P53 je aktivan u mišjim matičnim stanicama i mijenja transkript na način koji podsjeća na mutanta p53 | stanična smrt i bolest

P53 je aktivan u mišjim matičnim stanicama i mijenja transkript na način koji podsjeća na mutanta p53 | stanična smrt i bolest

Anonim

teme

  • Genetika raka
  • Embrionalne matične stanice
  • Proteini koji su supresori tumora

Sažetak

Budući da je otkriveno da je p53 izrazito izražen u matičnim stanicama mišjih embriona, ostalo je misterija je li p53 aktivan u ovom staničnom tipu. Pokazujemo da je značajan dio p53 lokaliziran u jezgri matičnih stanica embrionalnih embriona i da je većina tog nuklearnog p53 vezana za DNK. Prema njegovoj nuklearnoj lokalizaciji, pokazujemo da p53 mijenja transkripcijski program matičnih stanica. Unatoč tome, anti-proliferativno djelovanje p53 je ugroženo u matičnim stanicama, a ova kontrola je, dijelom dijelom, posljedica velike količine MdmX koji je prisutan u matičnim stanicama embriona i vezan na p53. Umjesto antiproliferativne aktivnosti koju p53 ima u diferenciranim stanicama, p53 kontrolira transkripciju proproliferativnih gena u embrionalnim matičnim stanicama uključujući c-myc i c-jun . Preprečena antiproliferativna aktivnost p53 i indukcija određenih protokokogena p53 u matičnim stanicama mišjih embriona mogu objasniti zašto matične stanice razmnožavaju učinkovito iako imaju visoku razinu p53.

Glavni

Protein supresor tumora p53 je faktor transkripcije koji inducira zaustavljanje proliferacije i staničnu smrt putem nuklearnih i citoplazmatskih aktivnosti. 1, 2 U uvjetima s povećanim rizikom od mutageneze, razina p53 raste i protein supresorskog tumora postaje post-translacijsko modificiran, što rezultira njegovom aktivacijom. 3 Stanice kojima nedostaje p53 obično se razmnožavaju brže od svog divljeg tipa, čak iu odsustvu stresa 4 što ukazuje da je p53 aktivan u određenoj mjeri čak i u normalnim uvjetima rasta.

p53 je često mutiran u ljudskim tumorima. 5 Intrigantno, tumor mutant p53 obično ne samo da je izgubio aktivnosti divljeg tipa, već često povećava proliferaciju stanica i invazivnost, 6, 7, što se odražava na izmijenjen transkripcijski program ovisan o p53. 6, 7

Matične stanice mišjih embriona (mESC) su pluripotentne stanice koje se obično brzo razmnožavaju i imaju veliku količinu p53. 8 Ovo postavlja pitanja kako se mESC-ovi mogu toliko brzo širiti i zašto MESC-i imaju toliko p53.

Pokazujemo da je anti-proliferativna aktivnost p53 ugrožena u mESC-ovima. U mESC-ovima, p53 je povezan s MdmX, koji kontrolira njegovo antiproliferativno djelovanje. Dio p53 s neutralnim pI ekskluzivno je prisutan u mESC-ima. U mESC-ima, p53 usmjerava transkripcijski program koji jako podsjeća na onaj mutanta p53 koji potječe od tumora.

Rezultati

p53 je primarno nuklearni u mESC-ima

p53 je anti-proliferativni protein i obiluje mESC-ovima (dopunska slika S1A), 8 staničnim tipom koji se razmnožava brže od većine diferenciranih staničnih linija (dopunska slika S1B). Ovo opažanje postavilo je pitanje kako se mESC-ovi mogu tako učinkovito širiti unatoč velikim količinama p53. Jedan argument koji se koristio u prošlosti je da bi p53 bio citoplazmatski u matičnim stanicama. Pratili smo lokalizaciju p53 imunofluorescentnim bojenjem s četiri različita antitijela protiv p53. Za kontrolu smo koristili p53 - / - mESC-ove koji su izvedeni ciljanjem gena i tako su genetski identični našim matičnim stanicama D53 pozitivnim na p53. U skladu s prethodnim studijama, 9, 10, primijetili smo obojenje u citoplazmi anti-p53 antitijelima Pab421 i Pab246. Iznenađujuće, ova antitijela daju signale sličnog intenziteta i u citoplazmi p53 - / - mESC (slika 1a, dopunska slika S2A). Tek kad smo koristili anti-p53 antitijelo 1C12, nismo vidjeli nikakvu mrlju u stanicama p53 - / - . Kad smo nanijeli antitijelo protiv p53 CM5, samo smo povremeno imali vrlo slabu mrlju. Važno je da je s antitijelima 1C12 i CM5 većina bojenja bila u jezgri, iako nisu sve p53-pozitivne stanice obojene istim intenzitetom (Slika 1a, Dopunska slika S2A). Da bismo potvrdili ove rezultate, frakcionirali smo mESC u citoplazmatski i nuklearni lizat. Pored toga, uključili smo mESC-ove koji su bili diferencirani s retinoičnom kiselinom. Da bismo kontrolirali učinkovitost stanične frakcije, pratili smo obilje nuklearnog proteina Histon H3 i citoplazmatskog proteina GAPDH. Pripremili smo četiri identične membrane na koje smo postavili jednak broj stanica različitih tipova stanica. U skladu s imunofluorescentnom analizom, antitijela Pab246 i Pab421 pokazala su jak signal u citoplazmi matičnih stanica pozitivnih na p53 (Slika 1b). Taj signal, međutim, bio je prisutan i u p53-negativnim stanicama (slika 1a). Samo antitijela CM5 i 1C12 prepoznaju protein molekulske težine od oko 53 kD koji je bio odsutan u p53 - / - mESC. Većina ovog proteina nalazi se u jezgri, što potvrđuje rezultat bojenja imunofluorescencijom. Unatoč tome, bilo je i nešto p53 u citoplazmi (slika 1b), što pokazuje da je p53 prisutan i u citoplazmi i u jezgri mESC-a. U diferenciranim stanicama otkrili smo samo p53 u jezgri; najvjerojatnije zbog puno niže količine p53 u ovom staničnom tipu i slabe osjetljivosti testa (Slika 1b).

Image

Većina p53 je lokalizirana u jezgri u matičnim stanicama mišjih embriona. ( a ) matične stanice D3 embriona i njihov derivat s manjkom p53 (p53 - / - ) uzgajane su na dovodnim stanicama na pokrovnim slapicama. Stanice su fiksirane, obojene naznačenim antitijelima (prikazane zelenom bojom) i suprotstavljene nuklearnim markerom Draq5 (prikazano plavom bojom). Bojenje bez primarnih antitijela (IgG) izvršeno je radi kontrole. Slike su analizirane na mikroskopu Leica LSM. ( b ) D3 stanice, njihov p53-deficitarni derivat (p53 - / - ) i D3 stanice koje su diferencirane s retinoičnom kiselinom (D3 razl.), frakcionirane su u citoplazmatski i nuklearni lizat. Lizati koji odgovaraju jednakoj količini stanica naneseni su na SDS-PAGE gelove i izbrisani. Pripremljene su četiri identične membrane i svaka od njih je inkubirana s različitim antitijelom protiv p53 (1C12, CM5, Pab246, Pab421). Obilje GAPDH i Histone H3 korišteno je za praćenje uspješne frakcije. ( c ) Stanice su 24 sata bile gladirane serumom prije tretmana 2 μM leptomicina B (LMB) tijekom 16 sati. Alikvot stanica je liziran i korišten je za praćenje obilja p53 u cijelom staničnom ekstraktu (WCL). Preostale stanice su frakcionirane u citoplazmatski i nuklearni lizat. Četrdeset mikrograma različitih frakcija naneseno je na SDS-PAGE gel i izbrisano. Membrane su hibridizirane s anti-p53 antitijelom 1C12 i s anti-Nanog i anti-PARC antitijelima kao nuklearnim markerima. Bojenje s tintom izvedeno je radi praćenja jednakog nanošenja gela. ( d ) D3 stanice su frakcionirane u citoplazmatski i nuklearni dio. Jedan dio ovih frakcija je inkubiran 1 sat s 200 jedinica / ml DNAseI ili obrađen. Nakon inkubacije, nuklearna frakcija je očišćena centrifugiranjem. Obilje p53 u različitim frakcijama praćeno je Western blottingom. PARC i Histone H3 korišteni su kao nuklearni markeri, a GAPDH kao citoplazmatski marker

Slika pune veličine

Kako bismo dodatno poduprli nalaz da je p53 nuklearni u mESC-ovima, obrađivali smo stanice leptomicinom B, lijekom koji inhibira izvoz proteina ovisnih o CRM1 i dovodi do nuklearne akumulacije p53. 11, 12 Ako bi p53 bio citoplazmatski u mESC-u, ovaj lijek trebao bi spriječiti nuklearnu akumulaciju p53. Međutim, liječenje mESC-a leptomicinom B rezultiralo je snažnom akumulacijom p53 i u jezgri i u citoplazmi mESC-a (Slika 1c, Dopunska slika S2B).

Faktori transkripcije obično imaju visoki afinitet za DNK. Dakle, ako bi p53 bio citoplazmatski, on se ne bi trebao povezati s DNK. Da bismo testirali ovo obrazloženje, frakcionirali smo stanice u citoplazmu i jezgre, lizirali jezgre, podijelili lizate na dva dijela i dodali DNAseI u jedan dio. Zatim smo oba dijela inkubirali 1 sat na ledu. Peletirali smo netopive sastavnice jezgara i pratili obilje p53 u svim frakcijama zapadnim upijanjem. Opet je većina p53 bila nuklearna. Bez tretiranja DNK, p53 je bio isključivo u netopljivom nuklearnom materijalu (slika 1d), dok je tretmanom DNAseI pustio p53 u topljivi nuklearni dio (slika 1d), što ukazuje da se većina p53 u mESC-u veže na DNK.

Aktivnost p53 je ugrožena u embrionalnim matičnim stanicama

Drugo objašnjenje za brzu proliferaciju matičnih stanica bilo bi da je p53 neaktivan u mESC-ima. Kako p53 smanjuje proliferaciju diferenciranih stanica čak i pod normalnim uvjetima kulture, 4 pratili smo proliferaciju pES-pozitivnih i p53-negativnih mESC-a. Za kontrolu smo koristili p53-pozitivne i p53-negativne mišje embrionalne fibroblaste (MEF) i diferencirane mESC. U skladu s Li i suradnicima, 4 primijetili smo da se p53-negativne diferencirane stanice razmnožavaju znatno brže od svog divljeg tipa. Razlika u broju stanica već je bila uočljiva 2 dana nakon oplate, a ta se razlika u narednim danima još više povećala. Suprotno tome, nismo primijetili razliku u broju p53 - / - i p53 + / + ESC-ova do 2 dana nakon nanošenja ploče (slika 2a). Taj je rezultat uvelike potvrđen MTT testovima. Ovdje smo primijetili nešto veći signal s p53 - / - ESCsima u usporedbi s p53 + / + mESCS, ali razlika je bila mnogo manja od razlike između p53 + / + i p53 - / - fibroblasta (dopunska slika S3). Štoviše, samo diferencirane stanice razmnožavale su se brže nakon smanjivanja p53, ali ne i matične stanice (Slika 2b). Isto tako, nutlin, spoj koji inducira obilje p53 i aktivnost 13 samo je smanjio proliferaciju p53 pozitivnih diferenciranih stanica, ali ne i matičnih stanica (dopunska slika S3B). Sve u svemu, ovi rezultati pokazuju da je anti-proliferativna aktivnost p53 ugrožena u mESC-ovima.

Image

U matičnim stanicama ugrožena je antiproliferativna aktivnost p53. ( a ) D3 stanice, njihov derivat s manjkom p53 (p53 - / - ), mišji embrionalni fibroblasti (MEF) i njihov kolega s manjkom p53 (MEF p53 - / - ) posađene su u gustoći od 5 × 10 4 stanice / jažici u ploči sa 6 jažica. Za diferencirane D3 stanice (D3 razl.), D3 stanice i p53-negativne stanice su postavljene na gustoću od 10 5 stanica / jažici u ploče sa 6 jažica. U vrijeme pločenja dodana je retinoična kiselina radi diferenciranja stanica. Sve su se stanice brojile svaki dan. Grafikon prikazuje srednje vrijednosti i standardna odstupanja tri neovisna pokusa. ( b ) D3 stanice i D3 stanice koje su sedam dana diferencirane retinoičnom kiselinom (D3 razli.) su transficirane siRNA usmjerenom protiv p53 ili s kontrolnom siRNA u triplikatima. Sedamdeset i dva sata nakon transfekcije, relativni broj živih stanica određen je MTT testom iz dva duplikata. Grafikon prikazuje srednje vrijednosti i trake pogrešaka dva (D3 razl.) Ili tri (D3) neovisna eksperimenta. Treći trostruki dio stanice upotrijebljen je za praćenje obilja p53-a zapadnim upijanjem. Za kontrolu opterećenja provedena je hibridizacija s p- aktinom

Slika pune veličine

p53 s neutralnim pI isključivo je prisutan u mESC-ovima

Aktivnost p53 uglavnom se kontrolira post-translacijskim modifikacijama. 3 Stoga smo se pitali može li se p53 različito modificirati u mESC-u i u diferenciranim stanicama. Da bismo to istražili, odredili smo količinu modificiranog p53 pomoću antitijela usmjerenih protiv acetiliranog lizina 379 (K379), fosforiliranog serina 6 (S6), fosforiliranog serina 15 (S15) ili fosforiliranog serina 392 (S392). Za kontrolu smo uključili p53-negativne stanice i stanice koje su ozračene ionizirajućim zračenjem. Nakon oštećenja DNA, p53 je acetiliran na K379 i fosforiliran na S15 i S392, potvrđujući reaktivnost antitijela. Nijedno od antitijela nije pokazalo signal u p53 - / - stanicama, pokazujući njihovu specifičnost (Slika 3a). Osim antifosfo-S392 antitijela, koje su davale vrlo slab signal i za ne-ozračene mESC-ove, nijedno od antitijela nije prepoznalo p53 iz neoštećenih stanica. aktivnost p53, međutim, bila je ugrožena u mESC-ovima u normalnim kulturološkim uvjetima. Stoga, p53 iz mESC-a i iz diferenciranih stanica može imati post-translacijske modifikacije koje kontroliraju njihovu funkciju u normalnim kulturološkim uvjetima, a te promjene mogu biti različite od onih nakon genotoksičnog stresa. Da bismo istražili ovu mogućnost, izveli smo dvodimenzionalno zapadno brisanje. U skladu s ranijim nalazima, otkrili smo da je p53 kiseli protein. 14 Većina p53 iz ESC-a i iz diferenciranih stanica migrirala je s pI između 4, 8 i 5, 2, dok je mala količina migrirala s pI između 5, 3 i 6, 4. Zanimljivo je da su mESC-i također imali dio p53 koji je migrirao s pI između 6.4 i 8.2 koji nije bio prisutan u diferenciranim stanicama. Dakle, dio p53 se doista razlikovao između mESC-a i diferenciranih stanica (slika 3b). Da bismo vidjeli je li ovaj udio p53 samo nefosforilirani protein, tretirali smo stanični lizat lambda fosfatazom. Radi kontrole, ozračili smo stanice gama zrakama što je rezultiralo fosforilacijom p53 u serinu 15. Ova fosforilacija je u velikoj mjeri uklonjena nakon obrade fosfatazom (dopunska slika S4A). Kada smo tretirali lizate nezračenih matičnih stanica i diferencirane stanice s lambda fosfatazom pod istim uvjetima, opazili smo djelić p53 iz matičnih stanica s pI iznad 8.6 koji nije bio prepoznat u matičnim stanicama bez tretiranja fosfatazom (Slika 3c), pokazujući da je p53 u matičnim stanicama konstitutivno fosforiliran, barem u određenoj mjeri. Naboj p53 iz diferenciranih stanica također je izmijenjen tretmanom fosfatazom, iako nije otkriven p53 s pI iznad 8.6, što ukazuje da u diferenciranim stanicama mogu postojati dodatne modifikacije s negativnim nabojem. Doslovno, p53 iz diferenciranih stanica liječenih fosfatazom sliči neobrađenom p53 iz matičnih stanica (Slika 3c). Druga posttralacijska modifikacija koja utječe na naboj proteina je acetilacija. Da bismo vidjeli je li p53 iz matičnih stanica acetiliran, tretirali smo matične stanice i diferencirane stanice inhibitorima HDAC trihostatinom A i nikotinamidom prije lize stanica. Radi kontrole, analizirali smo alikvot tretiranih stanica za acetilaciju p53 u lizinu 379. Tretiranje matičnih stanica i diferenciranih stanica trihostatinom A / nikotinamidom rezultiralo je snažnom acetiliranjem p53 i povećanjem ukupnog broja p53 (dopunska slika S4B). Ovaj tretman nadalje je snažno povećao negativni naboj p53 iz matičnih stanica što je rezultiralo potpunim uklanjanjem frakcije p53 s neutralnim pI (slika 3d). U diferenciranim ćelijama povećao se i udio p53 s pI između 4, 6 i 5, 2. Učinak, međutim, nije bio tako jak kao u matičnim stanicama (slika 3d).

Image

Frakcija p53 s neutralnim pI postoji isključivo u matičnim stanicama. ( a ) D3 stanice (ESC), D3 stanice koje su 7 dana diferencirane retinoičnom kiselinom (Diff.) i njihove p53 negativne kolege ozračene su sa 7 sivih ili su ostale neozračene. Dva sata nakon ozračivanja stanice su lizirane. Lizati su razdvojeni na pet SDS-PAGE gelova i izbrisani. Svaka membrana je hibridizirana s različitim antitijelom protiv p53, bilo usmjerenim protiv p53 koji je fosforiliran ili acetiliran na naznačenim mjestima ili protiv pan-p53. Hibridizacija s Nanog provedena je radi kontrole stabljike i s β- aktinom radi kontrole jednakog i usporedivog opterećenja. Zapadne mrlje razvio je ECL. ( b ) D3 stanice (ESC) i D3 stanice koje su bile diferencirane retinojskom kiselinom 7 dana (D3 Diff.) su lizirane, razdvojene dvodimenzionalnom gel elektroforezom i izbrisane. Obilje p53 i PCNA, za internu kontrolu, praćeno je Western blottingom. ( c ) D3 stanice (ESC) i D3 stanice koje su bile diferencirane retinoičnom kiselinom 7 dana (D3 Diff.) tretirane su lambda fosfatazom ili mockom tretirane za kontrolu. Proteini su taloženi TCA, razdvojeni dvodimenzionalnom gel elektroforezom i izbrisani. Obilje p53 i PCNA, za internu kontrolu, praćeno je Western blottingom. ( d ) D3 stanice (ESC) i D3 stanice koje su 7 dana diferencirane retinoičnom kiselinom (D3 Diff.) tretirane su s 1 μM trihostatina A (TSA) i 5 mM nikotinamida (NA) 6 h. Stanice su lizirane, razdvojene dvodimenzionalnom gel elektroforezom i izbrisane. Obilje p53 i PCNA, za internu kontrolu, praćeno je Western blottingom

Slika pune veličine

p53 je povezan sa MdmX u matičnim stanicama

Kako je frakcija p53 s neutralnijim pI postojala isključivo u mESC-ima, pitali smo se utječe li to na povezanost p53 s drugim proteinima i provodili smo centrifugiranje gustoće saharoze. Zanimljivo je da je većina p53 pronađena u kompleksima većim od 500 kD, a jedva da je bilo koji p53 protein postojao kao monomeri ili dimeri. Međutim, nismo mogli vidjeti razliku između mESC-a i diferenciranih stanica (Slika 4a; snažni signali u frakciji 26-28 mESC-a i frakciji 22-28 diferenciranih stanica nisu specifični kao što je vidljivo u p53 - / - stanicama).

Image

p53 je povezan s MdmX u mESC-ovima. ( a ) D3 stanice i D3 stanice koje su 7 dana diferencirane retinoičnom kiselinom (D3 razl.) su lizirane. Nakon centrifugiranja lizata gustoće gustoće, sakupljeno je 28 frakcija i analizirano na broj p53, Mdm2 i MdmX. Obiljeljeno je obilje lista / 4 za kontrolu stabljike, a hibridizacija s α- 7 provedena je za internu kontrolu. ( b ) D3 stanice su tretirane retinoičnom kiselinom (RA) radi diferencijacije. Navedeni broj dana nakon početka diferencijacije stanice su lizirane i obilje MdmX, p53 i Mdm2 praćeno je zapadnim blotiranjem. Utvrđeno je obilje Nanog za kontrolu stabljike i β- aktina za kontrolu opterećenja. ( c ) D3 stanice su ozračene sa 7 Gray i lizirane 3 sata nakon zračenja. p53 je istaložen i pridruženi MdmX je praćen Western blottingom. Alikvot celijskog lizata upotrijebljen je za praćenje obilja p53 i MdmX u cijelom staničnom lizatu. Izvedena je hibridizacija s Oct3 / 4 radi kontrole stabljike i s β- aktinom za kontrolu opterećenja

Slika pune veličine

aktivnost p53 uglavnom inhibira Mdm2 i MdmX (Mdm4). 3 Stoga smo se pitali je li vezivanje p53 na Mdm2 i MdmX promijenjeno u mESC-u i diferenciranim stanicama. Ako su Mdm2 i MdmX povezani s p53, oni bi trebali koeluirati s p53 iz gradijenta saharoze. Doista, profil elucije p53 i MdmX iz mESC-a i diferenciranih stanica bio je superponiran, ali signal za MdmX bio je znatno slabiji u diferenciranim stanicama (Slika 4a). Začudo, većina Mdm2 (slika 4a) bila je prisutna u kompleksima koji su bili mnogo manji od većine kompleksa koji sadrže p53. Od 28 frakcija samo je 6 (frakcija 12-18) sadržavalo veće količine i p53 i Mdm2. Međutim, nije bilo uočljive razlike u raspodjeli Mdm2 između mESC-a i diferenciranih stanica, ali signal za Mdm2 bio je slabiji u diferenciranim stanicama (slika 4a).

Naši rezultati sugeriraju da se količina Mdm2 i MdmX može smanjiti tijekom diferencijacije. Zaista je razina MdmX bila vrlo visoka u matičnim stanicama i naglo se smanjivala tijekom diferencijacije, istodobno s p53 i markerom matičnih stanica Nanog (slika 4b). Obilje Mdm2 također se smanjivalo tijekom diferencijacije, ali je smanjenje bilo sporije i slabije (Slika 4b).

Da vidimo je li MdmX povezan s p53, izveli smo ko-imunoprecipitacije. Radi kontrole, ozračili smo stanice, što je pokazalo da tretman smanjuje MdmX. 15 MdmX doista je istaloženo s p53 iz mESC-a. Nakon ozračivanja, ta interakcija je snažno smanjena, što pokazuje specifičnost ko-taloženja (slika 4c).

Da bismo vidjeli da li MdmX stvarno inhibira aktivnost p53 u mESC-ovima, smanjili smo MdmX. Smanjena regulacija MdmX doista je povećala obilježje p53-transkripcijskog cilja Mdm2 (Slika 5a). Smanjenje regulacije MdmX nadalje je smanjilo staničnu proliferaciju u p53-pozitivnim mESC-ima na manje od 75%, dok u p53-negativnim mESC-ovima nije bilo razlike u broju stanica (Slika 5b.I). Iznenađujuće je da je pod istim uvjetima smanjivanje proliferacije Mdm2 smanjilo proliferaciju stanica za samo 7% (slika 5b.II).

Image

aktivnost p53 kontrolira MdmX u mESC-ovima. ( a ) D3 stanice su transficirane sa siRNA koja je usmjerena protiv mdmX ili s kontrolnom siRNA. Četrdeset osam sati nakon transfekcije stanice su lizirane. Obilje MdmX, Mdm2 i p53 praćeno je zapadnim blotiranjem. Za kontrolu opterećenja korištena je hibridizacija s p- aktinom. ( b ) Divlje vrste D3 i D3 stanice s genetskom delecijom p53 (p53 - / - ) transficirane su u duplikatima sa siRNA usmjerenom protiv mdmX ( b I ), mdm2 ( b II ) ili s kontrolnom siRNA. Četrdeset i osam sati nakon transfekcije, jedan od duplikata je liziran kako bi se kontroliralo smanjivanje regulacije zapadnim blontom. Drugi duplikat korišten je za praćenje relativnih brojeva stanica pomoću MTT testa. Grafikon prikazuje srednje vrijednosti i standardno odstupanje relativnih brojeva stanica od tri (silazna regulacija Mdm2 u p53 - / - stanicama) do pet (smanjivanje MdmX) nezavisnih pokusa. Relativni broj stanica koji su transficirani kontrolnom siRNA postavljen je na 100%. * P <0, 05; *** P <0, 005

Slika pune veličine

Divlji p53 kontrolira sličan skup ciljnih gena u mESC-ima kao mutant p53 u diferenciranim stanicama

Budući da je razina p53 visoka u mESC-ovima (dopunska slika S1A), 8 mi smo zaključili da p53 može ispuniti važnu funkciju u tim stanicama koja bi mogla biti drugačija od njegove funkcije u diferenciranim stanicama. Stoga smo analizirali transkripte nestimuliranih p53 - / - i p53 + / + mESC-a iste genetske pozadine. Uočili smo značajno preklapanje transkripta p53 + / + i p53 - / - ESC-a, ali bilo je i nekih jasnih razlika (slika 6a). Među genima koje je inducirao p53 u mESC-ima bili su fosb , mdm2 , cdkn1 (p21), akt1 , c- myc , c-jun, igf2, ciklin D1 i ciklin D2 . Zanimljivo je da su ti geni također inducirani mutantnim p53 u tumorskim stanicama. 6, 7 Za konsolidaciju podataka iz RNA sekvenciranja izveli smo qRT-PCR nekih gena. U skladu s podacima iz diferenciranih stanica, ekspresija 1 mdm2 i cdkn1 (p21) bila je veća u p53 pozitivnim mESC-ima (slika 6b.I). Najzanimljivije je da je ekspresija aktl, c-myc , c-jun ili igf2 također bila značajno veća u p53-pozitivnim mESC-ima nego u p53-negativnim mESC-ima (slika 6b.II). Ova povećanja nisu posljedica ukupnog porasta ekspresije gena jer je, na primjer, ekspresija lef1 smanjena u ESC-ima divljeg tipa u usporedbi s p53 - / - mESC-ima (Slika 6b.II). Ova indukcija proto-onkogena divljim tipom p53 također se prevodi u protein, jer su mESC-i s divljim tipom p53 posjedovali više c-Jun proteina nego p53 - / - mESC (Slika 6c). Tretiranje matičnih stanica nutlinom rezultiralo je ne samo indukcijom klasičnih p53 ciljnih gena Mdm2 i p21, već ovisnim o p53, već i c-Jun i c-myc u matičnim stanicama (Slika 6d, Dopunska slika S5). Ova indukcija c-Jun i c-myc nije primijećena u p53-negativnim matičnim stanicama. Iako nutlin očito nije uspio povećati razinu c-myc RNA u diferenciranim stanicama, inducirao je c-Jun u diferenciranim stanicama. Ova indukcija se, međutim, također dogodila u p53-negativnim diferenciranim stanicama (Slika 6d). Smanjenje regulacije Mdm2 ili MdmX povećalo je obilje c-Juna, dok smanjivanje p53 siRNA-om smanjilo je njegovu obilnost (Slika 6e) nadalje podržavajući da p53 kontrolira c-jun ekspresiju u matičnim stanicama. U skladu s tim, lef1, za koji smo ustanovili da je reguliran p53 u matičnim stanicama, induciran je nakon snižavanja regulacije p53 i dodatno smanjen nakon deregulacije Mdm2 i MdmX (Slika 6e). Suprotno tome, p21, iako smanjen nakon smanjene regulacije p53, nije povećan nakon deregulacije Mdm2 i MdmX (Slika 6e), što sugerira da moraju biti ispunjeni daljnji uvjeti da se omogući indukcija p21 do p53. U skladu s regulacijom akt1, c-myc i c-jun divljim tipom p53 u matičnim stanicama, pronašli smo p53 povezan s njihovim promotorima. Važno je da možemo istaložiti DNA akt1 , c-myc i c-jun sa anti-p53 antitijelom samo iz lizata matičnih stanica p53-pozitivnih, ali ne i iz p53-negativnih matičnih stanica ili diferenciranih stanica (Slika 6f, Dopunska slika S5B),

Image

p53 je aktivan u matičnim stanicama. ( a ) Transkriptorska analiza divljeg tipa (D3) i p53-negativnih (p53 - / - ) D3 stanica pomoću RNAseq. Grafikon prikazuje crtanje log10 ekspresije gena u oba uvjeta. Geni s promjenom nabora 2 prikazani su crvenom bojom. ( b ) Stanice divljeg tipa D3 i D3 stanice s genetskom delecijom p53 (p53 - / - ) su lizirane. RNK je pripremljena, prepisana u cDNA i podvrgnuta qRT-PCR. Obilje specifičnih cDNA normalizirano je određivanjem obilja kućnog gena RibPO. Srednje vrijednosti i trake pogrešaka dvaju neovisnih pokusa su izračunati i prikazani. Relativno obilje specifične RNA u D3 stanicama postavljeno je na 1. ( c ) Lidi divljeg tipa D3 i D3 stanice s genetskom delecijom p53 (p53 - / - ) su lizirani. Obilje c-Juna i p53 praćeno je zapadnim blotiranjem. Za kontrolu opterećenja provedena je hibridizacija s p- aktinom. ( d ) D3 stanice, njihove p53-negativne kolege (p53 - / - ) i stanice D3 i p53 - / - koje su sedam dana diferencirane retinoičnom kiselinom (D3 razl., p53 - / - razli.) tretirane su sa 5 μM nutlina 32 h. Dio stanica je liziran, a izolacijom c-Juna, Mdm2 i p53 određeno je zapadnim blotiranjem ( d I ). Iz preostalih stanica pripravi se RNA, a qRT-PCR se odredi relativno obilje p21 i c-myc. Obilje specifičnih cDNA normalizirano je obiljem gena za domaćinstvo RibPO. Grafikon prikazuje srednje vrijednosti i trake pogrešaka dvaju neovisnih pokusa. Relativno obilje specifične RNA u mock-tretiranim stanicama postavljeno je na 1 ( d II ). ( e ) D3 stanice su transficirane siRNA usmjerenom protiv p53, Mdm2 ili MdmX, ili s kontrolnom siRNA. Nakon žetve stanice su razdvojene na dva dijela. Jedan od uzoraka analiziran je western blotom kako bi se utvrdilo obilje c-Jun, Puma i bax i p53, Mdm2 i MdmX ( e I ). Iz drugog dijela pripravljena je RNA, a obilje p21 i le1 je određeno qRT-PCR. Grafikon prikazuje srednje vrijednosti i trake pogrešaka dvaju neovisnih pokusa. Relativno obilje p21 i le1 RNA u kontrolnim stanicama transficiranim siRNA postavljeno je na 100% ( e II ). ( f ) D3 stanice i njihov p53 manjkav kolega (p53 - / - ) su lizirani. p53 je istaložen (IP: p53) i pridružena c-myc , c-jun , akt-1 i mdm2 DNA je praćena PCR. Taloženje s IgG i ukupnim staničnim lizatom (unos) korišteni su za kontrolu

Slika pune veličine

Kako se p53 aktivira kao odgovor na oštećenje DNA, 16 smo se zapitali da li p53 inducira c-myc ili c-jun u matičnim stanicama također kao odgovor na oštećenje DNA. Kada smo tretirali matične stanice etopozidom inhibitora topoizomeraze da induciraju puknuće niti DNA, uočili smo snažnu indukciju p53 i porast Mdm2 i p21 ovisnog o p53 (dopunska slika S5C). Primijetili smo i indukciju c-juna i snižavanje regulacije lef1 kao odgovor na oštećenje DNA. Međutim, induciran je i c-jun i lef1 se također smanjio u p53-negativnim stanicama, pa je upitno je li p53 doprinio njihovoj regulaciji nakon oštećenja DNA (dopunska slika S5C). Suprotno tome, c-myc, koji je normalno induciran p53 u matičnim stanicama, smanjen je kao odgovor na liječenje etopozidom i to smanjenje je bilo neovisno o p53. Stoga je malo vjerojatno da p53 kontrolira svoje ciljne gene specifične za matične ćelije, kao odgovor na oštećenje DNK.

Općenito, ovi rezultati pokazuju da p53 mijenja program transkripcije u mESC-ovima. Najistaknutije je da p53 kontrolira ekspresiju različitog seta gena u mESC-ima nego u diferenciranim stanicama, a što je najupečatljivije da je nekoliko tih gena također kontrolirano mutantnim p53 u tumorskim stanicama.

Rasprava

p53 je nES u mESC-ima

Korištenjem različitih antitijela pokazujemo da je većina p53 nuklearna u mESC-ima, što je za razliku od prethodnih izvještaja koja su p53 opisala kao citoplazmatski protein u mESC-ima. 9, 10, 17 Neslaganje je najvjerojatnije zbog nedovoljne specifičnosti antitijela korištenih u prethodnim studijama. Antitijela Pab421 ili Pab246 davali su signale u citoplazmi mESC-a, nakon imunološkog bojenja i frakcije frakcije / zapadnog blotiranja. Međutim, u svim slučajevima primijetili smo sličan signal i kod p53 negativnih mESC-a, što ukazuje da ta antitijela prepoznaju protein različit od p53. Antitijela 1C12 i CM5 koja prepoznaju p53 posebno pokazuju da većina p53 nalazi u jezgri mESC-a. U dogovoru s Liom i suradnicima, 18 otkrili smo da je većina p53 u jezgri povezana s DNK. Nakon liječenja leptomicinom B, p53 se akumulirao u jezgri, u skladu s njegovom nuklearnom lokalizacijom u mESC-ima i CRM1 posredovanim prebacivanjem između jezgre i citoplazme. 11 Iznenađujuće, p53 se također nakupljao u citoplazmi nakon liječenja leptomicinom B, što ukazuje da se proteini koji razgrađuju p53 mogu također prebaciti između jezgre i citoplazme.

aktivnost p53 u mESC-ima kontrolira MdmX

Kad se p53 ne kontrolira pravilno, potiče zaustavljanje staničnog ciklusa i staničnu smrt. Najpoznatiji regulatori p53 su Mdm2 i MdmX koji se pridružuju domeni transaktivacije p53. 3 Najuočljivija razlika između Mdm2 i MdmX je ta što Mdm2 ima funkcionalnu RING domenu i stoga cilja p53 za degradaciju dok MdmX to ne čini. Iako je Mdm2 izrazito naglašeno, u većini netransformiranih tkiva MdmX se teško može otkriti. Iznenađujuće, MdmX je bio izrazito izražen u mESC-ovima. Nadalje, MdmX je ko-frakcionirao s p53 iz gradijenta saharoze, ko-istaložio s p53 iz mESC lizata i kontrolirao p53 transkripcijsku i antiproliferacijsku funkciju u mESC-ima. Prethodno je pokazano da MdmX kontrolira aktivnost p53 tijekom diferencijacije. 19 Ovom studijom ovu aktivnost proširujemo i na mESC. Ipak, iako je MdmX najvjerojatnije važan faktor za kontrolu aktivnosti p53 u matičnim stanicama, on možda nije jedini. Na primjer, TRIM25, član super familije TRIM proteina koji kontrolira aktivnost p53 (Zhang i sur. , Prihvaćeno), također je obilnije matičnim stanicama nego u diferenciranim stanicama (Ping Zhang, neobjavljeni rezultati) i mogu postojati daljnji proteini s takvim svojstvima., Stoga, umjesto da se oslanjaju na jedan jedini protein za kontrolu p53 aktivnosti, mESC-ovi mogu imati skup proteina s preklapajućom funkcijom kako bi se osiguralo da se p53 drži pod kontrolom.

p53 mijenja program transkripcije matičnih stanica

ESC-i imaju velike količine p53. 8 Kako je p53 anti-proliferativni protein, ranije se mislilo da je p53 neaktivan u matičnim stanicama. Zaista, antiproliferativna aktivnost p53 bila je ugrožena u mESC-ovima. Međutim, slijedom RNA, otkrili smo da je transkripcijski profil p53-pozitivnih i p53-negativnih mESC-a različit, što pokazuje da p53 utječe na program transkripcije u mESC-ima. Da li će p53 aktivirati transkripciju gena izravno ili je njegov utjecaj neizravniji, ostaje da se utvrdi. Kako su matične stanice p53-negativne imale drugačiji transkripcijski obrazac od matičnih stanica divljih vrsta, upitali smo mogu li neke od promjena prilagoditi gubitku p53. Ipak kad smo smanjili p53, primijetili smo slične promjene kao i na p53-negativne matične stanice.

Intrigantno je da su mnogi geni koji su bili regulirani u mESC-ima s divljim tipom p53 inducirani mutantnim p53 u tumorskim stanicama, što implicira da divlji tip p53 u matičnim stanicama može steći svojstva mutanta p53 koji potječu od tumora. Zanimljivo je da je p53 iz matičnih stanica povezan s istim regionom c-myc promotora koji je zauzet mutiranim p53 u diferenciranim stanicama. 20 Nadalje, p53 povezan s regijama bogatim GC-om oko mjesta transkripcije polazišta c-jun i akt-1 u mESC-ima, svojstvo koje je opisano za mutant p53 u diferenciranim stanicama. 21 Mutant p53 iz tumorskih stanica često je izmijenjena konformacija koja omogućava nove interakcije protein-protein. 6, 7 Mislimo da se sličan mehanizam može primjenjivati ​​na p53 u matičnim stanicama, posebno jer nismo uspjeli pronaći mjesto vezanja za konsenzus za p53 u "novim" p53 ciljnim genima. Ostaje da se utvrđuje da li se p53 iz matičnih stanica podvrgava interakcijama protein-protein u mESC-ima kao mutant p53 u diferenciranim stanicama. Zanimljivo je da smo pronašli udio p53 s neutralnim pI u mESC-ima koji nije prisutan u diferenciranim stanicama što ukazuje da je p53 iz mESC-a i diferenciranih stanica različito modificiran. Ove modifikacije mogu omogućiti p53 kontroliranje različitog skupa ciljnih gena u matičnim stanicama i diferenciranim stanicama.

Kako se p53 aktivira kao odgovor na stanični stres, 3, 17 pitali smo se hoće li p53 inducirati ove ciljne gene specifične za matične ćelije i nakon oštećenja DNA. Međutim, iako su klasični p53 ciljni geni p21 i mdm2 regulirani nakon tretiranja matičnih stanica etopozidom, ekspresija c-myc je snažno smanjena i u p53-pozitivnim i p53-negativnim matičnim stanicama. c-jun je induciran u p53-pozitivnim i p53-negativnim matičnim stanicama, a lef1 je smanjen u p53-pozitivnim i p53-negativnim matičnim stanicama, što čini malo vjerojatnim da p53 kontrolira svoje ciljeve specifične za matične stanice kao odgovor na oštećenja DNA.

Materijali i metode

Stanične linije i njihovo liječenje

D3 stanice uzgajane su u mediju Glutamax-I (Life Technologies, Darmstadt, Njemačka) dopunjenom 15% fetalnim goveđim serumom, 1 × neesencijalnim aminokiselinama, 0, 1 mM β -merkaptoetanolom, 1% penicilina / streptomicina i 1000 jedinica / ml LIF-a, Mišji embrionalni fibroblasti (MEF) koji su ozračeni s 6, 3 Grey služili su kao hranilice. p53-negativne matične stanice (p53 - / - ) uzgajane su u mediju Glutamax-I (Life Technologies) uz dodatak 15% fetalnog goveđeg seruma, 1 × neesencijalnih aminokiselina, 0, 1 mM β -merkaptoetanola, 1% penicilina / streptomicina i 1000 jedinica / ml LIF. MEF stanice koje su ozračene sa 6, 3 Grey služile su kao hranilice. MEF su uzgojeni u Dulbeccovom modificiranom mediju Eagle (Life Technologies) uz dodatak 10% fetalnog goveđeg seruma i 1% penicilina / streptomicina. Da bi se razlikovalo, stanice su uzgajane u Dulbeccovom modificiranom mediju Eagle-GlutaMAX-I uz dodatak 10% fetalnog goveđeg seruma, 1 × ne-esencijalnih aminokiselina, 0, 1 mM β -merkaptoetanola, 1% penicilina / streptomicina i 1 μM sve- trans -retinoična kiselina (Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Njemačka) tijekom 7 dana na jelima s kulturom obloženim 0, 1% želatine.

Stanice su ozračene sa 60 Co-gama izvora brzine doze od 0, 5 Grey u minuti u mediju za staničnu kulturu. Etopozid je upotrijebljen u krajnjoj koncentraciji od 50 μM. Leptomicin B (Sigma-Aldrich) dodan je u konačnu koncentraciju od 2 μM nakon gladovanja u serumu i inkubiran je 16 sati. Upotrebljen je trihostatin A pri konačnoj koncentraciji od 2, 5 mM, a nikotinamid krajnje koncentracije od 7, 5 mM.

Antitijela i siRNA

Antitijela protiv p53 Pab421, Pab246, CM5 i 1C12 kupljena su od Millipora (Darmstadt, Njemačka), Vector laboratorija (Burlingame, CA, USA) i stanične signalizacije (Danvers, MA, SAD). Od Santa Cruza (Dallas, TX, SAD) dobili smo antitijela protiv listopada 4 (C-10) Nanog (C-4), c-juna (H79) i PCNA (PC10). Antitijela protiv acetiliranog i fosforiliranog p53 (K379, S6, S15, S392) bila su iz stanične signalizacije. Antitijela protiv GAPDH (6C5), PARC (PO69) i α -7 (MCP72) bila su iz Hytest (Turku, Finska), BioLegend (San Diego, CA, USA) i Enzo (Loerrach, Njemačka). Antitijela protiv p- aktina i histona H3 kupljena su od Abcama (Cambridge, Velika Britanija), a antitijelo protiv MdmX (MDMX82) od Sigma-Aldricha.

siRNA su kupljeni od Eurofina (Ebersberg, Njemačka). Sekvence su dostupne na zahtjev. transfekcije siRNA provedene su korištenjem Macsfectina (Miltenyi Biotec, Bergisch-Gladbach, Njemačka) slijedeći upute proizvođača.

Stanična liza i Western blotting

Izvedena je liza stanica i 1-D zapadno blotiranje kako je opisano. 22 Za 2-D Western blotting, stanice su suspendirane u Urea Lysis puferu (8, 5 M Urea, 4% CHAPS, 50 mM Tris pH8, 0, 1 mM PMSF) i poremećene sonikacijom u Amp 50 tokom 10 s. Lizat je očišćen centrifugiranjem tijekom 20 minuta pri 15000 o / min. Protein (0, 5-1 mg) je razrijeđen jednakom volumenom pufera 2 × IEF uzorka (5 M ureje, 2 M tiorea, 65 mM CHAPS, 4 mM tributilfosfina i 1% Nosač-amfolat pH 3-10 (Serva, Heidelberg, Njemačka)). Volumen je podešen na 335 µl puferom za rehidraciju (5 M ureja, 2 M tio-urea, 65 mM CHAPS, 2 mM tributilfosfina, 0, 5% nosač-amfolit pH 3–10). Dodano je 5 μl 0, 8% Commassie Brilliant Blue. Ova otopina korištena je za hidrataciju 18 cm-Immobiline DryStrip pH 3-11 (GE Healthcare, München, Njemačka). Izoelektrično fokusiranje izvedeno je korištenjem Ettan IPGphor II sustava izoelektričnog fokusiranja (GE Healthcare) na 25 o C i 200 V 3, 5 h, na 500 V 3, 5 h, na 1000 V 3, 5 h, pri gradijentnoj rampi do 8000 V za 1 h, a na 8000 V 11 h. IEF-gel uravnotežen je u ravnotežnom puferu (50 mM Tris pH 8, 8, 6 M ureje, 30% glicerola, 2% SDS, 65 mM DTT) tijekom 15 minuta i alkiliran 15 minuta u puferu alkilacije (50 mM Tris pH 8, 8, 6 M urea, 30% glicerola, 2% SDS, 20 mg / ml jodoacetamida, 0, 03% Commassie Brilliant Blue). Druga dimenzija izvedena je u bio-Rad (München, Njemačka) SDS-PAGE 1D stanici koristeći 10 ili 12, 5% SDS poliakrilamid gelova. Nakon elektroforeze gel je izbrisan i p53 i PCNA proteini praćeni su imunodetekcijom.

Za liječenje fosfatazom, stanice se suspendiraju u fosfataznom puferu i liziraju blagim ultrazvukom. Dvije stotine jedinica lambda fosfataze dodano je u 100 μg proteina i inkubirano 30 minuta na 30 ° C. Proteini su taloženi TCA i suspendirani u puferu za lizu Urea.

Za frakcioniranje stanica, stanična peleta suspendirana je u 4 punjena stanična volumena pufera za liziranje (10 mM HEPES pH 7, 4, 50 mM NaCl, 0, 5 M saharoze, 0, 5% Triton x-100, 1 mM PMSF), inkubirana je 5 minuta na ledu centrifugira se na 1000 o / min 10 min. Citoplazmatska frakcija (supernatant) prenesena je u novu epruvetu. Pelet je ispran dvaput hladnim PBS-om, suspendiran u istom volumnom puferu za liziranje kao i stanice na početku postupka i poremećen sonikacijom.

Za tretiranje DNK, DNK (Pierce Universal Nuclease za staničnu lizu, Thermo Fisher Scientific, Bonn, Njemačka) dodana je nuklearnom lizatu i inkubirana 1 sat na ledu.

Imunofluorescentno bojenje

ES stanice uzgajane su na želatiniziranim poklopcima. Nakon dva puta ispiranja ledenim PBS-om, stanice su fiksirane ledenim acetonom / metanolom (1: 1) 8 minuta na ledu. Potom su pokrovne kapke isprane tri puta s PBS-om i blokirane su 30 minuta s blokirajućim puferom (1% goveđi serumski albumin, 1% kozji serum u PBS-u). Nakon blokiranja, stanice se inkubiraju preko noći s prvim antitijelom. Sljedećeg dana prekriveni slojevi su isprani tri puta s PBS-om i inkubirani 30 minuta na sobnoj temperaturi u mraku s antitijelom usmjerenim protiv mišjeg IgG, povezanog s Alexa-Fluor-488 (Life Technologies) ili s antitijelom usmjerenim protiv zečjeg IgG zajedno s Alexa-Fluor-546 (Life Technologies) zajedno s Draq5 (Biostatus Limited, Shepshed, Velika Britanija), svi su razrijeđeni 1: 1000 u blokirajućem puferu. Konačno, poklopci su isprani tri puta s PBS-om, montirani Hydromount na dijapozitivima mikroskopa i analizirani mikroskopijom.

Imunotaloženie

Stanice su isprane dvaput ledenim PBS-om i lizirane u puferu za liziranje Co-IP (10 mM HEPES, pH 7, 4, 50 mM NaCl, 0, 5 M saharoze, 0, 5% Triton x-100, 1 mM PMSF, 1 × Phosphostop (Roche, Mannheim, Njemačka), 200 U / ml DNAse (Univerzalna nukleaza za staničnu lizu; Pierce). Jedan miligram proteina dodan je proteinu A-agarozi (Pierce) prethodno spojenom s antitijelom 1C12 anti-p53. Nakon 2 h inkubacije na rotirajućim kotačem na 4 ° C, talog se ispere tri puta s Co-IP puferom za ispiranje (50 mM Tris, pH 7, 5, 1 mM EDTA, 100 mM NaCl, 0, 1% Triton x-100, 5% glicerola). 2 × SDS pufer za uzorke (4% natrijev dodecil sulfat, 0, 16 M Tris pH 6, 8, 20% glicerol, 4% p- merkaptoetanol, 0, 002% bromfenol plavo) dodani su talogima prije toplotne denaturacije i punjenja na 10% SDS-PAGE gel.

Centrifugiranje gradijera saharoze

Stanice su isprane dva puta ledenim PBS-om, strugane u PBS i prikupljene centrifugiranjem. Stanice su suspendirane u (50 mM Tris pH 7, 4, 20 mM NaCl, 10 mM MgCl2, 0, 5% NP40, 5 mM ATP, 1 mM DTT, 1 mM PMSF, 40 U / ml DNK (Universal Nuclease za staničnu lizu; Pierce), 10 mM N-etilmaleimida, 10 mM l, 10-fantrotlin i 1 × fosfostop), gurnut tri puta kroz 26G iglu i 30 minuta inkubiran na ledu. Ekstrakt proteina je očišćen centrifugiranjem na 16 000 × g na 4 ° C tijekom 15 minuta, napunjen na 10–40% gradijent saharoze i centrifugiran na 100 000 × g na 4 ° C 18 sati. Frakcije su sakupljene i analizirane Western blottingom.

Testovi širenja

Stanice su postavljene na ploče obložene želatinom (matične stanice) ili neplastične (mišji embrionalni fibroblasti) ploče i broje se svaki dan. Za MTT testove, 3 - [4, 5-dimetiltiazol-2-il] -2, 5-difeniltetrazolij bromid dodan je u krajnjoj koncentraciji od 0, 2 mg / ml i inkubiran je 4 sata. Medij je uklonjen, a stanice i sol formasa otopljene su u 1, 5 ml izopropanola. Sto pedeset mikrolitara ove otopine preneseno je na mikroploču i apsorbancija je utvrdila na 550 nm čitač mikroploča.

Redoslijed RNA

Ukupna RNA pripravljena je korištenjem reagensa TRIzol (Life Technologies) prema uputama proizvođača. Izvađeni ukupni uzorci RNA testirani su na RNA nanočipovima (Bioanalyser 2100, Agilent, Santa Clara, CA, SAD) i nije bilo znakova razgradnje (RNA indeks broj> 8). Knjižnice za sekvenciranje nastale su iz 1 μg RNA uzoraka s TruSeq namotanim mRNA kitom (Illumina, San Diego, CA, USA). Veličina i kvaliteta biblioteke za sekvenciranje određena je na DNA-čipu (Bioanalyser 2100, Agilent). Multipleksirani uzorci u 7pM učitani su u jednu stazu Illumina Flow ćelije v3. Upareni krajnji očitanja (2 x 50 nukleotida) dobiveni su na Hiseq1000 pomoću SBS v3 seta (Illumina). Otkrivanje klastera i pozivanje na bazu izvedeni su korištenjem RTAv1.13, a kvaliteta očitanja procijenjena je s CASAVA v1.8.1 (Illumina). Redoslijedom je bilo> 67 milijuna pari 50-nt čitanja po uzorku sa srednjom ocjenom Phred kvalitete> 35 (dopunska tablica 1). Čitanja su mapirana prema genomu miša (M37) koristeći tophat verziju 1.4.1 23 i bowtie 0.12.7 s opcijama - pretraživanje leptira -pokrivanje-pretraživanje -mikroekson-pretraživanje -a 5 -p 5 -biblioteka tipa fr- neopterećen i koristeći poznate egzonske spojnice (Ensembl izdanje 67). Srednja udaljenost i standardno odstupanje između očitanih parova dobiveni su iz CASAVA. Ekspresija gena određena je s HTSeq verzijom 0.5.3p3 24 računanjem za svaki gen broj čitanja koji se preklapaju s mjestom primjedbe dobivenom otpuštanjem Ensembl 67. Diferencijalni izraz izračunat je korištenjem R paketa DESeq. 24

qRT-polimerazna lančana reakcija

Ukupna RNA pripremljena je iz stanica koristeći RNeasy kit (Qiagen, Hilden, Njemačka) prema preporuci proizvođača. RNK je tretirana DNaseI radi uklanjanja zaostale genomske DNA i transkribirana u cDNA pomoću nasumičnih prajmera i RevertAid H MinusM-MuLV reverzne transkriptaze (Fermentas, St. Leon-Rot, Njemačka). PCR u stvarnom vremenu provedena je u duplikatima sa SYBR Green PCR smjesom (Qiagen / Promega, Mannheim, Njemačka). CDNA je denaturirana 15 min na 95 ° C, nakon čega slijedi 40 ciklusa od 95 ° C tokom 15 s i 50 ° C tijekom 1 minute korištenjem 7000 ABI sustava detekcije sekvenci i gensko specifičnih prajmera. Signali su normalizirani na signale za domaćinstvo gena RibPO (34B4). Vidi dodatnu tablicu 3 za redoslijede primera.

Kromatinske imunoprecipitacije

Proteini i DNA su umreženi inkubacijom s formaldehidom (1% fc) 10 minuta na sobnoj temperaturi. Reakcija je zaustavljena inkubacijom s glicinom (0.125 M fc) tijekom 5 minuta na sobnoj temperaturi. Medij je uklonjen i ploče su isprane tri puta ledenim PBS-om. Stanice su strugane iz posude za kulturu, sakupljene centrifugiranjem i isprane PBS-om koji sadrži 1 mM PMSF. Stanice su suspendirane u 3 x volumenu pufera za lizu (5 mM HEPES pH 8, 85 mM KCL, 0, 5% NP40, 1 mM PMSF, 1 μg / ml aproptinina, 1 μg leupeptina) i inkubirane su 10 min. Jezgre su peletirane 5 minuta pri 5000 o / min i 4 ° C, suspendirane u puferu za liziranje jezgara (50 mM Tris pH 8, 10 mM EDTA 8, 1, 1% SDS, 1 mM PMSF, 1 μg / ml aproptinina, 1 μg / ml leupeptina) i inkubira se 10 minuta na ledu. Lizati su ultrazvučni radi postizanja prosječne duljine kromatina od oko 400 bp i očišćeni su centrifugiranjem pri 13 000 okr / min tijekom 10 minuta na 4 ° C. Supernatant je razrijeđen pet puta u ChIP puferu za razrjeđivanje (0, 01% SDS, 1, 1% Triton X 100, 1, 2 mM EDTA pH 8, 1, 16, 7 mM Tris-Cl pH 8, 0, 167 mM NaCl, 1 mM PMSF, 1 μg / ml aproptinina, 1 μg / ml leupeptina). Uzorci su prethodno očišćeni 30 minuta na 4 ° C mješavinom DNA sperme lososa, BSA i proteina A agaroze. Kuglice su bile granulirane i supernatant je prebačen u novu epruvetu. Deset posto supernatanta zadržano je za kontrolu ulaza. Preostali lizat podijeljen je u dva dijela. Jednom dijelu je dodan IgG, a drugom dijelu anti-p53 antitijelo CM5. Uzorci se inkubiraju na 4 ° C preko noći sa rotacijom preko kraja. Zatim je dodana suspenzija DNA ultrazvučne sperme lososa, proteina A aharoza i BSA i inkubirana je 1 sat pri 4 ° C s rotacijom od kraja do kraja. Talog je sakupljen centrifugiranjem pri 7200 o / min i 4 ° C tijekom 3 minute i uzastopno ispran jednom puferom za pranje slanom soli (0, 1% SDS, 1% Triton X 100, 2 mM EDTA pH (8, 1, 20 mM Tris-Cl, pH 8, 0), dva puta s visokim puferom za ispiranje soli (0, 1% SDS, 1% Triton X 100, 2 mM EDTA, pH 8, 1, 20 mM Tris-Cl, pH 8, 0, 500 mM NaCl), jednom s puferom za ispiranje LiCl (10 mM Tris -Cl pH 8, 0, 250 mM LiCl, 1% NP40, 1% deoksiholična kiselina, 1 mM EDTA pH 8, 1) i dva puta s TE puferom (10 mM Tris pH 8, 0, 1 mM EDTA pH 8, 1). Svi tragovi pufera su uklonjeni i kompleksi antitijelo / protein / DNA eluiraju se dva puta svježe napravljenim puferom za ispiranje (100 mM NaHC03, 1% SDS). Supernatanti su kombinirani i centrifugirani kako bi se uklonili svi tragovi agaroze proteina A. Povezane veze su uklonjene iz oborinskih uzoraka i ulazne kontrole inkubacijom s RNAzom A u prisustvu 0, 3 M NaCl (fc) na 65 ° C preko noći. Proteini i DNK su istaloženi dodatkom 2½ volumena etanola na -80 ° C 1 sat i lektirano centrifugiranjem. Pelete su suspendirane u 0, 01 M EDTA pH 8, 1, 0, 04 M Tris-Cl pH 6, 5 i 150 μg / ml proteinaze K i inkubirane su 2 sata na 45 ° C. Doda se 175 μl TE pufer i uzorci se ekstrahiraju jednom s fenol / kloroform / izoamil alkoholom i jednom s kloroform izoamil alkoholom. Uzorci su podešeni na 0, 85 M NaCl. Dodano je 5 μg tRNA i Roti-Pink (Roth, Karlsruhe, Njemačka) i 800 μl etanola i DNA je istaložena na -20 ° C preko noći. DNA je granulirana centrifugiranjem, razrijeđena s H20 i analizirana PCR korištenjem 1 μl svakog temeljnog premaza (50 μg / μl), 0, 5 μl dNTPs (10 mM) i GoTaq polimeraze (Promega). Pogledajte dodatnu tablicu 2 za redoslijed prajmera i ciklus ciklusa.

Dodatna informacija

Datoteke slika

  1. 1.

    Dopunska slika 1

  2. 2.

    Dopunska slika 2

  3. 3.

    Dopunska slika 3

  4. 4.

    Dopunska slika 4

  5. 5.

    Dopunska slika 5

  6. 6.

    Dopunska tablica 1

Word dokumenti

  1. 1.

    Dopunska tablica 2

  2. 2.

    Dopunska tablica 3

  3. 3.

    Dopunske figure i legende tablice

Glosar

MdmX

miš dvostruka minuta X

MDM2

miš dvostruka minuta 2

mESCs

mišje embrionalne matične stanice

pl

izoelektrična točka

GAPHD

gliceraldehid 3-fosfaddehidogenaza

kD

kilo dalton

LMB

leptomicin B

h

sat

CRM1

održavanje kromosomske regije 1

MEFs

mišji embrionalni fibroblasti

MTT

3 - [4, 5-dimetiltiazol-2-il] -2, 5-difeniltetrazolij bromid

K379

lizin 379

S6

serin 6

S15

serine 15

S392

serin 392

HDAC

histon deacetilaza

TSA

trihostatin A

NA

nikotinamid

Cdkn1

inhibitor kinaze ovisan o ciklinu 1

Igf2

faktor rasta 2 sličan inzulinu

LIF

inhibitor leukemije

iM

mikromolekulamu

mM

milimolarni

RNK

ribonukleinska kiselina

siRNK

mala interferirajuća RNA

CHAPS

3 - [(3-holamidopropil) dimetilaminijoj] -1 propansulfonat

PMSF

phenylmethylsulfonylflurorid

min

minuta (e)

min

rundi u minuti

ug

mikrogram

mg

miligram

IEF

izoelektrično fokusiranje

lI

umi

ml

mililitra

° C

stupnja Celzijusa

V

volt

cm

centimetar

SDS

sodiumdodecylsulfate

DTT

ditiotreitola

HEPES

(4- (2-hidroksietil) -1-piperazinetansulfonska kiselina

NaCl

sodiumchlorid

PBS

fosfatom PDAPP

IgG

imunoglobulin G

Co-IP

ko-imunoprecipitaciju

STRANICA

elektroforeza poliakrilamidnog gela

MgCl2

magnezijev klorid

NP-40

nonidet P40

ATP

adenozin trifosfat

G

mjerilo

l

À

mRNA

glasnik ribonukleinske kiseline

nT

nukleotid

QRT-PCR

kvantitativna lančana reakcija polimeraze u stvarnom vremenu

cDNA

kopirati DNK

MuLV

virusa mišje leukemije

RibPO

riboprotein

fc

konačna koncentracija

KCL

kalijev klorid

EDTA

etilendiamintetraoctena kiselina

Čip

kromatina-imunoprecipitaciju

BSA

albumin od goveđeg seruma

Lici

litijev klorid

TE

tris-EDTA

M

kutnjak

tRNA

prijenos RNA

dNTP

deoksinukleotide

WCL

lizat cijelih stanica

ECL

pojačana hemiluminiscencija

PCNA

umnožavanje staničnog nuklearnog antigena

TCA

triklorocetna kiselina

Oct3 / 4

faktor transkripcije oktamera 3/4

IP

imunoprecipitaciju

Dodatne informacije nalaze se u ovom radu na web stranici Cell Death and Disease (//www.nature.com/cddis)