P57kip2 kontrola dinamike citoskeleta aktina odgovorna je za njegov pro-apoptotski učinak mitohondrija | stanična smrt i bolest

P57kip2 kontrola dinamike citoskeleta aktina odgovorna je za njegov pro-apoptotski učinak mitohondrija | stanična smrt i bolest

Anonim

teme

  • aktin
  • apoptoza
  • Migracija stanica
  • Proteini koji su supresori tumora

Sažetak

za p57 (Kip2, inhibitor kinaze ovisne o ciklinu 1C), koji se često nalazi u regulaciji raka, prijavljeno je da ima supresijska svojstva tumora. Izvorno opisan kao inhibitor klinaste (cdk) ovisne o ciklinu, dokazano je da p57 KIP2 utječe na druge stanične procese, van regulacije staničnog ciklusa, uključujući staničnu smrt i staničnu migraciju. Inhibicija stanične migracije p57 KIP2 pripisuje se stabilizaciji citoskeleta aktina aktiviranjem LIM kinaze domene-1 (LIMK-1). Nadalje, p57 KIP2 može poboljšati mitohondrijalno posredovanu apoptozu. Ovdje izvještavamo da je efekt p57 KIP2 koji potiče smrt stanica povezan s njegovim učinkom na citoskelet aktina. Doista, dok je Jasplakinolid, sredstvo za stabilizaciju citoskeleta u aktinu, oponašalo pro-apoptotički učinak p57 KIP2, destabilizirajući citoskelet aktina s citohalsinom D preokrenuo pro-apoptotsku funkciju p57 KIP2 . Suprotno tome, LIMK-1, efekt enzima koji posreduje p57 KIP2 na citoskelet aktina, bio je potreban za učinak promicanja smrti p57 KIP2 . Konačno, p57 KIP2 posredovana stabilizacija citoskeleta aktina povezana je s premještanjem hekokinaze-1, inhibitora anionskog kanala o mitohondrijskom naponu, iz mitohondrija, pružajući mogući mehanizam za promociju puta smrti mitohondrijske apoptotske stanice, Sve u svemu, naša otkrića povezuju dva tumorska svojstva p57 KIP2, pokazujući da promicanje stanične smrti pomoću p57 KIP2 zahtijeva njezinu funkciju stabilizacije citoskeleta.

Glavni

p57 (Kip2, inhibitor kinaze ovisne o ciklinu 1C) opisan je kao potencijalni gen supresorskog tumora zbog njegove sposobnosti inhibicije nekoliko karakteristika raka. 1 Važnost p57 KIP2 u suzbijanju karcinoma naglašena je njegovom mutacijom / inaktivacijom u Beckwith-Wiedemannov sindromu, sindromom predipozicije raka, 2 i izvještavanim smanjenjem ekspresije proteina kod karcinoma dojke, pluća, jetre i prostate, među ostalim. 3, 4, 5, 6, 7, 8 Inhibicija p57 KIP2 ekspresije u stanicama raka posreduje promocijskom metilacijom DNA na CpG otocima i / ili histonskim modifikacijama, poput metilacije i deacetilacije. 1 Vrijedno napomenuti, nedostatak p57 KIP2 ekspresije u tumorima povezan je s lošim preživljavanjem i prepoznat je kao prognostički marker za mnoge od spomenutih vrsta raka. 1

U početku je identificiran kao član Cip / Kip porodice inhibitora Cdk (ciklin-ovisna kinaza), pokazalo se da je 9, 10 p57 KIP2 imao raznoliku staničnu ulogu osim inhibicije staničnog ciklusa, na primjer, promicanje stanične smrti, 11, 12, 13 inhibicija stanične migracije, 14 i regulacija diferencijacije stanica. 15, 16, 17 Uzimajući u obzir da nula miševa p57 KIP2 imaju povećanu letalnu smrtnost i brze razvojne nedostatke u usporedbi s nula miševa p21 CIP1 / CDKN1A i p27 KIP2 / CDKN1B, čini se da ćelijske uloge p57 KIP2 nadmašiti ulogu ostalih miševa p57 Cdk inhibitori. 18, 19, 20

Lakoća kojom ćelije raka migriraju i upadaju u susjedno tkivo pokazuje važnost regulatora stanične citoskeleta u progresiji raka. Kofilin sa faktorom preuređenja citoskeleta razgrađuje aktinske filamente i na taj način olakšava migraciju stanica povećanjem frakcije aktinske pokretljivosti. 21 Aktivni nefosforilirani kofilin povezan je s povećanim metastazama tumora. 22 Kofilin se može inaktivirati pomoću LIM domene kinaze-1/2 (LIMK-1/2), 23, 24 koja se sama aktivira fosforilacijom na Th5050 25 putem signalnog puta Rho / Rho kinaze (ROCK). 26 Zanimljivo je da p57 KIP2 djeluje s kinazom domenom LIM-1 (LIMK-1) i povećava svoju kinaznu aktivnost neovisno o Rho / ROCK signalizaciji i na taj način doprinosi stabilizaciji aktinskih filamenata i inhibiciji stanične migracije. 14

p57 Ekspresija KIP2 može poboljšati staničnu smrt induciranu staurosporinom (STS) i agentima koji oštećuju DNK, kao što su etopozid i cisplatin, a svi oni induciraju apoptotičke mitohondrijske događaje. 11, 12 Suprotno tome, p57 KIP2 nema potencirajući učinak na apoptozu induciranu ligandom receptora smrti12, što ukazuje da p57 KIP2 pojačava staničnu smrt specifično na razini mitohondrija. Zapravo, prekomjerna ekspresija Bcl-2 ili inhibicija anionskog kanala ovisnog o naponu mitohondrija inhibira pionir P57 KIP2 promicanje učinaka stanične smrti. 12 Zanimljivo je da postoje izvješća da aktin može utjecati na provodljivost VDAC kanala. U Neurospora crassa , obilje monomernog aktina olakšalo je zatvaranje VDAC kanala, dok stabilni vlaknasti aktin (F-aktin) nije mogao to učiniti. 27 Zapravo, prisutnost F-aktina dovodi do povećane provodljivosti iona kroz vanjsku mitohondrijsku membranu. To ukazuje na moguću vezu između stabilnosti citoskeleta aktina i integriteta mitohondrijskog transmembranskog potencijala. U ovom istraživanju istražili smo mogućnost da učinak p57 KIP2 koji potiče smrt stanica zahtijeva svoj učinak na stabilizaciju citoskeleta.

Rezultati

p57 KIP2 stabilizira citoskelet aktina i potiče apoptozu

Dvije karakteristike supresorskog tumora p57 KIP2 uključuju inhibiciju stanične migracije i promociju apoptoze. 11, 12, 14 U ovom smo istraživanju iskoristili staničnu liniju dobivenu HeLa Tet-On stabilnom transfekcijom tetraciklin-inducibilnim p57 KIP2, HeLa-p57 KIP2 stanicama. Te se stanice mogu inducirati da eksprimiraju p57 KIP2 selektivno, nakon davanja analognog doksiciklina (Dox) tetraciklin (Dox) (Slika 1a). Indukcija ekspresije p57 KIP2 u stanicama HeLa-p57 KIP2 dovela je do povećanog stvaranja aktinskih stresnih vlakana kao što je prikazano bojenjem faloidinom, koji veže F-aktin (Slika 1b). Dodatno, oporavak fluorescencije nakon analize izbjeljivačem (FRAP) analize zelenog fluorescentnog proteina (GFP) s obilježenim aktinom pokazao je smanjenu pokretnu frakciju aktin-GFP u stanicama HeLa-p57 KIP2 tretirane s Doxom u usporedbi s netretiranim stanicama, pružajući dodatne dokaze za aktin funkcija stabilizacije citoskeleta p57 KIP2 (Slika 1c). Iako indukcija p57 KIP2 ekspresije sama po sebi nije izazvala smrt stanica, ona je senzibilizirala stanice na apoptozu koju je aktivirao STS (Slike 1d i e, Dopunska slika S1).

Image

Stabilizacija citoskeleta povećava apoptozu uzrokovanu STS-om. ( a ) HeLa-p57 TET-on stanice su tretirane s Dox tijekom 24 sata. p57 Ekspresija KIP2 analizirana je imunoblotingom, a ( b ) aktinski filamenti obojeni su faloidenom. ( c ) Mobilna frakcija aktina nakon izlaganja Doxu ili Jaspu (3 h) izmjerena je FRAP analizom stanica koje su bile transficirane aktinom-GFP. Vrijednosti predstavljaju% oporavka fluorescencije tijekom vremena aktin-GFP-a nakon izbjeljivanja. Strelice označavaju područje koje je izbjeljeno. ( d ) HeLa-p57 KIP2 stanice su tretirane Jasp-om 30 minuta, a zatim je tretirano STS 3 h sa ili bez izlaganja Dox-u. Apoptotička nuklearna morfologija kvantificirana je nakon Hoechstovog bojenja i izražena u postotku od ukupnog broja prebrojenih stanica. ( e ) cijepanje PARP-a ocijenjeno je imunoblotingom. G3PDH korišten je kao kontrola opterećenja. Potpuna duljina (f) i cijepljeni (c) PARP je analiziran denzitometrijom, a cijepljeni PARP izražen je u% ukupnog PARP (% c)

Slika pune veličine

Već je utvrđeno da stabilizacija citoskeleta aktina može izazvati smrt apoptotskih stanica. 28, 29 Jasplakinolid (Jasp), sredstvo za stabilizaciju citoskeleta u aktinu, korišten je za ispitivanje da li stabilizacija citoskeleta u aktinu povećava staničnu smrt izazvanu STS, oponašajući tako učinak p57 KIP2 . 30 U koncentraciji korištenoj u ovom istraživanju Jasp je stabilizirao citoskelet aktina, kao što pokazuje FRAP mjerenje pokretljivosti aktin-GFP (slika 1c), ali nije povećao staničnu smrt (slike 1d i e, dopunska slika S1). Prethodno liječenje stanica HeLa-p57 KIP2 Jasp-om 30 minuta prije STS tretmana rezultiralo je povećanjem stanica koje pokazuju apoptotsku nuklearnu morfologiju (slika 1d, dopunska slika S1) i cijepanje poli ADP-riboze polimeraze (PARP) (slika 1e), slično do razine opažene u stanicama liječenim Dox-om i STS-om. Važno je da indukcija p57 KIP2 ekspresije liječenjem Doxom nije značajno povećala staničnu smrt uzrokovanu Jasp i STS ko-tretmanom što ukazuje da doista Jasp oponaša pro-apoptotički učinak p57 KIP2 .

Destabilizacija aktinskih filame inhibira p57 KIP2 pojačavanje STS-inducirane stanične smrti

Kako je stabilizacija citoskeleta aktina oponašala pro-apoptotičke učinke p57 KIP2, koristi se destabilizirajući agens citoskelatona citokalasin D (Cyto. D), 31 da bi se istražilo može li depolimerizacija aktinskih filamenata spriječiti promicanje stanične smrti pomoću p57 KIP2 . Citološ. D je korišten u koncentraciji koja ne inducira staničnu smrt, ali ipak zadržava sposobnost destabilizacije citoskeleta aktina (Slike 2a-c). FRAP analiza pokretljivosti aktin-GFP-a u stanicama HeLa-p57 liječenih Dox-om pokazala je da je liječenje Cyto-om. D tijekom 3 sata uspješno je preokrenuo učinak stabilizacije citoskeleta na aktin p57 KIP2 (slika 2a). Da bi se procijenio učinak depolimerizacije aktina na p57 KIP2 - učinak promocije smrti, HeLa-p57 KIP2 stanice su tretirane s Dox i STS sa ili bez Cyto. D pred tretman. Stanice koje su tretirane s Dox i STS pokazale su smanjenu apoptotsku nuklearnu morfologiju u prisustvu Cyto-a. D (Slika 2b: 7, 2% sa Cito D u odnosu na 22, 2% bez Cito D). Nadalje, porast cijepanog PARP-a u stanicama HeLa-p57 KIP2 liječene STS-om smanjeno je u prisutnosti Cyto-a. D (slika 2c). Stoga bi se moglo zaključiti da destabilizacija citoskeleta aktina inhibira sposobnost p57 KIP2 da pojača STP -induciranu smrt apoptotske stanice.

Image

Destabilizacija citoskeleta sprečava pojačavanje apoptoze p57 KIP2 . ( a ) FRAP analiza HeLa-p57 KIP2 stanica tretirane sa ili bez citohalsina D u trajanju od 3 sata. Vrijednosti predstavljaju% oporavka fluorescencije tijekom vremena aktin-GFP-a nakon izbjeljivanja. Strelice označavaju područje koje je izbjeljeno. ( b i c ) Stanice HeLa-p57 KIP2 tretirane su citohalsinom D 1 sat, nakon čega slijedi tretman sa STS tokom 3 sata. ( b ) Apoptotska nuklearna morfologija kvantificirana je nakon Hoechstovog bojenja i izražena u postotku od ukupnog broja prebrojanih stanica. ( c ) cijepanje PARP-a ocijenjeno je imunoblotingom. G3PDH korišten je kao kontrola opterećenja. Potpuna duljina (f) i cijepljeni (c) PARP je analiziran denzitometrijom, a cijepljeni PARP izražen je u% ukupnog PARP (% c)

Slika pune veličine

LIMK-1 je potreban za p57 KIP2- induciranu staničnu smrt

Aktivacija LIMK-1 kinaze rezultira smanjenom aktivnošću kofilina fosforilacijom i kao takvom, povećanom stabilizacijom citoskeleta aktina. 26 Prethodno je pokazano da p57 KIP2 izravno djeluje s LIMK-1 što rezultira povećanjem aktivnosti kinaze LIMK-1, što je potrebno za stabilizaciju citoskeleta aktina posredovanu s p57 KIP2 . 14 Kako bi se istražilo je li LIMK-1 potreban za pptoptozu posredovanu p57 KIP2, korištene su male interferirajuće RNA (siRNA) usmjerene protiv LIMK-1, što je rezultiralo specifičnim padom razina proteina LIMK-1 (Slika 3a).

Image

LIMK-1 potreban je za p57 KIP2- induciranu apoptozu. HeLa-p57 KIP2 stanice su transficirane kodiranom sekvencom siRNA ili LIMK-1 siRNA u prisustvu ili odsutnosti Dox (24 h) i STS (3 h). ( a ) Odbacivanje LIMK-1 potvrđeno je imuno blotiranjem protiv LIMK-1, koristeći G3PDH kao kontrolu opterećenja. ( b ) Apoptotička nuklearna morfologija kvantificirana je Hoechstovim obojenjem i izražena u postotku od ukupnog broja prebrojanih stanica. ( c ) Aktivacija efektorskih kaspaza izmjerena je DEVDase testom, izraženim kratkim povećanjem kontrole. Vrijednosti predstavljaju prosjek +/− SD tri odvojena pokusa. ( d ) cijepanje PARP-a ocijenjeno je imunoblotingom, koristeći G3PDH kao kontrolu opterećenja proteinom. Potpuna duljina (f) i cijepljeni (c) PARP je analiziran denzitometrijom, a cijepljeni PARP izražen je u% ukupnog PARP (% c)

Slika pune veličine

U HeLa-p57 KIP2 stanicama koje su tretirane s Dox-om i STS-om, došlo je do smanjenja apoptotskih jezgara na 6, 7% u obrušenim stanicama LIMK-1 u usporedbi s 15, 2% u stanicama koje eksprimiraju LIMK-1 (Slika 3b). U stvari, broj apoptotskih jezgara u obrušenim ćelijama LIMK-1 koji su tretirani s Dox-om i STS-om bio je sličan onome opaženom u stanicama tretiranim samo sa STS-om (slika 3b). Slično tome, mjerenje aktivnosti DEVDase također je pokazalo smanjenje aktivnosti slične kaspazi-3 u stanicama koje su tretirane s Dox i STS kada je ekspresija LIMK-1 bila potisnuta u usporedbi s kontrolom (Slika 3c). Nadalje, analiza cijepanja PARP imunoblotom potvrdila je da u stanicama s nedostatkom LIMK-1, p57 KIP2 nije mogao poboljšati STS-posredovano odcjepljenje ovog supstrata kaspaze-3 (Slika 3d). Zajedno, ovi su rezultati pokazali da prešutjavanje LIMK-1 sprečava p57 KIP2 pojačavanje apoptoze izazvane STS-om. Dakle, ovo je dodatno utvrdilo da je gubitak učinka koji stabilizira aktin p57 KIP2 dovoljan da se spriječi njegov pro-apoptotički učinak.

Stabilizacija citoskeleta aktina pomoću p57 KIP2 pozitivno modulira apoptozu na mitohondrijskoj razini

Do sada je utvrđeno da pro-apoptotički učinak p57 KIP2 zahtijeva njegovu sposobnost stabilizacije citoskeleta aktina. Ovaj učinak promicanja smrti od p57 KIP2 prethodno se pokazao posredovanim kroz mitohondrije. 12 Zapravo je liječenje HeLa-p57 KIP2 stanica Dox-om i STS-om povećalo gubitak mitohondrijskog transmembranskog potencijala (ΔΨm) u usporedbi sa samo liječenjem STS-a (Slika 4a). Važnost dinamike aktina za održavanje ΨΨm pokazuje sposobnost Jasp-a da povećava STS-inducirani gubitak u Δ (m (slika 4b) i Cyto. D kako bi se smanjio gubitak Δcedm izazvan kox tretmanom Dox i STS (slika 4c). Nadalje, u prisutnosti mutanta koji neaktivno djeluje na kinazu, LIMK-1 (LIMK-1-D460A), p57 KIP2 ekspresija nije povećala STS-inducirani gubitak ΔΨm (Slika 4d). Sve u svemu, ovi rezultati pokazuju da stabilan citoskelet aktina, induciran p57 KIP2, pozitivno modulira apoptozu na razini mitohondrija.

Image

Stabiliziranje citoskeleta aktina pomoću p57 KIP2 promiče ΨΨm. HeLa-p57 KIP2 stanice su tretirane STS-om u prisutnosti ili odsutnosti Dox-a. ( a ) ΔΨm izmjereno je protočnom citometrijom nakon bojenja s TMRE. ( b ) HeLa-p57 KIP2 stanice su tretirane Jasp-om 30 minuta, a zatim je tretirana STS 5 h. ΔΨm izmjereno je protočnom citometrijom nakon bojenja s TMRE. ( c ) HeLa-p57 KIP2 stanice su tretirane s Citochalsin D u trajanju od 30 minuta, nakon čega slijedi tretiranje sa STS u trajanju od 3 sata u prisutnosti Dox. ΔΨm izmjereno je protočnom citometrijom nakon bojenja s TMRE. ( d ) HeLa-p57 KIP2 stanice transficirane su divljim tipom LIMK (LIMK-WT) ili mutantom neaktivnim kinazom LIMK-a (LIMK-D460A) prije liječenja Dox-om i STS-om. ΔΨm izmjereno je protočnom citometrijom nakon bojenja s TMRE

Slika pune veličine

Stabilna aktina p57 KIP2 istiskuje hekokinazu -1 (HK-1) ​​iz mitohondrija

Prethodni rad pokazao je da inhibicija otvaranja VDAC kanala korištenjem 4, 4'-diizotiocijanatostilbenben-2, 2'-disulfonske kiseline (DIDS) djeluje suprotno efektu promicanja p57 KIP2 . 14 Stoga je ispitan učinak p57 KIP2 na razine proteina mitohondrija HK-1, važnog regulatora provodljivosti VDAC kanala. Smanjenje lokalizacije mitohondrija HK-1 uočeno je nakon doks liječenja stanicama HeLa-p57 KIP2 (slika 5a), a stabilizacija citoskeleta Aktina Jasp-om također je rezultirala smanjenjem mitohondrijalnog HK-1 (slika 5a). Ispitana je sposobnost HK-1 da spašava stanice od apoptoze izazvane p57 KIP2 . U skladu s tim, prekomjerna ekspresija HK-1 u stanicama koje eksprimiraju p57 KIP2 rezultirala je smanjenjem rascjepkane bojenja kaspaze-3 u usporedbi s kontrolom transficiranom pcDNA (slike 4b i c).

Image

Stabiliziranje aktina pomoću p57KIP2 potiče istiskivanje HK-1 iz mitohondrija. ( a ) HeLa-p57 KIP2 stanice su tretirane ili s Dox ili Jasp. Mitohondrijske i citosolne frakcije proteina analizirane su imunoblotingom koristeći antitijela protiv HK-1. Tom40 korišten je kao kontrola opterećenja mitohondrija. Zvezdica (*) označava produkt cijepanja HK-1. Vrijednosti predstavljaju smanjenje pregiba pune duljine HK-1 u odnosu na kontrolu. ( b ) HeLa-p57 KIP2 stanice su transficirane HK-1-GFP ili pcDNA i uzgajane u prisustvu ili odsutnosti Dox tijekom 24 sata. Prekomjerna ekspresija HK-1-GFP analizirana je imunoblotiranjem s GFP-om, korištenjem Tom40 kao kontrole opterećenja, a ( c ) bojenje kapaze-3 ocijenjeno je protočnom citometrijom

Slika pune veličine

Rasprava

p57 KIP2 inhibira mnoge odlike raka i kao takav je smatran potencijalnim genom za suzbijanje tumora. 1 Rezultati ove studije potvrđuju prethodna istraživanja koja pokazuju prvo da p57 KIP2 inhibira migraciju stanica karcinoma stabilizacijom citoskeleta aktina, a drugo, da p57 KIP2 pospješuje smrt apoptotske stanice karcinoma mitohondrijskom depolarizacijom. Ova studija ispituje međusobnu interakciju ovih dviju naizgled različitih funkcija p57 KIP2 i pokazuje da pro-apoptotički učinak p57 KIP2 ovisi o njegovoj sposobnosti stabilizacije citoskeleta aktina. Zabrinjavajuća dinamika citoskeleta aktina utječe na sposobnost p57 KIP2 da potiče staničnu smrt. Ovdje pokazujemo da stabiliziranje aktinog citoskeleta oponaša efekt povećanja p57 KIP2, a destabilizacijom aktinskih filamenata taj učinak poništava. Značajno, inhibicija učinka stabiliziranja citoskeleta na aktin p57 KIP2 (kroz knockdown LIMK-1) također ukida efekt p57 KIP koji potiče smrt, pružajući izravnu vezu između funkcije aktinog citoskeleta p57 KIP2 i funkcije poticanja smrti p57 KIP2 . Pokazalo se da stabilizacija citoskeleta aktina inducira staničnu smrt. 28, 32 Iako do danas, mehanizam kojim F-aktin preosjetljiv na staničnu smrt nije u potpunosti opisan, dokazi govore da je to putem mitohondrijske depolarizacije. 27, 32 Daljnja istraga kako p57 KIP2 senzibilizira stanice na smrt otkrila je vezu između stabilizacije citoskeleta aktina i razine mitohondrijske heksokinaze. Hekokinaza se često nalazi prekomjerno izražena u stanicama karcinoma, gdje njeno vezivanje za mitohondrije povećava brzinu glikolize u stanici kroz jednostavan pristup ATP koji nastaje mitohondrijom. 33 Zatvaranje VDAC kanala nakon vezanja hekokinaze jedan je mehanizam koji stanice raka koriste da izbjegnu smrt. 34 Ovo istraživanje pokazuje da stabilizacija citoskeleta aktina Jasp-om ili ekspresijom p57 KIP2 istiskuje HK-1 iz mitohondrijske membrane. U stvari, prekomjerna ekspresija HK-1 inhibira promociju stanične smrti pomoću p57 KIP2 . Opisao je scenarij u kojem stabilizacija aktina pomoću p57 KIP2 pospješuje staničnu smrt kroz istiskivanje HK-1 iz mitohondrija. Mnoge stanice raka pokazuju smanjenu p57 KIP2 ekspresiju bilo putem metilacije DNA promotora, modifikacija histona, genetske mutacije, prigušivanja mikroRNA ili proteasomne ​​degradacije. 1 Zanimljivo je da inducirana ekspresija p57 KIP2 u tumorima prisiljava regresiju raka. Zbog toga je, kao i kod mnogih tumora, važno da rak održi ekspresiju p57 KIP2 na smanjenoj razini. Prema tome, ekspresija proteina p57 KIP2 testira se kao prognostički pokazatelj u karcinomu. U ovom istraživanju pokazali smo da se negativna regulacija barem dva obilježja raka, povećana migracija stanica-metastaza i izbjegavanje stanične smrti može pratiti do sposobnosti p57 KIP2 da stabilizira citoskelet aktina. Potencijalno, druga obilježja raka mogu se regulirati i p57 KIP2 regulacijom aktin dinamike citoskeleta. Već je poznato da povećana pokretljivost aktina pojačava angiogenezu tumora. 36 Ovi nalazi bi trebali povećati interes za terapije koje ponovno aktiviraju p57 KIP2 ekspresiju u stanicama karcinoma.

Materijali i metode

Plazmidi i siRNA

Myc-LIMK-1 i Myc-LIMK-1 D640A mutant u FPC1 vektoru bili su pokloni K Mizunoa (Sveučilište Tohoku, Japan). Actin-GFP plazmid poklon je tvrtke Pirta Hotulainen (Sveučilište u Helsinkiju, Finska). GFP plazmid bio je iz tvrtke Clontech (Invitrogen, Carlsbad, CA, SAD). SMARTPool siRNA protiv LIMK-1 i ne-ciljani niz kupljeni su od Dharmacon-a (Lafayette, CO, USA).

Stanična kultura, transfekcije i tretmani

HeLa stanice cervikalnog karcinoma grlića maternice koje eksprimiraju p57 KIP2 pod kontrolom promotora tetraciklina (HeLa-p57 KIP2 ) poklon su S Okret, Karolinska Institutet i uzgajane su u MEM mediju (Gibco, Carlsbad, CA, SAD) sa 10% fetalne goveđi serum, penicilin / streptomicin, nebitne aminokiseline, natrijev piruvat i L-glutamin. 2 μg / ml Dox dodano je u kulturni medij tijekom 24 sata da se inducira ekspresija p57 KIP2 . Transfekcije su izvedene s reagensom Lipofectamine i Plus (Invitrogen) prema protokolu proizvođača. Stanice su tretirane s 0, 1 µM Jasp, 1 µM Citohalsin D, ili 0, 1 µ M STS, naznačena vremena.

Proteinski ekstrakti i imunobloting

Stanice su skupljene i lizirane soniciranjem u NP40 lizijskom puferu koji sadrži inhibitore proteaze. 17 Proteinski lizati su zagrijavani na 95 ° C tokom 5 minuta u Laemmli puferu. Sve u svemu, 20–40 µg proteina elektroforezirano je na 12% SDS-PAGE akrilamidnim gelovima, a zatim imunoblotirano na nitroceluloznu membranu. Membrane su blokirane u 5% mlijeka i inkubirane su s anti-PARP (BD Pharmingen, Franklin Lakes, NJ, USA), anti-p57 KIP2 (C-20, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, Kalifornija, SAD), anti-HK- 1 (N-19, Santa Cruz Biotechnology), anti-GFP (Santa Cruz Biotechnology), anti-translokacija vanjske membrane 40 (tom40; Biotehnologija Santa Cruz), ili anti-glicerol 3 fosfat dehidrogenaza (G3PDH; Trevigen, Gaithersburg, MD), SAD) preko noći na 4 ° C, nakon čega slijedi inkubacija s odgovarajućim sekundarnim antitijelom peroksidaze iz hrena (1: 10 000) tijekom 1 sata na sobnoj temperaturi. Trake su vizualizirane pojačanom kemiluminiscencijom (Pierce, Rockford, IL, SAD) slijedeći protokol proizvođača.

Fluorescentni oporavak nakon izbeljivanja fotografija (FRAP)

FRAP je korišten za procjenu količine mobilnih aktinom-GFP monomera. HeLa-p57 KIP2 ćelije, uzgajane na staklenim kliznim prekrivačima, transficirane su aktinom -GFP i tretirane su kako je prikazano na slikama. Klizni komori su zatim postavljeni u POC komoru / CTI regulator / grijaći umetak P sustava za živo stanično snimanje. Nakon izbjeljivanja područja interesa (ROI) sa 100% intenzitetom argona / 2 lasera 488 nm (struja 4, 7 Amp), vremenski tijek oporavka fluorescencije u izbjeljenom ROI je praćen s intervalima od 20 ms. Uzorci su analizirani s mikroskopom Axiovert 200 m (Zeiss, Oberkochen, Njemačka).

Mjerenje aktivnosti efektorske kaspaze-3/7 (DEVDase)

Aktivnost DEVDaze u staničnim lizatima izračunata je mjerenjem brzine cijepanja fluorogenog supstrata DEVD-MCA (Peptide Institute Inc., Osaka, Japan). Slobodni AMC je praćen u čitaču ploča Fluoroscan II (Labsystems, Waltham, MA, USA) koristeći pobudno pobudno 355 nm i valno duljina emisije 460 nm.

Mjerenje mitohondrijskog transmembranskog potencijala

Stanice se inkubiraju sa 25 nM tetrametil-rodamin etil-esterom (TMRE) (Molecular Probes, Carlsbad, CA, 30 min) na 37 ° C 30 minuta prije žetve. Stanice su isprane dva puta u fiziološkoj otopini puferiranoj fosfatima (PBS), tripsinizirane, resuspendirane u PBS i analizirane protočnom citometrijom na protočnom citometru FACSCalibur (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA). Rezultati su analizirani korištenjem CellQuest (Becton Dickinson) softvera.

Subcelularno frakcioniranje

Sakupljene stanice isprane su dva puta s PBS-om i resuspendirane 10 minuta na ledu u puferu A (10 mM Hepes, pH 7, 9 na 4 ° C, 1, 5 mM MgCl2, 10 mM KCl i 0, 5 mM DTT). Stanice su centrifugirane na 2000, okretaja 5 min pri 4 ° C. Stanični pelet resuspendiran je u puferu A koji sadrži 0, 2% NP40 i inhibitore proteaze tijekom 2 minute na ledu. Stanice su centrifugirane pri 500 o / min tijekom 2 minute. Supernatant je sakupljen i dalje centrifugiran 30 minuta na 14 000 o / min. Supernatant i peleta sadržavali su citosolnu i mitohondrijsku frakciju.

Kvantifikacija apoptotske nuklearne morfologije

Stanice su uzgajane na staklenim pokrivačima, obrađene i fiksirane 4% paraformaldehidom tijekom 15 minuta na 4 ° C. Fiksne stanice su zatim inkubirane 10 minuta u Hoechst (1 μg / ml) na sobnoj temperaturi da bi se obojile jezgre. Po uzorku se broji najmanje 200 stanica.

Detekcija F-aktina

Da bi se vizualizirao F-aktin, stanice uzgajane na staklenim poklopcima su fiksirane i inkubirane 30 minuta na sobnoj temperaturi s kontaminiranim rodominom faloidinom (1: 8000). Nuklei su obojeni inkubiranjem poklopca u 1 μg / ml Hoechst-a (Molekularne sonde) 10 min na sobnoj temperaturi. Stanice su vizualizirane upotrebom 510 Meta konfokalnog mikroskopa (Zeiss).

Mjerenje cijepljene kaspaze-3

Stanice su fiksirane s 4% paraformaldehida 10 minuta na 37 ° C i permeabilizirane u 90% metanolu u trajanju od 30 minuta na -20 ° C. Stanice se inkubiraju u blokirajućoj otopini (0, 5% BSA u PBS-u) 10 minuta na sobnoj temperaturi, nakon čega slijedi anti-cijepljena kaspaza-3 (Stanična signalizacija, Danvers, MA, SAD; 1: 3200 u blokirajućoj otopini) 1 sat u sobi temperatura, a zatim sa kozjim anti zečjim Alexa 488 (Invitrogen; 1: 200 u blokirajućoj otopini) 30 minuta. Stanice su jednom isprane u blokirajućoj otopini između svih inkubacija antitijela, te su konačno resuspendirane u PBS-u radi analize na protočnom citometru FACSCalibur (Becton Dickinson). Rezultati su analizirani pomoću CellQuest softvera.

Statistička analiza

Statističke analize provedene su korištenjem dva paralelnog t- testa uparenog učenika gdje se * P <0, 05 i ** P <0, 01 smatralo značajnim. Trake i trake pogreške predstavljaju srednju vrijednost kod SEM-a

Dodatna informacija

Datoteke slika

  1. 1.

    Dopunska slika 1

Word dokumenti

  1. 1.

    Dopunska slikovna legenda

Glosar

Cdk

kinaza ovisna o ciklinu

Citološ. D

citohalsin D

DIDS

4, 4'-diizotiocijanatostilbenben-2, 2'-disulfonska kiselina

Dox

doksiciklin

F-aktin

vlaknasti aktin

FRAP

oporavak flourescencije nakon fotobeljivanja

G3PDH

glicerol 3 fosfat dehidrogenaza

GFP

zeleni fluorescentni protein

HK-1

heksokinaze-1

Jasp

jasplakinolide

LIMK-1

Kinaza LIM-domene-1

p21 / CIP1 / CDKN1A

ciklin-ovisan inhibitor kinaze 1A

p27 / Kip1 / CDKN1B

inhibitor kinaze ovisan o cikl

p57 / KIP2 / CDKN1C

ciklin-ovisan inhibitor kinaze 1C

PARP

poli ADP-riboza polimeraza

PBS

fiziološka otopina puferirana fosfatima

ROCK

rho kinaza

ROI

regija interesa

STS

staurosporina

TMRE

etil ester tetrametilrodamin

Tom40

translokacija vanjske membrane 40

VDAC

anionski kanal ovisan o naponu

ΔΨm

gubitak mitohondrijskog transmembranskog potencijala

Dodatne informacije prate rad na web stranici Cell Cell and Disease (//www.nature.com/cddis)