur. 3, Norberg i sur. 4 ). Međutim, do sada su izostali specifični mehanizmi pomoću kojih se kontrolira dinamika Ca2 + i pomoću kojih Ca2 + sudjeluje u apoptotskim kaskadama. Funkcija Ca 2+ u apoptozi je posebno fascinantna, posebno kada uzmemo u obzir važnost Ca 2+ u regulaciji mnoštva fizioloških procesa i uključivanju poremećene stanične Ca2 + homeostaze u patogenezu.

Rak prostate (PCa) je drugi najsmrtonosniji tumor kod muškaraca, pri čemu je glavni znak stečena otpornost na apoptozu, a ne pojačana proliferacija. 5, 6 Rana faza PCa ovisi o androgenima potrebnim za rast i preživljavanje, a terapija ablagenom androgena u ovom trenutku može biti učinkovita u izazivanju regresiranja tumora zbog indukcije masivne apoptoze. 7 Nažalost, PCa napreduje u stadij neovisan o androgenima, uzrokujući relaps raka s pojavom agresivnijih fenotipa stanica karakteriziranih povećanom otpornošću na apoptozu. Unatoč sve većem broju studija, mehanizmi koji vode do ovih fenotipa još uvijek su slabo definirani, iako je razumijevanje čimbenika koji pokreću PCa na otpornost na apoptozu presudno za razvoj novih terapija za napredne PCa.

Brojna istraživanja pokazala su da se veliki, kontinuirani priliv Ca2 + koji izaziva apoptozu u stanicama karcinoma osigurava kapacitivni unos Ca 2+ koji se nalazi u skladištu (kapacitivni unos kalcija (CCE) ili unos kalcija u trgovinu (SOCE)), posredovani kanalima koji upravljaju trgovinama (SOC). 8, 9 SOC nalaze se u plazma membrani (PM) i aktiviraju se iscrpljivanjem skladišta u ER-u. Unos Ca 2+ putem SOC-a inducira kontinuirano povećanje koncentracije citosolne Ca2 + i tako vraća sadržaj ER Ca 2+ . Stoga, kada se aktiviraju SOC, oni reguliraju i citosolnu i ER intraluminalnu koncentraciju Ca 2+ . To je jedan od razloga zašto su SOC postali veliki interesi kao potencijalni regulatori apoptoze. 8 Štoviše, prethodno smo pokazali da je inhibicija apoptoze u androgen-neovisnim PCa stanicama povezana s padom regulacije SOC zbog smanjenja broja funkcionalnih kanala. 9 Unatoč tome, unatoč znatnom napretku u razumijevanju SOC-a, molekularna priroda kanala koji su uključeni u apoptozu PCa stanica i tako pridonijeli razvoju otpornosti na apoptozu ostaje nepoznanica.

Naš je rad ovdje bio fokusiran na proučavanje molekularnih mehanizama uključenih u pojačanu otpornost na apoptozu PCa stanica u njihovom prelasku u najagresivniji hormon-vatrostalni stadij.

Rezultati

Ekspresija Orai1 i STIM1 i njihova uključenost u CCE u PCa stanicama lišenim steroida

Kompletna stanična konfiguracija tehnike patch-spona korištena je za usporedbu amplituda SOC struje ( I SOC ) u karcinomu prostate limfnih čvorova (LNCaP) i LNCaP (LNCaP-ST) stanice lišene steroida. Kao što je dokumentirano na slici 1a-c, I SOC induciran staničnom dijalizom, s osnovnom unutarćelijskom otopinom dopunjenom bilo IP3 (100 µM) ili EGTA (5 mM) (EGTA + BAPTA), bio je približno 50% niži u LNCaP -ST stanice u usporedbi s normalnim LNCaP stanicama. To je lijepo povezano s smanjenjem ekspresije Orai1 u LNCaP-ST stanicama (Slika 1d), kako je utvrđeno kvantitativnim PCR-om i western blottingom (Slika 1f). Kako se zna da Orai1 kolokalizira s ER Ca 2+ senzorom, STIM1, na ER-PM raskrsnicama i zahtijeva aktiviranje translokacije STIM1 u punktatne strukture, 10 također smo provjerili da li STIM1 ekspresija dolazi do oštećenja steroida. Za razliku od Orai1, ekspresija STIM1 ostala je nepromjenjiva bez obzira na to jesu li androgeni prisutni u kulturi ili ne (Slika 1d).

Image

Ekspresija Orai1 i STIM1 u epitelnim stanicama raka prostate lišene steroida i njihova uključenost u SOCE. ( a, b ) Reprezentativni vremenski tečajevi razvoja I SOC (mjereno na -100 mV zadržavanja potencijala) u kontrolnim LNCaP (crni krugovi) i LNCaP-ST (bijeli kvadrat) u odgovoru na dijalizu od 100 µ M IP 3 ( ) ili 5 mM EGTA ( b ). ( c ) Kvantifikacija IP 3 - i IOC-gustoće izazvane EGTA + BAPTA u kontrolnom LNCaP (crni stupovi, 2, 25 ± 0, 23 pA / pF, n = 23 i 0, 73 ± 0, 18 pA / pF, n = 31, respektivno) i u LNCaP-ST (bijeli stupovi, 0, 96 ± 0, 32 pA / pF, n = 17 i 0, 42 ± 0, 12 pA / pF, n = 21). ( d ) Kvantitativni PCR u stvarnom vremenu koji pokazuje ekspresiju Orai1 i STIM1 u kontrolnim LNCaP stanicama (CT) i LNCaP stanicama kultiviran je 3 dana u mediju lišenom steroida (3 dana). ( e ) Kvantifikacija IP 3 - i EGTA + BAPTA-inducirane I SOC gustoće u LNCaP nakon 24 sata transfekcije kontrolnom siRNA (si-Ctrl, bijeli stupovi, 1, 78 ± 0, 18 pA / pF, n = 23 i 0, 56 ± 0, 13 pA / pF, n = 22, respektivno) i anti-Orai1 siRNA (si-Ora1, crni stupovi, 0, 44 ± 0, 13 pA / pF, n = 19 i 0, 12 ± 0, 06 pA / pF, n = 22, respektivno). ( f ) Eksperiment sa Western blottingom koji pokazuje relativnu ekspresiju proteina Orai1 nakon povlačenja androgena u LNCaP stanicama. Podaci se normaliziraju u ekspresiju β- aktina. ( g ) Reprezentativni RT-PCR koji pokazuju dinamiku ekspresije Orai1 mRNA u LNCaP stanicama nakon 24, 48 ili 72 h transfekcije anti-Ora1 siRNA (si-Orai1); CT predstavlja stanice transficirane kontrolnom si-RNA; brojevi predstavljaju relativne količine ORai1 mRNA u usporedbi s β- aktinskom mRNA. ( h ) Kvantifikacija IP 3 - i EGTA + BAPTA-inducirane I SOC gustoće u LNCaP nakon 24 sata transfekcije kontrolnom siRNA (si-Ctrl, bijeli stupovi, 2, 52 ± 0, 28 pA / pF, n = 18 i 0, 70 ± 0, 05 pA / pF, n = 24, respektivno) i anti-STIM1 siRNA (si-STIM1, crni stupovi, 0, 49 ± 0, 23 pA / pF, n = 18 i 0, 11 ± 0, 03 pA / pF, n = 23, respektivno). ( i ) Reprezentativni Western blot koji pokazuje dinamiku ekspresije proteina hSTIM1 (77 kDa) u LNCaP stanicama nakon 24, 48 ili 72 h transfekcije anti-hSTIMl siRNA (si-STIM1); CT predstavlja stanice transficirane kontrolnom si-RNA; brojevi predstavljaju relativne količine proteina hSTIM1 u usporedbi s proteinom β- aktina (42 kDa). Na cijeloj slici ( * ) i ( ** ) označavaju statistički značajne razlike s P <0, 05 i P <0, 02, respektivno

Slika pune veličine

Kako bismo pokazali uključenost STIM1 i Orai1 u I SOC u LNCaP ćelijama, proveli smo niz eksperimenata knockdown-a posredovanih siRNA-om. Kao što je prikazano na slici 1e-h, 24-satni tretman siRNA protiv Orai1 (si-Orai1) značajno je smanjio Orai1 mRNA (slika 1 g) i proteina (slika 2e) u LNCaP stanicama. To je usporedno s smanjenjem IP3 - kao i EGTA + BAPTA-evociranom I SOC gustoćom za 75, 4 ± 7, 5%, odnosno 77, 8 ± 11, 3%, (respektivno, slika 1e). Slično tome, upotreba siRNA protiv STIM1 (si-STIM1) specifično je smanjila ekspresiju proteina STIM1 za približno 80% (Slika 1i) i bila u korelaciji sa smanjenjem I SOC gustoće I - 3 i EGTA + BAPTA za 80, 5 ± 8, 4% odnosno 83, 5 ± 4, 2%, respektivno (Slika 1h).

Image

Nederekspresija Orai1 štiti LNCaP stanice od apoptoze. ( a ) Apoptotičke stanice otkrivene tehnikom TUNEL. ( b ) Kvantifikacija pomoću TUNEL brzine apoptoze (Ctrl, DMSO-tretirana, sivi stupci) i apoptoze inducirane Tg (1 µM , 24 h, crni stupovi) u kontrolnim LNCaP stanicama (si-Ctrl) i LNCaP ćelijama sa si -RNA-posredovano prigušivanje Orai1 (si-Orai1). ( c ) Kvantifikacija pomoću Hoechstove tehnike brzine apoptoze (Ctrl, DMSO-tretirani, sivi stupci) i apoptoze inducirane Tg (1 μM , 24 h, crni stupovi) u kontrolnim LNCaP stanicama (si-Ctrl) i LNCaP ćelijama s prigušivanje sira-RNA Orai1 (si-Orai1). ( d ) Apoptoza inducirana TNF- a (10 ng / ml, 48 h, crni stupovi) u kontrolnim LNCaP stanicama (si-Ctrl) i LNCaP stanicama sa si-RNA posredovanim ušutjivanjem Orai1 (si-Orai1) (kvantificirano koristeći Hoechst tehnika). ( e ) Reprezentativno zapadno mrlje srušavanja si-Orai1 u stanicama LNCaP. Podaci se normaliziraju u ekspresiju β- aktina. Na cijeloj slici ( * ) i ( *** ) označavaju statistički značajne razlike s P <0, 05 i P <0, 01, respektivno

Slika pune veličine

Smanjena regulacija Orai1 daje otpornost na apoptozu LNCaP stanicama

S obzirom na glavnu ulogu Orai1 u SOCE PCa ćelija i smanjenje ekspresije Orai1 nakon povlačenja androgena, pokušali smo dalje istražiti uključenost Orai1 u apoptozu. Korišćen je klasični induktor apoptoze, thapsigargin (Tg, inhibitor pumpe SERCA koji aktivira Ca2 + -ovisnu apoptozu putem iscrpljivanja skladišta ER Ca 2+ i SOCE (npr. Prevarskaya et al. 2 )).

Koristili smo tehniku ​​TUNEL (uključujući negativnu i pozitivnu kontrolu) za mjerenje brzine apoptoze LNCaP stanica (Slika 2a). Stanice su transficirane ili si-Ora1 ili si-Ctrl i dan nakon tretiranja s 1 μM TG tijekom 24 sata. Kao što je otkriveno bojenjem TUNEL-om, 24-satni Tg tretman dovoljan je da inducira apoptozu u oko 50% LNCaP stanica (Slika 2b). Međutim, obaranje izraza Orai1 (sa si-Orai1, slika 2e) učinilo je stanice znatno otpornijima na Tg-induciranu apoptozu (4, 24 ± 1, 47 nasuprot 48, 4 ± 4, 9%; Slika 2b). Ovaj rezultat potvrđen je Hoechstovim nuklearnim bojenjem, koje je otkrilo 27% apoptoze u kontrolnim stanicama nakon 24-satnog Tg tretmana i približno 8% u si-Orai1-transficiranim stanicama (Slika 2c). Stoga se čini da je Orai1 važan igrač u apogenosti izazvanoj Tg-om, najvjerojatnije kao ključni dobavljač smrtonosnog priliva Ca 2+ kao odgovor na iscrpljivanje ER Ca 2+ uzrokovanog Tg-om i uzastopno SOCE. Da bismo potvrdili ulogu Orai1 u odgovoru na fiziološke pro-apoptotičke signale, proveli smo slične eksperimente s faktorom nekroze tumora α (TNF α ). Tretman TNF α 10 ng tokom 48 h izazvao je apoptozu u 7, 25% kontrolnih LNCaP stanica i samo u 2, 5% LNCaP ćelija srušenih Orai1 (Slika 2d).

Da bismo procijenili može li underaxpression Orai1 biti uključen u rezistenciju na apoptozu izazvanu kemoterapijom, također smo istražili apoptozu izazvanu cisplatinom i oksaliplatinom. Upotreba 20 µM cisplatina (Y) i 40 µM oksaliplatina (X), dva vrlo jaka alkilirajuća sredstva, rezultirala je stopom apoptoze koja se značajno smanjila u ONPaP-stanicama srušene u Orai1 (slika 3a). Čak je i u slučaju ovih jakih alkilirajućih sredstava si-Orai1 bio sposoban zaštititi stanice od apoptoze (Slika 3b). Nadalje, 24-satna prethodna obrada s 20 µ M cisplatinom ili 40 µM oksaliplatina pokazala je statistički značajno povećanje razine bazalnog Ca2 + u usporedbi s stanicama kontrolnim DMSO-om (podaci nisu prikazani). Ovi podaci pružaju dokaz moguće veze između alkilirajućeg agensa i Ca2 + -homeostaze. Prema tome, naši podaci sugeriraju da bi prerekspresija Orai1 mogla spriječiti apoptozu koja se pokreće bilo fiziološki ili hemoterapijom i stoga može biti važna u progresiji PCa.

Image

Uloga Orai1 u apoptozi induciranoj alkilirajućim agensima cisplatinom i oksaliplatinom. ( a ) Reprezentativne slike brzine apoptoze mjerene Hoechstovom tehnikom LNCaP stanica tretiranih s 20 µM cisplatina. Bijele strelice označavaju apoptotske jezgre. ( b ) Odgovarajući histogram koji prikazuje apoptozu LNCaP stanica tretiranih ili s 20 μM cisplatina (Y) ili s 40 μM oksaliplatina (X) u stanicama koje su prethodno bile tretirane s siCT i siOrai1. ( * ) označava statistički značajne razlike s P <0, 05 (kvantificirano korištenjem Hoechstove tehnike)

Slika pune veličine

Gubitak funkcije Orai1 štiti stanice LNCaP od apoptoze izazvane Tg-om

Da bismo dalje proučavali ulogu Orai1 u apoptozi, koristili smo dva funkcionalna Orai1 mutanta opisana kao I SOC inhibitore: 'mutant selektivnosti' R91W, koji sprečava prodiranje Ca 2+ kroz Orai1, 11 i 'zavojito namotan mutant' L273S, koji narušava interakciju između STIM1 i Orai1 i tako inhibira njegovu aktivaciju. 12 Elektrofiziološka mjerenja na LNCaP stanicama koja su prolazno transficirana s YFP-označenim R91W mutantom (YFP-Orai1-R91W) ili Y27-mutiranim mutantom L273S (YFP-Orai1-L273S) (Slika 4a) pokazala su značajno smanjenu IP 3 - i EGTA + BAPTA -poziva gustoću I SOC u usporedbi s kontrolnim LNCaP stanicama, što je u skladu s negativnim djelovanjem ovih mutanata na endogenu Orai1 funkciju.

Image

Gubitak funkcije Orai1 štiti stanice LNCaP od apoptoze izazvane thapsigarginom (Tg). ( a ) Kvantifikacija IP S - gustoća I -SAP-a izazvanih EGTA + BAPTA-om u kontrolnim LNCaP stanicama (pcDNA3, crni stupovi, 1, 8 ± 0, 15 pA / pF, n = 18 i 0, 8 ± 0, 15 pA / pF, n = 14, respektivno ) i LNCaP stanice transficirane s YFP-Orai1 L273S (tamno sivi stupci, 0, 41 ± 0, 18 pA / pF, n = 18 i 0, 34 ± 0, 12 pA / pF, n = 16, respektivno) ili YFP-Orai1 R91W (sivi stupovi, 0, 46 ± 0, 12 pA / pF, n = 18 i 0, 25 ± 0, 08 pA / pF, n = 16, respektivno). ( b ) Kvantifikacija osnovne apoptoze (pcDNA3, DMSO-tretirane, sivi stupci) i apoptoze inducirane Tg (1 μM , 24 h, crni stupovi) u kontrolnim LNCaP stanicama (Ctrl) i LNCaP stanicama transfektiranim s Orai1-L273S ili Mutanti Orai1-R91W (kvantificirani tehnikom Hoechst). ( c ) Kvantifikacija IP 3 - i EGTA + BAPTA-inducirane I SOC gustoće u kontrolnim LNCaP stanicama (Ctrl, sivi stupci, 2, 1 ± 0, 18 pA / pF, n = 19 i 19 ± 2, 8 pA / pF, n = 32, respektivno ) i LNCaP stanice kofeficirane s YFP-STIM1 i CFP-Orai1 (crni stupovi, 0, 75 ± 0, 12 pA / pF, n = 16 i 3, 1 ± 0, 75 pA / pF, n = 33, respektivno). ( d ) Kvantifikacija osnovne apoptoze (pcDNA3, DMSO-tretirane, sivi stupci) i apoptoze inducirane Tg (1 μM , 24 h, crni stupovi) u kontrolnim LNCaP stanicama (pcDNA3) i LNCaP stanicama koje su kofeficirane s YFP- STIM1 i CFP-Orai1 (kvantificirano tehnikom Hoechst). ( e ) Reprezentativne slike LNCaP stanice koje su kofeficirane s YFP-STIM1 (lijevo) i CFP-Orai1 (u sredini) i njihovim prekrivanjem (desno). Bijela traka na lijevoj ploči predstavlja 5 μ m udaljenosti. Na cijeloj slici ( * ) i ( ** ) označavaju statistički značajne razlike s P <0, 05 i P <0, 01, respektivno

Slika pune veličine

Nadalje, slično onome što je uočeno siralizacijom Orai1 posredovanom siRNA, LNCaP stanice transficirane bilo kojim od Orail mutanata pokazale su pojačanu otpornost na Tg-induciranu apoptozu. 24-satna izloženost Tg uzrokovala je 22 ± 4% apoptoze u kontrolnim LNCaP stanicama, a u stanicama koje su bile transficirane YFP-Orai1-R91W ili YFP-Orai1-L273S, stopa apoptoze smanjena je za oko 70–80% ( 6 ± 3% i 5 ± 2%, slika 4b).

Uzeto zajedno, ovi podaci pokazuju da Orai1 tvori glavni Ca2 + ulazni put potreban u Ca2 + -induciranoj apoptozi: silazna regulacija ili gubitak funkcije Orai1 aktivira otpornost na apoptozu. S druge strane, dobitak funkcije Orai1 koekspresijom oba CFP-označenog Orai1 i YFP-označenog STIM1 u LNCaP stanicama stvorio je 10-puta povećanje gustoće I SOC kao odgovor na infuziju bilo IP 3 ili EGTA + BAPTA u usporedbi s odgovarajućim kontrolama (slika 4c). Istodobno je koekspresija Orai1 i STIM1 više nego udvostručila Tg-induciranu apoptozu (50 ± 6% nasuprot 22 ± 4% stope apoptoze; Slika 4d). Kontrola CFP označene Orai1 i YFP označene STIM1 transfekcije u LNCaP stanice provedena je korištenjem konfokalne mikroskopije (Slika 4e). Stoga, pojačavanje SOCE zbog prekomjerne ekspresije Orai1 i STIM1 korelira s izraženim porastom apoptoze izazvane Tg-om.

Spasavanje Orai1 obnavlja Ca2 + -induciranu apoptozu u LNCaP-ST stanicama: moguća regulacija androgena

Pokazali smo da su smanjenje ekspresije Orai1 i gustoća I SOC odgovorni za apoptozu otpornost na stanice LNCaP-ST lišene androgena. Kako bismo dodatno pokazali ulogu Orai1 u apoptozi, spasili smo Orai1 ekspresiju u LNCaP-ST stanicama. Stanice su transficirane s CFP označenim Orai1. Prekomjerna ekspresija Orai1 u LNCaP-ST stanicama rezultirala je približno dvostrukim povećanjem I SOC gustoća IP 3 - i EGTA + BAPTA u usporedbi s odgovarajućim kontrolama (Slika 5a), što ukazuje na to da je prekomjerna ekspresija Orai1 mogla barem djelomično spasilačke SOC-ove, regulirane uskraćivanjem androgena. Ovo spašavanje u suštini je obnovilo brzinu Tg-inducirane apoptoze Orai1-prekomjernih ekspresivnih stanica (od 9 ± 4% do 16 ± 6%), približivši je vrijednosti normalnih LNCaP stanica (24 ± 7%, slika 5b).

Image

Spašavanje Orai1 u stanicama karcinoma prostate lišene androgena ukida otpornost na apoptozu. ( a ) Kvantifikacija IP 3 - i EGTA + BAPTA-inducirane I SOC gustoće u kontrolnim LNCaP-ST stanicama (pcDNA3, sivi stupci, 0, 89 ± 0, 13 pA / pF, n = 13 i 0, 33 ± 0, 11 pA / pF, n = 14 odnosno) i LNCaP-ST stanice transficirane CFP-Orai1 (crni stupovi, 2, 1 ± 0, 18 pA / pF, n = 21 i 0, 75 ± 0, 12 pA / pF, n = 23, respektivno). ( b ) Kvantifikacija osnovne apoptoze (pcDNA3, DMSO-tretirane, sivi stupci) i apoptoze izazvane Tg (1 μM , 24 h, crni stupovi) u kontrolnim LNCaP stanicama i u LNCaP-ST stanicama sa ili bez Orai1 koje su spasile transfekcija CFP-Orai1 (kvantificirana tehnikom Hoechst). ( c ) Kvantifikacija IP 3 - i EGTA + BAPTA-inducirane I SOC gustoće u LNCaP nakon 48 h transfekcije kontrolnom siRNA (si-Ctrl, bijeli stupovi, 2, 01 ± 0, 19 pA / pF, n = 19 i 0, 78 ± 0, 25 pA / pF, n = 18, respektivno) i anti-AR siRNA (si-AR, crni stupovi, 0, 81 ± 0, 14 pA / pF, n = 21 i 0, 32 ± 0, 10 pA / pF, n = 15, respektivno). ( d ) Reprezentativni RT-PCR koji pokazuju promjene u ekspresiji mRNA Orai1 i androgenog receptora (AR) u LNCaP stanicama nakon 48 h transfekcije anti-AR siRNA (si-AR) u usporedbi sa stanicama koje su transficirane kontrolnom si-RNA (CT) ; brojevi predstavljaju relativne količine Orai1 i AR mRNA u usporedbi s β- aktinskom mRNA. Na cijeloj slici ( * ) i ( ** ) označavaju statistički značajne razlike s P <0, 05 i P <0, 02, respektivno

Slika pune veličine

Da bismo utvrdili vezu između Orai1 i fenotipa neovisnog o PCa, pokušali smo ispitati može li androgeni receptor (AR) regulirati ekspresiju Orai1. Da bismo izravno pokazali da o rai1 gen ovisi o funkcionalnom AR-u, koristili smo siRNA protiv AR (si-AR). Kao što je prikazano na slici 5d, nakon 48 h siAR transfekcije, razina mRNA Orai1 smanjena je za 70% u LNCaP stanicama. Patch-clamp eksperimenti pomoću siAR-transfektiranih stanica otkrili su da su i njihov IP 3 - i EGTA + BAPTA-evocirani I SOC također smanjeni za 63% i 67% (Slika 5c). Ovaj rezultat ukazuje da AR može regulirati Orai1 ekspresiju. Za daljnje proučavanje ove potencijalne regulacije koristili smo i MatInspector 7.7.3 program (Genomatix Software GmbH, München, Njemačka) za analizu pretpostavljenih AR mjesta vezivanja na Orai1 promotoru (vidi odgovarajući dio rasprave).

Rasprava

Pojava apoptotske rezistencije u stanicama karcinoma presudan je korak za razvoj i napredovanje humane PCa na hormonski vatrostalni fenotip neovisan o androgenima. U ovom istraživanju izlažemo tri glavna otkrića koja će omogućiti razumijevanje mehanizama za stjecanje otpornosti na apoptozu od strane PCa stanica: (i) smanjenje endogenog I SOC karakteristično je za fenotip neovisan o androgenu, uzrokovan silaznom regulacijom kanala Orai1; (ii) smanjivanje ekspresije Orai1 i I SOC koriste PCA stanice za razvoj otpornosti na apoptozu ključnu za razvoj PCa i njegovo napredovanje u stadijumu vatrostalnog hormona; (iii) Orai1 je uobičajena veza između Ca 2+ i apoptoze, neovisno o prirodi podražaja koji potiču apoptozu.

Uključenost mehanizama ovisnih o Ca2 + u indukciju i regulaciju apoptoze sada je dobro utvrđena. Izmjene u kapacitetu ER i SOC aktivnosti imaju glavnu ulogu u uspostavljanju fenotipa otpornih na apoptozu otpornih na apoptozu PCa stanica. Zapravo, kao što smo pokazali u prethodnim radovima o androgen-neovisnim, apoptozi otpornim fenotipovima LNCaP PCa stanica (poput LNCaP stanica lišenih androgena, LNCaP ćelije prekomjerno eksprimiraju anti-apoptotične Bcl-2 proteine ​​i neuroendokrino-diferencirane LNCaP stanice), povećana otpornost na Tg- i TNF- α- induciranu apoptozu karakterizira (i) smanjeno bazalno Ca2 + popunjavanje ER bazena i (ii) smanjeni unos Ca 2+ u skladištu. 5, 13 Primarni okidač za apoptozu u stanicama ovisnim o androgenu je iscrpljivanje skladišta ER-a, a čak i neće biti potreban stalni priliv Ca2 + . 8 Zanimljivo je da za stanice koje nisu ovisne o androgenima, smanjivanje brzine pohrane ER po sebi nije dovoljno da izazove smrt stanica bez smrtonosnog priliva Ca 2+ iz SOCE. 2, 9, 14 Stoga su identifikacija molekularne prirode SOC-a i njihovi mehanizmi aktivacije / regulacije od velike važnosti za kontrolu apoptoze nezavisnih PCa stanica.

Tijekom posljednjih godina identificiran je i okarakteriziran novi molekularni kandidat za SOC nazvan Orai1. Orai1 posreduje CRAC-ove struje i SOCE u velikom broju ćelija i sudjeluje u širokom rasponu staničnih funkcija, uključujući proliferaciju endotelnih stanica, 15 proliferaciju limfocita, 16 aktiviranje mastocita, 13, kao i razvoj skeletnih mišića i kontraktilnu funkciju. 17 Međutim, unatoč predloženoj ključnoj ulozi SOC-a u otpornosti na apoptozu PCa stanica, sudjelovanje Orai1 u prostati specifičnom SOC-u, kao i u Ca2 + -ovisnoj apoptozi PCa stanica, nikada nije proučeno.

U ovom istraživanju pokazali smo da Orai1, ionski kanal u PM i STIM1, kao pretvarač signala iz ER, predstavljaju glavne molekularne komponente SOCE u epitelnim stanicama PCa: siRNA posredovani nokautom od bilo koje od njih snažno smanjuje I SOC u stanicama LNCaP. Međutim, kako je otkriveno da samo ekspresija Orai1 smanjuje LNCaP stanice nakon depresije androgena, pretpostavili smo da silazna regulacija I SOC, koja slijedi prijelaz PCa stanica na androgenu neovisnost i otpornost na apoptozu, barem dijelom povezana s smanjenje razine Orai1.

Terapija ablagenom androgena u adenokarcinomu prostate potiče involuciju tkiva prostate, uglavnom kroz povećanje stanične apoptoze. 18 Međutim, podskup malignih stanica nastaje kao nova populacija stanica otpornih na apoptozu. Obogaćivanje prostate takvim staničnim fenotipovima na kraju uzrokuje da se gotovo svi tumori preusmjere u agresivno rastući tip nezavisan od androgena. 18

Androgeni imaju bitnu ulogu u karcinogenezi prostate i neovisnosti androgena o većini malignih fenotipa neovisnih o androgenima, za koje se zna da nastaju uslijed gubitka AR (npr. Bonkhoff 19 ). Stoga smo pretpostavili da smanjenje ekspresije Orai1 i I SOC gustoće nakon indukcije diferencijacije LNCaP stanica povlačenjem androgena dolazi jer ekspresija gena orai1 može biti regulirana funkcionalnim AR. Naši podaci pokazali su da AR prigušivanje LNCaP stanica dovodi do dramatičnog smanjenja ekspresije Orai1, kao i u I SOC gustoći. Struktura promotora takvog klasičnog gena ovisnog o androgenu, kao što je prostata specifični za antigen, obično uključuje element koji reagira na androgen (ARE) blizu mjesta početka transkripcije i drugih ARE smještenih nekoliko kilobaznih parova uzvodno unutar pojačivača. 20 Da bismo procijenili moguću regulaciju gena orai1 pomoću AR, proučavali smo ljudsku sekvenciju promotora Orai1 . Za analizu transkripcijskih faktora korišten je genski niz koji odgovara 6200 bp uzvodno i 100 bp nizvodno od hOrai1 ATG. MatInspector 7.7.3 program korišten je za analizu pretpostavljenih AR mjesta vezivanja. 21 Orai1 promotorski slijed analiziran je na prisutnost ARE-a pomoću prostatičnog matriksa koji je povezan s faktorima transkripcije koji su eksprimirani i transkripcijski aktivni u ovom tkivu. Identificirali smo nekoliko ARE-ova: tri koja su smještena na −3700, −4105 i −4700 bp iz Orai1 ATG kodona s više od 80% sličnosti matriksa. Ovi rezultati mogu sugerirati da je Orai1 vjerojatno androgeni gen u prostati. Štoviše, s obzirom na to da Orai1 predstavlja ključnu komponentu SOC-a za prostatu, pretpostavili smo da smanjenje funkcionalnih SOC-ova tijekom napredovanja PCa u agresivnom stadiju neovisnih o androgenima proizlazi iz deregulacije funkcionalnog AR-a i na kraju deregulacije Orai1 .

Prijelaz na fenotip neovisan o androgenu ne utječe samo na Orai1 ekspresiju i SOCE, nego je još važnije, na stjecanje otpornosti prema apoptozi. Otkrili smo da je osjetljivost stanica na indukciju apo2 ovisne o Ca2 + uvijek u izravnoj korelaciji s ekspresijom Orai1 i I SOC gustoćom: što je manja gustoća struje (tj., Niska Orai1 ekspresija), veća je otpornost na apoptozu (tj. niska stopa apoptoze). Ta je korelacija postojala neovisno o eksperimentalnim alatima koji su korišteni za smanjenje ekspresije i aktivnosti Orai1: status ovisnosti o androgenu LNCaP stanica (tj. Lišavanje androgena ili prigušivanje AR), ciljana silazna regulacija Orai1 (anti-Orai1 siRNA) ili Orai1 mutanata. Zanimljivo je da su pro-apoptotički učinci Orai1 bili neovisni o podražajima koji izazivaju apoptozu. Smanjivanje regulacije Orai1 vjerojatno će umanjiti trajno povećanje citosolnih Ca2 + i zaštititi PCa stanice od apoptoze. Prvo smo koristili klasični induktor apoptoze Ca2 + ovisan, Tg. Tg je vrlo moćan alat i kao takav je čak nedavno predložen da se koristi kao "pametna bomba" za ciljanje PC-a neovisnih o androgenima. 22 Naši podaci pokazuju da je apogenost izazvana Tg-om uglavnom posredovana aktivacijom Orai1, a njihovo učinkovito uklanjanje može biti važno sredstvo za zaštitu stanice od moguće smrti. Da bismo razlikovali izravnu i neizravnu Ca2 + ovisnu apoptozu, upotrijebili smo drugi induktor apoptoze, TNF α , protuupalni citokin koji deregulira Ca2 + homeostazu inducirajući ER stres. Prema našim prethodnim opažanjima, TNF α je efikasno pro-apoptotsko sredstvo PCa epitelnih stanica. 9 U stvari, TNF α je inducirao apoptozu LNCaP stanica; međutim, čak je i ovaj izravni mehanizam ovisan o Ca2 + značajno blokiran padom Orai1, sugerirajući da unos Ca2 + posredovan od Orai1 ima veliku ulogu u apoptozi, posebno u ranoj fazi. Nadalje, koristili smo još dva snažna induktora apoptoze: cisplatin i oksaliplatin. Ta alkilirajuća sredstva reagiraju in vivo vezanjem i izazivanjem umrežavanja DNK, što u konačnici izaziva apoptozu (za pregled, vidi Gonzalez i sur. 23 ). Čini se da je oštećenje DNK uzrokovano cisplatinom dug i složen proces umiranja stanica i zbog toga što je cisplatin nespecifičan lijek koji reagira ne samo na DNK već i s proteinima, postoji mogućnost da će se pokrenuti lakši postupak, poput oštećenja citoplazme mogu se odvijati proteini. 23 Nadalje, inhibicija proteasoma inducira ER stres i također aktivira nerazvijeni protein proteina, čime izaziva apoptozu. 24 Pokazalo se da cisplatin potiče ER stres i povećava ER dilataciju, unutarćelijsku razinu Ca 2+ i staničnu smrt. 25 To na kraju povezuje cisplatin s ER stresom i povećanom razinom unutarćelijskih Ca2 +, što može uspješno inhibirati knockdown Orai1 s uzastopnim smanjivanjem I SOC i apoptozom općenito. U stvari, ranije smo pokazali da ER stres inducira unos Ca 2+, 26 i primijetili smo da 24-satna obrada cisplatinom ili oksaliplatinom povećava citoplazmu [Ca 2+ ].

Konačno, nedavna istraživanja koja se odnose na aktivaciju Orai1 pokazala su da prekomjerna ekspresija i Orai1 i STIM1 izaziva 20-puta povećanje IOC-a, što rezultira „CRST-om čudovišta“. 27 Porast SOC funkcije u LNCaP stanicama ovisnim o androgenu kao odgovor na prekomjernu ekspresiju Orai1 i STIM1 očitovao se pojavom SOC visoke amplitude, što je dovelo do značajnog povećanja Capto 2- ovisne apoptoze. Nadalje, spašavanje funkcije I SOC pomoću prekomjerne ekspresije Orai1 u stanicama LNCaP-lišenih apoptoze lišene androgena može vratiti stopu apoptoze koja je bliska brzini PCa-stanica ovisnih o androgenu. Ovaj je rezultat posebno impresivan jer je relevantan za razvoj perspektivnih terapija za napredne PC-ove neovisne o androgenima.

Stoga smo pokazali uključenost Orai1 kao glavne molekularne komponente nativnih SOC u apoptozi ovisne o Ca2 + ovisnoj od PCa stanica. Naši rezultati zaključuju da je prelazak na fenotip neovisan o PCa povezan sa gubitkom izraza Orai1 što dovodi do smanjenja regulacije SOCE, što sprečava povećanje citosolnih Ca2 + koji su dovoljni da induciraju apoptozu putem dobro poznatih mitohondrijskih i citosolnih mehanizama, Uz to, smanjeni SOCE može pridonijeti kroničnom podcjenjivanju spremnika ER Ca 2+, što predstavlja novo stanje ravnoteže za PCa stanice neovisne o androgenima, 2 dodatno povećavajući njihovu otpornost na apoptozu (Slika 6).

Image

Shematski dijagram koji sažima glavne nalaze ove studije. Progresija prema androgen-neovisnoj PCa povezana je s pojavom novih fenotipa stanica okarakteriziranih smanjenim SOCE zbog smanjene regulacije Orai1, što rezultira pojačanom otpornošću na apoptozu ovisnu o Ca2 + . Ovaj prirodni postupak koji se dogodio u in vivo tumorima može se oponašati umjetnim prigušivanjem Ora1 ekspresije ili inhibicijom funkcije Orai1 s dominantno negativnim mutantima. S druge strane, spašavanjem Orai1 u fenotipovima PCA stanica neovisnih o androgenu može se vratiti normalna stopa apoptoze ovisne o Ca2 +, osiguravajući tako sredstva za perspektivnu terapiju napredne PCa

Slika pune veličine

Naši podaci podudaraju se sa stavom da su SOCE i Orai1 važni igrači u indukciji apoptoze. Međutim, čini se da apoptoza nije jedini postupak koji je izravno povezan sa SOCE. Nedavno istraživanje pokazalo je da su Orai1 / STIM1 i SOCE također bitni za migraciju, invaziju i metastazu tumorskih stanica dojke. 28 Također je pokazano da su SOCE i STIM1 / Orai1 uključeni u migraciju, proliferaciju, 29 i napredovanje staničnog ciklusa. 30 Dakle, čini se da Orai1 / STIM1 i SOCE imaju važnu ulogu u širokom spektru ponašanja ovisnih o raku o Ca2 + i očekuje se da će imati značajan utjecaj na buduća istraživanja.

Glosar

AR

androgeni receptor

Ca 2+

kalcijum

HGK

kapacitivni unos kalcija

ER

endoplazmatski retikulum

I SOC

SOC struja

LNCaP

karcinom limfnih čvorova stanica prostate

LNCaP-ST

steroidno lišeni LNCaP

PCA

rak prostate

PM

membrana plazme

SoCs

kanali kojima se upravlja trgovinama

Soče

unos kalcija u trgovini

Tg

thapsigargin

TNF α

faktor nekroze tumora α