Inhibicija p38mapk: novi kombinirani pristup za smanjenje rezistentnosti neuroblastoma pod liječenjem etopozidom | stanična smrt i bolest

Inhibicija p38mapk: novi kombinirani pristup za smanjenje rezistentnosti neuroblastoma pod liječenjem etopozidom | stanična smrt i bolest

Anonim

teme

  • Terapijska otpornost na rak
  • Rak CNS-a
  • Molekularno ciljana terapija

Sažetak

Neuroblastoma (NB) je drugi najčešći čvrsti dječji tumor i karakterizira ga klinička i biološka heterogenost, a stadij IV bolesti predstavlja 50% svih slučajeva. S obzirom na ograničeni uspjeh sadašnjeg liječenja kemoterapijom, postalo je potrebno pronaći nove i učinkovite terapije. U tom se kontekstu naš pristup sastoji od identificiranja i ciljanja ključnih molekularnih putova povezanih s NB kemoresistencijom. Ovo je istraživanje provedeno na tri stanične IV stanice NB s različitim statusom pojačanja MYCN. Stanice su bile izložene standardnom sredstvu za kemoterapiju, naime etopozidu, bilo same ili u kombinaciji s određenim lijekovima, koji ciljaju unutarćelijske signalne putove. Sam etopozid izazvao je koncentraciju ovisnu o staničnoj vitalnosti i, u vrlo visokim dozama, potpuno suprostavio staničnom tumorskom tkivu i stvaranju neurosfere. Pored toga, etopozidno aktivirana p38 mitogen-aktivirana protein kinaza (MAPK), AKT i c-Jun N-terminalna kinaza. Pred tretman SB203580, p38MAPK inhibitorom, dramatično je senzibilizirao NB stanice na etopozid, snažno smanjujući dozu potrebnu za inhibiranje tumorske sposobnosti i stvaranja neurosfere. Važno je da je SB203580-etoposidno liječenje također smanjilo staničnu migraciju i invaziju utječući na ciklooksigenazu-2, međustaničnu molekulu adhezije-1, C – X – C hemokinski receptor-4 i matričnu metaloproteazu-9. Kolektivno, naši rezultati sugeriraju da inhibicija p38MAPK, u kombinaciji sa standardnom kemoterapijom, može predstavljati učinkovitu strategiju za suzbijanje otpornosti na NB u bolesnika u IV fazi.

Glavni

Neuroblastoma (NB) je drugi najčešći dječji solidni maligni tumor i karakterizira ga biološka i klinička heterogenost. 1, 2 Iako NB s niskim rizikom može spontano regresirati ili se diferencirati u benigni ganglioneuroblastom, visoki rizik NB (stadij IV) rezultira metastatskom diseminacijom 3 i samo 20% pacijenata preživi 5 godina od dijagnoze usprkos agresivnoj kemoterapiji. 4

Trenutno terapijsko raslojavanje pacijenata s NB temelji se na procjeni rizika prema kombinacijama dobi, stadijuma tumora, statusa MYCN, statusa ploidnosti DNA i histopatologije. Ova biološka heterogenost čini potrebnim identificiranje dodatnih markera za stratifikaciju i prognostiku, kao i molekularne putove koji se mogu ciljati u kombinaciji sa standardnom kemoterapijom. Međutim, djelotvornost terapije jednim lijekom ograničena je mehanizmima rezistencije koji koče njezin klinički uspjeh. Čimbenik koji pridonosi zloćudnosti NB je prisutnost subpopulacije matičnih stanica hemo- i radio-rezistentnih matičnih stanica. 5 Ove stanice slične stabljikama raka (CSC) doprinose i progresiji raka i metastazama. U NB-u su zapravo neurosfere (NBS), CSC-ovi neuronskog podrijetla, pronađeni u uzorcima primarnih tumora, kao i u uspostavljenim staničnim linijama. 6

Nadalje, dokazano je da agresivni agresivni NB rezistentni na terapiju često prekomjerno eksprimiraju i izdvajaju visoke razine čimbenika rasta i hemokine7, koji su u stanju aktivirati signalne putove rasta, pružajući prikladno mikro okruženje za razvoj tumora. 8, 9

U ovom istraživanju, analizirali smo glavne putove preživljavanja i smrti koje pokreće etoposid, uobičajeno kemoterapijski spoj, u dvije stanične linije koje su ojačane MYCN i jednoj ne pojačanoj. Konkretno, naša je studija bila snažno usredotočena na HTLA-230, jednu od NY staničnih linija s pojačanim MYCN-om, izoliranu iz aspirata koštane srži pacijenta s bolešću u stadiju IV. 10 Ove stanice su visoko tumorske stanice 11 i fenotipski su slične ostalim NB-stanicama koje su metastatizirane iz koštane srži. 12

Naši rezultati pokazuju da je etopozidna rezistencija NB stanica nastala zbog prisutnosti NBS-a i sugeriraju da SB203580, specifični p38 mitogen-aktivirani protein kinaza (MAPK), u kombinaciji s etopozidom, može biti učinkovit u sprečavanju rasta stanica, invazije, migracija, angiogeneza i stvaranje NBS, što su svi faktori odgovorni za relaps i progresiju NB.

Rezultati

Etopozid inducira smanjenje ovisnosti o životnoj dozi i visoke doze u potpunosti suprotstavljaju tumorskoj sposobnosti NB stanica i stvaranju NBS

NB stanice bile su izložene 24 h povećanim koncentracijama etopozida (0, 07-225 μM). Kao što je prikazano na slici 1a, etopozid je inducirao smanjenje ovisnosti o životnoj dozi, počevši od koncentracije od 10 µM i dosegnuvši smanjenje od 70% na 225 µM. tvore kolonije (68 kolonija od> 50 stanica). Slično tome, stanice NB izložene 24 sata 1, 25 µM etopozida, koncentracija koja oponaša in vitro dozu korištenu u kliničkoj terapiji, 13 formira kolonije (44 kolonije> 50 stanica). Suprotno tome, veće doze etopozida (od 10 do 225 μM ) u potpunosti su potisnule klonogenost ovih stanica.

Image

Etopozid smanjuje staničnu vitalnost i pri visokim koncentracijama lijeka inhibira tumorigenski potencijal HTLA-230 NB stanica i sprječava stvaranje NBS. ( a ) Stabilnost ćelije određena je MTT ispitivanjem u stanicama izloženim povećanju koncentracije etopozida (0, 07-225 µM) tijekom 24 sata. Histogrami sažimaju kvantitativne podatke o sredstvima ± SD pet neovisnih pokusa. * P <0, 01 naspram neobrađenih stanica (Ctr). ( b ) Lijeva ploča, klonogen test. HTLA-230 stanice su posijane u ploče sa šest jažica i zatim inkubirane 24 h, 1, 25, 10, 50, 100, 150 i 225 μM M etoposida, kao što je naznačeno. Nakon toga, stanice se inkubiraju u svježem mediju bez lijeka dodatnih 20 dana prije bojenja i prebrojavanja kolonija. Desna ploča, test formiranja kolonije mekih agara. HTLA-230 stanice su tretirane s 1, 25, 10, 50, 100, 150 i 225 μM etopozida, kao što je naznačeno, tijekom 24 sata, isprane i ponovo presadjene u mediju koji sadrži agar. Nakon 25 dana, kolonije su obojene i prebrojane. ( c ) Lijeva ploča, formiranje NBS. Nakon tretiranja etopozidom (1, 25-1100 µM), stanice HTLA-230 uzgajane su u uvjetima kulture bez seruma koji sadrže bFGF i EGF 1 tjedan (prvi prolaz). Izvorno uvećanje × 10. Desna ploča, graf. Pri svakom prolazu (jednom tjedno), NBS u netretiranim (Ctr) i u 1, 25 μM stanicama tretiranim etopozidom računaju se analizom pod invertiranim mikroskopom. Histogram rezimira kvantitativne podatke o sredstvima ± SD pet neovisnih pokusa. ( d ) RT-PCR analiza CD133 i Oct4 u neobrađenim i etopozidima tretiranim jednoslojnim stanicama i u NBS koje potječu iz istih monoplastičnih stanica. Signal gliceraldehid 3-fosfat dehidrogenaze (GAPDH) je unutarnja kontrola opterećenja. Rezultati su reprezentativni za tri neovisna eksperimenta s bitno sličnim rezultatima. Histogram, prijavljen na desnoj ploči, sažima kvantitativne podatke o sredstvima, normaliziranim u GAPDH ekspresiji ± SD tri neovisna pokusa. * P <0, 01 prema mono-sloju stanica

Slika pune veličine

Budući da je rast neovisan o sidrištu koristan u otkrivanju kolonija, koje nisu cijenjene klonogenskim testom, 14 stanica tretiranih 24 sata etopozidom uzgajano je u polutvrdom agaru. Slično tome, kao što je prikazano na slici 1b (desna ploča), kolonije su detektirane samo u netretiranim uzorcima (25 kolonija> 25 stanica) i u 1, 25 μM uzorcima etoposida (16 kolonija> 25 stanica).

Kad su stanice presađene iznad klonske gustoće (10 stanica po μl) i uzgajane u odgovarajućim uvjetima, opažene su mnoge NBS tijekom 1 tjedna kako u netretiranim, tako i u 1, 25 μM stanicama tretiranim etopozidom (Slika 1c). Zanimljivo je da se količina NBS povećavala s brojem prolaza (slika 1c), ali veće doze etopozida (10–100 µM) spriječile su stvaranje NBS-a već tijekom prvog tjedna (slika 1c).

Kao što je prikazano na slici 1d, neobrađene i etopozidom tretirane jednoslojne stanice izražene su CD133 i Oct4, poznatim markerima matičnih stanica. 15 Štoviše, kod NBS-a, u osmom prolazu, koji potječe iz kontrole ili iz tretiranih stanica, CD133 se povećao dvostruko, dok se Oct4 povećao za 40 i 85% u netretiranom i tretiranom NBS-u (Slika 1d).

Budući da su učinci na staničnu vitalnost i klonogenost, inducirani 100 µM etopozidom, bili usporedivi s onim koji su inducirani većim dozama, naknadne analize provedene su do 100 µM.

Nakon 24 sata liječenja stanica etopozidom (10–100 µM ) izazvalo je povećanje apoptotskih stanica ovisnih o dozi, a zabilježen je i nekrotični učinak na 50 i 100 µM etopozida.

Etopozid je stvorio povećanje ovisno o dozi u stanicama koje su tretirane diklorofluoresceinom (DCF) i koje su postale pet puta veće pri 100 µM, a γ -H2AX, marker prekida dvostrukog lanca DNA, induciran je u stanicama tretiranim etopozidom (podaci nisu prikazani),

Etopozid aktivira p38MAPK, AKT i JNK

Kao što je prikazano na slici 2a, 24-h etopozid povećao je protein kinazu C (PKC) δ i smanjio razinu PKC α . Analizom nizvodnih molekularnih puteva PKC-a, etopozid je izazvao aktivaciju p38MAPK-a ovisnog o dozi, već pri 1, 25 µM (slika 2b, lijeva ploča). Pored toga, c-Jun N-terminalna kinaza (JNK) aktivirana je za 60 i 30%, pri 1, 25 i 10 μ M, respektivno, ali nije primijećen učinak na ostale koncentracije (Slika 2b, desna ploča). Štoviše, etopozid je povećao aktivnost Akt (fosfo-Thr-Akt / Akt) za 70% u stanicama tretiranim s dozom od 1, 25 µM i za 50 i 35% (fosfo-Ser-Akt / Akt), u stanicama izloženi 50 i 100 µ M (slika 2b, donja ploča).

Image

Etopozid aktivira p38MAPK, Akt i JNK. ( a ) Razina proteina PKC δ i α u stanicama tretiranim etopozidom (1, 25–100 µM). Prikazani imunobloti reprezentativni su za tri neovisna pokusa. β -Aktin je unutarnja kontrola opterećenja. ( b ) aktiviranje p38MAPK, JNK i Akt. Histogrami rezimiraju kvantitativne podatke o sredstvima ± SD tri neovisna pokusa. * P <0, 05 i ** P <0, 01 nasuprot neobrađenim (Ctr) ćelijama. Podaci su izraženi kao omjer razina fosforiliranih proteina prema razinama nefosforiliranih, čije su vrijednosti prethodno normalizirane u odnosu na β- aktin

Slika pune veličine

SB203580 / etoposidno liječenje smanjuje vitalnost stanica, smanjuje klonogenost i inhibira stvaranje NBS

Budući da su sve signalizirane molekule već aktivirane na 1, 25 µM etopozida, učinci specifičnih enzimskih inhibitora istraženi su na ovoj koncentraciji etopozida. Kao što je prikazano na slici 3a (lijeva ploča), opaženo je smanjenje vitalnosti stanica kad su stanice tretirane etopozidom prethodno izložene LY290042 (fosfatidilinozitol 3-kinaza (inhibitor PI-3-kinaze) / Akt; smanjenje od 15%) na SB203580 (p38MAPK inhibitor; smanjenje za 17%) i SP600125 (JNK inhibitor; smanjenje od 30%). Kao što je prikazano na slici 3a (desna ploča), dok je pred-tretman PD98059 (inhibitor MEK-a) povećao sposobnost NB stanica da formiraju kolonije u prisutnosti etopozida, iznenađujuće, pre tretman s SB203580 znatno je smanjio tumorigenitet stanica tretiranih etopozidima (Smanjenje od 60%).

Image

Utjecaj SB203580 (SB) na djelovanje na životnu sposobnost, klonogenost i stvaranje NBS. ( a ) Lijeva ploča, održivost stanica. Stanice su prethodno obrađene 1 sat s različitim inhibitorima (0, 1 μM kleritrin klorid (Chele), 500 nM LY2940042 (LY), 50 μM PD98059 (PD), 10 μM SB203580 ili 4 μM SP600125 (SP)) a zatim izložena 1, 25 μM etoposida dodatnih 24 sata. Histogram rezimira kvantitativne podatke o sredstvima ± SD pet neovisnih pokusa. * P <0, 05 nasuprot ćelijama tretiranim etopozidom i ** P <0, 01 u odnosu na stanice tretirane etopozidom. Desna ploča, klonogen test. Histogram rezimira kvantitativne podatke o sredstvima ± SD pet neovisnih pokusa. ° oo P <0, 01 nasuprot netretiranim (Ctr) stanicama i ** P <0, 01 u odnosu na stanice tretirane etopozidom. ( b ) Krivulja rasta NBS-a. Pri svakom prolazu (jednom tjedno) NBS-ovi koji potječu iz prethodno obrađenih stanica etopozidom i inhibitorima računaju se analizom pod invertiranim mikroskopom. Histogram rezimira kvantitativne podatke o sredstvima ± SD tri neovisna pokusa. * P <0, 05 i ** P <0, 01 u odnosu na stanice tretirane etopozidom. ( c ) Lijeva ploča, p38MAPK aktivacija u netretiranim jednoslojnim ćelijama i u NBS. Histogram rezimira kvantitativne podatke o sredstvima ± SD tri neovisna pokusa. * P <0, 05 nasuprot netretiranim jednoslojnim stanicama i ** P <0, 01 nasuprot jednoslojnim stanicama. Podaci su izraženi kao omjer razina fosforiliranih proteina i nefosforiliranih proteina, čije su vrijednosti prethodno normalizirane s relativnom razinom gliceraldehid 3-fosfat dehidrogenaze (GAPDH). Desna ploča, imunoblotska analiza MKP-1 u neobrađenim jednoplastnim stanicama i u NBS. Histogram rezimira kvantitativne podatke o sredstvima ± SD tri nezavisna pokusa

Slika pune veličine

Liječenje inhibitorima koji su utjecali na staničnu vitalnost i tumorigenitet nije sam po sebi promijenio broj NBS (podaci nisu prikazani). Kao što je prikazano na slici 3b, etoposid nije mijenjao broj NBS-ova, čak ni u prisutnosti prethodnog tretmana s LY290042 ili SP600125 (prvi prolaz). Međutim, kada su stanice prethodno tretirane s SB203580, a zatim izložene etopozidu, nastajanje NBSs potpuno je izostalo, čak i od prvog prolaza (Slika 3b).

Pored toga, progresivni porast NBS-a uočen u netretiranim, etopozidnim i kućama u kojima je bila ovisna o prolazima ovisio je o prolazima i trajao je razdoblje od 5 tjedana (Slika 3b). Nakon 6 tjedana, vikendice nisu promijenile broj NBS-a (slika 3b).

U NBS-ima koji potječu od neobrađenih i etopozidom tretiranih stanica p38MAPK se aktivirao 18 puta u usporedbi s mono-slojevima stanica (slika 3c, lijeva ploča), dok se ekspresija MAPK fosfataze-1 (MKP-1), inhibitora p38MAPK, nije promijenila (Slika 3c, desna ploča).

SB203580 / etopozid ili SP600125 / etopozidne vikendice inhibiraju stvaranje kapilarnih struktura

Sposobnost NB stanica da formiraju mrežu epruveta nije promijenjena etopozidom ili LY290042 nakon 24 sata liječenja (Slika 4a). Umjesto toga, SB203580 i SP600125 samo su smanjili broj grana u cijevnoj mreži za 55% u odnosu na neobrađene stanice (slika 4a, graf).

Image

SB203580 (SB) ili SP600125 (SP) inhibiraju stvaranje kapilarnih struktura, a SB203580 uklanjanje smanjuje migraciju i invaziju stanica tretiranih etopozidima. ( a ) Formiranje kapilarnih struktura. Reprezentativne mikrografije cijele mreže epruveta koje nastaju neobrađene (Ctr), tretirane (samo etopozidom, LY2940042, SB203580 ili SP600125) i složene stanice (etoposid plus inhibitori). Negativna kontrola dobiva se izlaganjem stanica 10 µM sulforafanu. Izvorno uvećanje × 10. Grafikon prikazuje broj grana cijevne mreže formirane od stanica u uvjetima obrade kao što je gore opisano. Kvantitativni podaci su sredstvo ± SD triju neovisnih pokusa. ° oo P <0, 01 nasuprot netretiranim (Ctr) stanicama i ** P <0, 01 u odnosu na stanice tretirane etopozidom. ( b ) Imunoblotska analiza VEGF-a. Histogram rezimira kvantitativne podatke srednje vrijednosti ± SD za tri neovisna pokusa ° P <0, 05 nasuprot netretiranim (Ctr) stanicama i * P <0, 05 nasuprot ćelijama tretiranim etopozidima. Podaci su izraženi u omjeru količine VEGF prema količini gliceraldehid 3-fosfat dehidrogenaze (GAPDH). ( c ) Migracijski test. Migracija stanica procijenjena je ogrebotinama i Transwell testovima. U ispitivanju ogrebotina, brzina migracije kvantificirana je mjerenjem udaljenosti između granica migracijskih stanica. U ispitivanju Transwell, migracija je kvantificirana brojenjem broja stanica koje su se nakon 24 sata liječenja premjestile na donju stranu membrane. Histogram rezimira kvantitativne podatke o sredstvima ± SD tri neovisna pokusa. * P <0, 01 nasuprot stanicama tretiranim etopozidima. ( d ) Analiza invazije. Invazija stanica je kvantificirana brojenjem broja stanica koje su se nakon 24 sata liječenja premjestile na donju stranu obložene membrane. Histogram rezimira kvantitativne podatke srednje vrijednosti ± šest polja po membrani u tri neovisna pokusa. ° P <0, 01 nasuprot netretiranim (Ctr) ćelijama i * P <0, 01 nasuprot ćelijama tretiranim etopozidom

Slika pune veličine

Premda povezanost LY290042 s etopozidom nije promijenila stvaranje epruveta, uzgoj s SB203580 ili SP600125 smanjio je broj grana za 90% u odnosu na stanice tretirane etopozidom (slika 4a, graf). Nadalje, epruvete formirane od neobrađenih, etopozidnih ili LY290042 stanica koje su tretirane i koje su obrađene su postojale do 3 dana. Slični rezultati opaženi su u stanicama koje su inkubirane u mediju bez osnovnog faktora rasta fibroblasta (bFGF) i vaskularnog endotelnog faktora rasta (VEGF) (podaci nisu prikazani).

Nadalje, SB203580, sam ili u kombinaciji s etopozidom, smanjio je VEGF za 61, odnosno 69%, respektivno (Slika 4b). Samo SP600125 uspio je povećati količinu VEGF-a dvostruko, ali njegova kombinacija s etopozidom nije modificirala VEGF-izraz (Slika 4b).

SB203580 / etopozidna koža smanjuje migraciju stanica i invaziju utječući na COX-2, ICAM-1, CXCR4 ekspresiju i MMP-9 izlučivanje

Stanična migracija nije izmijenjena etopozidom (slika 4c) ili LY290042 ili SB203580 ili SP600125 davanjem sami (podaci nisu prikazani). Slično, vikendice etoposida s LY290042 ili SP600125 nisu utjecale na migraciju stanica (podaci nisu prikazani). Vrijedno je napomenuti da je prethodno liječenje SB203580 moglo smanjiti migraciju stanica za 65% i 50%, procijenjeno postupkom ogrebotina i Transwell (slika 4c).

Invazija stanica smanjena je za 33% nakon tretiranja etopozidom, a dalje je inhibirana za 51% i 80% nakon LY290042 i SB203580 vikendica, respektivno (Slika 4d). Nadalje, postupanje sa SP600125 nije promijenilo broj stanica koje napadaju membranu (Slika 4d). LY290042 ili SB203580 sami su smanjili invaziju stanica za 34% i 60%, dok je SP600125 sam po sebi bio neučinkovit (podaci nisu prikazani).

Uzimajući u obzir učinke inducirane SB203580 izvrtanjem virusa na staničnu migraciju i invaziju, istraženi su neki molekularni markeri za koje se zna da su povezani s invazivnim fenotipom.

Kao što je prikazano na slici 5a, etopozid je inducirao 60% porast razine ciklooksigenaze (COX) -2, učinak koji je u potpunosti inhibiran prethodnim tretmanom s SB203580. Štoviše, samo liječenje SB203580 nije promijenilo razinu COX-2 u netretiranim stanicama (Slika 5a).

Image

SB203580 (SB) smanjuje razinu COX-2, ICAM-1, CXCR4 i MMP9 u stanicama liječenim etopozidom. Imunoblotske analize COX-2 ( a ), ICAM-1 ( b ) i CXCR4 ( c ). Histogrami rezimiraju kvantitativne podatke o sredstvima ± SD tri neovisna pokusa. ° oo P <0, 01 nasuprot netretiranim (Ctr) stanicama; ** P <0, 01 nasuprot stanicama tretiranim etopozidima. Podaci su izraženi u omjeru količina COX-2 ili ICAM-1 ili CXCR4 prema gliceraldehid 3-fosfat dehidrogenazi (GAPDH). MMP9 aktivnost ( d ). Prikazane su reprezentativne obrnute crno-bijele slike želatinske zimografije (lijeva ploča). Histogram (desna ploča) sažima kvantitativne podatke o sredstvima ± SD tri neovisna pokusa. Podaci su izraženi kao omjer pro-MMP9 prema aktivnom MMP9. * P <0, 05 nasuprot stanicama tretiranim etopozidima

Slika pune veličine

Molekula međupredne adhezije-1 (ICAM-1) smanjena je za 25% nakon etopozida i za 65% nakon SB203580 sama u odnosu na netretirane stanice (Slika 5b). Štoviše, SB203580 preinaka smanjila je razine ICAM-1 pronađene nakon etopozida za 40% (Slika 5b).

Kao što je prikazano na slici 5c, sami etopozid ili SB203580 nisu promijenili nivo C-X-C hemokine receptora-4 (CXCR4), dok je uz pomoć kućanstva uspio smanjiti CXCR4 za 60%.

Analiza aktivnosti matrične metaloproteaze (MMP) pokazala je da MMP-9 izlučuju neobrađene stanice (Slika 5d). Pored toga, sami etopozid ili SB203580 nisu utjecali na lučenje MMP-9 (slika 5d). Međutim, etopozid / SB203580 vikendice smanjio je otpuštanje MMP-9 za 33% (Slika 5d).

SB203580 / etopozid smanjuje vitalnost stanica SK-N-SH i IMR-32, smanjuje njihovu tumorsku sposobnost i inhibira stvaranje NBS samo u stanicama IMR-32

Kao što je prikazano na slici 6a, etopozid je inducirao smanjenje ovisnog o dozi u staničnoj životinji SK-N-SH (bez pojačanja MYCN) i IMR-32 (s pojačanjem MYCN). Međutim, iako je odgovor stanične IMR-32 na liječenje etopozidima bio sličan onome HTLA-230 stanica, SK-N-SH stanice su bile osjetljivije na lijek. U stvari, 24-h etopozid, već pri 1, 25 µM , inducirao je smanjenje (od 30%) u staničnoj vitalnosti SK-N-SH (Slika 6a).

Image

Utjecaj SB203580 (SB) na djelovanje na održivost, klonogenost, ekspresiju CC133 / Oct4 i aktivaciju p38MAPK u stanicama SK-N-SH i IMR-32. ( a ) Stabilnost stanica. Stanice SK-N-SH (lijeva ploča) i IMR-32 (desna ploča) bile su izložene povećanoj koncentraciji etopozida (0, 07-225 μM) tijekom 24 sata. Histogrami sažimaju kvantitativne podatke o sredstvima ± SD pet neovisnih pokusa. * P <0, 05 i ** P <0, 01 nasuprot neobrađenim stanicama (Ctr). ( b ) Stabilnost stanica. Stanice SK-N-SH (lijeva ploča) i IMR-32 (desna ploča) tretirane su s 1, 25 μM etoposida / 10 µM SB203580 samostalno ili prethodno obrađene u trajanju od 1 sata s 10 µM SB203580, a zatim izložene 1, 25 µM etopozid dodatnih 24 h. Histogram rezimira kvantitativne podatke o sredstvima ± SD pet neovisnih pokusa. ° P <0, 05 nasuprot neliječenim stanicama (Ctr) i * P <0, 05 u odnosu na stanice tretirane etopozidom. ( c ) Klonogen test. Stanice SK-N-SH (lijeva ploča) i IMR-32 (desna ploča) posijane su u ploče sa šest jažica i zatim inkubirane sam sa 1, 25 μM etoposida / 10 µM SB203580 samostalno ili obrađene sa SB203580 + etopozidom 24 sata. Nakon toga, stanice se inkubiraju u svježem mediju bez lijeka dodatnih 20 dana prije bojenja i prebrojavanja kolonija. Histogram rezimira kvantitativne podatke o sredstvima ± SD pet neovisnih pokusa. ° oo P <0, 01 nasuprot neobrađenim stanicama (Ctr) i * P <0, 05 u odnosu na stanice tretirane etopozidom. ( d ) RT-PCR analiza CD133 i Oct4 u neobrađenim i etopozidima tretiranim jednoslojnim stanicama i u NBS koji potječu iz istih monoplastičnih stanica. Histogram rezimira kvantitativne podatke o sredstvima, normaliziranim u ekspresiji gliceraldehid 3-fosfat dehidrogenaze (GAPDH), ± SD tri neovisna pokusa. ** P <0, 01 prema mono-sloju stanica. ( e ) aktivacija p38MAPK u monoplastnim stanicama i u NBS. Histogram rezimira kvantitativne podatke o sredstvima ± SD tri nezavisna pokusa. ° P <0, 05 i ° oo P <0, 01 nasuprot neobrađenim jednoslojnim stanicama i ** P <0, 01 nasuprot tretiranim jednoslojnim stanicama etopozidima. Podaci su izraženi kao omjer razina fosforiliranih proteina i nefosforiliranih proteina, čije su vrijednosti prethodno normalizirane s relativnim razinama GAPDH

Slika pune veličine

Pored toga, kao što je prikazano na slici 6b, prethodna obrada SK-N-SH sa SB203580 uzrokovala je smanjenje vitalnosti stanica za 50% u odnosu na stanice tretirane etopozidom i osjetljive stanice IMR-32, otporne na etopozid, induciranjem smanjenje od 48% u održivosti stanica.

Kao što je prikazano na slici 6c, sam etopozid smanjio je broj kolonija za 60% i 90% u SK-N-SH i IMR-32 stanicama. Štoviše, u stanicama IMR-32, samo SB203580 utjecao je na klonogenost smanjujući klogenicitet za 35% (slika 6c). U obje stanične linije, pred tretman SB203580 nadalje je smanjio tumorigenicnost induciranu etopozidom (slika 6c).

Neobrađene stanice SK-N-SH i IMR-32 stvorile su NBS već unutar 1 tjedna, a za svaki prolaz, broj NBS bio je jednak 30% onoga koji potječe iz HTLA-230 (podaci nisu prikazani).

Sam etopozid ili SB203580 potpuno su inhibirali stvaranje NBS u SK-N-SH, ali nisu promijenili broj NBS u IMR-32 (podaci nisu prikazani). Međutim, kada su stanice IMR-32 ukrašene SB203580 i etopozidom, nastajanje NBSs potpuno je spriječeno, čak i od prvog prolaza (podaci nisu prikazani). Kao što je prikazano na slici 6d, neobrađeni i etopozidi tretirani jednoslojni SK-N-SH i IMR-32 stanice izražavaju CD133 i Oct4 matične markere. Štoviše, kod NBS-a, u osmom prolazu, CD133 je znatno smanjen (80–90%), dok se Oct4 nije promijenio (Slika 6d).

U NBS-ima, koji potječu od neobrađenih stanica SK-N-SH i IMR-32, pronađena je aktivacija p38MAPK 7- i 11-puta više u usporedbi s mono-slojevima (Slika 6e). Nadalje, u NBS-ovima iz IMR-32 stanica tretiranih etopozidom, p38MAPK se aktivirao osam puta u usporedbi s mono-slojevima koji su tretirani etopozidima (Slika 6e). Nisu primijećene promjene u MKP-1 (podaci nisu prikazani).

SB203580 plus etopozid smanjuje nivo VEGF, značajno smanjuje staničnu migraciju / invaziju i lučenje MMP-9

Stanice SK-N-SH i IMR-32 nisu mogle formirati kapilarne strukture (Slika 7a). Međutim, u tim staničnim linijama sam etopozid smanjuje VEGF za 30% u SK-N-SH i za 15% u stanicama IMR-32 (Slika 7b). Slično tome, SB203580 smanjio je VEGF za 38% u SK-N-SH i za 48% u IMR-32 stanicama (Slika 7b). Pored toga, SB203580, u kombinaciji s etopozidom, dodatno je smanjio VEGF za 20% i 50% u SK-N-SH i IMR-32 stanicama, respektivno (Slika 7b).

Image

SB203580 liječenje vidljivo smanjuje migraciju, invaziju i MMP9 aktivnost tretiranih etopozidom. ( a ) Formiranje kapilarnih struktura. Reprezentativne mikrografije cijele mreže epruveta u netretiranim (Ctr) i tretiranim stanicama. Izvorno uvećanje × 10. ( b ) Imunoblotska analiza VEGF-a. Histogram rezimira kvantitativne podatke srednje vrijednosti ± SD od tri neovisna pokusa ° oo P <0, 01 nasuprot neobrađenim (Ctr) stanicama i ** P <0, 01 nasuprot ćelijama tretiranim etopozidima. Podaci su izraženi u omjeru količine VEGF prema količini gliceraldehid 3-fosfat dehidrogenaze (GAPDH). ( c ) Migracijski test. Premještanje stanica je procijenjeno u stanicama SK-N-SH (lijeva ploča) i IMR-32 (desna ploča) pomoću Transwell testa. Histogram rezimira kvantitativne podatke o sredstvima ± SD tri neovisna pokusa. ° oo P <0, 01 nasuprot netretiranim (Ctr) stanicama i ** P <0, 01 u odnosu na stanice tretirane etopozidom. ( d ) Analiza invazije. Invazija stanica procijenjena je u stanicama SK-N-SH (lijeva ploča) i IMR-32 (desna ploča) i kvantificirana je brojenjem broja stanica, koje su nakon 24 sata liječenja prešle na donju stranu obložene membrane. Histogram rezimira kvantitativne podatke srednje vrijednosti ± šest polja po membrani u tri neovisna pokusa. ° oo P <0, 01 nasuprot netretiranim (Ctr) stanicama i ** P <0, 01 u odnosu na stanice tretirane etopozidom. ( e ) MMP9 aktivnost. Histogrami (SK-N-SH, lijeva ploča i IMR-32, desna ploča) sažimaju kvantitativne podatke o sredstvima ± SD tri neovisna pokusa. ° oo P <0.01 prema netretiranim (Ctr) stanicama i ** P <0.01 u odnosu na stanice tretirane etopozidom

Slika pune veličine

Kao što je prikazano na slici 7c, uklanjanje SB203580 s etopozidom uspjelo je smanjiti staničnu migraciju SK-N-SH za 77%, odnosno IMR-32 stanica za 40%, (respektivno, slika 7c). Pored toga, samo etopozid i SB203580 su uspjeli smanjiti staničnu migraciju SK-N-SH za 45%, odnosno 40%, (Slika 7c, lijeva ploča).

SB203580 sam ili u kombinaciji s etopozidom smanjio je za 80–83% invazivnost obje stanične linije (slika 7d).

Kao što je prikazano na slici 7e (lijeva ploča), sami etopozid ili SB203580 smanjuju izlučivanje MMP-9 iz stanica SK-N-SH za 30%, odnosno 75%. U IMR-32, etopozid nije utjecao na sekreciju MMP-9 (slika 7e, desna ploča), dok je samo SB203580 smanjio oslobađanje MMP-9 za 60% (slika 7e, desna ploča). Međutim, etopozid plus SB203580 smanjio je otpuštanje MMP-9 za 22% u SK-N-SH i za 42% u IMR-32, što se tiče samo stanica koje su tretirane etopozidom (Slika 7e).

Rasprava

U ovom radu pokazujemo da su HTLA-230 i IMR-32, obje stanice ojačane MYCN-om, visoko otporne na etopozide, jer samo doze u rasponu od 10 do 225 μM mogu smanjiti opstanak stanica. Pored toga, HTLA-230 otporniji je na IMR-32, jer 1, 25 μM etoposid, koncentracija koja in vitro oponaša dozu korištenu u kliničkoj terapiji, 13 ima manje izražen antitumorigenski učinak na HTLA-230, dok ista doza etoposida snažno smanjuje klonogenost stanica IMR-32.

Međutim, sve analizirane stanice NB mogu generirati NBS, ali samo u stanicama s pojačanjem MYCN, liječenje etopozidom ne ometa stvaranje NBS. Ovi su rezultati u skladu s radom koji pokazuje da stanice koje dobivaju NBS, a potječu iz dječjeg tumora mozga, imaju povećanu otpornost na etopozid u usporedbi sa stanicama koje dobivaju monoplaste. 16 Nadalje, pokazano je da samo stanice izvedene NB faze-IV generiraju sfere, ali da status ekspresije MYCN nije povezan s formiranjem sfere. 17

U ovom radu pokazujemo da se u NBS-ima, koji potječu iz stanica HTLA-230, povećavaju razine markera matičnosti (CD133 i Oct4), dok u NBS-ima, koji potječu iz stanica SK-N-SH i IMR-32, dolazi do izražaja CD133 je smanjen, a Oct4 se ne mijenjaju. Ovi su rezultati u skladu s izvješćem koje pokazuje da je ekspresija CD133 povećana u sferama, ali ne u svakoj analiziranoj sferi koja je izvedena iz NB uzoraka i staničnih linija. 17, 18 Vjerojatno, prekomjerna ekspresija markera stabljike doprinosi tome da se HTLA-230 učini otpornijim na etopozid, pa je u tom pogledu dokazano da je ekspresija CD133 u NB stanicama povezana s rezistencijom na doksorubicin, vinkristin i cisplatin. 19

U skladu s drugim istraživanjima, 20 nedavno smo izvijestili da etopozid uzrokuje oštećenje DNK i prekomjernu proizvodnju reaktivnih kisikovih vrsta (ROS) 21 za koje je dokazano da posreduju i u oštećenju stanica i u biološkim funkcijama. 22 U vezi s ovim, ovdje pokazujemo da etopozid inducira povećanje doza ovisnog proapoptotskog PKCδ 23 i paralelno smanjenje PKC α , antiapoptotske izoforme. 24

Međutim, s obzirom da su PKC-ove molekule uzvodno u signalnom putu ROS-a koje vode do oštećenja i apoptoze DNA, 21, 25, 26, važno je identificirati niže medijatore odgovora NB na etoposid i pokazujemo da etoposid inducira aktivaciju Akt i MAPK (tj. JNK i p38). Vrijedno je napomenuti da je zabilježeno aktiviranje MAPK-a kod preko 50% akutne mijelogene i limfocitne leukemije, te da se MAPK-i stimuliraju i kod drugih tumora, 27, 28 te stoga implicira da inhibicija MAPK-a može predstavljati važnu strategiju za suzbiti rast tumora. U tom kontekstu, naši rezultati pokazuju da se održivost HTLA-230 izložena etopozidu od 1, 25 µM smanjuje smanjenjem količine MAPK-a i Akt inhibitora.

Nadalje, prelijevanje etopozidom i SB203580, specifičnim p38MAPK inhibitorom, značajno smanjuje tumorsku sposobnost, dok PD98059, inhibitor MEK-a, povećava sposobnost formiranja kolonija. Ovi nalazi usklađeni su s studijama koje pokazuju, s jedne strane, da p38MAPK aktivacija igra ključnu ulogu u tumorskoj sposobnosti 29, a s druge strane, da PD98059 ne smanjuje toksičnost etopozida. 30

Prvi put smo pokazali da SB203580, sinergiranje s etopozidom, totalno inhibira stvaranje NBS-a. To je vjerojatno povezano s dokazima da NBS koje potječu iz stanica koje su bile pojačane MYCN imaju višu razinu aktivnosti p38MAPK u usporedbi s istim stanicama koje su uzgajane u jednoslojnom i s NBS koje potječu iz ne-amplificiranih stanica MYCN. Da bi se potvrdila temeljna uloga aktiviranja p38MAPK u stvaranju i razmnožavanju CSC-a, uloga MKP-1, endogenog inhibitora MAPK-a, 31 istraživana je s rezultatom da u stanicama NBS nisu primijećene promjene u MKP-1. Nedavno je također pokazano da aktivnost p38MAPK pojačava ekspresiju specifične podskupine ciljnih gena Oct4. 32 U tom pogledu, SB203580 plus etopozid ne dopušta stvaranje NBS-a, vjerojatno zbog njegovog djelovanja na CD133 i Oct4. Nadalje, otkriveno je da CD133-pozitivne stanice održavaju samoobnovu i svojstva slična CSC-om uključivanjem listopada 15, čiji je transkript otkriven u mnogim karcinomima čovjeka, 33 uključujući NB. 11

Valja napomenuti da naši podaci potvrđuju prethodne dokaze koji govore da je p38 kinaza uključena u proizvodnju VEGF 34 i u migraciju endotela izazvanog VEGF-om. 35 Dodatni mehanizam angiogeneze tumora predstavlja vaskularna mimikrija pri čemu stanice raka mogu steći svojstva tipična za endotelne stanice. 36 Nedavno, Pezzolo i sur. 11 su predložili da ciljanje sposobnosti HTLA-230 stanica da se transformiraju u endotelne ćelije može suzbiti doprinos endotelnih stanica dobivenih iz NB-a za relaps i kemoresistenciju tumora. 11 Koliko znamo, naš rad je prvi koji pokazuje da je sposobnost neobrađenih i liječenih stanica HTLA-230 da stječu tipična svojstva endotelnih stanica snažno smanjena inhibicijom p38MAPK i JNK. Štoviše, naši rezultati pokazuju da inhibicija p38MAPK smanjuje ekspresiju VEGF u svim NB stanicama koje se analiziraju, što sugerira da p38MAPK regulira VEGF putem mehanizma nezavisnog od MYCN. Međutim, s obzirom da samo SB203580 smanjuje VEGF u stanicama tretiranim etopozidima, dok SB203580 i SP600125 inhibiraju vaskularnu mimikriju, moguće je da p38MAPK i JNK inhibitori mogu djelovati modulacijom ostalih faktora rasta i komponenata povezanih s matricom. 37

Poznato je da je p38MAPK put koji regulira razvoj raka modulirajući ne samo angiogenezu, već i pokretljivost stanica i invaziju. U ovom kontekstu, naši rezultati pokazuju da migracija i invazivnost NB-stanica liječenih etopozidom ovisi o p38MAPK i također sugeriraju da bi inhibicija ovog puta mogla biti nova strategija u ograničavanju invazivnosti stadija IV. NB. Prema tome, pokazano je da SB203580 in vivo negativno utječe na invazivnost stanica karcinoma dojke 38, dok ispitivanja in vitro pokazuju da su migracija i invazija stanica mokraćnog mjehura i hepatokarcinoma povezane s aktivnošću p38MAPK. 39, 40

Sve veći dokazi također pokazuju da CXCR4, receptor faktora 1 koji provodi hemokin stromal (SDF1 / CXCL12), igra ključnu ulogu u NB biologiji 41 i ostvaruje promigracijski učinak aktiviranjem p38MAPK. 42 Drugi modulator invazivnosti karcinoma, čija je ekspresija povezana s aktiviranjem MAPK-a, je COX-2 (ref. 43, 44, 45) koji povećava migraciju i modulira ekspresiju ICAM-1, inducibilnog površinskog glikoproteina koji posreduje interakcije stanica-stanica ovisne o adheziji. 46 U vezi s tim, pokazali smo da u stanicama HTLA-230 etopozid značajno povećava ekspresiju COX-2 prema dokazima da hemo / radioterapije induciraju COX-2 u karcinomu. 47 S druge strane, etopozid smanjuje ICAM-1 i, iako ne utječe na opstanak stanica, značajno smanjuje invazivnost stanica.

Vjerojatno je učinak etopozida rezultat ravnoteže između povećane ekspresije COX-2, povezane s glavnim preživljavanjem i migracijskom sposobnošću, i smanjene ICAM-1 ekspresije, što dovodi do smanjenja metastatskog potencijala tumorskih stanica. Smanjenje etopozida s SB203580 smanjivanjem ekspresije oba proteina s jedne strane određuje citotoksični i antiangiogenetski učinak, a s druge strane smanjuje invazivna i metastatska svojstva. Dokaz da p38MAPK može regulirati migraciju i invazivnost ćelija NB potvrđen je inhibitornim učinkom SB203580 na aktivnost MMP-9.

Stoga ovi rezultati snažno sugeriraju da bi kombinacija etopozida sa SB203580 mogla biti učinkovita u blokiranju rasta tumora i metastaza.

Neke pretkliničke studije pokazale su da je SB203580 farmakološki aktivan in vivo na nekoliko životinjskih modela i moćan je inhibitor stvaranja citokina koji ima samo manje učinke na imunološki sustav. 48 Nekoliko p38 inhibitora testiranih za liječenje upalnih bolesti dobro se podnosi s minimalnim nuspojavama. 49 Posebno treba napomenuti da sve je više dokaza da su različiti proupalni hemokini uključeni u rast i invazivnost NB. 50

Zaključno, vjerujemo da, zbog dvostruke aktivnosti na stanicama raka i mikrookoline tumora, standardna kemoterapija u kombinaciji s p38 inhibitorima može predstavljati uspješnu terapijsku strategiju za liječenje NB-stupnja IV.

Materijali i metode

materijali

Etopozid, heleritrin klorid, LY2940042 i PD98059 dobiveni su od Calbiochem (Merck KGaA, Darmstadt, Njemačka). SB203580 and SP600125 were from Sigma Chemicals Co. (St. Louis, MO, USA). Matrigel (basement membrane matrix) was from Becton, Dickinson and Company (Franklin Lakes, NJ, USA).

Cell cultures and treatments

The MYCN-amplified human stage-IV NB cell lines, HTLA-230 and IMR-32, and the MYCN-non-amplified stage-IV SK-N-SH cells were obtained from Dr. V Pistoia (G Gaslini Institute, Genoa, Italy). The cell line was tested for mycoplasma contamination (Mycoplasma Reagent Set; Euroclone spa, Pavia, Italy). Cell morphology and proliferation were analyzed after thawing and within eight passages in culture. Cells were cultured in RPMI1640 (Euroclone) supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS; Euroclone), 2 mM glutamine (Euroclone), 1% penicillin/streptomycin (Euroclone), 1% sodium pyruvate (Sigma) and 1% of amino-acid solution (Sigma). Cells were treated for 24 h with etoposide doses ranging from 0.07 to 225 μ M, and then, in a series of experiments, were pre-treated for 1 h with various enzymatic inhibitors of different signaling pathways: 0.1 μ M chelerythrine chloride (PKC, pan inhibitor), 500 nM LY290042 (PI-3-kinase/Akt inhibitor), 50 μ M PD98059 (MAP kinase kinase, MEK, inhibitor), 10 μ M SB203580 (p38MAPK inhibitor) or 4 μ M SP600125 (JNK inhibitor).

The stock solutions of etoposide and chemical inhibitors were prepared in DMSO and pilot experiments have demonstrated that the final DMSO concentrations did not change the cell responses analyzed.

MTT test

Cell viability was determined using the dimethylthiazolyl-2-5-diphenyltetrazolium bromide (MTT; Sigma) staining. Briefly, cells were seeded into 96-well plates (Corning Incorporated, Corning, NY, USA) and then treated with etoposide and/or inhibitors for 24 h. Next, the cells were incubated with 0.5 mg/ml MTT for 3 h at 37 °C. After incubation, the supernatant was discarded, insoluble formazan precipitates were dissolved in HCl (0.1 N in isopropanol) and the absorbance at 570 nm was recorded using a microplate reader (EL-808; BioTek Instruments Inc., Winooski, VT, USA).

Clonogenic assay

NB cells (150 per well) were seeded in six-well plates (Corning) and treated with etoposide and/or inhibitors for 24 h. Subsequently, the medium was changed and the cells were maintained in drug-free medium for 20 days. Cells were then fixed with methanol and stained with crystal violet (0.5% in water with 50% methanol). Colonies containing more than 50 cells were counted and the images were acquired with a Nikon Coolpix L22 camera (Nikon Corporation, Tokyo, Japan).

Soft-agar colony formation assay

NB cells were plated into six-well plates in the presence or absence of etoposide and/or inhibitors for 24 h. Anchorage-independent growth was carried out as follows: base agar (0.5% agar, RPMI1640 and 10% FBS) was added to each well and allowed to solidify, and then an equal volume of top agar (0.35% agar, RPMI1640 and 10% FBS), containing untreated or treated cells (10 3 cells per cm 2 ), was added to each well. Plates were incubated in a 5% CO 2 humidified incubator at 37 °C for 25 days. Colonies were stained with 0.005% crystal violet. Colonies containing more than 25 cells were counted by a Leica DMIRB microscope (Leica, Wetzlar, Germany) and the images were acquired with a Nikon Coolpix L22 camera (Nikon).

Sphere culture of NB cells

After treatment, NB cells were cultured in DMEM-F12 knockout medium (Invitrogen, Paisley, UK) containing 1% penicillin/streptomycin (Euroclone), 2% B27 supplement (Invitrogen), 40 ng/ml bFGF (R&D Systems Inc., Minneapolis, MN, USA) and 20 ng/ml epidermal growth factor (EGF; Invitrogen). 51 Half of the medium was then replaced with fresh culture medium every 7 days.

The self-renewal capacity of NBSs was determined by counting the spheres in the liquid culture. Growth curves were established by mechanically dissociating the passaged tumor spheres, plating 16 × 10 4 single cells in 25 cm 2 flasks and assessing the NBSs number at every passage.

RT-PCR analiza

Total RNA was extracted using TRI ZOL reagent (Invitrogen) according to the manufacturer's instructions. Total RNA (1 μ g) was reverse-transcribed into cDNA by random hexamer primer and SuperScript II Reverse Transcriptase (Invitrogen).

Amplification of cDNA by a polymerase chain reaction was performed using AmpliTaq Polymerase (Invitrogen) and specific primers for CD133, Oct4 and GAPDH. Primer sequences were: CD133 Fw – 5′-ACATCTCAACATTAATGAGC-3′; CD133 Rv – 5′-TTTGCTTCTAGATCATATGC-3′(222 bp); Oct4 Fw – 5′-CAGTGCCCGAAACCCACAC-3′; Oct4 Rv – 5′-GGAGACCCAGCAGCCTCAAA-3′ (160 bp); GAPDH Fw–5′-AGCCACATCGCTCAGACACC-3′; and GAPDH Rv – 5′-TGAGGCTGTTGTCATACTTCTC-3′ (426 bp).

Fluorescence microscopy analysis of apoptotic and necrotic cells

For the assessment of apoptosis and necrosis, cells were analyzed as described previously. 25 Following treatment, cells were incubated with 0.5 μ g/ml fluorescein isothiocyanate (FITC)-labeled recombinant Annexin-V and 0.5 μ g/ml propidium iodide (PI; BioVision, Mountain View, CA, USA). Cells were then visualized and counted (four fields of 200–400 cells) by fluorescence microscopy using a Leica DMIRB microscope (Leica) with a dual filter set for FITC and rhodamine. Images were acquired with a Leica DCF320 camera. Cell death was evaluated as a percentage of Annexin-V (apoptotic) or PI-positive (necrotic) cells.

Detection of ROS production

Detection of ROS was performed as reported previously. 25 After treatment, cells were incubated with 20 μ M 2′, 7′-dichlorofluorescein-diacetate (DCFH-DA; Sigma) and the accumulation of DCF was analyzed at 530/485 nm. The cells were then observed and counted (four fields of 200–400 cells) by fluorescence microscopy using a Leica DMIRB microscope with a standard set of filters for fluorescein. The images were acquired with a Leica DCF320 camera.

DNA damage

Cells were seeded on chamber slides (Iwaky Seiyaku Co., Tokyo, Japan) treated with etoposide, fixed with paraformaldehyde (4% in PBS pH 7.5) and permeabilized with Triton 0.1%.

Nonspecific antibody binding was blocked by a 30 min incubation with 1% BSA and 1% gelatine. Cells were treated with anti- γ -H2AX antibody (1 : 500; Abcam, Cambridgeshire, UK) and then incubated with an FITC-conjugated anti-mouse antibody (Upstate, Lake Placid, NY, USA). Nuclei were identified by PI staining. Images were collected by fluorescence microscopy (Leica DMIRB microscope) with a dual filter set for FITC and rhodamine. The images were acquired with a Leica DCF320 camera.

Imunoblotska analiza

Immunoblots were carried out according to standard methods 25 using monoclonal mouse antibodies, anti-PKC α (Upstate, Lake Placid, NY, USA), anti-β-actin (Sigma), anti- γ -H2AX, anti-ICAM-1, anti-JNK (Abcam), anti-VEGF (Abnova, Taipei, Taiwan), and polyclonal rabbit antibodies, anti-human PKC δ , anti-Akt, anti-phospho-Akt (Thr308), anti-phospho-Akt (Ser473), anti-p38MAPK, anti-phospho-p38MAPK (Cell Signalling Technology Inc., Danvers, MA, USA), anti-phospho-JNK (Thr183) and anti-phospho-JNK (Tyr185), anti-CXCR4, anti-COX2 (Abcam), anti- MKP-1 and anti-GAPDH (Sigma).

Anti-mouse and anti-rabbit secondary antibodies were coupled with horseradish peroxidase (Amersham International, Buckinghamshire, UK). Proteins were visualized with an enzyme-linked chemiluminescence detection kit according to the manufacturer's (Amersham) instructions. Chemiluminescence was monitored by exposure to film and the signals were analyzed under non-saturating conditions with an image densitometer connected to Quantity One software (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA).

Formation of capillary-like structures

In vitro formation of capillary-like structures was carried out on untreated and treated HTLA-230 cells (2 × 10 4 cells per well), seeded into a 96-Matrigel-coated well plate, adding endothelial basal medium in the presence or absence of VEGF (15 ng/ml) and bFGF (50 ng/ml). 11 In parallel, 10 μ M sulforaphane was added as a control inhibitor of the capillary-like structure formation. Samples were analyzed over a 4–48 h period with a microscope (Leica DMIRB) using × 10 and × 20 lenses.

'Scratch' assay

HTLA-230 cells were plated into 24-well plates and cultured until confluent. A 200 μ l pipette tip was used to 'scratch' the cell monolayers and then etoposide and/or inhibitors were added for 24 h. Photomicrographs were taken using an inverted microscope (Leica DMIRB) equipped with a × 10 lens. To evaluate the cell migration rate, images were recorded at time 0 and 24 h after the treatments. The distance between the two margins of the wound was analyzed by Adobe Photoshop 7.0.1.

Analiza migracija

Cell migration assay was carried out using the Transwell system (Corning) equipped with 8- μ m pore size polycarbonate filters. Cells (5 × 10 4 ), suspended in serum-free medium, were plated into the upper chambers in the presence or absence of etoposide and/or inhibitors and allowed to migrate towards the lower chamber containing medium with 5% FBS, as a chemoattractant, for 24 h. Subsequently, the unmigrating cells in the upper compartment were removed using cotton swabs and the cells that had migrated to the lower surface of the filters were fixed with glutaraldehyde 2.5% (Sigma) and stained with Gill's hematoxylin no.1 solution (Sigma), following the manufacturer's instructions. The quantity of cells that had migrated through the filter was evaluated by microscopy analysis (Leica DMIRB microscope) using a × 10 lens.

Test invazije

In vitro invasion assay was carried out in BD BioCoat Matrigel Invasion Chambers (BD) with 8 μ m pores into 24-well plates, following the manufacturer's instructions. Cells (5 × 10 4 ), suspended in serum-free medium, were plated into the upper coated chambers in the presence or absence of etoposide and/or inhibitors and allowed to migrate towards the lower chamber containing medium with 5% FBS, as a chemoattractant, for 24 h. Subsequently, the unmigrated cells in the upper chamber were gently scraped off the filter. The quantity of cells that had migrated through the filter was evaluated by crystal violet staining and microscopy analysis (Leica DMIRB microscope) using a × 10 lens.

MMP activity

MMP activity in the conditioned media was determined by zymography, according to the methods described by Bernhard and Muschel. 52 Cells were cultured and treated in serum-free medium. Subsequently, the conditioned medium was harvested and centrifuged at 14 000 rpm × 10 min at room temperature and the resulting supernatant was concentrated by using Amicon Ultra Centrifugal Filters (Millipore Ireland Ltd, Country Cork, UK). The total protein amount was determined by the BCA method (Pierce, Thermo Scientific, Rockford, IL, USA).

Substrate polyacrylamide gel electrophoresis was carried out by a modified protocol of Heussen and Dowdle, 53 using the gelatine Ready Gel Zymogram 10% (Bio-Rad Laboratories). Briefly, samples were mixed with Laemmli buffer (in a ratio of 3 : 1), warmed at 37 °C for 30 min and subjected to gel electrophoresis. Subsequently, the gel was incubated for 48 h in developing buffer (50 mM Tris (pH 7.4), 0.2 M NaCl, 1% Triton X-100, 0.02 sodium azide and 5 mM CaCl 2 ).

After this step, the gel was stained for 1 h (0.2% Coomassie Blue, 30% ethanol and 10% acetic acid) and then de-stained in a solution containing 10% acetic acid. The gelatine digestion was analyzed with an image densitometer connected to Quantity One software (Bio-Rad Laboratories).

Analiza podataka

Results were expressed as mean±SD from at least three independent experiments. The statistical significance of parametric differences among sets of experimental data was evaluated by one-way ANOVA and Dunnett's test for multiple comparisons.

Glosar

bFGF

osnovni faktor rasta fibroblasta

COX

cyclooxygenase

eksplozivnim dizanjem utega

cancer stem-like cells

CXCR

C–X–C chemokine receptor

EGF

faktor rasta epiderme

FBS

fetalni goveđi serum

FITC

fluorescein isothiocyanate

ICAM

intercellular adhesion molecule

JNK

c-jun N-terminalna kinaza

MAPK

mitogen-aktivirana protein kinaza

MEK

MAP kinase kinase

MKP-1

MAPK phosphatase-1

MMP

matrix metalloprotease

MTT

dimethylthiazolyl-2-5-diphenyltetrazolium bromide

NB

neuroblastoma

NBSs

neurospheres

PI

propidium iodide

PI-3 kinase

phosphatidylinositol 3-kinases

PKC

protein kinaza C

ROS

reaktivne vrste kisika

SDF

stromal-derived factor

VEGF

vascular endothelial growth factor