P38α mapk antagonizirajući jnk za kontrolu nakupljanja jetrene masti u pedijatrijskih bolesnika kod kojih dolazi do zatajenja crijeva | stanična smrt i bolest

P38α mapk antagonizirajući jnk za kontrolu nakupljanja jetrene masti u pedijatrijskih bolesnika kod kojih dolazi do zatajenja crijeva | stanična smrt i bolest

Anonim

teme

  • Stanična signalizacija
  • Crijevne bolesti
  • Bolesti jetre
  • Pedijatrijska istraživanja

Sažetak

P38 α mitogen-aktivirana protein kinaza (MAPK) povezana je s glukoneogenezom i metabolizmom lipida. Međutim, uloge i povezani mehanizmi p38 α MAPK u crijevnoj insuficijenciji (IF) povezanoj steatozi jetre ostaju slabo razumjeli. Ovdje su naši eksperimentalni dokazi sugerirali da je p38 α MAPK značajno potisnuo nakupljanje masti u jetri pacijenata s IF uglavnom kroz dva mehanizma. S jedne strane, p38 α MAPK povećao je sintezu jetrene žučne kiseline (BA) povećanjem ekspresije enzima koji ograničava brzinu 7- α- hidroksilaze (CYP7A1) i receptora aktiviranog peroksisom proliferatorom γ koaktivatora-1 α (PGC-1 α ), što je zauzvrat aktiviralo transkripciju CYP7A1. S druge strane, p38 α MAPK potaknuo β- oksidaciju masne kiseline (FA) β putem regulacije alfa (PPAR α ) aktiviranog proliferatorom proliferatora i njegovih transkripcijskih ciljnih gena karnitin palmitoiltransferaza 1A (CPT1A) i peroksisomalni acil-koenzim aoksidaza 1 (ACOxOx1), Dvostruki testovi luciferaze pokazali su da p38 α MAPK povećava transkripciju PPAR α , PGC-1 α i CYP7A1 pojačavajući aktivnosti njihovih promotora. Pored toga, in vitro i in vivo testovi naznačeni p38 α MAPK negativno regulira steatozu jetre kontrolirajući JNK aktivaciju. Zaključno, naši nalazi pokazuju da jetreni p38 α MAPK djeluje kao negativni regulator steatoze jetre u održavanju sinteze BA i FAO antagoniziranjem c-juna N-terminalne kinaze (JNK).

Glavni

Djeca s crijevnim zatajenjem (IF) koje su najviše uzrokovana poremećajima crijevne dismotilnosti ili sindromom kratkog crijeva, a za preživljavanje im je potrebna dugotrajna parenteralna prehrana. Disfunkcija crijeva i dugotrajni PN često su rezultat bolesti jetre povezanih s IF (IFALD), što je glavna komplikacija i vodeći uzrok obolijevanja i smrtnosti u pedijatrijskih bolesnika s IF. 1, 2, 3 IFALD karakterizira u početku intrahepatička kolestaza, a zatim progresivna portalna upala do steatoze i fibroze tijekom PN. Steatoza i fibroza jetre postoje kod većine bolesnika i nakon odvikavanja od PN. Iako su višestruki čimbenici rizika koji uključuju ograničenu količinu enteralnih hranjivih sastojaka, trajanje i sastav PN, različite komponente PN, prerano rođenje, mala težina rođenja, rast bakterija i masna intestinalna resekcija vezani su za IFALD, 3, 4, 5, mehanizmi koji uzrokuju i održavaju hepatička steatoza kod bolesnika s IF uglavnom nije jasna.

P38 mitogen-aktivirane proteinske kinaze (MAPK) važni su regulatori staničnog odgovora na različite izvanstanične stimuluse. Obitelj p38 MAPK uključuje četiri člana (p38 α , p38 β , p38 γ i p38 δ ), 6 u kojima je p38 α prevladavajući izoform u jetri. 7 Zabilježeno je da su miševi s jetrom specifičnim brisanjem p38 α pokazali pojačanu proliferaciju hepatocita nakon djelomične hepatektomije. 8, 9 Pokazalo se da jetrena p38 α potiskuje staničnu proliferaciju antagoniziranjem c-Jun N-terminalne kinaze (JNK) / c-Jun. 9, 10 Pored toga, pokazalo se da p38 α inhibira JNK aktivaciju da spriječi zatajenje jetre izazvano endotoksinom. 11 Aktivacija p38 primijećena je u jetri mišjih modela pretilosti i hiperlipidemije 12, 13 Pokazano je da p38 može imati regulatornu ulogu u glukoneogenezi i lipogenezi u jetri. 14, 15, 16, 17 Ovdje smo pokazali da je p38 α MAPK aktiviran u jetri pacijenata oboljelih od IF-a i povezan s razvojem steatoze. Stoga smo hipotetirali da p38 α MAPK može imati važnu ulogu u izazivanju ili održavanju steatoze u bolesnika s IF.

Sinteza žučne kiseline (BA) i β- oksidacija masne kiseline (FA) masne kiseline (FAO) u jetri dva su prevladavajuća načina homeostaze kolesterola i lipida. Kolesterol 7- α- hidroksilaza (CYP7A1) je enzim koji ograničava brzinu i koji kolesterol upućuje na put biosinteze neutralne žučne kiseline i vrlo je reguliran. Ranije je objavljeno da miševi koji prekomjerno eksprimiraju Cyp7a1 štite od hiperkolesterolemije izazvane visokom masnoćom, pretilosti i inzulinske rezistencije. 18, 19 Otkriveno je da se receptor α koaktivator-1 α (PGC-1 α ) aktivira peroksisom proliferatorom aktivira p38 α MAPK 20 i da PGC-1 α aktivira CYP7A1 ekspresiju u aktivaciji promotora CYP7A1. 21 Dakle, p38 α MAPK može aktivirati ekspresiju CYP7A1 aktiviranjem CYP7A1 promotora dijelom preko PGC-1 α . Pokazalo se da nuklearni receptor peroksisom proliferacijski aktivirani receptor α (PPAR α ) služi kao ključni regulator transkripcije puta FAO. Kao faktori transkripcije, PPAR α ima kritičnu ulogu u jetrenoj FAO uglavnom kroz regulaciju kanonskih ciljnih gena karnitin palmitoiltransferaza 1A (CPT1A) i peroksisomalna acil-koencim aoksidaza 1 (ACOX1). 22, 23 Nedavno su se pojavili dokazi da p38 α MAPK može fosforilirati i aktivirati transkripcijski faktor PPAR α , što dovodi do pojačane kogativacije posredovane ligandom transkripcijskim koaktivatorom PGC-1 α u miocitima srca. 24 Prema tome, p38 MAPK može biti uključen u FAO reguliranjem PPAR α i PGC-1 α .

S obzirom da p38 MAPK ima važnu ulogu u sintezi FAO i BA, pretpostavili smo da p38 α MAPK može biti kritični regulator u IF-povezanoj steatozi jetre. U ovom istraživanju sustavno smo istraživali ulogu p38 α MAPK u razvoju hepatičke steatoze povezane s IF i identificirali uključene ciljeve i putove, što ukazuje da jetreni p38 α MAPK predstavlja uzbudljivu farmakološku metu za liječenje IFALD-a.

Rezultati

Akumulacija masti u jetri pedijatrijskih bolesnika IF bila je povezana s trajanjem PN

U ovu studiju su bila uključena ukupno 24 pacijenta u srednjoj dobi 4, 0 mjeseci (IQR 2, 25–6) (Tablica 1). Uzroci IF-a uključuju atreziju tankog crijeva ( n = 6), nekrotizirajući enterokolitis ( n = 7), volvulus srednjeg crijeva ( n = 3), kroničnu crijevnu pseudo-opstrukciju ( n = 5) i aganglionozu hirschsprung-ove bolesti ( n = 3) ). Sveukupno, 42% (10/24) bolesnika imalo je steatozu jetre (tablica 1). U bolesnika sa steatozom pronađeni su približno jednake količine mikro- i makrovestikularne steatoze u jetrenim odjeljcima histološkim pregledom (Slika 1a). U skladu s histološkim promjenama, bolesnici sa steatozom imali su značajno povećanu razinu triglicerida jetre (TG) i fosfolipida (PL), u usporedbi s onima bez steatoze (Slike 1b i c). Kao što se očekivalo, serumski lipidi, uključujući LDL kolesterol i TG, značajno su povisili u bolesnika sa steatozom, povezanu s onom bez steatoze (Tablica 1). Pored toga, broj apoptotskih hepatocita i stupnjeva portalne fibroze bili su veći u odjeljcima jetre kod pacijenata sa steatozom u usporedbi s onima bez steatoze (dopunska slika 1). Kao što je prikazano u tablici 1, bolesnici sa steatozom bili su dulje na PN u usporedbi s onima bez steatoze (IQR 40 (27–75) u odnosu na 100 (56, 75–143), P = 0, 026, tablica 1). Korelirana analiza pokazala je da su jetreni sadržaj TG ( r = 0, 51, P = 0, 02) i PL ( r = 0, 44, P = 0, 05) u pozitivnoj korelaciji s trajanjem PN, što ukazuje da je PN glavni uzrok steatoze jetre kod bolesnika s IF (Slike 1d i e). Poznato je da je sinteza jetrenih žučnih kiselina (BA) važan put za katabolizam kolesterola u jetri. Ovdje smo pokazali da se ukupni BA u serumu i jetri, kao i bilirubin u plazmi, očito smanjio kod bolesnika s IF-om koji imaju steatozu u usporedbi s onima bez steatoze (Slike 1f i g; Tablica 1). BA sastav jetre i seruma bio je značajno izmijenjen u bolesnika sa steatozom, pokazujući značajno smanjenje udjela primarnog BA, kao što su kolna kiselina (CA) i kenoodeoksikolična kiselina (CDCA) (slika 1h; dodatna tablica 4).

Tablica pune veličine

Image

Steatoza jetre bila je u korelaciji s trajanjem parenteralne prehrane (PN) i povezana je sa smanjenjem sadržaja žučne kiseline (BA) u jetrenim tkivima bolesnika s dječjim crijevnim zatajenjem (IF). ( a ) Reprezentativne slike hematoksilina i eozina (H&E) i prijenosne elektronske mikroskopije (TEM) u jetrenim tkivima bolesnika IF-a sa ili bez steatoze. ( b, c ) Kvantifikacija razine hegmatičnih triglicerida (TG) i fosfolipida (PL) u bolesnika s IF-om. ( d, e ) Sadržaj jetrenih TG i PL pozitivno je korelirao s trajanjem PN. ( f, g ) Razina BA u jetri i u serumu smanjena je u bolesnika sa steatozom u usporedbi s onima bez steatoze. ( h ) Primarna BA kolicna kiselina (CA) i chenodeoxycholic acid (CDCA) smanjili su se u jetri bolesnika sa steatozom, u odnosu na one bez steatoze. Linija mjerila = 50 μm, 2 μm; Strelice označavaju masne kapi ( a ) sa steatozom ( n = 6–10) i bez steatoze ( n = 8–14) * P <0, 05, ** P <0, 01

Slika pune veličine

Smanjena regulacija p38 α MAPK i uregulacija JNK u steatotičkim jetrama dječjih IF bolesnika

Da bi se ispitala potencijalna uloga p38 α MAPK u jetrenoj steatozi, ekspresija i aktivacija p38 α MAPK ispitano je prvo u uzorcima jetre pedijatrijskih bolesnika IF. Kao što je prikazano na slici 2, razine fosforiliranog p38 α MAPK (Thr180 / Tyr182) značajno su smanjene u odjeljcima jetre kod pacijenata sa steatozom, u odnosu na one bez steatoze (Slike 2a i b). Suprotno tome, ovdje smo pokazali da su fosforilirane razine JNK (Thr183 / Tyr185) evidentno porasle u uzorcima jetre kod pacijenata sa steatozom u usporedbi s onima bez steatoze (Slike 2a i b). Western blot analiza na uzorcima jetre dodatno je potvrdila značajno smanjenje fosforiliranog p38 α MAPK i povišenje fosforiliranog JNK u jetri bolesnika sa steatozom, u odnosu na one bez steatoze (Slike 2c i d). U skladu s promjenama razine proteina, ekspresija p38 α MAPK mRNA je smanjena, a JNK mRNA povećana u jetri bolesnika sa steatozom, u usporedbi s onima bez steatoze (Slika 2e).

Image

Aktivacija p38 α MAPK smanjena je kod jetre bolesnika IF-a sa steatozom i povezana s ekspresijom kolesterola 7- α- hidroksilaza (CYP7A1), receptorom aktiviranim proliferatorom α koaktivatorom-1 (PGC-1 α ) i aktiviranim proliferatorom peroksisomskih peroksisoma receptor α (PPAR α ). ( a ) Reprezentativne slike p-p38, p-JNK, CYP7A1, PGC-1 α , PPAR α , CPT1A i ACOX1 obojenja u jetrenim tkivima oboljelih od IF bez steatoze ( n = 14) i sa steatozom ( n = 10), ( b ) Kvantifikacija rezultata na ploči A. ( c ) Analiza Western blot- a za nivoi proteina p-p38, p-JNK, CYP7A1, PGC-1 α , PPAR α , CPT1A i ACOX1 u jetri pacijenata oboljelih od IF s ili bez steatoze. ( d ) Kvantificiranje proteina rezultira u panelu C. ( e ) qRT-PCR analizama određuje nivo p38 α , JNK1 / 2, CYP7A1, PGC-1 α , PPAR α , CPT1A i ACOX1 mRNA kod pacijenata s IF. ( f ) Odnosi između p38 α mRNA i mRNA razine CYP7A1, PGC-1 α , PPAR α i između PGC-1 α mRNA i mRNA CYP7A1, PPAR α mRNA u jetrenim tkivima IF pacijenata s Pearsonovim korelacijama. Linija mjerila = 25 µm * P <0, 05, ** P <0, 01

Slika pune veličine

Jetreni p38 α MAPK povezan je sa sintezom BA i FAO u jetri pedijatrijskih bolesnika IF

S obzirom da su jetrena sinteza BA i FAO vitalni put za katabolizam masnih kiselina u jetri, odredili smo ekspresiju ključnih gena koji sudjeluju u tim putovima. Holesterol 7- α- hidroksilaza (CYP7A1) je ključni enzim za pretvorbu kolesterola u žučne kiseline. Peroksisomski proliferacijski receptor alfa (PPAR α ) i njegovi transkripcijski ciljni geni karnitin palmitoiltransferaza 1 A (CPT1A) i peroksisomalna acil-koenzim aoksidaza 1 (ACOX1) imaju kritičnu ulogu u jetrenoj FAO. Peroksisomski aktivator proliferatora proliferatora γ koaktivator-1 alfa (PGC-1 α ) važan je koaktivator u metabolizmu masne kiseline / žučne kiseline. Kao što je prikazano na slici 2, i IHC analiza i analiza Western blot-a pokazali su da su proteini CYP7A1, PGC-l α , PPAR α , CPT1A i ACOX1 smanjeni u jetrenim tkivima bolesnika sa steatozom u usporedbi s onima bez steatoze (Slike 2a-d ). U skladu s ovim promjenama proteina, kvantitativni PCR u stvarnom vremenu (qRT-PCR) također je pokazao da su ti geni mRNA reducirani u steatotičkim jetrima (slika 2e). Pored toga, otkrili smo značajnu pozitivnu povezanost između mRNA razina p38 α i CYP7A1 ( r = 0, 68, P = 0, 004), p38 α i PPAR α ( r = 0, 84, P <0, 0001) i p38 α i PGC- 1 α ( r = 0, 61, P = 0, 02) u svim uzorcima jetre bolesnika s IF-om (slika 2f). Korelirana analiza je također pokazala da su mRNA razine PGC-1 α bile pozitivno korelirane s razinama PPAR α mRNA ( r = 0, 56, P = 0, 03) i mRNA CYP7A1 ( r = 0, 55, P = 0, 03) (Slika 2f).

p38 α MAPK i JNK antagonistički regulira PN-inducirana steatoza jetre

PN je spasonosna terapija u bolesnika s crijevnim zatajenjem. Međutim, i drugi i oboje smo naznačili da je PN glavni pridonositelj steatoze jetre kod bolesnika s IF. Dakle, treba utvrditi važnost p38 α MAPK i JNK u steatozi jetre kod bolesnika s IF-om na temelju modela PN. Kao što je prikazano na slici 3a, analiza hematoksilinom i eozinom (H&E) i obojenom uljom crvenim O pokazala je da se masnoća u obliku mikro- i makrovestikularne steatoze akumulirala u jetri nakon šest dana neprekidne primjene PN (slika 3a). U skladu s histološkom pojavom steatoze, PN značajno inducira jetreni TG i PL (slike 3b i c). Zanimljivo je da na sadržaj TG-a i kolesterola u serumu nije utjecala primjena PN-a (Slike 3d i e; Dodatna tablica 6). Mjerenjem BA otkrili smo da je ukupni BA u jetri i serumu značajno smanjen u štakora sa hranom PN u usporedbi s kontrolama (Slike 3f i g; Dodatna tablica 7). Primarni BA, uključujući količnu kiselinu (CA), chenodeoxycholic acid (CDCA) i α , β , ω- muricholnu kiselinu ( α -, β -, ω MCA) u jetri PN-štakora znatno je smanjen, u odnosu na kontrole (Slika 3h ; Dopunska tablica 7). Da bismo procijenili ulogu hepatocita p38 α MAPK i JNK u steatozi uzrokovanoj PN, tretirali smo PN štakora s SB203580 i SP600125, koji su specifični inhibitori za p38 α MAPK i JNK. Kao što je prikazano na slici 3, jetra štakora tretiranih s SB203580 pokazala je značajno nagomilavanje masti i lipida, dok su jetre štakora tretiranih SP600125 pokazale suprotan trend u usporedbi s njihovim odgovarajućim PN štakorima, kako je analizirao H&E, Oil Red O obojeni dijelovi jetre i izravno mjerenje jetrenih TG i PL. Nadalje, liječenje SB203580 pogoršalo je PN-smanjenu sintezu BA u jetri, dok je tretman SP600125 pospješio stvaranje jetrenih BA (slike 3f – h; dopunska tablica 7).

Image

p38 α MAPK i JNK imaju suprotne učinke na PN-povezanu jetrenu steatozu. ( a ) Bojenje H&E i uljem crveno O pokazalo je da inhibicija p38 α MAPK uz tretman SB203580 povećava masnoću nakupljenu u jetri štakora hranjenih PN-om. Suprotno tome, JNK inhibicija liječenjem SP600125 suzbila je steatozu povezanu sa PN. ( b – e ) Izmjena razina triglicerida (TG) i fosfolipida (PL) u jetri i serumu iz skupina Sham, PN, PN + SB203580 i PN + SP600125. ( f, g ) Razine ukupnog BA u jetri i serumu iz skupina Sham, PN, PN + SB203580 i PN + SP600125. ( h ) Mjerenje primarne koncentracije BA, uključujući količnu kiselinu (CA), chenodeoxycholic acid (CDCA) i α , β , ω- muricholnu kiselinu ( α -, β -, ω MCA) u jetri iz skupina Sham, PN, PN + SB203580 i PN + SP600125. Linija mjerila = 25 µm * P <0, 05, ** P <0, 01

Slika pune veličine

Dalje smo pokušali istražiti potencijalne puteve koji su u osnovi učinaka p38 α MAPK i JNK na hepatičku steatozu posredovanu PN-om. Zbog sinteze BA i funkcije FAO kao važnih putova u metabolizmu masnih kiselina, stoga smo istražili učinke uključenosti p38 α MAPK i JNK na ključne gene koji reguliraju sintezu BA i FAO tijekom jetrene steatoze posredovane PN-om. Kao što je prikazano na slici 4, tretman SB203580 i SP600125 ukidaju PN-induciranu aktivaciju p38 α MAPK i JNK smanjenjem fosforiliranih razina, kao što pokazuje IHC i analiza zapadne mrlje (slike 4a-d). Nadalje, primijetili smo da liječenje SB203580 povećava aktivaciju JNK, gdje god, inhibicija JNK nije utjecala na p38 α MAPK, sugerirajući da p38 α MAPK može suzbiti aktiviranje JNK (Slike 4a-d). IHC analiza i Western blot test pokazali su da su se proteini CYP7A1, PGC-1 α , PPAR α , CPT1A i ACOX1 u jetri očito smanjili nakon SB203580 tretmana, naprotiv, tretman SP600125 imao je suprotan učinak na ovu ekspresiju proteina (Slike 4a– d). U skladu s promjenom razine proteina, ekspresija CYP7A1 mRNA, PGC-1 α mRNA, PPAR α mRNA, CPT1A mRNA i ACOX1 mRNA smanjena je nakon p38 α MAPK i povećana je u prisutnosti inhibicije JNK (Slika 4e).

Image

p38 α MAPK suprotstavljajući se JNK da suzbija ekspresiju CYP7A1, PGC-1 α , PPAR α , CPT1A i ACOX1 in vivo . ( a ) Reprezentativne slike p-p38, p-JNK, CYP7A1, PGC-1 α , PPAR α , CPT1A i ACOX1 obojenja u jetrenim tkivima Sham, PN, PN + SB203580 i PN + SP600125 skupina. ( b ) Kvantifikacija rezultata na ploči A. ( c ) Analiza Western blot- a za razine proteina p-p38, p-JNK, CYP7A1, PGC-1 α , PPAR α , CPT1A i ACOX1 u jetri Shama, PN, PN + SB203580 i PN + SP600125 grupa. ( d ) Kvantificiranje proteina rezultira na ploči C. ( e ) qRT-PCR analizama određuje nivo p38 α , JNK1 / 2, CYP7A1, PGC-1 α , PPAR α , CPT1A i ACOX1 mRNA u jetri Shama, PN, PN + SB203580 i PN + SP600125 grupa. Linija mjerila = 25 µm * P <0, 05, ** P <0, 01

Slika pune veličine

p38 α MAPK i JNK antagonistički kontrolira staničnu steatozu uzrokovanu slobodnom masnom kiselinom

Kako su zasićene masne kiseline značajne komponente parenteralne formulacije, koristili smo PA za induciranu staničnu steatozu i dalje istraživali uloge p38 α MAPK u staničnoj steatozi. Kao što je prikazano na slici 5, slike su pokazale da kapljice lipida i masti izazvane PA-om u ljudskim primarnim stanicama jetre (slika 5a), što je u skladu s prethodnom studijom. 25 Nadalje, liječenje PA značajno je povećalo razinu unutarstaničnih TG i PL (slika 5b). Dalje ćemo utvrditi je li p38 α MAPK odgovoran za steatozu koja je zabilježena kod humanih primarnih hepatocita tretiranih s PA. Pokazali smo da je liječenje SB203580 ili obustava MAPK14 učinkovito smanjilo fosforilaciju p38 α MAPK i promicalo PA-posredanu jetrenu steatozu, što je analizirano neutralnim lipidnim obojenim stanicama jetre i izravno mjerenje jetrenih TG i PL (slike 5a-d). Pored toga pokazali smo da JNK inhibitor SP600125 ili oborina JNK sprečava PA-induciranu steatozu jetre smanjujući sadržaj TG i PL i neutralne lipidne mrlje (Slike 5a-d). Budući da se p38 α MAPK aktivira MKK3, a MKK6 i JNK izravno aktiviraju MKK4 i MKK7, time oborimo MKK3 / 6 i MKK4 / 7, odnosno da bismo istražili moguće mehanizme p38 α MAPK i JNK koji su uključeni u steatozu jetre. U stvari, knockdown MKK3 / 6 i knockdown MKK4 / 7 poništio je aktiviranje p38 α MAPK i JNK. Pored toga, knockdown MKK3 / 6 povećao je PA-posredovanu steatozu, dok knockdown MKK4 / 7 smanjio je PA-steatozu (slike 5a-d). Nadalje smo pokazali da je PPAR a agonist GW7647 tretman značajno oslabio PA-posredovanu steatozu i. povećao je ekspresiju CPT1A i ACOX1 (slike 5a-d). PGC-1 α ima važnu ulogu u koordinaciji transkripcijskih programa FAO-a. 26, 27 Ovdje smo pokazali da je pad PGC-1 α povećao PA-induciranu steatozu, na što ukazuju neutralne lipidne mrlje i mjerenje TG i PL. Štoviše, analiza zapadne mrlje pokazala je da pad PGC-1 α smanjuje ekspresiju PPAR α kao i njegove ciljeve ACOX1, CPT1A i enzim CYP7A1 sintetiziranom žučnom kiselinom (Slika 5d).

Image

p38 α MAPK antagonistički JNK radi kontrole lipogeneze posredovane palmitatom (PA). ( a ) Reprezentativne slike neutralnih lipida obojenih u navedenim stanicama. ( b, c ) Kvantifikacija sadržaja jetrenog triglicerida (TG) i fosfolipida (PL) u naznačenim tretmanima. ( d ) Western blot analiza za p-p38, p-JNK, CYP7A1, PGC-1 α , PPAR α , CPT1A i ACOX1 protein u ljudskoj primarnoj jetrenoj ćeliji s naznačenim tretmanima. ( e-g ) Relativna promotorska aktivnost CYP7A1, PGC-1 α i PPAR α s naznačenim tretmanima. ( h ) Shema ilustrira potencijalni mehanizam kojim p38 α MAPK kontrolira metabolizam masnih kiselina u jetri pacijenata oboljelih od IF. Linija mjerila = 25 µm * P <0, 05, ** P <0, 01

Slika pune veličine

p38 α MAPK antagonizirajući JNK za promicanje transkripcije PGC-1 α , CYP7A1 i PPAR α

Kao što je prikazano na slici 5d, prvo smo primijetili da inhibicija p38 α MAPK značajno povećava aktivaciju JNK, što ukazuje da p38 α MAPK ima inhibicijske učinke na JNK aktivaciju u hepatocitima. Drugo, pokazali smo da p38 α MAPK aktivacija povećava ekspresiju PGC-1 α , PPAR α i CYP7A1, dok JNK. aktivacija ima suprotan učinak na ekspresiju ovih proteina (slika 5d). Da bismo razumjeli uključene molekularne mehanizme, konstruirali smo vektore luciferaze koji sadrže promotore PGC-1 α , PPAR α i CYP7A1 i odredili aktivnosti reaktora ovih promotora na p38 α MAPK i JNK aktivaciju. Kao što je prikazano na slici 5, prekomjerna ekspresija p38 α značajno je poboljšala aktivnosti luciferaze PGC-1 α , PPAR α i CYP7A1 promotora, dok je inhibicija p38 MAPK s MAPK14, MKK3 / 6 obustavom ili SB203580 tretmanom ukinula aktivnosti ovih gena promotora (Slike 5e G). Za JNK transkripcijsko reguliranje PGC-1 α , PPAR α i CYP7A1, JNK inhibicija tretmanom JNK, MKK4 / 7 ili SP600125 značajno je povećala aktivnosti promotora, što ukazuje da JNK aktivacija može imati supresivnu ulogu u transkripciji PGC-1 α , PPAR α i CYP7A1 (slike 5e – g).

Rasprava

U ovoj smo studiji prvo naznačili da pedijatrijski bolesnici s IF-om pokazuju steatozu jetre i povezuju se sa stupnjevima fibroze i apoptozom jetre. Steatoza jetre u bolesnika bila je usko povezana s trajanjem PN. Drugo, smanjivanje β- oksidacije masnih kiselina β- oksidacijom (FAO) i žučne kiseline (BA) pridonijelo je steatozi jetre kod pedijatrijskih bolesnika IF. Treće, p38 α MAPK i JNK antagonistički kontrolira sintezu FAO i BA kako bi utjecao na jetrenu masnoću kod pedijatrijskih bolesnika IF reguliranjem CYP7A1 i PPAR α .

U prethodnom istraživanju Annike i njegovih suradnika, 28 prevalencije hepatičke steatoze tijekom PN iznosio je 60% u pedijatrijskog početka IF-a. Ovdje smo pokazali da je oko 40% pedijatrijskih bolesnika s IF (10/24) imalo steatozu jetre u mnogo nižoj životnoj dobi. Izvjestila je da su mlađi pacijenti s PN skloniji kolestazi. Stoga sugerira da dob pacijenata može biti posljedica razlike u prevalenciji steatoze jetre. Slično prethodnim nalazima, i mikro i makroveskularna steatoza uočena je u jetri pacijenata sa steatozom. Steatoza jetre bila je povezana s napredovanjem portalne fibroze i jetrenih apoptoza u bolesnika s IF-om. Također je pokazalo da su bolesnici s steatozom jetre dulje bili na PN u usporedbi s onima bez steatoze, što ukazuje da je dugotrajna PN ključni faktor koji obrađuje steatozu jetre kod bolesnika s IF. Pored toga, otkrili smo da bolesnici s IF-om sa steatozom pokazuju smanjenu razinu primarnog BA u krvi i jetri, uključujući CA i CDCA, istodobno s smanjenom razinom sekundarne BA. U ljudi se primarni BA, uključujući CA i CDCA, iz kolesterola pretvarao uglavnom putem hidroksilaze kolesterola 7- α (CYP7A1). CYP7A1 je enzim koji ograničava brzinu u biosintetskom putu žučne kiseline u jetri i na taj način kontrolira homeostazu kolesterola i žučnih kiselina. Objavljeno je da prekomjerna ekspresija CYP7A1 u mišjoj jetri sprječava aterosklerozu uzrokovanu litogenom prehranom i održava homeostazu kolesterola. 18, 19 Ovdje smo naznačili da je ekspresija proteina CYP7A1 i mRNA smanjena u steatotičkim jetrima u usporedbi s onima bez steatoze. To znači da smanjenje sinteze BA može uzrokovati sakupljanje masti u bolesnika sa steatozom. Osim sinteze BA, β- oksidacija masnih kiselina (FAO) ima važnu ulogu u metabolizmu masnih kiselina razgradnjom aktiviranog FA do acetil-CoA. PPAR α je nuklearni receptor aktiviran ligandom, visoko izražen u jetri, koji kontrolira razinu ekspresije gena peroksisomalne P- oksidacije koja ograničava brzinu, uključujući ACOX1 i CPT1A. U ovom istraživanju bolesnici sa steatozom imali su niže razine PPAR α , ACOX1 i CPT1A od onih bez steatoze. Stoga smo nagađali da smanjenje FAO-a ima stimulansnu ulogu u steatozi jetre. Već se pokazalo da je PGC-1 ključni aktivator metabolizma FAO i BA. U ovom smo istraživanju pokazali da je ekspresija PGC- a α smanjena u jetri pacijenata sa steatozom u usporedbi s onima bez steatoze. Pored toga, razine PGC-1 α mRNA bile su pozitivno korelirane razine PPAR α mRNA i CYP7A1 mRNA. Stoga sugerira da PGC-1 α može regulirati sintezu FAO i BA promovirajući ekspresiju PPAR α i CYP7A1. Nedavna ispitivanja pokazala su da p38 α MAPK može potaknuti aktivaciju i ekspresiju PGC-1 α 20, 29 i blokadu p38 MAPK dovesti do hipertrigliceridemije i masne jetre. 30 Ovdje smo pokazali da je aktivacija p38 MAPK smanjena u steatotičkim jetrama i da su njegove razine mRNA bile čvrsto povezane s razinama PGC-1 α mRNA, PPAR α mRNA i CYP7A1 mRNA. Stoga smo pretpostavili da p38 može posredovati supresiju steatoze jetre kroz regulaciju sinteze FAO i BA. Suprotno tome, opazili smo da je JNK aktivacija povećana u steatotičkim jetrama, što ukazuje da može imati suprotnu ulogu u odnosu na p38 MAPK α u steatozi jetre.

Parenteralna prehrana (PN) rutinski je klinički postupak liječenja pedijatrijskih bolesnika IF-a. Drugi i mi smo pokazali da kontinuirana infuzija PN-a može izazvati steatozu jetre kod pacijenata s IF. U ovoj smo studiji uspostavili model PN štakora kako bismo istražili moguće mehanizme koji su uključeni u steatozu. Štakori s PN tijekom 7 dana pokazali su steatozu i povećavali razinu TG i PL u jetri. Kako je PN infuzija povećala razinu TG i PL u jetri? Prethodna studija da infuziju PN-a nije pratila povećana de novo lipogeneza. Zauzvrat, razine lipogenih enzima smanjile su se kod štakora s hranom PN. 31 Stoga smo postulirali PN-induciranu steatozu vjerovatno da je rezultat smanjene sinteze FAO i BA. U stvari, ključni regulatori FAO- a , uključujući PPAR α , CPT1A i ACOX1, sniženi su u štakora sa hranom PN. Smanjena ekspresija Cyp7a1 zajedno s jetrenim primarnim BA opažena je i kod štakora hranjenih s PN. Da bismo odredili uloge p38 α MAPK i JNK u steatozi povezanoj s PN, prvo smo koristili SB203580 i SP600125 da inhibiramo aktiviranje p38 MAPK i JNK. Primijećeno je da steatoza koja je liječila SB203580 agregirala steatozu kod štakora koji su bili hranjeni sa PN i povećala razinu TG i PL u jetrenim tkivima. Štoviše, štakori s SB203580 tretmanom pokazali su daljnje smanjenje sinteze BA i ekspresije PPAR a , CPT1A, ACOX1 i CYP7A1. Neočekivano je primijećeno da je liječenje SB203580 povećalo aktivaciju JNK. Inhibicija JNK sa SP600125 supresiranom steatozom PN jetre. Pokazalo se da JNK put ima inhibitornu ulogu u regulaciji razine PPAR α i CYP7A1 u primarnim hepatocitima štakora. 32 Stoga, p38 α MAPK i JNK mogu imati suprotne učinke na steatozu u smislu regulacije sinteze FAO i BA.

Budući da je lipidna emulzija PN bogata srednjim lancem zasićenim FA, dalje smo koristili PA kako bismo in vitro potaknuli lipogenezu jetre. Pokazalo je da liječenje PA može povećati broj lipidnih kapljica i sadržaj TG i PL u stanicama jetre, a ti efekti značajno su pogoršani inhibicijom p38 MAPK s liječenjem SB203580, ili oborenjem MAPK14, MKK3 / 6. Slično nalazima in vivo , p38 inhibicija MAPK potisnula je ekspresiju PPAR a , PGC-l a i CYP7A1. Nedavno je nekoliko studija pokazalo da p38 α MAPK može inhibirati JNK aktivaciju u jetri. 10, 11, 33 U skladu s ovim istraživanjima, pokazali smo da je JNK aktivacija doista povećana nakon inhibicije p38 α MAPK. Nadalje smo otkrili da JNK inhibicija može ukinuti lipogenezu jetre posredovanu s PA. Da bismo dalje definirali mehanizam p38 α MAPK u lipogenezi jetre, ispitali smo ulogu p38 α MAPK u aktivaciji PGC-l α , PPAR α i CYP7A1 promotora. Ovdje smo pokazali da su promotori PGC-1 α , PPAR α i CYP7A1 stimulirani p38 α prekomjernom ekspresijom, kao što se i očekivalo, ali su supresirani inhibicijom p38 liječenjem SB203580 ili MAPK14, MKK3 / 6 knockdownom. Budući da p38 α MAPK može fosforitirati PGC-1 α i PPAR α mjesta, 20, 24, hipotetizirali smo da p38 α MAPK poboljšava njihovu transkripciju, možda ih fosforilira. Pokazano je da se PGC-1 α aktivira p38 kinazom 20 i da PGC-1 α aktivira CYP7A1 ekspresiju. 21 Dakle, p38 MAPK može aktivirati ekspresiju CYP7A1 kroz PGC-1 α . Nasuprot učincima p38 MAPK na PGC-1 α , PPAR α i CYP7A1 promotore, JNK aktivacija značajno je suzbila aktivnosti tih promotora, što je bilo u skladu s prethodnim izvještajima.

Ukratko, sadašnje studije pokazuju da p38 α MAPK ima inhibitornu ulogu u steatozi jetre bolesnika IF-a putem povećane sinteze FAO i BA antagoniziranjem JNK. Nadalje identificiramo PGC-1 α kao cilj p38 α MAPK i zahtjev za PPAR α i CYP7A1 ekspresijom.

Materijali i metode

pacijenti

U to su istraživanje sudjelovala ukupno 24 pedijatrijska bolesnika s IF-om. Uzorci seruma i uzorci jetre dobiveni su od pacijenata koji su bili na operaciji. Svi skrbnici pacijenata dali su pismeni informirani pristanak. Karakteristike pacijenata prikazane su u tablici 1. Ovu studiju odobrilo je Etičko povjerenstvo Medicinske fakultete bolnice Xin Hua (XHEC-C-2016-063), Medicinski fakultet, Šangajsko sveučilište Jiao Tong, Šangaj, Kina. Sve su metode u ovoj studiji izvedene u skladu s odgovarajućim smjernicama.

Model PN

Tri tjedna stari mužjaci štakora Sprague-Dawley (Centre za eksperimentalne studije na Kineskoj akademiji znanosti) bili su smješteni u pojedinačnim kavezima i izloženi 12-satnom ciklusu svijetlo-tamno sedam dana. Štakori su randomizirani u lažnu skupinu ( n = 10), PN skupinu ( n = 8), PN plus SB203580 skupinu (PN + SB203580, n = 8) i PN plus SP600125 grupu (PN + SP600125, n = 6). Kateteri za PN su stavljeni u vanjske jugularne vene štakora i infuzirani s 30 ml / dnevno PN otopine tokom šest dana. Sham grupa je primila potpuno isti postupak i infuzirana fiziološkom otopinom te je hranjena standardnim chow ad libitum . Skupinama PN + SB203580 i PN + SP600125 upravljano je s SB203580, SP600125 u koncentraciji od 2 mg / kg / dan, 5 mg / kg / dan, preko katetera. Sastav TPN otopine prikazan je u Dodatnoj tablici 1 kako je ranije opisano. 34 Sve su eksperimente odobrili Odbor za skrb životinja u bolnici Xin Hua, Šangajsko sveučilište Jiao tong.

Analiza triakilglicerola, fosfolipida, neutralnog lipida i žučne kiseline

Kvantitativna procjena triglicerida ili fosfolipida određena je korištenjem EnzyChrom TM Trigliceridni setovi za analizu (BioAssay Systems, Hayward, CA, USA) i EnzyChrom TM Fosfolipidni setovi za ispitivanje (BioAssay) prema protokolima proizvođača. LipidTOX ™ neutralne lipidne mrlje (znanstveni Thermofisher, Molecular Probes, Eugene, OR, SAD) korišteni su za nadziranje sadržaja neutralnih lipida u stanicama jetre kako je opisano u protokolima proizvođača. Za analizu profila žučnih kiselina, detaljne metode opisane su u Dodatnim metodama.

Analize steatoze, određivanje fibroze i imunohistokemija

Analize steatoze upotrebljavale su hematoksilin i eozin (H&E) bojenje i ulje Red O obojenje. Steatoza je određena slijepo na osnovi udjela pogođenih hepatocita u ulju (0 = odsutan, 1≤25%, 2 = 25–50%, 3≥50%) kao što je prethodno opisano. 28 Fibroza je izvedena upotrebom masonske trihromske mrlje prema protokolu proizvođača (Genmed Scientifics, Wilmington, DE, SAD). Fibroza jetre procijenjena je stadijom metavirusne fibroze (0 = izostala, 1 = vlaknasta ekspanzija većine portalnih područja, 2 = premošćivanje žarišta od portala do portala, 3 = označeno premošćivanje i 4 = ciroza). 35 Imunohistohemija je izvedena primjenom diaminobenzidina ( DAB) kromogen kako je prethodno opisano. 36 Ukratko, tkiva s umetnutim parafinom deparafiniziraju se ksilolom i padajućim koncentracijama etanola. Za pronalazak antigena upotrijebljen je citratni pufer (pH 6, 0 ili pH 8, 0). Endogene peroksidaze su uklonjene s 0, 3% H20 i zatim je ispuhane koristeći 10% goveđi serumski albumin (BSA). Primarna antitijela primijenjena su u optimalnoj koncentraciji preko noći u vlažnoj komori (fosforilirani p38 (Cell Signaling, Danvers, MA, USA, 4511), razrjeđivanje 1: 100; fosforilirani JNK (Cell Signaling, 4668), razrjeđivanje 1: 100; CYP7A1 ( Millipore, Darmstadt, Njemačka, MABD42), razrjeđivanje 1: 100; PPAR α (Abcam, Bristol, Velika Britanija, ab8934) razrjeđivanje 1: 100; FXR (Invitrogen, Camarillo, CA, SAD, 417200), razrjeđivanje 1: 500; CPT1A ( Proteintech, Rosemont, IL, SAD, 15184-1-AP), razrjeđivanje 1: 100; ACOX1 (Proteintech, 10957-1-AP), razrjeđivanje 1: 100 PGC-1 α (Abcam, ab54481), razrjeđivanje 1: 200), Vezanje protutijela je vizualizirano pomoću tekućeg DAB hromogenog sustava supstrata (Dako, Glostrup, Danska). Za analizu IHC slika korišten je softver Image Pro Plus (Media Cybernetics) 10 polja / uzorak.

Stanična kultura i tretmani

Primarni humani hepatociti (F00995-P) dobiveni su iz Istraživačkog instituta za bolesti jetre (Šangaj, Kina). Prolazne transfekcije s malim interferirajućim RNA (siRNA) provedene su korištenjem Lipofectamine® RNAiMAX Transfekcijskog reagensa (ThermoFisher) slijedeći protokol proizvođača. GenePharma (Šangaj, Kina) sintetizirao je male interferirajuće RNA (siRNA) duplekse MAPK14, MAPK8, MAPK9, MKK3 / 6, MKK4 / 7 i PPARGC1A. Sekvence siRNA navedene su u Dodatnoj tablici 2. Nakon 28 sati transfekcije, 400 µM palmitat (PA) je 18 h liječio primarne hepatocite. SB203580 (20 µM), SP600125 (10 µM) ili GW7647 (2 µM) tretirali su stanice jetre prije 1 h dodavanjem PA i zadnji 16 h.

Kvantitativni PCR u stvarnom vremenu i western blot-u

Ukupna RNA ekstrahirana je Trizolom prema protokolu proizvodnje (Invitrogen, Foster, CA, USA). Za otkrivanje nivoa gena korišteni su SYBR-Green Universal Master Mix kit i komplet cDNA reverzne transkripcije visokog kapaciteta. Primeri su navedeni u Dodatnoj tablici 3. Za Western blot, jednake količine proteina (200 µg / jažici) su razdvojene 4-12% SDS-PAGE i prenesene na nitrocelulozne membrane. Membrane su inkubirane preko noći na 4 ° C s primarnim antitijelima. Analizirana su antitijela za GAPDH, CYP7A1, PPAR α , p-p38, p-JNK, PGC-l α , ACOX1 i CPT1A. Membrane su isprane s PBS-om (koji sadrži 0, 1% Tween) i inkubirane s hren-peroksidazom konjugiranom detektirale su komplekse antigen-antitijelo pomoću ECL Plus kemiluminescentnog reagensa (Pierce, Rockford, IL, SAD).

Analiza novinara

Da konstruiramo reporterski vektor koji nosi promotore CYP7A1, PPARA i PPARGC1A, sintetizirali smo fragmente koji sadrže promotore za humani CYP7A1, PPARA i PPARGC1A koji su prikazani dodatnim metodama, i klonirali ih u psiCHECK2 luciferarazni vektor (Promega, Madison, WI). Promotorski vektori su kotransficirani siRNA za MAPK14, MAPK8, MAPK9, MKK3 / 6, MKK4 / 7 ili negativnu kontrolu u COS-7 stanice pomoću Lipofektamina 2000. Stanični lizati su sakupljeni tri dana nakon transfekcije, a aktivnost izvještača bila je mjereno testom dvostruke luciferaze (Promega). Vrijednosti luciferaze krijesnica normalizirane su na Renilla, a prikazani su omjeri krijesnica / Renilla.

Statistička analiza

Statistički podaci prikazani su kao medijan IQR ili prosjek ± SD Za usporedbe različitih skupina, statistička značajnost određena je na temelju studentskog t- testa. Korelacije su testirane s Spearmanovom korelacijom. P- vrijednosti <0, 05 smatrane su statistički značajnim.

Dodatna informacija

Word dokumenti

  1. 1.

    Dodatna informacija

    Napomena izdavača: Springer Nature ostaje neutralan s obzirom na tvrdnje o nadležnosti u objavljenim mapama i institucionalnoj pripadnosti.

    Dodatne informacije nalaze se u ovom radu na web stranici Cell Death and Disease (//www.nature.com/cddis)