Dugi nekodirajući rna tug1 reguliran p53 utječe na proliferaciju stanica u karcinomu pluća kod čovjeka koji nije malo ćelija, dijelom i putem epigenetičke regulacije ekspresije hoxb7 | stanična smrt i bolest

Dugi nekodirajući rna tug1 reguliran p53 utječe na proliferaciju stanica u karcinomu pluća kod čovjeka koji nije malo ćelija, dijelom i putem epigenetičke regulacije ekspresije hoxb7 | stanična smrt i bolest

Anonim

teme

  • Stanična proliferacija
  • Stanična signalizacija
  • Duge nekodirajuće RNA
  • Ne-stanični karcinom pluća

Sažetak

Nedavno se brzo otkriva nova klasa transkripata, dugih nekodirajućih RNA (lncRNA). Ove RNA imaju kritičnu ulogu u različitim biološkim procesima, uključujući tumorigenezu. Ovdje izvješćujemo da je taurin-regulirani gen 1 ( TUG1 ), 7.1-kb lncRNA, regrutovanje i vezanje za rekompresivni kompleks 2 (PRC2) u polikombi, uglavnom reguliran u tkivima karcinoma pluća malih stanica (NSCLC). U skupini od 192 pacijenta s NSCLC, niži izraz TUG1 bio je povezan s većim stadijom TNM-a i veličinom tumora, kao i lošijim ukupnim preživljavanjem ( P <0, 001). Univarijatna i multivarijatna analiza otkrila je da ekspresija TUG1 služi kao neovisni prediktor za opće preživljavanje ( P <0, 001). Daljnji eksperimenti otkrili su da je ekspresija TUG1 inducirana p53, a imunoprecipitacija luciferaze i kromatina (ChIP) potvrdila je da je TUG1 izravna transkripcijska meta p53. TUG1 knockdown značajno je promovirao proliferaciju in vitro i in vivo . Štoviše, regulacija ekspresije HOX gena u tumorigenezi i razvoju posredovana lncRNA nedavno je dobila sve veću pažnju. Zanimljivo je da inhibicija TUG1 može povećati ekspresiju homeobox B7 (HOXB7); ChIP testovi pokazali su da promotor HOXB7 lokusa veže EZH2 (pojačivač zeste homologa 2), ključne komponente PRC2, i trimetilira H3K27. Ova regulacija rasta posredovana TUG1 dijelom je zahvaljujući specifičnoj modulaciji HOXB7, čime sudjeluje u putovima AKT i MAPK. Zajedno, ovi rezultati sugeriraju da je TUG1 reguliran p53 regulatorom rasta, koji djeluje dijelom kroz kontrolu HOXB7. Interakcija p53 / TUG1 / PRC2 / HOXB7 može poslužiti kao meta za dijagnozu i terapiju NSCLC.

Glavni

Rak pluća je najčešći uzrok smrti povezane s rakom u svijetu. Nemi-stanični karcinom pluća (NSCLC) čini ∼ 85% svih slučajeva i općenito se dijagnosticira u naprednoj fazi. Karcinogeneza pluća je kompliciran biološki proces, koji je rezultat disregulacije mnogih gena povezanih s tumorima. 2 Stoga će bolje razumijevanje molekularnih mehanizama na kojima djeluje progresija NSCLC pružiti ruku za poboljšanje dijagnoze i liječenja ljudskog NSCLC.

S pojavom tehnologija nove sekvence sljedeće generacije postajalo je sve jasnije da se dugo nekodirajuće RNA (lncRNA) prožimaju transkripcijom u genom. 3, 4 LncRNA predstavljaju podskupinu nekodirajućih RNA koje su> 200 baza. 5 Nedavna istraživanja pokazala su da se veliki broj lncRNA dinamički izražava u tkivno specifičnim uzorcima, pokazujući slabije evolucijsko ograničenje i nižu razinu ekspresije od gena koji kodiraju proteine. 6 Do sada je poznato da veliki broj lncRNA ima važnu ulogu u staničnom razvoju, diferencijaciji i mnogim drugim biološkim procesima. 7, 8, 9, 10, 11, 12 Nađeno je da su neki lncRNA pogrešno regulirani u različitim bolestima, uključujući Duchenneovu mišićnu distrofiju 10 i srčane bolesti. 13 Aberantni izrazi lncRNA također su prikazani u različitim vrstama raka, uključujući NSCLC. 14, 15, 16, 17

Molekularni mehanizmi lncRNA su raznoliki. Mogli bi funkcionirati (I) kao lijekovi za pronalaženje faktora transkripcije; (II) kao regulatorni signali za transkripciju; (III) kao skele za agregaciju različitih proteina; (IV) kao "spužva" za interakciju s mikroRNA-ima; i (V) kao vodiči za vezivanje enzima koji modificiraju kromatin na ciljne gene. 10, 18 Tipičan je PRC2 (polimbusni represivni kompleks 2).

Nedavno su identificirani brojni lncRNA koji imaju izravnu ulogu u regrutovanju PRC2. PRC2, metiltransferaza koja se sastoji od EZH2 (pojačivač zeste homolog 2), SUZ12 (supresor zeste 12) i razvoj embrionalne ektoderme, može katalizirati di- i trimetilaciju lizinskog ostatka 27 histona 3 (H3K27me3), modulirajući na taj način. ekspresija gena. Ove lncRNA epigenetički reguliraju ekspresiju gena kroz vezanje na PRC2 u različitim biološkim procesima, posebno u karcinomu. Na primjer, HOTAIR, 2, 2-Kb lncRNA uključeni u suzbijanje HOX lokusa, koji su promovirali metastazu u dojkama. 11, 14 ANRIL, 3, 8-Kb lncRNA, uključen je u utišavanje p15 INK4B . 19 Oni pokazuju da je mnogo lncRNA povezano s PRC2 kompleksom, te da disregulacija lncRNA povezanih s PRC2 sudjeluje u različitim patološkim procesima, uključujući rak.

U posljednje vrijeme, Khalil i sur. 20 je identificiralo da se ∼ 20% lncRNA eksprimiranih u različitim tipovima stanica veže na PRC2 analizom imunoprecipitata (RIP) u cijelom genomu, uključujući gen za ublažavanje taurina 1 ( TUG1 ). TUG1, 7.1-kb lncRNA, inicijalno je otkriven na genomskom zaslonu za gene koji su regulirani kao odgovor na liječenje taurinom u mišjim stanicama mrežnice u razvoju. Otkriveno je da iscrpljivanje TUG1 u mišju u razvoju blokira razvoj mrežnice. 21 Ovi rezultati pokazuju da je TUG1 možda neophodan za razvoj i da bi njegova disregulacija mogla sudjelovati u napredovanju bolesti kod ljudi. Međutim, biološke funkcije TUG1 u kontroli NSCLC tumorigeneze nisu dobro okarakterizirane, što nas je potaknulo da istražimo ulogu TUG1 u ljudskom NSCLC.

U ovom istraživanju otkrili smo da je lncRNA TUG1 značajno smanjena u tkivima NSCLC u usporedbi s odgovarajućim ne-tumorskim plućnim tkivima i može poslužiti kao neovisni prediktor za opće preživljavanje NSCLC. Pored toga, TUG1 je bio direktni transkripcijski cilj p53 kroz interakciju s pretpostavljenim p53 odgovorom u promotorskoj regiji TUG1. Štoviše, TUG1 može regulirati rast stanica i in vitro i in vivo . Pored toga, pokazali smo da TUG1 može epigenetički modulirati homeobox B7 (HOXB7), koji dijelom može objasniti regulaciju proliferacije posredovanu sa TUG1, utječući na proliferaciju NSCLC i in vitro i in vivo .

Rezultati

Ekspresija TUG1 je regulirana u ljudskim tkivima NSCLC i korelira s lošom prognozom

Da bismo otkrili razinu ekspresije TUG1, analizirali smo ekspresiju TUG1 pomoću qRT-PCR u 192 parova NSCLC tkiva u usporedbi s odgovarajućim ne-tumorskim tkivima i otkrili da je TUG1 značajno smanjen u 86% (166 od 192) karcinoma ( smanjen za> 50%, P <0, 001) u usporedbi s normalnim kolegama, kako u plućno-pločasti staničnom karcinomu, tako i u tkivima adenokarcinoma pluća (Slika 1a). Zatim smo ispitali povezanost razine ekspresije TUG1 s kliničkim parametrima u NSCLC. Kao što je prikazano na slikama 1b i c, snižavanje regulacije TUG1 povezano je s naprednim patološkim stadijem ( P = 0, 002) i većom veličinom tumora ( P = 0, 003). Ostali klinički parametri, na primjer, spol (muški i ženski), dob (≤60 godina i> 60 godina) i status pušenja, u našem istraživanju (Dopunska tablica S2) nisu u značajnoj vezi s TUG1.

Image

Analiza ekspresije TUG1 u tkivima NSCLC i kliničkim parametrima. ( a ) TUG1 je otkriven u 192 parova NSCLC tkiva pomoću qRT-PCR. Razine TUG1 u tkivima NSCLC značajno su niže od onih u netumornim tkivima. Vrijednost ΔCt određena je oduzimanjem vrijednosti GAPDH Ct od vrijednosti TUG1 Ct (u odnosu na jednu referentnu vrijednost). Manja vrijednost ΔCt ukazuje na veći izraz. ( b i c ) Podaci su prikazani kao relativna razina ekspresije u tumorskim tkivima (prikazana kao ΔCt). Ekspresija TUG1 bila je značajno niža u bolesnika s višim patološkim stadijem i velikom veličinom tumora. ( d ) Bolesnici s niskom razinom ekspresije TUG1 pokazali su smanjeno vrijeme preživljavanja u usporedbi s pacijentima s visokom razinom ekspresije TUG1 ( P <0, 001, log-rank test). ** P <0, 01

Slika pune veličine

Analiza preživljavanja Kaplana-Meiera i ispitivanja rangiranja dnevnog reda primjenom postoperativnog preživljavanja pacijenta provedene su kako bi se dodatno procijenila povezanost između ekspresije TUG1 i prognoze bolesnika s NSCLC. Srednja vrijednost ΔCt za TUG1 u tumorskim tkivima korištena je za podjelu uzoraka na visoku (ispod medijane, n = 96) i nisku (iznad medijane, n = 96) ekspresijsku skupinu TUG1, a odgovarajuća P- vrijednost izračunata je sa analiza rang-zapisa. Iz krivulje preživljavanja Kaplan-Meier, opazili smo da su pacijenti s visokom razinom ekspresije TUG1 imali znatno duže vrijeme preživljavanja od onih s niskim razinama ( P <0, 001, test rang-loga; Slika 1d).

Univarijantnom analizom identificirali smo tri prognostička čimbenika: histološki stupanj (nizak, srednji ili visoki), TNM stadij (I / II, III / IV) i TUG1 ekspresiju, dok su ostali klinički parametri, poput metastaze na limfnim čvorovima (N0, N1 i više), dob (≤60 godina i> 60 godina), spol (muškarac i žena), veličina tumora (≤3 cm i> 3 cm) i pušenje u povijesti nisu bili značajni faktori prognoze. Nadalje, multivarijantna analiza otkrila je da se ekspresija TUG1 može smatrati značajnim neovisnim prediktorom lošeg preživljavanja bolesnika s NSCLC ( P <0, 001), kao i histološkom ocjenom ( P = 0, 002) i stadiju TNM-a ( P <0, 001) (dopunska tablica S3).

Uzeto zajedno, ovi rezultati sugeriraju da smanjivanje regulacije TUG1 može imati važnu ulogu u razvoju i napredovanju NSCLC-a.

TUG1 je induciran od p53, a p53 djeluje s elementom odgovora p53 u promotorskom području TUG1

Da bismo istražili mehanizam niske ekspresije TUG1, najprije je proveden qRT-PCR radi otkrivanja ekspresije TUG1 u različitim NSCLC staničnim linijama. Kao što je prikazano na slici 2a, tri stanične linije (A549, SK-MES-1 i NCI-H1299) izražavale su niže razine TUG1 u usporedbi s normalnom stanicom epitela bronha (16HBE) i dvije stanične linije (SPC-A1 i NCI-H1650 ) izražene relativno visoke endogene razine TUG1. Drugo, analizirali smo promocijsku regiju TUG1 i otkrili prisutnost p53-mjesta vezivanja (divlji tip (WT)), kao što je prikazano na slici 2b. Nagađali smo da bi p53 mogao modulirati ekspresiju TUG1 na razini transkripcije. Zatim smo obradili stanice HCT-116 koje eksprimiraju WT p53 (HCT-116 WT) s različitim koncentracijama doksorubicina (doxo), poznatog agensa koji oštećuje DNA. Nakon 24 sata, provedena je analiza Western blot-a kako bi se utvrdila razina ekspresije p53, a rezultati su pokazali da doxo inducira p53 na način ovisan o dozi (Slika 2c). Zatim smo 24 sata liječili HCT-116 u 1, 5 µg / ml i otkrili da doxo može inducirati TUG1 ekspresiju. Pored toga, takva je indukcija detektirana i u ostalim staničnim linijama koje eksprimiraju divlji tip p53, to jest MCF-7, SPC-A1 i A549 (Slika 2c). Za potvrdu specifičnog utjecaja p53 na ekspresiju TUG1, tretirali smo stanice NCI-H1299 (p53-nulta stanična linija) u istoj koncentraciji doxo. U p53-nulnim stanicama (NCI-H1299) nije otkrivena gotovo nikakva indukcija (Slika 2c). Kako doxo može inducirati stanični odgovor neovisan o p53, pojačali smo p53 ekspresiju transfektiranjem vektora ekspresije p53 (WT) i također otkrili da prisilna p53 ekspresija povećava ekspresiju TUG1 (slika 2d), također u staničnoj liniji A549 (dopunska slika S2A), slično indukciji primijećenog gena koji je reguliran p53, p21 (slika 2c). Zatim smo pokušali utvrditi može li p53 mutacija regulirati TUG1 ekspresiju. U tom smislu, p53 s točkovnom mutacijom (R175H) na domeni koja veže DNA, čest mutant kod raznolikih karcinoma, 22 nije imao utjecaja na TUG1 ekspresiju, što ukazuje da TUG1 posebno inducira WT p53.

Image

p53 inducira TUG1 kroz interakciju s promotorskom regijom TUG1. ( a ) Analiza razine ekspresije TUG1 u staničnim linijama NSCLC (A549, SPC-A1, SK-MES-1, NCI-H1299 i NCI-H1650) u usporedbi s normalnom staničnom linijom epitela bronha (16HBE) pomoću qRT-PCR. ( b ) Opis p53RE i mutantnog p53RE u promotorskoj regiji TUG1. Položaj ChIP primera ( e ) označen je strelicama. ( c ) Western blot je upotrijebljen za otkrivanje indukcije p53 doxo-om. qRT-PCR se koristio za otkrivanje učinka doxo na TUG1 ekspresiju u p53-WT i p53-null stanicama. ( d ) Indukcija TUG1 ektopički eksprimiranim p53 (divlji p53 ili mutirani p53). Prekomjerna ekspresija potvrđena je Western blottingom. ( e ) Indukcija promotorskih aktivnosti TUG1 p53, ali ne i mutirajuća p53 u NCI-H1299 staničnim linijama. ( f ) Analiza brisanja i mutacije promotorske aktivnosti da bi se utvrdila uloga p53RE u regulaciji TUG1 posredovane p53. ( g ) Vezanje p53 u promotorskim regijama TUG1 ocijenjeno je ChIP analizom. ChIP temeljni premazi su detaljno opisani u odjeljku Materijali i metode. Prikazane su reprezentativne slike tri neovisna pokusa. Trake pogrešaka znače ± SEM * P <0, 05, ** P <0, 01. ns, nije značajno

Slika pune veličine

Da bismo odredili da li p53 transkripcijski regulira TUG1, klonirali smo promotorsku regiju (∼ 1, 6 kb) TUG1 u plazmid reportera luciferaze (pGL3 bazični). Kao što je prikazano na slici 2e, testovi luciferaze pokazali su da p53 inducira aktivnost promotora TUG1, što je usporedivo s indukcijom p21 promotora. Pored toga, otkrili smo da mutant p53 nije imao utjecaja na promotorsku aktivnost TUG1 (slika 2e). Da bismo dodatno odredili funkciju ovog p53RE, izvršili smo brisanje na promotoru TUG1 (slika 2f). Nakon transfekcije ekspresionim plazmidom p53, delecija (koja ne sadrži p53RE) uzrokovala je značajno smanjenje aktivnosti promotora u usporedbi s konstrukcijom promotora pune duljine (Slika 2f). Nadalje, mutageneza usmjerena na mjesto koja uključuje sačuvani C i G p53RE (slika 2b) također je značajno smanjila aktivnost luciferaze (slika 2f).

Da bi se utvrdilo može li se p53 izravno vezati na mjesta TUG1 promotora in vitro , izvedeni su eksperimenti s kromatinskom imunoprecipitacijom (ChIP). Kao što je prikazano na slici 2 g, p53 imunoprecipitacija uočena je na promotoru TUG1 u staničnim linijama 16HBE, A549, SPC-A1, NCI-H1650 i SK-MES-1. Kao negativna kontrola korišten je izotip-podudarni IgG, a p21 je služio kao pozitivna kontrola za ChIP test. Položaj ChIP primera označen je strelicama (slika 2b).

Zajedno, ovi rezultati pokazuju da p53 djeluje s elementom odgovora p53 u promotoru TUG1, potičući na taj način njegovu transkripciju.

TUG1 regulira NSCLC staničnu proliferaciju i in vitro i in vivo

Poznato je da P53 inducira mnoge gene, poput p21, genskog supresorskog gena. Da bi se istražila biološka posljedica p53 indukcije p53 TUG1 u stanici NSCLC, odabrane su relativne stanice visokog izražaja (SPC-A1, NCI-H1650) za daljnje ispitivanje u usporedbi s normalnom staničnom linijom epitela bronha (16HBE). Prvo, TUG1 knockdown izveden je korištenjem dva različita siRNA (si-TUG1 2 # i si-TUG1 3 #) da se izbjegnu off-target efekti (Slika 3a). Zatim je MTT ispitivanje pokazalo da oborenje TUG1 ekspresije značajno povećava staničnu proliferaciju i u staničnim linijama SPC-A1 i NCI-H1650 u usporedbi s kontrolnim stanicama (Slika 3b). Zatim je provedeno ispitivanje formiranja kolonije da bi se otkrila vitalnost stanica. Kao što je prikazano na slici 3c, broj kolonija SPC-A1 i NCI-H1650 stanica zaraženih si-TUG1 bio je očigledno veći od onih koji su zaraženi si-NC. Provedena je protočna citometrijska analiza kako bi se dodatno ispitalo je li utjecaj TUG1 na proliferaciju NSCLC stanica mijenjanjem napredovanja staničnog ciklusa. Rezultati su otkrili da stanice SPC-A1 i NCI-H1650 transficirane si-TUG1 mogu ubrzati napredovanje staničnog ciklusa (Slika 3d).

Image

Učinak TUG1 na rast stanica in vitro. ( a ) Relativna razina ekspresije TUG1 u stanicama SPC-A1, transfektirana si-NC ili si-TUG1 (si-TUG1 # 1, # 2 i # 3) testirana je qPCR-om. ( b ) 24 sata nakon transfekcije proveden je MTT test kako bi se utvrdila proliferacija stanica SPC-A1 i NCI-H1650. ( c ) Reprezentativni rezultati formiranja kolonija SPC-A1 i NCI-H1650 stanica transficiranih si-NC ili si-TUG1. ( d ) 48 sati nakon transfekcije stanični ciklus je analiziran protočnom citometrijom. Vrijednosni grafikon predstavlja postotak stanica u fazi G1 – G0, S ili G2 – M, kako je naznačeno. ( e ) SPC-A1 transfektiran sa si-NC / si-TUG1 / p53 + si-NC i transfektiran s p53, nakon čega slijedi transfekcija si-RNA TUG1. Četrdeset osam sati nakon transfekcije, stanice su obojene i analizirane protočnom citometrijom. LR, rane apoptotičke stanice. UR, terminalne apoptotičke stanice. Trake pogrešaka znače ± SEM * P <0, 05, ** P <0, 01

Slika pune veličine

Da se dalje utvrdi fiziološka uloga TUG1 u rastu stanica, stanice SPC-A1 su transfektirane s p53 ekspresijskim vektorom i zatim si-RNA TUG1 2 #. Nakon 48 h, progresija staničnog ciklusa i apoptoza analizirani su protočnom citometrijskom analizom. Naši eksperimenti pokazali su da ko-transfekcija p53 i si-TUG1 može djelomično preokrenuti zaustavljanje rasta i pojačavanje apoptoze koje potiče p53 (Slika 3e). Pored toga, si-TUG1 2 # pokazao je bolji supresivni učinak. Stoga smo odlučili koristiti si-TUG1 2 # u kasnijim studijama.

Da bi se potvrdilo utječe li razina TUG1 ekspresije na tumorigenezu, SPC-A1 stanice koje su transficirane od scramble / shTUG1 inokulirane su u gole miševe. Svi su miševi razvili ksenograft tumore na mjestu ubrizgavanja. Kao što je prikazano na slikama 4a i b, rast tumora u shTUG1 skupini bio je značajno brži od onog u kontrolnoj skupini. Do 16 dana nakon injekcije prosječna težina tumora u grupi SPC-A1 / shTUG1 bila je znatno veća nego u kontrolnoj skupini. Provedena je qRT-PCR analiza kako bi se utvrdila prosječna ekspresija TUG1 u tumorskim tkivima (slika 4c). Također smo otkrili da su tumori razvijeni iz stanica SPC-A1 / shTUG1 pokazali veću obojenost od Ki-67 od one u tumorima formiranim SPC-A1 / scramble-transfektiranim stanicama, što je utvrđeno imunohistokemijskom (IHC) analizom (slika 4d).

Image

Utjecaj TUG1 na tumorigenezu in vivo . ( a i b ) Scramble ili shTUG1 je transfektiran u stanice SPC-A1, koje su ubrizgane u gole miševe ( n = 10), respektivno. Volumen tumora izračunat je nakon injekcije svaka 2 dana. Trake označavaju SD ( c ) Težine tumora predstavljene su kao sredstva težine tumora ± SD qRT-PCR izveden je radi otkrivanja prosječne ekspresije TUG1. ( d ) Histopatologija tumora ksenografta. Odjeljci tumora bili su pod H&E bojenjem i IHC obojenjem pomoću antitijela protiv Ki-67. Bar, 100 μ m. Trake pogrešaka znače ± SEM * P <0, 05, ** P <0, 01

Slika pune veličine

TUG1 je mogao sudjelovati na AKT i MAPK putu epigenetskim reguliranjem HOXB7

Važnost lncRNA leži u reguliranju ekspresije gena u ljudskim bolestima. TUG1 može regulirati ekspresiju gena vezanjem na PRC2. Nedavno je regulacija posredovana lncRNAsom o ekspresiji HOX genetske porodice dobila veću pozornost u tumorigenezi i razvoju. 11, 23, 24 Mnoga su istraživanja pokazala da je HOX familija gena identificirana kao klasični ciljevi modifikacije polimbropskog kompleksa tijekom razvoja, a sva četiri klastera bila su visoko obogaćena oznakama H3K27me3. 25 Nadalje, pronađen je veliki broj aberantnih ekspresija Hox gena kod različitih karcinoma. 26 Dalje, pitali smo da li je bilo koji od Hox gena pod utjecajem TUG1, sudjelujući u progresiji tumora. Provedena je qRT-PCR analiza radi otkrivanja ekspresije HOX gena. Rezultati su pokazali da je ekspresija mRNA HOXB7, HOXD4, HOXD9 i HOXD10 inducirana u stanicama SPC-A1 transfektiranim si-TUG1 (slika 5a). Zatim smo analizirali ekspresiju ovih gena pomoću qRT-PCR u 50 parova NSCLC tkiva (nasumično odabranih prema svakom udjelu TNM stadija u svih 192 pacijenta) u usporedbi s odgovarajućim ne-tumorskim tkivima i otkrili smo da je HOXB7 reguliran u tkivima NSCLC. Nije utvrđena značajna razlika u izrazima HOXD4, HOXD9 i HOXD10 (dopunska slika S1). Pored toga, knockdown TUG1 također je povećao ekspresiju HOXB7 također u staničnoj liniji NCI-H1650. IHC analizom utvrđeno je da tumori razvijeni iz shTUG1 stanica pokazuju jače obojenje HOXB7 od onog u kontroli (slika 5a). Da bismo istražili molekularne mehanizme uključene u regulaciju HOXB7 posredovanu sa TUG1, ispitali smo ulogu PRC2 u regulaciji HOXB7. Prvo smo potvrdili da se TUG1 može direktno vezati za PRC2 u SCP-A1 stanicama RIP testom, kao i za stanice SK-MES-1 (dopunska slika S2C); su istaložena RNA podvrgnuta je qRT-PCR za TUG1, a HOTAIR je poslužio kao pozitivna kontrola (slika 5b). Pored toga, mjerili smo ekspresiju TUG1 u nuklearnoj i citosolnoj frakciji iz SPC-A1 i A549 staničnih linija s qRT-PCR. Diferencijalno obogaćivanje GAPDH i U6 RNA korišteno je kao pokazatelje frakcijske frakcije (dopunska slika S2D). Pronašli smo značajan porast ekspresije TUG1 u jezgri u odnosu na citosol (slika 5b), sugerirajući tako da je TUG1 uglavnom lokaliziran u jezgri i da ima glavnu regulatornu funkciju na razini transkripcije. Stanice se zatim transficiraju siRNA ciljajući ključnu katalitičku podjedinicu PRC2 histon metiltransferaze, EZH2, H3K27-trimetilirane, što učinkovito smanjuje razinu EZH2 (dopunska slika S2B). Rezultati ChIP pokazuju da su prajmeri usmjereni na ± 200 bp od mjesta transkripcije promotora HOXB7 detektirali trimetilaciju H3K27 i vezanje PRC2 u stanicama SPC-A1 transficiranim si-NC. Knockdown TUG1 otkrio je gubitak vezanja PRC2 i smanjenje zauzetosti trimetilacije H3K27 (slika 5c). Ovi rezultati sugeriraju da je TUG1 potreban za ciljanje PRC2 popunjenosti i aktivnosti za regulaciju transkripcije HOXB7. Ovi rezultati sugeriraju da TUG1 može epigenetički modulirati ekspresiju HOXB7 vezanjem na PRC2.

Image

TUG1 može epigenetički regulirati HOXB7 vezanjem na PRC2. ( a ) qRT-PCR je proveden za otkrivanje ekspresije HOX gena u transfektiranim stanicama, a Western blot testovi su korišteni za otkrivanje nivoa HOXB7 nakon transfekcije si-TUG1. IHC testovi korišteni su za otkrivanje HOXB7 u odjeljcima tumora iz stanica transficiranih shTUG1. ( b ) RIP eksperimenti su izvedeni u SPC-A1, a koprecipitirana RNA podvrgnuta je qRT-PCR za TUG1. HOTAIR se koristio kao pozitivna kontrola. Bogatija obogaćivanje TUG1 u EZH2 RIP relativno je u odnosu na odgovarajući RIP IgG kontrole. TUG1 nuklearna lokalizacija, kako je identificirano pomoću qRT-PCR u frakcioniranim stanicama SPC-A1 i A549. ( c ) ChIP H3K27me3 i EZH2 promotorne regije HOXB7 lokusa nakon tretiranja siRNA ciljajući si-NC ili si-TUG1; qPCR je proveden za određivanje kvantitativnosti ChIP testova. Razine qPCR proizvoda izražene su u postotku od ulazne DNK. Trake pogrešaka znače ± SEM * P <0, 05, ** P <0, 01

Slika pune veličine

HOXB7, kao poznati onkogen, 27, 28, 29, 30 ima važnu ulogu u različitim vrstama raka. Da bismo dodatno ispitali ulogu HOXB7 u NSCLC, koristili smo siRNA za smanjivanje HOXB7 ekspresije (dopunska slika S2B). MTT testovi otkrili su da stanice transficirane si-HOXB7 imaju značajnu inhibiciju rasta u usporedbi sa stanicama koje su transficirane si-NC, a ko-transfekcija (si-TUG1 i si-HOXB7) može djelomično preokrenuti inhibiciju rasta izazvanu si-HOXB7 ( Slika 6A). Zatim je protočna citometrijska analiza pokazala da je napredovanje staničnog ciklusa si-HOXB7 stanica zaustavljeno na fazama Gl-G0 u usporedbi sa stanicama koje su transficirane si-NC, a oboreni HOXB7 mogao je izazvati apoptozu (Slika 6A). Ovi su nalazi u skladu s učinkom TUG1. Važno je da prekomjerna ekspresija p53 može inhibirati HOXB7 ekspresiju, a ko-transfekcija (p53 i si-TUG1) mogla bi djelomično ukinuti inhibiciju HOXB7 izazvane p53 (Slika 6B).

Image

TUG1 je mogao sudjelovati u AKT i MAPK putu kroz modulaciju HOXB7. ( A ) MTT analiza stanične proliferacije ko-transfekcijom (si-NC, si-HOXB7, si-HOXB7 + si-TUG1). 48 sati nakon transfekcije si-HOXB7 stanični ciklus i apoptoza analizirani su protočnom citometrijom. LR, rane apoptotičke stanice. UR, terminalne apoptotičke stanice. ( B ) provedena je qRT-PCR radi otkrivanja ekspresije HOXB7 nakon prekomjerne ekspresije p53 i transfektirane s p53, nakon čega slijedi transfekcija si-TUG1. ( C ) Western blot analiza u ekspresiji p-ERK, ukupnog ERK, p-AKT, ukupnog AKT, p-GSK-3 β , ukupnih GSK-3 β proteina u naznačenim si-NC-transficiranim, si-HOXB7 i si -TUG1-transfektirane stanične linije SPC-A1. ( D ) Imuno obojenje HOXB7 bilo je negativno ili vrlo slabo pozitivno u odgovarajućim netumorskim plućnim tkivima (a i b), ali je bilo snažno pozitivno u tkivima karcinoma pločastih stanica (c i d) i adenokarcinomu pluća (e i f). Bar, 100 μ m. ( E ) Imunoreaktivnost proteina HOXB7 u tkivima NSCLC pokazala je statistički značajnu obrnutu korelaciju s relativnom razinom ekspresije TUG1. Trake pogrešaka znače ± SEM * P <0, 05, ** P <0, 01

Slika pune veličine

Nadalje, HOXB7 je promovirao proliferaciju stanica aktiviranjem AKT i MAPK staza. 28 Western blotting je otkrio da su razine p-ERK, p-AKT i p-GSK3 β smanjene padom HOXB7 i povećane padom TUG1 u SPC-A1 stanicama, respektivno (Slika 6C).

Pored toga, IHC je korišten za otkrivanje ekspresije HOXB7 proteena u NSCLC i odgovarajućim ne-tumorskim plućnim tkivima. Svi tumori pokazali su pozitivno imunološko obojenje proteina HOXB7, kako u plućnom pločasti karcinomu pluća, tako i u plućima adenokarcinoma pluća: 12 od 50 slučajeva NSCLC (24, 0%) pokazalo je slabo pozitivno bojenje, a 38 slučajeva NSCLC (76%) izrazito pozitivno bojenje. Suprotno tome, sva odgovarajuća ne-tumorska plućna tkiva pokazala su negativno ili slabo pozitivno imunološko obojenje proteina HOXB7 (Slika 6D). Daljnja analiza otkrila je da je ekspresija TUG1 obrnuto povezana s razinom proteina HOXB7 u tkivima NSCLC (slika 6E).

Ovi rezultati sugeriraju da TUG1 može sudjelovati u AKT i MAPK putu kroz modulaciju HOXB7, vezanjem na PRC2, što ukazuje da TUG1 utječe na rast stanica NSCLC barem djelomično kroz epigenetsku regulaciju HOXB7.

Rasprava

Postaje očigledno da genomi sisavaca kodiraju tisuće lncRNA. 4 Pored mikroRNA, lncRNA se pojavljuju kao važni čimbenici u staničnoj biologiji. Do danas, sve veći broj dokaza povezuje disregulaciju lncRNA s različitim ljudskim bolestima, uključujući tumore. 31

U našem trenutnom istraživanju otkrili smo da je prosječna razina TUG1 u tkivima NSCLC bila značajno niža od one u odgovarajućim ne-tumorskim tkivima. Niska razina ekspresije TUG1 u bolesnika s NSCLC bila je povezana s uznapredovalom patološkom fazom i veličinom tumora. Štoviše, niska ekspresija TUG1 u tkivima NSCLC povezana je s lošom prognozom i mogla bi biti neovisan prognostički pokazatelj. Međutim, TUG1 je prekomjerno izražen kod raka mokraćnog mjehura, raka želuca i osteosarkoma. 32, 33, 34 Ovo otkriće je vjerojatno zato što lncRNA pokazuju izrazito specifične tkivne uzorke nego gene koji kodiraju proteine. 6, 35 Ovi rezultati pokazuju da TUG1 može imati tkivno specifičan uzorak ekspresije i pokazati važnu ulogu u razvoju i napredovanju NSCLC.

Disregulacija lncRNA pridružuje se širokom nizu patoloških procesa, ali mehanizmi ekspresije lncRNA nisu jasni i potrebno je daljnje istraživanje. Ovdje, pomoću bioinformacijske analize, otkrili smo da promotor TUG1 sadrži sačuvano mjesto za vezanje p53, što je u skladu s predviđenim rezultatima Khakija. 20 Uz to, naši rezultati pokazali su da je TUG1 izravna transkripcijska meta p53. Naše istraživanje pokazalo je da odsutnost p53 ekspresije može doprinijeti smanjivanju regulacije TUG1 u NSCLC.

Iako je TUG1 proučavan u različitim fiziološkim i patološkim procesima, moguća je uloga TUG1 u NSCLC-u tek treba razjasniti. U našem istraživanju, funkcija TUG1 istraživana je srušenjem posredovanih RNA (RNAi) i prekompresijom izazvanom p53. Kao rezultat, inhibicija TUG1 može pospješiti proliferaciju NSCLC stanica in vitro i in vivo . Pored toga, otkriveno je da djelomično preokret egzogenog RNAi TUG1 posredovanog p53 rastom i indukcija apoptoze. Naše studije otkrile su da TUG1 može biti efektor p53 nizvodno.

Mnogi lncRNA moduliraju specifične genske lokuse vrbovanjem i vezanjem za PRC2 proteinske komplekse, a epigenetska regulacija posredovana PRC2 ima presudnu ulogu u procesu razvoja tumora. 14 Dakle, TUG1 može potaknuti svoju biološku aktivnost vezanjem na PRC2, epigenetički regulirajući ekspresiju gena. U novije vrijeme regulacija ekspresije HOX gena u tumorigenezi i razvoju posredovana lncRNAs pridaje sve veću pažnju. Na primjer, HOTAIR stupa u interakciju s PRC2 i potreban je za histon H3 lizin-27 trimetilaciju HOXD lokusa. Wang i sur. 23 su otkrili da se lncRNA HOTTIP veže izravno na proteinski adapter WDR5 i cilja WDR5 / MLL komplekse preko HOXA, pokrećući trimetilaciju histon H3 lizina 4 i aktivirajući transkripciju gena. Kao dobro poznate modifikacijske ciljeve polimomskog kompleksa zbog bogatstva markera H3K27me3, HOX geni su važni za morfogenezu i razvoj. 36 Disregulacija ekspresije gena HOX pokazala se u mnogim raznim vrstama karcinoma. 26 Osim toga, Ke i sur. 37 je pokazalo da se H3K4me3 i H3K27me3 prebacuju u HOX genskim klasterima između normalnih stanica i stanica karcinoma prostate kroz genomsku analizu modifikacija H3K4me3 i H3K27me3.

Inspirirani gornjom činjenicom, otkrili smo razinu ekspresije porodice HOX gena nakon obaranja TUG1. Među različito eksprimiranim genima otkrili smo da je HOXB7 reguliran u tkivima NSCLC i da ima usko povezanu funkciju u karcinogenezi. Pored toga, RIP testovi potvrdili su da se TUG1 može vezati na PRC2, a ChIP testovi potvrdili su da je padom TUG1 gubitak trimetilacije H3K27 i vezanje PRC2 na genomske lokuse HOXB7, potvrđujući da je HOXB7 bio bona meta reguliranog od TUG1 / PRC2. geni.

U pokušaju razumijevanja biološke uloge HOXB7 u NSCLC, inhibirali smo ekspresiju HOXB7 i otkrili prividnu inhibiciju proliferacije. Pored toga, HOXB7 regulira rast stanica uglavnom putem MAPK i PI3K / Akt putova aktivacije. 28 Srušenje TUG1 također može povećati razine p-ERK, p-AKT i p-GSK3 β . Nadalje, naši rezultati pokazali su da su razine ekspresije HOXB7 bile regulirane u ljudskim tkivima NSCLC i obrnuto su korelirane s razinama ekspresije TUG1. Kao član HOX familije gena, visoka razina HOXB7 promiče stopu proliferacije u različitim vrstama tumora, ističući onkogeno obilježje ovog gena. 28, 38, 39 Pored toga, Rosenfeld i kolege 40 otkrili su da TUG1 s određenom lokalizacijom može premjestiti transkripcijske jedinice u trodimenzionalni prostor jezgre kao odgovor na signale rasta vezanjem na metilirani Pc2 (Polycomb 2 protein), regulirajući tako. aktivnost promotora gena za kontrolu rasta Naši rezultati pokazali su značajan porast ekspresije TUG1 u jezgri u usporedbi s citosolom (Slika 5b) i da TUG1 može epigenetički regulirati HOXB7 (Slika 5c). U našoj studiji nađeno je da se padom TUG1 dovodi do anti-apoptotičke aktivnosti; niži izraz TUG1 pojačava ovaj učinak zbog gubitka vezanja PRC2 i zauzetosti trimetilacije H3K27 na HOXB7 lokusu, slično funkciji ncRNA intSMYD3. 41 Nadalje, epigenetska deregulacija, posebno histonska modifikacija, pridonosi deregulaciji HOX gena u karcinomu. 26 Ova negativna korelacija naglašava važnost TUG1, posebno u NSCLC tumorigenezi. Naši nalazi pružaju novi potencijalni mehanizam kroz koji HOXB7 pojačava proliferaciju tumorskih stanica.

Ova studija sugerira da lncRNA također mogu biti sastavni dio mreže koja regulira p53, slično kao geni koji kodiraju proteine. For example, PANDA and lincRNA-p21, have been confirmed to be p53 transcription targets. 42, 43 In addition, we demonstrated that the co-transfection (p53 and si-TUG1) could partially abrogate p53-mediated HOXB7 inhibition. Therefore, TUG1-mediated regulation of cell growth is at least in part through regulation of HOXB7. Collectively, we showed that TUG1 is an important prognostic factor for NSCLC patients and modulates NSCLC cell proliferation both in vitro and in vivo bioassays. TUG1 as a member of PRC2-mediated epigenetic regulation participates in the occurrence and development of NSCLC. Our study may supply a strategy for targeting with the p53/TUG1/PRC2/HOXB7 interaction as a novel therapeutic application for NSCLC patients.

Dodatna informacija

Datoteke slika

  1. 1.

    Dopunska slika S1

  2. 2.

    Dopunska slika S2

Word dokumenti

  1. 1.

    Dopunski materijali i metode

  2. 2.

    Dopunska tablica S2

  3. 3.

    Dopunska tablica S3

Excel datoteke

  1. 1.

    Dopunska tablica S1

Glosar

lncRNA

long non-coding RNA

TUG1

taurine-upregulated gene 1

PRC2

polycomb repressive complex 2

NSCLC

non-small cell lung carcinoma

EZH2

enhancer of zeste homolog 2

HOXB7

homeobox B7

Čip

kromatinska imunoprecipitacija

POČIVAO U MIRU

RNA imunoprecipitacija

Dodatne informacije nalaze se u ovom radu na web stranici Cell Death and Disease (//www.nature.com/cddis)