Pin1 inhibira pp2a posredovanu rb dephosforilaciju u regulaciji staničnog ciklusa i oštećenja DNA na s-fazi | stanična smrt i bolest

Pin1 inhibira pp2a posredovanu rb dephosforilaciju u regulaciji staničnog ciklusa i oštećenja DNA na s-fazi | stanična smrt i bolest

Anonim

teme

  • Oštećenje i popravljanje DNK
  • onkogcnczom
  • Post-translacijske modifikacije

Sažetak

Inaktivacija proteina retinoblastoma (Rb) ima ključnu ulogu u tumorigenezi. Dobro je utvrđeno da je funkcija Rb u velikoj mjeri regulirana dinamičkom ravnotežom fosforilacije i defosforilacije. Iako je provedeno mnogo istraživanja kako bi se razumjeli mehanizmi i funkcija RB fosforilacije, regulacija deposforilacije Rb još uvijek nije dobro shvaćena. U ovom istraživanju pokazujemo da Pin1 ima važnu ulogu u regulaciji funkcije Rb u progresiji staničnog ciklusa i kontrolnoj točki S-faze nakon oštećenja DNA. Pokazujemo da se džep Rb C izravno veže na Pin1 WW domenu in vitro i in vivo , te da je fosforilacija Rb C-džepa pomoću kompleksa kinaze ovisnih o G1 / S Ciklin / Ciklin ključna za posredovanje ove interakcije. Nadalje pokazujemo da zaustavljanje staničnog ciklusa posredovano Rb i prerano stanično starenje izazvano s Rb učinkovito inhibiraju ekspresijom Pin1. Pored toga, oštećenje DNK inducira Rb deposforilaciju na način ovisan o PP2A, a ovaj proces inhibira Pin1. Nadalje, prekomjerna ekspresija Pin1 potiče Rb hiperfosforilaciju nakon oštećenja DNA na S-fazi. Važno je da su i efekt na kontrolnoj točki S-faze potrebni i Pin1 WW domena i aktivnost izomeraze. Nadalje, prekomjerna ekspresija Pin1 povezana je s Rb hiperfosforilacijom u biopsijama raka dojke. Ovi rezultati pokazuju da Pin1 ima kritičnu ulogu u modulaciji Rb funkcije reguliranjem deposforilacije Rb, što može imati važnu patološku ulogu u razvoju raka.

Glavni

Protein retinoblastoma (Rb), kodiran genom RB1 , kritični je regulator progresije staničnog ciklusa i ima važnu ulogu u brojnim aspektima biologije, uključujući odgovor oštećenja DNK, apoptozu, starenje i diferencijaciju. 1, 2, 3, 4, 5 Rb važan je regulator staničnog ciklusa koji djeluje pretežno vezanjem i inhibicijom transaktivacije gena faktorima transkripcije E2F, koji bi inače izazvali ekspresiju gena koji pospješuju napredovanje staničnog ciklusa. Rb veže E2F proteine ​​kroz Rb veliku džepnu domenu (RbLP), koja uključuje dvije sačuvane domene A i B, kao i džep C-terminala (RbC). Domene A i B, zajedno nazvane mali džep Rb (RbSP), posreduju vezanje za specifične regulatorne proteine ​​i onkoproteine ​​koji sadrže sačuvani LXCXE motiv. 6, 7, 8, 9 Pokazalo se da je džep za Rb C neophodan za posredovanje interakcije Rb s E2F. 10 Pored toga, RbC se direktno veže na MDM2, koji inhibira Rb natječući se s E2F za vezanje, kao i promovirajući razgradnju Rb proteasomom. 11, 12

Biološka funkcija Rb je kritično regulirana fosforilacijom proteina. Hipofosforilirani Rb djeluje u interakciji s E2F, čime djeluje kao biološki aktivni oblik Rb. Suprotno tome, hiperfosforilirani Rb ne može vezati E2F proteine, omogućavajući tako E2F da promiče napredovanje staničnog ciklusa. 1, 13 Tijekom staničnog ciklusa, Rb fosforilaciju primarno provode kompleksi Ciklin / Ciklin ovisna kinaza (CDK); 4, 14, 15, 16 Ciklin D / CDK4 / 6 su početne kinaze do fosforilata Rb, zatim Ciklin E / CDK2, a potom Ciklin A / CDK2. Većina mjesta fosforilacije Cyclin / CDK nalaze se u RbC. 4, 17 Defosforilacija Rb proteinskom fosfatazom 1 (PP1) i proteinom fosfatazom 2A (PP2A) tijekom mitotskog izlaska vraća Rb u hipofosforilirano stanje, u skladu s potrebnom regulacijom novog staničnog ciklusa. 18, 19, 20

Rb ima glavnu ulogu u regulaciji napredovanja staničnog ciklusa tijekom normalnih i stresnih uvjeta. Oštećenje DNA na S-fazi izazvano zračenjem, oksidativnim stresom ili kemoterapeutskim agensima poput cisplatina ili etopozida dovodi do brze defosforilacije i aktivacije ovisne o PP2A, što rezultira suzbijanjem sinteze DNA i zaustavljanjem staničnog ciklusa. Nadalje, pokazalo se da PP2A poboljšava funkciju Rb prema inhibiciji replikacije DNK preuzimanjem hipofosforiliranog Rb na kontrolna mjesta replikacije. 19, 20, 21, 22

Prolil izomeraza Pin1 veže se i modulira brojne proteine ​​koji su uključeni u staničnu proliferaciju, diferencijaciju, odgovor oštećenja DNA, apoptozu i razvoj. 23, 24 Pin1 se sastoji od N-terminala WW domene za specifičnu interakciju proteina i C-terminalne katalitičke peptidil-prolil izomeraze (PPIase) domene. Pin1 specifično katalizira cis do trans izomerizacije ostataka prolina u strogo fosforiliranim ostacima serina / treonin-prolina (pS / TP), utječući na taj način na supstrat, funkciju, stabilnost, subcelularnu lokalizaciju i / ili svojstva koja međusobno djeluju. 25, 26, 27

U ovom istraživanju opisujemo molekularni mehanizam pomoću kojeg Pin1 modulira Rb funkciju u progresiji staničnog ciklusa i u kontrolnoj točki induciranoj oštećenjem DNA na S-fazi. Pokazujemo da se Pin1 specifično veže na hiperfosforilirani Rb i inhibira PP2A-posredovanu Rb-deposforilaciju. Pored toga, zaustavljanje staničnog ciklusa posredovano Rb i prerano stanično starenje izazvano s Rb učinkovito se inhibiraju ekspresijom Pin1. Slično tome, nedostatak Pin1 dovodi do nenormalnog Rb deposforilacije nakon oštećenja DNA na S-fazi, što rezultira neispravnom kontrolnom točkom S-faze. Stoga ova studija sugerira novi molekularni mehanizam u kojem Pin1-posredovana modulacija Rb fosforilacije ima važnu ulogu u razvoju raka.

Rezultati

Pin1 posebno se vezuje za džep Rb C

Termin Rb C sadrži nekoliko S / TP motiva, što su vjerojatna Pin1 mjesta koja vežu. Stoga smo ispitali može li Pin1 fizički komunicirati s Rb pomoću padajućeg testa. Kao što je prikazano na slici 1a, i GST-Pin1 i GST-Pin1-WW učinkovito su povukli endogeni Rb iz staničnih lizata osteosarkoma U2-OS, dok domena GST-Pin1-PPIase nije bila u mogućnosti da veže Rb. Pored toga, točkaste mutacije u domeni Pin1 WW na W34A ili Y23A, dvije aminokiselinske rezidue kritične za vezanje Pin1 supstrata, 28 ukinuo je interakciju Pin1-Rb (Slika 1a). Ovi rezultati pokazuju da Rb posebno djeluje s Pin1 WW domenom.

Image

Pin1 WW domena izravno se veže za hiperfosforilirani Rb C džep. ( a ) U2-OS stanične lizate inkubirali su cijelim dužinama, skraćenim ili mutiranim Pin1-GST fuzijskim konstrukcijama i nakon toga bili podvrgnuti GST padajućem testu, kao što je prikazano. Proteini su razdvojeni SDS-PAGE i imunoblotirani s Rb specifičnim antitijelom (gornja ploča). Usporedive razine ulaznih GST ili GST fuzijskih proteina su prikazane Coomassie-jevim plavim bojenjem (donja ploča). ( b ) U2-OS stanice prolazno su transficirane s duljinom pune duljine Rb, RbLP, Rb (RbSP) ili Rb C-džepom (RbC). Ukupni protein (500 µg) podvrgnut je padajućem testu GST koristeći rekombinantni GST-Pinl ili GST kao kontrolu, a zatim je analiziran zapadnjačkim blotiranjem na vezanje Rb. Ukupni protein (10 μg) iz svakog staničnog lizata izravno je učitan kao ulazna kontrola. ( c ) Stanice H1299 podvrgnute su imunofluorescenciji, kao što je prikazano. (d) Stanični lizati iz stanica H1299 koji stabilno eksprimiraju FLAG-Pin1 ili pLVX vektor podvrgnuti su imunoprecipitaciji antiflag M2 afinitetnim gelom i imunoblotirani za fosforilirani Rb (pRb) na Ser807 / 811 (S807 / 811) ili Pin1, kako je prikazano, ( e ) Lizati U2-OS stanica podvrgnuti su imunoprecipitaciji antitijelom specifičnim za Pin1 ili kontrolnim IgG i imunoblokiranim za Rb, kao što je prikazano

Slika pune veličine

Da bismo dalje definirali interakciju Pin1-Rb, izrazili smo različite konstrukcije Rb proteina u stanicama U2-OS i stanične lizate podvrgli GST-Pin1 spuštanju. Kao što je prikazano na slici 1b, Pin1 je komunicirao s cijelom dužinom Rb kao i s RbLP (uključujući domene A, B i C), ali ne i s malim džepom Rb (RbSP, uključujući A i B domene), sugerirajući da je Rb C-džep (RbC) važan je za Pin1 interakciju. Zapravo, sam RbC dobro je komunicirao s Pin1, što ukazuje na to da je Rb C džep potreban i dovoljan za interakciju Rb-Pin1. Nadalje, primijetili smo endogenu kokalokalizaciju Pin1-Rb imunofluorescencijom u ne-staničnim stanicama karcinoma pluća H1299 (Slika 1c), kao i vezanjem in vivo ko-imunoprecipitacijom u stanicama H1299 i U2-OS (Slike 1d i e ).

Pin1-Rb interakcija inducirana je G1-S Cyclin posredovanom Rb fosforilacijom

CDK su prvenstveno odgovorni za fosforilaciju Rb. Kako se većina mjesta fosforilacije CDK nalazi u džepu Rb C, 4, 17, ispitali smo jesu li CDK-posredovani signali Rb fosforilacije za interakciju Pin1-Rb. Pin1 se ponajprije vezuje za hiperfosforilirane, sporije migrirajuće Rb vrste. Tretiranje stanica U2-OS roskovitinom, moćnim inhibitorom CDK, rezultiralo je značajnim nakupljanjem hipofosforiliranog Rb, što pokazuje brža migracija hipofosforiliranih Rb vrsta. Tretman roskovitinom ukinuo je Pin1-Rb interakciju, što ukazuje da je Rb fosforilacija potrebna za vezanje Pin1-Rb i da se Pin1 preferirano veže na hiperfosforilirani Rb, ali ne i na hipofosforilirani Rb (slika 2a).

Image

Pin1-Rb interakcija inducirana je G1-S Cyclin posredovanom fosforilacijom. ( a ) U2-OS stanice su 18 sati tretirane nosačem (dimetil sulfoksidom, DMSO) ili 30 μM roskovitinom. Stanični lizati (500 µg ukupnog proteina) su uklonjeni sa GST-Pin1, nakon čega slijedi zapadnja mrlja za Rb. Kao ulazna kontrola unosi se ukupni protein (30 μg). Hiper-pRb, hiperfosforilirani Rb; Hipo-pRb, hipofosforilirani Rb. ( b ) Dijagram RbLP-a koji označava sedam pS / TP pretpostavljenih Pin1-vezajućih mjesta unutar Rb C-džepa (RbC), kao i dvije mutacije s dvostrukom točkom na Ala (S807A; S811A, denominirano 2S, i T821A; T826A, denominirano 2T) i mutacije svih Ser ili Thr ostataka Ala ostataka (7A) korištenih za studije vezanja RbC-Pin1. ( c ) U2-OS stanice su transficirane s WT ili mutantnim RbLP. Stanični lizati su podvrgnuti GST-Pinl ispitivanju propadanja i zapadno izbrisani za Rb radi procjene vezanja. ( d ) Saos-2 stanice su kofeficirane s Rb zajedno s Cyclin A, Cyclin B1, Cyclin D1, Cyclin E ili vektorskom kontrolom, kao što je prikazano. Stanični lizati su podvrgnuti sniženju GST-Pinl, nakon čega je slijedilo zapadno blotiranje za Rb

Slika pune veličine

Džep Rb C sadrži sedam pS / TP motiva (slika 2b). Da bismo istražili ulogu ovih pretpostavljenih Pin1-vežućih mjesta u interakciji Pin1-Rb, izrazili smo divlji tip (WT) ili mutantni RbLP u U2-OS stanicama i uspoređivali njihovu sposobnost vezanja Pin1. Dvostruka supstitucija S807 i S811 alaninskim ostacima (RbLP-2S) praktički je ukinula Pin1-Rb interakciju. Isto tako, kombinirane mutacije T821A i T826A (RbLP-2T) značajno inhibiraju vezanje Pin1-Rb, iako u manjem stupnju. Štoviše, RbLP-7A, u kojem je svih sedam serinskih ili treoninskih ostataka supstituirano alaninom, potpuno je izgubio interakciju s Pin1 (slika 2c).

Zatim smo ispitali učinak specifičnih Cyclin / CDK kompleksa na Rb-Pin1 interakciju. Kofeficirali smo stanice Saos-2 s Rb i raznim Cyclin-ekspresionirajućim plazmidima, te smo stanične lizate podvrgli ispitivanju GST-Pin1, a zatim imunoblotingom za Rb. Odlučili smo koristiti Saos-2 stanice jer su one Rb-null i pokazuju nisku razinu endogene CDK aktivnosti. Kao što je prikazano na slici 2d, koekspresija Rb s Cyclin D1, Cyclin E ili Cyclin A dramatično je povećala interakciju Pin1-Rb, dok je koekspresija Cyclin B1 imala mali učinak, usprkos usporedivim razinama ekspresije proteina. Ti podaci pokazuju da je fosforilacija Rb pomoću Gl- i S-faze ciklin-povezanih kinaza presudan signal za interakciju Rb-Pin1.

Pin1 inhibira PP2A-posredovanu Rb deposforilaciju

Kako su naši rezultati pokazali da se Pin1 veže na hiperfosforilirani Rb, istražili smo utječe li interakcija Pin1-Rb na Rs fosforilaciju. Kao što je prikazano na slici 3a, stanice mišjih embrionalnih fibroblasta (MEF) sa nedostatkom Pin1 pokazale su očigledan pad hiperfosforiliranih vrsta Rb kod Ser807 i Ser811. Nadalje, ablacija Pin1 rezultirala je povećanjem razine hipofosforiliranog Rb u stanicama H1299 (Slika 3b). Hipofosforilirani Rb čvrsto se povezuje s nuklearnom ovojnicom i zahtijeva visoke koncentracije soli za disocijaciju, dok je hiperfosforilirani Rb topljiv u nižim koncentracijama soli. 29 Prema tome, da bismo dalje ispitali učinak Pin1 na Rb fosforilaciju, obradili smo humane netransformisane stanice epitela mliječne mliječne ćelije koje eksprimiraju Pin1 ili vektorsku kontrolu sa ili bez ekstrakcijskog pufera koji sadrži 0, 1% Triton-X-100 i 250 mM NaCl. Tretiranje ćelija koje eksprimiraju Pin1 ekstrakcijskim puferom rezultiralo je disocijacijom Rb iz jezgre u znatno većem obimu nego u kontrolnim stanicama (slika 3c), što ukazuje da se Rb veže manje čvrsto na nuklearnu matricu nakon ekspresije Pin1. Ovi podaci zajedno pokazuju da je Pin1 važan u održavanju hiperfosforilacije Rb.

Image

Pin1 inhibira Rb PP2a-posredovanu defosforilaciju. ( a ) MEF stanični lizati s nedostatkom WT ili Pin1 (Pin1 - / - ) podvrgnuti su se Western blot analizom za ukupne razine Rb (Pan-Rb), fosforilirani Rb (pRb) na Ser807 / 811 (S807 / 811), Pin1 ili aktin. ( b ) H1299 stanice su zaražene rekombinantnim retrovirusom koji eksprimira shRNA protiv Pin1 ili vektorskom kontrolom. Ljetati iz cijelih stanica podvrgnuti su se zapadnjačkom blotiranju, kao što je prikazano. ( c ) MCF-10A stanice su stabilno transficirane s PLVXpuro vektorskom kontrolom (Vec) ili PLVX-Pin1 (Pin1). Stabilne stanice su tretirane sa ili bez ekstrakcijskog pufera i naknadno podvrgnute imunofluorescenciji za Rb i suprotstavljene DAPI. ( d ) Peptidi Rb C-džepa (RbC) in vitro su fosforilirani i obilježeni kompleksima Cyclin E / CDK2 s γ - [ 32 P] -ATP kako je opisano u Materijalima i postupcima. Fosforilirani RbC peptidi obilježeni [ 32 P] zatim su inkubirani s BSA, okadeinskom kiselinom ili WT ili mutiranim GST-Pin1 fuzijskim proteinima, prije inkubacije s navedenim vremenima PP2A. Reakcije dehosforilacije ugašene su dodavanjem SDS pufera za uzorke. Uzorci su analizirani pomoću SDS-PAGE nakon čega je slijedila autoradiografija

Slika pune veličine

Kako je pokazano da Pin1 regulira aktivnost PP2A, 26, 30, 31 i da je PP2A važan za Rb deposforilaciju, 19, 20, izveli smo in vitro eksperimente sa defosforilacijom da bismo ispitali učinak Pin1 na Rb deposforilaciju Rb. RbC fragmenti in vitro su fosforilirani i radioaktivno obilježeni korištenjem [ 32 P] Cyclin E / CDK2, prethodno inkubiranim s WT ili mutantom Pin1, i inkubirani s PP2A u naznačenim vremenskim intervalima, nakon čega slijedi kasnija SDS-poliakrilamidna elektroforeza (SDS-PAGE) i autoradiografijom. Kao kontrola upotrijebljena je okadainska kiselina, koja specifično inhibira aktivnost PP2A u niskim koncentracijama, 32 ili goveđi serumski albumin (BSA). Kao što je prikazano na slici 3d, [32P] označen RbC je brzo defosforiliran PP2A kada je prethodno inkubiran s BSA, dok je predinkubacija okadaičnom kiselinom u potpunosti blokirala Rb deposforilaciju. Iznenađujuće je da je deposforilacija Rb pomoću PP2A značajno inhibirala WT Pin1, ali ne i mutantni derivati. Ovi rezultati pokazuju da Pin1 može in vitro inhibirati PP2A posredovanu Rb deposforilaciju.

Pin1 inhibira zaustavljanje staničnog ciklusa i Rb-inducirano starenje

Kako naši podaci pokazuju da Pin1 inhibira Rb dephosforilaciju, održavajući na taj način Rb hiperfosforiliranu, koja nije u mogućnosti da veže E2F, istražili smo učinak Pin1 na Rb funkciju prema inhibiciji aktivnosti E2F. U tu svrhu koristili smo izvještaj luciferaze (DHFR-Luc) vođen promotorom dihidrofolat reduktaze, što je dobronamjeran cilj E2F nizvodno. Kofeficirali smo DHFR-Luc ili s WT Pin1 ili Pin1-W34A u Rb-pozitivne U2-OS stanice, nakon čega slijedi analiza aktivnosti luciferaze. WT Pin1, ali ne Pin1-W34A, značajno je potaknuo aktivnost E2F reportera u U2-OS stanicama. S druge strane, ektopična ekspresija Pin1 u Rb-null Saos-2 stanicama nije uspjela inducirati E2F izvještajnu aktivnost (Slika 4a). Da bismo procijenili biološki značaj ove regulacije, utišali smo Rb i / ili Pin1 ekspresiju u stanicama H1299. Ponovno, ablacija Pin1 dovela je do povećanja hipo-pRb i smanjene razine hiper-pRb (Slika 4b). Analiza protočne citometrije ovih stanica pokazala je da je knockdown Pin1 rezultirao zaustavljanjem G1 staničnog ciklusa, što se učinkovito obratilo nakon istodobnog rušenja Rb (Slika 4c). Štoviše, pokazalo se da ektopična ekspresija Rb u Saos-2 stanicama (Rb-null i p53 nula) inducira prerano stanično starenje. 33 U skladu s tim opažanjima, ekspresija Rb u Saos-2 stanicama dovela je do povećane stanične starenja, što se očitovalo ravnom i povećanom staničnom morfologijom (slika 4d), te povećanom aktivnošću β -galaktozidaze (SA- β -Gal) sa staroscencijom (Slika 4e). Značajno je da je istodobna Pin1 ekspresija u stanicama koja eksprimiraju Rb značajno poništila ove efekte, dok mutirani Pin1 (W34A) nije mogao utjecati na stanicu staničnog starenja izazvanu Rb (Slike 4d i e). Ovi podaci sugeriraju da Pin1 inhibira zaustavljanje zaustavljenog staničnog ciklusa i Rb-inducirano starenje.

Image

Pin1 inhibira Rb funkciju u napredovanju i starenju staničnog ciklusa. ( a ) Stanice U2-OS (Rb-pozitivne) ili Saos-2 (Rb-null) kofeficirane su WT ili mutantnim Pin1, ili vektorskom kontrolom, zajedno s DHFR-luciferarazom (DHFR-Luc) koji reagira na E2F1 reporter i plazmid ekspresije p- galaktozidaze. Stanice su lizirane 24 sata nakon transfekcije i podvrgnute ispitivanju aktivnosti luciferaze i p- galaktozidaze. Aktivnost DHFR-Luc je normalizirana na aktivnost p- galaktozidaze kako je opisano u Materijalima i postupcima i prikazana kao aktivacija pregiba. Rezultati predstavljeni kao sredstva i SE od tri neovisna eksperimenta izvedena u tri primjerka. ** P <0, 01. ( b ) Stanice H1299 bile su stabilno zaražene shRNA protiv Rb, Pin1 ili kontrolne skupine, i odabrane prema rezistenciji na puromicin. Stanični lizati su podvrgnuti Western blotiranju, kao što je naznačeno. ( c ) Stabilne stanice H1299 podvrgnute su protočnoj citometriji za analizu staničnog ciklusa. ( d i e ) Saos-2 stanice su kofeficirane s Rb i / ili WT ili mutantnim Pin1, ili s vektorskom kontrolom, i odabrane rezistencijom na puromicin, kako je opisano u Materijalima i postupcima. Stabilne stanice su uzgajane u normalnom mediju za rast uz dodatak 0, 5 µg / ml puromicina 10 dana. Stanice su zatim vizualizirane pod svjetlosnim mikroskopom za analizu velikog / ravnog fenotipa ( d ) ili su podvrgnute obojenju s β- galaktozidazom ( e ). Stanice su ocijenjene i predstavljene kao postotak obojenih stanica u odnosu na ukupne stanice. Rezultati su predstavljeni kao reprezentativne slike i srednje vrijednosti i SE iz tri neovisna eksperimenta. Najmanje 300 stanica bilo je prebrojano za svaki uvjet

Slika pune veličine

Pin1 modulira Rb fosforilaciju tijekom napredovanja staničnog ciklusa

Rb ima važnu ulogu na kontrolnoj točki S-faze u staničnom odgovoru na oštećenje DNA. Nakon γ- zračenja ili oksidativnog stresa, Rb se aktivira pomoću defosforilacije, što rezultira blokadom sinteze DNA i zaustavljanjem staničnog ciklusa faze S. 19, 20 Kako Pin1 modulira Rb fosforilaciju, istražili smo ulogu Pin1 u regulaciji Rb fosforilacije tijekom kontrole kontrolne točke S-faze. WT ili Pin1 - / - MEF stanice sinhronizirane su u S-fazi liječenjem aphidicolinom, što je dovelo do povećanja hiperfosforiliranog Rb i u WT i Pin1 - / - MEF (slika 5a, trake 2 i 8), što ukazuje da je Rb hiperfosforiliran tijekom S-faze. γ -zračenje S-faznih WT MEF-ova rezultiralo je Rb deposforilacijom u 8 sati nakon zračenja. Suprotno tome, defosforilacija Rb u Pin1 - / - MEF bila je evidentna već 2 sata nakon ozračenja, što je dovelo do značajno smanjene razine Rs fosforilacije u usporedbi s WT MEFs (slike 5a i b).

Image

Pin1 modulira Rb deposforilaciju u kontroli staničnog ciklusa. ( a ) Stanice WT ili Pin1 - / - MEF su sinkronizirane s ahidicolinom, a zatim γ- ozračene (20 Gy). Uzorci su sakupljeni svakih 2 sata tokom 8 sati i podvrgnuti se zapadnom upijanju, kao što je prikazano. ( b ) Fosforilacija Rb kvantificirana je denzitometrijskom analizom i izražena kao postotak Rb fosforilacije u nuli. ( c ) IMR90 stanice su stabilno zaražene adenovirusom koji eksprimira GFP i HA1 označen Pin1 (Ad-Pin1), sam SV40 mali t antigen (Ad-st), ili sam GFP (Ad-GFP). Stanice su sinhronizirane sa 1.0 mM hidroksiuree 18 sati, oslobađane i zatim γ- zračene (20 Gy). Uzorci su sakupljeni 6 sati nakon ozračivanja i podvrgnuti se zapadnom blotiranju, kao što je prikazano. ( d ) Stanice H1299 bile su stabilno zaražene Ad-GFP, Ad-st ili Ad-Pin1. Šest sati nakon infekcije, stanice su sinkronizirane sa 100 ng / ml nokodazola tijekom 18 sati. Mitotske ćelije su određena vremena uzdrmane i uzgajane u svježem mediju. Lizati s cijelim stanicama podvrgnuti su se zapadnom blotiranju kako je naznačeno. Fosforilacija Rb kvantizirana je denzitometrijskom analizom i izražena kao postotak Rb fosforilacije u nuli. ( e ) fosforilacija Rb kvantificira se analizom denzitometrije, normalizira se na aktin i izrazi kao postotak fosforilacije Rb u nuli

Slika pune veličine

Ispitali smo može li ektopična ekspresija Pin1 utjecati na Rb fosforilaciju na kontrolnoj točki S-faze. Stanice IMR90 koje stabilno eksprimiraju bilo Pinl ili GFP, sinkronizirane su hidroksiurejom (HU) i zatim puštene u S-fazu prije izlaganja γ- zračenju. Kao kontrolu, analizirali smo stanice koje eksprimiraju SV40 mali t antigen (st), za koji se pokazalo da inhibira aktivnost PP2A, što dovodi do viših razina hiperfosforiliranog Rb. 34, 35 γ -zračenje dramatično je smanjilo hiperfosforilirani Rb. Ekspresija SV40 st dovela je do značajno povišene razine hiperfosforiliranog Rb nakon γ- zračenja. Slično tome, ektopična ekspresija Pin1 rezultirala je Rb hiperfosforilacijom u S-fazi, iako manjoj nego u stanicama koje eksprimiraju SV40 st (slika 5c). Uzeto zajedno, ovi podaci sugeriraju da Pin1, poput SV40 st, može održati Rb fosforilaciju inhibicijom PP2A kao odgovor na oštećenje DNA u S fazi.

Kako je pokazano da Rb ostaje hiperfosforiliran tijekom staničnog ciklusa do kasne M-faze, 15, 16, istraživali smo je li Pin1 utjecao na Rb-deposforilaciju na M-fazi. Stanice H1299 koje stabilno eksprimiraju GFP, st ili Pin1, sinkronizirane su s nokodazolom, a zatim oslobođene. Kao što se očekivalo, Rb se brzo oslobađao defosforiliranog nakon oslobađanja iz nokodazola u kontrolnim stanicama (slike 5d i e), dok je SV40 dramatično inhibirao defosforilaciju. Slično tome, ekspresija Pin1 kasni s Rb deposforilacijom (slike 5d i e). Stoga ovi podaci sugeriraju da Pin1 ima ulogu u regulaciji Rb fosforilacije na mitotičkom izlazu.

Pin1 ima ulogu na kontrolnoj točki S-faze

Kako Rb ima kritičnu ulogu u kontroli kontrolne točke S-faze nakon oštećenja DNA, a naši podaci pokazuju da Pin1 može regulirati aktivnost Rb modulacijom Rb fosforilacije, istražili smo ulogu Pin1 u kontroli kontrolne točke pri oštećenju DNA tijekom S-faze. Stanice H1299 stabilno eksprimiraju Pin1, SV40 st ili GFP sinkronizirane su u S-fazi s HU, te su potom oslobođene i potom izložene zračenju od 20 Gy γ . Stanice su zatim označene sa BrdU. γ- zračenje je dovelo do značajne inhibicije sinteze DNA u kontrolnim ćelijama, kao što se očekivalo, dok je ekspresija SV40 st ili Pin1 rezultirala višom razinom ugradnje BrdU nakon oštećenja DNK (slika 6a), što sugerira da Pin1 može spriječiti kontrolnu točku S faze kao odgovor na oštećenje DNK.

Image

Pin1 ima kritičnu ulogu u kontroli kontrolne točke S-faze. ( a ) Stanice H1299 bile su zaražene adenovirusom koji eksprimira GFP i HA-označen Pin1 (Ad-Pin1), sam SV40 mali t antigen (Ad-st) ili sam GFP (Ad-GFP). Stanice su sinhronizirane sa 1.0 mM HU tijekom 18 sati, a zatim oslobođene, zatim γ- zračenjem i obilježene sa 5-bromo-2'-deoksiuridinom (BrdU). Stanice su zatim fiksirane, obojene anti-BrdU antitijelima, suprotstavljene DAPI i vizualizirane fluorescentnom mikroskopijom. Rezultati su normalizirani na netretiranu kontrolu. Najmanje 100 stanica dobiveno je za svaki uvjet. Rezultati su izraženi kao sredstva i SE iz tri neovisna pokusa. * P <0, 05. ( b ) H1299 stanice su stabilno transficirane sa shRNA protiv Pin1 (shPin1) ili vektorskom kontrolom (Vec), i adenovirusom koji kodira Pin1 (Ad-Pin1), kako je naznačeno. Stabilne stanice su podvrgnute RDS testu na sljedeći način: stanice su prethodno obilježene s [ 14C ] -timidinom radi dobivanja unutarnje kontrole sadržaja DNA, sinkronizirane sa 1.0 mM HU tijekom 18 sati, a zatim oslobođene. Stanice S-faze bile su izložene stupnjevanim dozama γ- zračenja, a potom su puls obilježen s [3H] -timidinom tijekom 15 minuta. Relativna DNK sinteza određena je kao omjer ugradnje [3H] -timidina u [ 14C ] -timidina i normalizirana u odgovarajuću neniradijanu kontrolu. ( c ) RDS ispitivanja provedena su u WT ili Pinl - / - MEF stanicama kako je gore opisano. * P <0, 05; ** P <0, 01. ( d i e ) WT ili Pinl - / - MEF stanice su transfektirane s HA ​​označenim WT ili mutantnim Pin1 (W34A ili R68, 69A), ili s vektorskom kontrolom, kako je prikazano. ( d ) Ekspresija proteina je ocijenjena Western blottingom. ( e ) Stanice su podvrgnute RDS ispitivanjima kao što je gore opisano. Rezultati su predstavljeni kao srednja vrijednost ugradnje [3H]-timidina i SE iz tri neovisna eksperimenta

Slika pune veličine

Zatim smo ispitali učinke prigušivanja Pin1 u kontrolnoj točki S-faze izazvane IR upotrebom testova radiorezistentne DNK (RDS). Stabilne stanice koje eksprimiraju shRNA specifičnu za Pin1 prvo su označene metil- [ 14C ] -timidinom, sinkronizirale su se u S-fazi i oslobodile, a potom podvrgle γ- zračenju (5 ili 10 Gy), nakon čega je slijedilo pulsiranje s metil- [ 3H] -timidin za određivanje količine tekuće sinteze DNK nakon oštećenja DNA. Izloženost zračenju od 5 i 10 Gy γ dovela je do ~ 15 i 20% smanjenja ugradnje [3H] -timidina. Izrazito, ablacija Pin1 dodatno je smanjila sintezu DNK nakon oštećenja DNA, što je rezultiralo smanjenjem ugradnje [3H]-timidina za preko 30%. Pored toga, ovi efekti su efektivno poništeni obnavljanjem Pin1 ekspresije (slika 6b). Ovi podaci pokazuju da Pin1 ima važnu ulogu u kontrolnoj točki S-faze koju inducira IR.

Da bismo dodatno ispitali ulogu Pin1 u kontroli kontrolne točke S-faze, proveli smo RDS ispitivanja u MEF-u sa nedostatkom Pin1 i WT. Iako je γ- zračenje WT MEF stanica dovelo do smanjenja sinteze DNA o dozi, nedostatak Pin1 doveo je do daljnje smanjene sinteze DNK (slika 6c). Zatim smo ponovno uveli ili WT Pin1, Pin1 s nedostatkom vezanja R1 (W34A), ili Pin1 (R68, 69A) sa oštećenjem izomerazne aktivnosti, 36 u Pin1 - / - MEF. Ekspresija WT i mutantnog Pin1 potvrđena je Western blottingom (slika 6d). Dosljedno, RDS ispitivanja pokazuju da je nedostatak Pin1 doveo do smanjene ugradnje [3H]-timidina nakon γ- zračenja, što je revertirano WT Pin1, ali ne i Pin1 (W34A) ili Pin1 (R68 / 69A) (Slika 6e). Ovi podaci sugeriraju da su i sposobnost Pin1 da veže Rb i njegova aktivnost izomerizacije ključni za funkciju Pin1 na kontroli kontrolne točke S-faze.

Prekomjerna ekspresija Pin1 korelira s hiperfosforilacijom Rb u karcinomu dojke kod ljudi

Pin1 je često prekomjerno izražen kod različitih vrsta karcinoma kod ljudi, uključujući karcinom dojke. 37 Kako naši rezultati pokazuju da Pin1 inhibira Rb funkciju održavanjem Rb hiperfosforilacije, ispitali smo postoji li klinička važnost. Obavili smo imunohistokemijsko bojenje uzoraka biopsije humanog tumora dojke i utvrdili fosforilaciju Pin1 i Rb (pS807 / 811). Kao što je prikazano na slici 7a, hiperfosforilacija Rb na S807 / S811 pronađena je u 42, 9% svih uzoraka (12 od 28), dok je prekomjerna ekspresija Pin1 pronađena u ~ 35% svih uzoraka (10 od 28). Značajno je da su gotovo svi tumori koji sadrže višu razinu Pin1 (9 od 10) pokazali znatno više razine hiperfosforiliranog Rb (pS807 / 811), dok su tumori koji izražavaju niže razine Pin1 (15 od 18) na sličan način pokazali niže razine hiperfosforiliranog Rb., Statistička analiza pokazala je značajnu pozitivnu povezanost između ekspresije Pin1 i hiperfosforilacije Rb, što je utvrđeno Spearmanovim korelacijskim testom ( P <0, 001; Slika 7b i Dopunska slika S1). Uzeti zajedno, ovi rezultati pokazuju da je prekomjerna ekspresija Pin1 uporedo s Rb hiperfosforilacijom u karcinomu dojke kod ljudi.

Image

Prekomjerna ekspresija Pin1 u korelaciji je s hiperfosforilacijom Rb u karcinomu dojke kod ljudi. ( a ) Uzastopni odsjeci raka dojke podvrgnuti su imunohistokemiji za ekspresiju Pin1 ili hiperfosforiliranom nivou Rb (pS807 / 811) i fotografirani pod svjetlosnim mikroskopom. Zatim su mikrografije analizirane i klasificirane kao visoke ili niske, ovisno o intenzitetu bojenja i postotku pozitivnih stanica. Prikazane su reprezentativne slike za svaku razinu. ( b ) Sažetak nivoa ekspresije Pin1 i hiperfosforilirane razine Rb (pS807 / 811; ppRb). Korelacija je analizirana Spearmanovim testom ( P <0, 001)

Slika pune veličine

Rasprava

Rb protein je kritično važan za reguliranje napredovanja staničnog ciklusa i odgovor oštećenja DNK. Stoga je tijesna regulacija aktivnosti Rb presudna za sprečavanje stanične transformacije i tumorigeneze. Ovdje smo pokazali da Pin1 ima važnu ulogu u regulaciji staničnog ciklusa posredovanja Rb i kontrolnoj točki S-faze nakon oštećenja DNA. Prvo, Pin1 se specifično veže za RbC i ta interakcija ovisi o Rb fosforilaciji koju induciraju G1 / S ciklini. Drugo, Pin1 in vitro inhibira PP2A posredovanu Rb deposforilaciju. Treće, ekspresija Pin1 učinkovito inhibira prerano stanično starenje uzrokovano Rb. Četvrto, prekomjerna ekspresija Pin1 potiče Rb hiperfosforilaciju i dovodi do neispravne kontrolne točke S-faze nakon oštećenja DNA. Nadalje, prekomjerna ekspresija Pin1 značajno je u korelaciji s hiperfosforilacijom Rb u uzorcima biopsije ljudskog karcinoma.

Pokazano je da više proteina djeluje u interakciji s hipofosforiliranim Rb, što je biološki aktivna vrsta Rb. Do danas, osim proteinskih fosfataza, nema poznatih staničnih proteina koji specifično djeluju na hiperfosforilirani Rb. Ovdje smo pokazali da se Pin1 specifično veže za RbC na način ovisan o fosforilaciji. Značajno je da RbC sadrži više S / TP komponenti koje fosforiliraju Cyclin / CDK kompleksi i imaju kritičnu ulogu u regulaciji Rb funkcije. 17, 38 Otkrili smo da mutacija ovih mjesta na alanin ukida interakciju Pin1-Rb, dok ekspresija Cyclin A, Cyclin D1 ili Cyclin E pojačava vezanje Pin1-Rb. Ova su opažanja u skladu s nedavnim izvješćem koje pokazuje da CDK2 ili CDK4 / 6 ekspresija jača Rb-Pin1 interakciju u multiformnim staničnim linijama glioblastoma. 39 Napomena, autori su također izvijestili da mali džep Rb, koji isključuje RbC, djeluje na Pin1, što pokazuju testovi GST pada u stanicama 293FT. 39 Razlozi tih odstupanja su nepoznati. Iako su ove studije pokazale da je hiperfosforilacija posredovana CDK pretpostavkom za Pin1-Rb interakciju, molekularni mehanizmi odgovorni za Pin1 posredovanu regulaciju Rb funkcije još uvijek nisu rasvijetljeni. Funkcija Rb određena je njezinim statusom fosforilacije, što ovisi o kinetičnosti fosforilacije pomoću Cyclin / CDK kompleksa i defosforilaciji fosfatazama, kao što su PP1 i PP2A. Ovdje smo otkrili da WT Pin1, ali ne i Pin1 derivati ​​mutanta koji imaju nedostatak u vezivanju Rb, inhibiraju Rb funkciju u napredovanju staničnog ciklusa i u prijevremenoj staničnoj starenji. Nadalje, Pin1 sprječava Rb deposforilaciju na kontrolnoj točki S-faze, sprječavajući tako zaustavljanje zaustavljanja staničnog ciklusa posredovanog Rb. Naši podaci pokazuju da Pin1 izravno inhibira PP2A, stoga održava Rb hiperfosforilaciju. Zanimljivo je da PP2A normalno defosforilira fosfo-Ser / Thr-Pro izomere u transkonformaciji , 26, 40 i Pin1-posredovanom cis - trans prolinom izomerizacijom općenito potiče PP2A-posredovanu defosforilaciju određenog broja proteina, poput Pim-1 kinaze, 41 raf-1, 30 c-Myc, 31 Cdc25C 26 i Tau. 26 Unatoč tome, pokazalo se da Pin1 inhibira i PP2A posredovanu defosforilaciju neurofilamentnih proteina u kortikalnim neuronima. 42 Dakle, specifični molekularni mehanizmi koji su u osnovi inhibicije PP2A od strane Pin1 zahtijevaju daljnje istraživanje. Moguće je da specifične konformacijske promjene nakon Pin1 posredovane izomerizacijom mogu maskirati mjesta povezivanja za PP2A, te stoga ishod Pin1 akcije za PP2A može varirati ovisno o supstratu i kontekstu signalizacije.

Unatoč tome, Pin1 može poboljšati Rb hiperfosforilaciju drugim mehanizmima. Na primjer, za Pin1 je prijavljeno da izaziva Cyclin D1 ekspresiju i pojačava njegovu funkciju. 27, 37, 43 Stoga je moguće da Pin1 modulira Rb fosforilaciju kombiniranim učincima aktivacije ciklin D1 i inhibicije PP2A. Međutim, Cyclin D proteini imaju glavnu ulogu u posredovanju fosforilacije Rb tijekom G1 faze, ali manje vjerovatno za vrijeme S-faze. Zanimljivo je da je objavljeno da oštećenje DNA na S-fazi snižava CDK2 i Cyclin D1. 44, 45 Stoga bi moglo biti da je smanjenje fosforilacije Rb nakon oštećenja DNA na S-fazi posljedica smanjene aktivnosti Cyclin / CDK. No, nakupljanje uzrokovano oštećenjem DNA hipofosforiliranog Rb tijekom S-faze ne zahtijeva CDK inhibitore p16 INK4A ili p21 WAF1 / CIP1 (ref. 21). Stoga, iako se potencijalni doprinos promjenama aktivnosti CDK-a ne može u potpunosti isključiti, vjerojatno je da opaženo Rb hipofosforilacija na oštećenju DN-a u S fazi uglavnom proizlazi iz defosforilacije izazvane PP2A i da Pin1 inhibira taj proces direktnom interakcijom s hiperfosforiliranom Rb,

Osim što ima ulogu u kontroli oštećenja DNA na S-fazi, pokazali smo da Pin1 inhibira Rb deposforilaciju na mitotičkom izlazu. Moguće je da je Pin1 uključen u vremensku regulaciju Rb dephosforilacije i da nenormalno visoke razine Pin1 mogu poremetiti ovaj proces, što dovodi do oštećenja u napredovanju staničnog ciklusa.

Disregulacija Rb izravno je povezana s tumorigenezom i napredovanjem raka. Mutacije gerlina u genu RB1 često rezultiraju dječjim retinoblastomom. 46 Slično, mutacije RB1 pronađene su i u mnogim ljudskim karcinomima, uključujući karcinom pluća malih stanica, osteosarkom i melanom. 47, 48, 49 Nadalje, kod karcinoma kod ljudi često se javljaju aberacije koje dovode do nenormalne aktivacije Rb kinaza, poput prekomjerne ekspresije ciklin D1 i inaktivacije p16 INK4A . 50 Slično, prekomjerna ekspresija Pin1 često je povezana s napredovanjem raka. 37, 51 Štoviše, pokazano je da Pin1 pojačava tumorigenezu i metastaze izazvane mutantnim p53 u mišjim modelima. 52 Međutim, mnogo je manje poznato o vezi između Rb deposforilacije i tumorigeneze. Ovdje smo otkrili da prekomjerna ekspresija Pin1 korelira s povećanom Rb fosforilacijom u karcinomu dojke. Ranije smo izvijestili da je Pin1 prekomjerno izražen i usko je povezan s Rb fosforilacijom u tumorima izazvanim DMBA kod miševa, u usporedbi s normalnim mliječnim žlijezdama. 53 Također, Pin1 ekspresija je u korelaciji s fosforilacijom Rb u uzorcima ljudskog glioma, 54 što sugerira da povećana ekspresija Pin1 može barem djelomično biti posljedica inaktivacije Rb. Značajno, analiza baze podataka TCGA 55 otkriva jasnu povezanost između nivoa p1 mRNA i fosforiranog Rb (S807 / 811) u glioblastoma ( N = 70, P <0, 01). Međutim, analiza baze podataka TCGA ne otkriva jasnu povezanost invazivnog adenokarcinoma dojke 56 . Razlozi za neusklađenost ove analize i ove studije još nisu jasni. Moguće je da razine p1 mRNA ne odražavaju stvarne razine proteina, kako je izvješteno prije 57 . Zajedno ovo istraživanje sugerira da prekomjerna ekspresija Pin1 i naknadno održavanje hiperfosforilacije Rb mogu imati važnu patološku ulogu u razvoju raka.

Materijali i metode

Stanična kultura i sinkronizacija

Ljudski osteosarkom Saos-2 i U2-OS stanice i humani ne-stanični karcinom pluća H1299 stanice održavani su u Dulbeccovom modificiranom mediju Eagle (DMEM; Invitrogen Inc., Carlsbad, Kalifornija, SAD) koji sadrži 4, 5 g / l glukoze s dodatkom bilo kojeg 10% seruma novorođenčeta teleta (NCS; U2-OS) ili 10% fetalnog goveđeg seruma (FBS; Saos-2) ili 5% FBS (H1299). Humane netransformirane stanice mliječnog epitela MCF-10A održavane su u 1: 1 mješavini DMEM-a i Ham, s F12 medija sa smanjenim Ca2 + (0, 04 mM; Invitrogen Inc.), 20 ng / ml epidermalnog faktora rasta (Invitrogen Inc.), 100 ng / ml kolerenog toksina (Sigma, St. Louis, MO, SAD), 10 μg / ml inzulina (Sigma), 500 ng / ml (95%) hidrokortizona (Sigma) i 5% konjskog seruma tretiranog Chelexom ( Invitrogen Inc.). Primarne ljudske stanice fibroblasta pluća IMR90 održavane su u DMEM-u uz dodatak 10% FBS-a i 0, 1 mM nebitnih aminokiselina (GIBCO Life Technologies, Rockville, MD, USA). WT i Pin1-null MEF održavani su u DMEM-u uz dodatak 10% FBS-a. Za studije sinkronizacije, stanice su uzgajane do 60% sutoka i tretirane s 1.0 mM HU tokom 18 sati ili 2.0 μg / ml ahidicolina tijekom 24 sata ili 100 ng / ml nokodazola tijekom 18 sati. Stanice su oslobođene ispiranjem dvaput fiziološkom otopinom puferiranom fosfatom (PBS) i jednom sa sredstvom za rast, a zatim su inkubirane u normalnom mediju rasta.

Transfekcije plazmida, virusne infekcije i RNA smetnje

Prolazne transfekcije provedene su korištenjem FuGENE 6 (Roche, Indianapolis, IN, SAD) za stanice U2-OS, Lipofektamin 2000 (Invitrogen Inc.) za stanice H1299, MEF i Saos-2 (ako je naznačeno) ili CalPhos kit za transfekciju sisavaca (Clontech, Mountain View, CA, USA) za stanice Saos-2, prema uputama proizvođača. Plazmidi prolazne ekspresije uključuju pCMV-Rb (puna duljina i mutant delecije ili točke), HA-označeni pHook2-Pin1 (WT i točkasti mutant), PLVXpuro-Pin1 (WT ili point mutant), a plazmidi adenovirusne ekspresije uključuju Pin1-pAdTrack-CMV, SV40 mali t antigen (st) -pAdTrack-CMV i GFP-pAdTrack-CMV. Ti su plazmidi prethodno opisani. 11, 25 RNA kratke dlake protiv Pin1 (5'-AGGCCGAGTGTACTACTTCTCAA-3 ') klonirana je u pSM2 retrovirusni vektor (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, SAD). Retrovirus i adenovirus su amplificirani transfektiranjem stanica 293FT odgovarajućom okosnicom i pakiranjem plazmida; supernatanti su sakupljeni nakon 48 sati, filtrirani i upotrebljeni odmah ili pohranjeni na -80 ° C. Retrovirus je koncentriran ultracentrifugiranjem pri 27 000 okr / min tijekom 90 minuta na 4 ° C. Za virusnu transdukciju, stanice s 60% -tnom sljepljivošću inkubiraju se retrovirusom (virusni titri od 10 8 do 10 9 CFU / ml) ili adenovirusom (MOI od 1: 100) tijekom 90 minuta pri 37 ° C uz blago miješanje u intervalima od 20 minuta, nakon čega slijedi dodavanje medija kulture uz dodavanje 10 μg / ml polibrena i inkubacija tijekom 24 sata.

Analiza aktivnosti luciferaze

U2-OS ili Saos-2 stanice u pločama sa šest jažica su transfektirane sa 1, 5 µg (U2-OS) ili 4, 0 µg (Saos-2) WT ili mutiranim HA označenim pHook2-Pin1, zajedno sa 0, 5 µg (U2-OS) ili 2, 0 µg (Saos-2) DHFR-luciferaza, i 100 ng (U2-OS) ili 400 ng (Saos-2) pCMV- β- galaktozidaza plazmida, i prikupljeno je 24 sata nakon transfekcije. Aktivnost luciferaze je mjerena primjenom sistema za ispitivanje luciferaze (Promega, Madison, WI, USA) prema uputama proizvođača i normalizirana u aktivnosti β- galaktozidaze. Za aktivnost P- galaktozidaze, 30 µl stanični lizati se inkubiraju u 500 μl LacZ puferu (60 mM Na2P04, 40 mM NaH2P04, 10 mM KCl i 1, 0 mM MgS04, pH 6, 95) i 100 µl supstratna otopina (2 mg / ml O- nitrofenil β -D-galaktopiranozida u 60 mM Na2 HPO 4 i 40 mM NaH2P04) na 37 ° C 20 minuta. Reakcija je zaustavljena dodavanjem 250 μl 1.0 M Na2C03 i apsorbancija je izmjerena na 420 nm.

Analiza Western blotta, imunoprecipitacija i eksperimenti s imunofluorescencijom

Ako nije naznačeno, stanice su lizirane u EBC 250 puferu za lizu (250 mM NaCl, 50 mM Tris · HCl, pH 8, 0, 0, 5% Nonidet P-40, 0, 2 mM PMSF, 2 μg / ml aprotinina i 2 μg / ml leupeptina, 5 mM NaF i 0, 5 mM NaVO 4 ), kratko sonicirano i zatim centrifugirano na 14 000 × g, 15 minuta, na 4 ° C. Supernatanti su sakupljeni, a koncentracije proteina određene su reagensom za ispitivanje proteina Bio-Rad (Bio-Rad, Hercules, CA, SAD). Za Western blotning, uzorci su razdvojeni pomoću SDS-PAGE, preneseni na membrane polivinilidena difluorida (NEN Life Sciences, Waltham, MA, SAD) i hibridizirani na odgovarajuće primarno antitijelo i konjugirano peroksidazno konjsko antitijelo za detekciju pomoću pojačane hemiluminiscencije (Thermo Fisher Scientific Inc., Rockford, IL, SAD). Za imunoprecipitaciju, H1299 stanice su lizirane u 0, 25% NP-40 puferu (20 mM Tris-HCl, pH 7, 8, 125 mM NaCl, 0, 25% Nonidet P-40, 0, 2 mM EDTA, 5 mM MgCL2, 1 mM PMSF, 5 mM NaF, 2 mM Na3VO4), 2, 0 mg / ml ukupnog proteina se inkubira 8 sati s anti-FLAG M2 afinitetnim gelom (A2220, Sigma). Za imunoprecipitaciju u stanicama U2-OS prvo je očišćeno 2, 0 mg / ml ukupnog proteina normalnim mišjim ili zečjim IgG (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, Kalifornija, 1 sat), nakon čega je dodano proteina A / konjugiranog agarozom. G kuglice (Santa Cruz Biotechnology) i inkubira se 30 minuta uz blago miješanje. Supernatanti su zatim inkubirani kroz 2 sata sa specifičnim primarnim antitijelom ili kontrolnim IgG, nakon čega je dodano agarozno zrnca s konjugiranim agarozom (Santa Cruz Biotechnology) i inkubirana 1 sat. Imuni kompleksi su zatim isprani tri puta s puferom za lizu i otopljeni SDS-PAGE i zapadnim upijanjem. Sve inkubacije su izvedene na 4 ° C. Antitijela koja se koriste za Western blot obuhvaćaju Pan-Rb (G3-245, BD Biosciences, San Jose, CA, USA; i mješavinu monoklonskih antitijela XZ77 i XZ91), hipofosforilirani Rb (G99-549; BD Biosciences), fosforilirani Ser780 (pS780 ), pS795 ili pS807 / 811 Rb (# 9307, # 9301 i # 9308, respektivno; Stanična signalizacija, Danvers, MA, SAD), Pin1 (Ab-1, Oncogene Research Products, Cambridge, MA, SAD; H123, sc- 15340, Biotehnologija Santa Cruz) i Actin (C-11, Biotehnologija Santa Cruz). Za imunofluorescenciju, stanice su fiksirane s 4% paraformaldehida, imuno obojene s primarnim Rb antitijelima i sekundarnim protutijelima Alexa Fluor 488 (A11001; Santa Cruz Biotechnology) u 4% BSA i suprotstavljene 4, 6-diamidino-2-fenilindolom (DAPI). Za analizu Rb povezanosti s nuklearnim matriksom, stanice su tretirane sa ili bez ekstrakcijskog pufera (250 mM NaCl, 10 mM HEPES-KOH, pH 7, 9, 0, 1% Triton X-100, 0, 5 mM ditiotreitola, 0, 2 mM PMSF, 2 μg / ml aprotinina i 2 μg / ml leupeptina, 5 mM NaF i 0, 5 mM NaVO 4 ) prije imunofluorescencije. Slike stanica zabilježene su mikroskopom Axiovert 200 M (Carl Zeiss, Oberkochen, Njemačka) i analizirane softverom Axiovision 3.1 (Carl Zeiss).

GST pokusni testovi

GST testovi spuštanja provedeni su u osnovi kako je prethodno opisano. 58 Ukratko, stanice su lizirane u EBC 200 puferu (isti kao EBC 250, ali koji sadrži 200 mM NaCl) uz dodatak 10% (v / v) glicerola. Jednake količine proteina inkubirane su sa 20 μl perlama Glutation-Sepharose 4B napunjene različitim proteinima GST-Pin1 ili kontrolnim GST-om tijekom 3 sata na 4 ° C. Zrnca su tada isprana s EBC 200 puferom i podvrgnuta Western blot analizi.

In vitro fosforilacija i defosforilacija

Prvo je 400 ng RbC proteina (stanično signaliziranje, # 6022) označeno in vitro fosforilacijom u reakcijskom sustavu koji sadrži 40 ng Cyclin E / CDK2 (stanična signalizacija, # 7524), 30 µ Ci γ - [ 32 P] -ATP (NEN Life Sciences), 100 μM ATP, 50 mM Tris-HCl pH 7, 5, 10 mM MgCl2, 1 mM EGTA, 2 mM DTT i 0, 01% (w / v) Brij-35 inkubacijom na 30 ° C 30 min. Reakcija je zaustavljena povećanjem temperature na 65 ° C 10 min. Slobodni y - [32P] -ATP uklonjen je centrifugiranjem kroz tri stupca Sephadex-G25 (Roche) pri 3200 o / min u trajanju od 10 minuta. Drugo, za određivanje učinka Pin1 na Rb deposforilaciju in vitro , 200 ng fosforiliranog RbC proteina in vitro inkubirano je bilo s BSA (0, 04 µg / μl), 10 nM okadaične kiseline, ili pročišćenim GST-Pin1 proteinom (0, 04 µ g / μl) u defosforilacijskom puferu od 50 µl (10% glicerola, 20 mM MOPS pH 7, 4, 0, 1 M NaCl, 1 mM MgCl 2, 0, 1 mM MnCl2, 60 mM β -merkaptometnol, 1 mM EGTA, 1 mM DTT i 0, 1 μg / μl BSA) na 30 ° C tokom 15 min. Zatim se u reakcijsku smjesu doda 5, 0 ng pročišćenog PP2A (Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY, USA), čime se konačni volumen stavi na 100 μl i inkubira na sobnoj temperaturi. Alikvoti se uklanjaju svakih 10 min i nakon toga se rastvara SDS-PAGE. [ 32 P] Označeni RbC otkriven je autoradiografijom.

Protok citometrija

Stanice su prvo inkubirane u puferu A (4, 0 mM natrijev citrat pH 7, 8, 0, 1% Triton-X-100, 100 µg / ml RNaze A i 50 µg / ml propidium jodida) na sobnoj temperaturi 10 min. Dodan je jednaki volumen pufera B (400 mM NaCl, 0, 1% Triton-X-100, 50 μg / ml PI) i inkubiran preko noći na 4 ° C. Stanice su potom podvrgnute protočnoj citometriji analizom pomoću FACScan Flow citometra (Becton Dickinson Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA), a podaci su analizirani pomoću programa Cell Quest (Becton Dickinson Biosciences).

RDS test

Za RDS ispitivanja, stanice su se inkubirale 24 sata s metil- [ 14C ] -timidinom (10 nCi / ml) (NEN Life Science) tijekom obilježavanja. Stanice su zatim sinhronizirane kako je gore opisano, te podvrgnute stupnjevanim dozama γ- zračenja. Nakon 45 min, stanice su obilježene pulsom obilježenim 2, 0 µCi / ml metil- [3H] -timidina (NEN Life Sciences) tijekom 15 minuta. Stanice su jednom isprane ledeno hladnim PBS-om i tri puta sa 5% triklorooctenom kiselinom, a zatim sušene na sobnoj temperaturi preko noći i ubrane. Radioaktivnost je mjerena u tekućem scintilacijskom brojaču, a sinteza DNA predstavljena je kao odnos broja [ 3 H] u odnosu na [ 14 C] i normalizirana na odgovarajuću kontrolu.

Test inkorporiranja BrdU

Stanice su obilježene sa 3 μM BrdU (Roche) 3 h, fiksirane 70% -tnim etanolom dopunjenim 15 mM glicina pH 2, 0 tijekom 30 minuta na -20 ° C i imunostanirane s anti-BrdU antitijelom (Roche) nakon čega slijedi bojenje sa Cy3-konjugirani kozji protu-mišji IgG (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA, USA; 115-165-146) i kontrastiran s DAPI. BrdU-pozitivne stanice su ocijenjene pod fluorescentnim mikroskopom. Analizirana su tri različita polja i brojilo se najmanje 100 jezgara. Rezultati su normalizirani na netretiranu kontrolu.

Testovi za fenotipove povezane sa starenjem

Za testove supresije rasta Rb, Saos-2 stanice su kofeficirane pCMV-Rb i / ili PLVX-Pin1 (WT ili mutant) Lipofektaminom 2000 (Invitrogen Inc.) i odabrane rezistencijom na puromicin (0, 5 µg / ml). Stabilne stanice su uzgajane u normalnom mediju rasta 10 dana. Stanice su zatim vizualizirane pod svjetlosnim mikroskopom i procjenjene za postotak morfologije velikih plosnatih stanica. Za bojenje povezano s P- Galaktozidazom (SA- P- Gal) vezanom za starenje, stanice su fiksirane 3, 7% formaldehida u PBS-u tokom 15 minuta na sobnoj temperaturi, isprane i obojene otopinom X-Gal (Beyotime, Šangaj, Kina) 16 h na 37 ° C. Stanice su zatim vizualizirane pod svjetlosnim mikroskopom i procijenjene na postotak ćelija β -Gal-pozitivnih.

Imunohistokemijske analize

Parafinski dijelovi tkiva s uzorcima biopsije raka dojke kod ljudi nabavljeni su od bolnice zapadne Kine sa sveučilišta Sichuan (Chengdu, Sichuan, Kina). Za imunohistokemiju, tobogani su depakirani u ksilenu, rehidrirani u etanolu i zatim prethodno obrađeni sa 1% H202 / 10% metanola u PBS-u tijekom 15 minuta na sobnoj temperaturi kako bi se ugasila aktivnost endogene peroksidaze. Sekcije su blokirane s 2% BSA 1 sat na sobnoj temperaturi, nakon čega je slijedila inkubacija preko anti-Pinl (H123; Santa Cruz Biotechnology) ili anti-pS807 / 811-Rb (# 9308; Stanična signalizacija) preko noći. Nakon opsežnog pranja, tobogani su se inkubirali s biotiniliranim konjskim anti-zečjim IgG (BA-1000; Vector Laboratories, Burlingame, CA, SAD). Produkti reakcije vizualizirani su s ABC Elite kitom (Vector Laboratories) prema uputama proizvođača. Zatim su dijapozitivi suprotstavljeni hematoksilinom i eozinom (Sigma). Zatim je provedeno dvostruko slijepo bodovanje za Pin1 i Rb prema intenzitetu bojenja i postotku pozitivnih stanica. Statistička analiza izvršena je Spearmanovim korelacijskim testom.

Dodatna informacija

PDF datoteke

  1. 1.

    Dodatna informacija

Glosar

Rb

Retinoblastoma protein

RbLP

Rb velika džepna domena

RBC

Rb domena C-terminala

RbSP

Rb domena malog džepa

CDK

Ciklin-ovisne kinaze

PP1

Proteinska fosfataza 1

PP2A

Protein fosfataza 2A

PPIase

Peptidil-prolil izomeraza

pS / TP

motiv fosforiliranog serina / treonin-prolina

S / TP

Motiv serina / treonin-prolina

MEF

Mišji embrionalni fibroblast

BSA

Album od goveđeg seruma

SA- β -Gal

Senescence-associated β -Galactosidase

St

SV40 small t antigen

RDS

Radioresistant DNA synthesis assays

PBS

Phosphate-buffered saline

Dodatne informacije nalaze se u ovom radu na web stranici Cell Death and Disease (//www.nature.com/cddis)