Egzosomsko profiliranje u plazmi oboljelih od raka sustavom biologije sljedeće generacije | znanstvena izvješća

Egzosomsko profiliranje u plazmi oboljelih od raka sustavom biologije sljedeće generacije | znanstvena izvješća

Anonim

Sažetak

Tehnologije koje mogu karakterizirati ukupnu širinu staničnih sustava moraju biti u stanju istovremeno mjeriti milijune proteina, izoformi i kompleksa. Opisali smo pristup koji ispunjava ovaj kriterij: Adaptivno dinamično umjetno ciljanje poli-liganda (ADAPT). ADAPT koristi obogaćenu biblioteku jednolančanih oligodeoksinnukleotida (ssODN) za profilisanje složenih bioloških uzoraka, čime se postiže neviđena pokrivenost izvornih biomolekula širom sustava. Koristili smo ADAPT kao visoko specifičan alat za profiliranje koji razlikuje žene s rakom dojke ili bez njega na temelju cirkulirajućih egzooma u njihovoj krvi. Da bismo razvili ADAPT, obogatili smo biblioteku od ~ 10 11 ssODN za one koji se povezuju s egzozomima od pacijenata s karcinomom dojke ili kontrolama. Rezultirajući 10 6 obogaćenih ssODN-a zatim je profiliran u plazmi od neovisnih skupina zdravih i žena s pozitivnim rakom dojke. ssODN-posredovano pročišćavanje afiniteta i masenom spektrometrijom identificirali su proteine ​​i komplekse proteina niskog obilja proteina i komplekse proteina, od kojih su neki poznati i u normalnoj homeostazi i u bolesti. Sekvenciranje oporavljenih ssODN osiguralo je kvantitativne mjere koje su korištene za izgradnju vrlo točnih potpisa s više analita za klasifikaciju pacijenata. Sondiranje plazme od 500 ispitanika s manjim podgrupom od 2000 reintetiziranih ssODN-ova stratificiranih zdravih, negativnih na biopsiju dojke i -pozitivnih žena. AUC od 0, 73 dobiven je pri uspoređivanju zdravih davatelja s pacijentima pozitivnim na biopsiju.

Uvod

Izvanstanične vezikule (EV), koje izlučuju u cirkulaciji mnoge tipove stanica, mogu pružiti snimku staničnih procesa aktivnih u bolestima i zdravim stanicama, omogućujući egzosomima u cirkulaciji da služe kao čuvari zdravlja pojedinca. U raku su egzosomi iz neoplastičnih stanica uključeni u međućelijsku komunikaciju koja je bitna za nekoliko osnovnih aspekata malignosti, uključujući imunološku evaziju 1, angiogenezu 2 i metastazu 3, 4 . Molekularni sastav egzozoma korelira sa stanicom porijekla 5, a promjene u membranskim komponentama, luminalnom sadržaju i obilju 6 egzosoma opisane su u različitim vrstama karcinoma 7, 8, 9, 10 . Stoga egzosomi mogu biti informativni biološki supstrat, odražavajući dinamičke promjene koje se mogu dogoditi tijekom progresije tumora.

Biblioteke koje se sastoje od nekoliko trilijuna ssODN-a obuhvaćaju gotovo beskonačan broj trodimenzionalnih struktura zbog velike složenosti prostora sekvenci DNA 11, 12, 13 . Sheme odabira / pojačanja mogu se osmisliti za skeniranje ovog ogromnog strukturalnog prostora za ssODN-ove koji se vežu za jednostavne ili složene ciljeve 14, 15 . Ove kvalifikacije omogućuju paralelno profiliranje razlika u molekularnom sadržaju u širokom rasponu bioloških izvora bez prethodnog znanja obvezujućih partnera 16, 17, ali taj potencijal do danas nije u potpunosti iskorišten.

Ovdje smo opisali kako se knjižnice ssODN-ova mogu koristiti za profiliranje egzooma plazme kod žena s i bez karcinoma dojke. Predstavljamo „Adaptivno dinamično ciljanje umjetnog poliliganda (ADAPT)“, novi pristup za praćenje razlika u molekularnom sadržaju egzooma u plazmi na masovno paralelni način i bez prethodnog poznavanja ciljeva.

Rezultati i rasprava

ADAPT se oslanja na frakcioniranje uzorka kako bi identificirao i okarakterizirao specifične subpopulacije makromolekula i kompleksa u krvnoj plazmi, uključujući one koje borave na površini egzooma. Koristili smo oborine iz polietilen glikola (PEG) (PPT) 18 i ultracentrifugiranje (UC) da bismo povratili egzosome iz uzoraka krvne plazme zdravih davatelja i analizirali sadržaj proteina pomoću LC-MS / MS (dopunska slika 1a). LC-MS / MS analizom identificirano je 131 protein proteina 19 (dopunska tablica S1) iz PPT i UC peleta (Sl. 1a, gornja ploča). Među njima je 13 bilo specifično za PPT, a 27 za UC. Identificirani proteini sastoje se od integralnih, perifernih i lipidno usidrenih membranskih proteina 20, ali i bjelančevina s nepoznatom interakcijom na membrani (dopunska Sl. 1b-e). Pored toga, PPT i UC identificirali su 17 neeksosomalnih komponenti, 5 specifičnih za PPT i 4 za UC (Sl. 1a, donja ploča).

Image

( a ) Vennov dijagram koji prikazuje preklapanje između proteina koji su povezani sa egzozomom (gornji) i neeksosom povezanim (donjim) proteinima identificiranim u plazmi peleta precipitiranih PEG ili UC. ( b ) TEM slike PEG precipitiranih egzooma (EV) vizualiziranih anti-CD9 antitijelom povezanim zlatno-nanočesticama (crne sfere). ( c ) Analiza dinamičkog raspršivanja svjetlosti (DLS) raspodjele veličina EV izoliranih PEG oborinama. Krivulja propadanja signala, kao i DLS kontrola (UC pročišćeni plazmi egzoomi i proteinska otopina bez egzooma) prikazani su na dodatnoj slici 1g. ( d ) Princip obogaćivanja biblioteke: biblioteka molekula velike raznolikosti (~ 10 11 predstavnika) dovodi se u kontakt s krvnom plazmom iz biopsivno pozitivnih (Rak, C) i paralelno s plazmom iz biopsije negativne (ne-Rak, nC) pojedinci; u drugom stupnju se nevezani ssODN uklanjaju s supernatantom i prikupljaju se vezane molekule; u trećem koraku, ssODN-ovi oporavljeni od C inkubiraju se s nC (i obrnuto ), a nevezači se uklanjaju peletom; četvrti korak je još jedno vezivanje za pozitivan cilj, kao što je prikazano u koracima prvi i drugi . Taj se postupak obogaćivanja ponovio tri puta s PCR-om između: u prvoj iteraciji UC je korišten za obnavljanje EV-a; u slijedeće dvije iteracije, PEG-oborina je korištena za EV oporavak. U prvom krugu obogaćivanja L3 korišteno je ukupno 119 biopsija-pozitivnih (n = 59), biopsi-negativnih (n = 30) i samoproglašenih normalnih (n = 30) bolesnika, dok su samo rak i ne -uzorci kancera korišteni su u sljedećim krugovima. Ovim postupkom obogaćivanja dobivaju se dvije odvojene biblioteke niže raznolikosti (~ 10 6 predstavnika) obogaćene značajkama (ciljevima) prisutnima u uzorcima A i B. ( e, f ) Procjena kvalitete i populacije početne knjižnice (L0) i pripadajućih knjižnica L1 i L2 dobivene iz ( d ). Dubina NGS sekvenci bila je slična za L0, L1 i L2 ( f, sive trake: valjano očitava V, crne trake: ukupno očitava T), dok je broj kopija po nizu značajno povećan u L1 i L2 ( e ), dok je ukupna broj jedinstvenih sekvenci je smanjen (dopunska Sl.1i).

Slika pune veličine

Transmisijska elektronska mikroskopija korištena je za analizu materijala prikupljenog PPT-om, a potvrđene su egzozomske morfologije usporedive s egzosomima izoliranim UC 21, 22 . TEM-snimka s anti- CD9 antitijelom i 10 nm koloidnim imunogoldom (Sl. 1b), i Western blottingom (dopunsko Sl. 1f) potvrdili su prisutnost kanonskog egzozomalnog marker proteina CD9 na površini egzooma izvedenih iz PPT. Dinamičko raspršivanje svjetla (DLS) pokazalo je 20–200 nm čestica (Sl. 1c) s robusnom krivuljom propadanja signala (Dodatna slika 1 g, lijeva ploča) što potvrđuje pouzdanost mjerenja DLS-a. Veličina čestica je u skladu s veličinom koja je uočena za UC precipitirane egzosome (dopunski Sl. 1 g, srednja ploča) u odnosu na "ne-plazmu" -kontrolu (Dopunska slika Sl. 1 g, desna ploča).

Kao početni korak u razvoju ADAPT-a, obučena knjižnica randomiziranih ssDNA sljedova (koja se naziva profilirajuća knjižnica L3) generirana je iz neselektirane slučajne polazne biblioteke (nazvane L0; slika 1d). Četiri različite sheme obogaćivanja korištene su za stvaranje ssODN biblioteka specifičnih za egzosome (dopunska tablica S2). Obogaćivanje pod najvećom strogošću izvršeno je kako slijedi: alikvot 10 11 sekvenci L0 (dopunska slika 1h) ili je inkubiran s objedinjenom krvnom plazmom kod 59 pacijenata s pozitivnom biopsijom raka dojke (Sl. 1d, Rak; Dodatna tablica S3), ili s objedinjenom krvnom plazmom od 30 pacijenata negativnih na biopsiju i 30 zdravo proglašenih zdravih žena (Sl. 1d, Non-karcinom; Dodatna tablica S4). Svi su uzorci krvi prikupljeni prije biopsije dojke. Iz oba uzorka su očišćeni UC-ocjenjivanjem (Sl. 1d, korak 2) i s talogom povezanim s egzozomom. Da bismo obogatili ssODN-ove specifične za svaku skupinu uzoraka, koristili smo korak kontracelacije pri čemu je svaka obogaćena biblioteka inkubirana plazmom iz druge kohorte (slika 1d, korak 3), a ssODN sadržani u egzozomskoj frakciji odbačeni su pod pretpostavkom da bi oni bili obvezujući za zajedničke elemente koji nisu specifični za bolest. Zatim smo izvršili drugu pozitivnu selekciju (Sl. 1d, korak 4) koristeći ssODN sadržane u odgovarajućim supernatantima iz koraka 3 kao unosa za ponavljanje koraka 2. Obnovljeni su ssODN povezani s egzozomima, što predstavlja obogaćene biblioteke, nazvane L1 za pozitivnu biopsiju pacijenata i L2 za kontrolnu skupinu. Konačno, L1 i L2 su amplificirani PCR-om, pretvoreni u ssDNA i pomiješani da bi se dobila knjižnica L3. Ovaj se program obogaćivanja ponovio dva puta koristeći L3 kao ulaz i zamjenu UC za PPT. Tri kruga odabira smanjila su složenost ssODN biblioteke na ~ 10 6 različitih sekvenci i obogatila se za one koji su povezani s ciljevima karakterističnim za egzosomske populacije iz oba izvora, tj. SsODN koji se povezuju s molekulima koji su preferirano izraženi u svakoj skupini.

Biblioteke L1 i L2 okarakterizirane su korištenjem slijeda sljedeće generacije (NGS; vidjeti odjeljak Metode „obogaćivanje biblioteke aptamera“ i Dodatnu tablicu S5 za opću statistiku i podatke o QC mjernim podacima). NGS inicijalne biblioteke L0 pokazuje da velika većina sekvenci postoji u malom broju kopija (Sl. 1e i dopunska slika 1h), dok krajnje knjižnice L1 i L2 pokazuju značajno veće prosječne brojeve po nizu (Sl. 1e) i smanjene složenost (dopunska Sl. 1i) s nepromijenjenim ukupno važećim očitanjima (Sl. 1f). Povećanje prosječnog broja primjeraka i smanjenje jedinstvenih sekvenci u skladu su s uspješnim postupkom obogaćivanja.

Da bismo potvrdili da obogaćeni ssODN djeluju s površinom egzosoma, izvršili smo analizu protočne citometrije 5'-biotiniliranih knjižnica L2 i L0, koristeći UC-pročišćene egzosome iz združene plazme u skupini samoproglašenih zdravih ljudskih davatelja (Sl. . 2a). Eksperimenti potvrde i ciljne identifikacije provedeni su samo na uzorcima zdravih pojedinaca zbog velike količine uzorka (> 195 ml) i ograničene količine plazme dostupne pacijentima s karcinomom. Eksosomi su pročišćeni pomoću UC i trostruko obojeni lipidno obojenim lipidima (DiD) kako bi se potvrdila prisutnost lipidnog dvosloja, bojila osjetljivog na esterazu (CFSE) da se potvrdi prisustvo lumena (Dopunska slika Sl. 2) i streptavidin-fikoetrin (SA-PE) za potvrdu prisutnosti biotiniliranih ADAPT-ssODN na površini egzooma. Pronašli smo značajno povećanje učestalosti pozitivnih događaja vezivanja za egzozom-ssODN s bibliotekom L2 u usporedbi s početnom bibliotekom L0 (Sl. 2a, b). U nedostatku ssODN-ova, nije uočeno povećanje broja pozitivnih događaja (Sl. 2a, b, SA-PE). Nadalje, da bismo provjerili je li L3 prikladan za potencijalno profiliranje up-down-reguliranih markera u uzorcima plazme, ispitali smo pojedinačne i združene uzorke plazme (dopunska tablica S5). Normalizirani brojevi zasnovani na NGS mogu odražavati diferenciranu ekspresiju molekulskih ciljeva ssODN, oporavljenih testom vezanja kao što je prikazano na Dodatnoj slici 3 i slici 2c gornje ploče (vidi također Dodatnu tablicu S6).

Image

( a ) Obogaćena 5'-biotinilirana ssODN knjižnica L2 (plave krivulje) otkriva pojačano vezanje, mjereno protočnom citometrijom, za UC izolirane egzosome, u usporedbi s 5'-biotiniliranom početnom bibliotekom L0 (cijan krivulje), ili nepostojanjem ssODN-a (bez /; crne krivulje) upotrebom SA-PE kao sredstva za bojenje, a zaštićen je samo na dvostruko pozitivnim CFSE + DiD + događajima (dopunska Sl. 2). Krivulje pokazuju raspodjelu relativnih intenziteta fluorescencije za promatrane događaje. Svaka krivulja predstavlja neovisni eksperiment vezanja (n = 3). ( b ) Ukupni broj pozitivnih događaja bojenja SA-PE iz ( a ) (broj događaja> RFU 400) biotiniliranog L0 (cijan) i biotiniliranog L2 (plava), u odnosu na odsutnost ssODN (bez / crno), u egzozomskom vezivanju. U svakoj reakciji vezanja korišteno je 12 nM svake knjižnice. ( c ) Post-ADAPT kvantifikacija vezanja pojedinih aptamera kao dijela biblioteke i pojedinačno kako je prikazano na Dodatnoj slici S3. Gornja ploča prikazuje 23 reprezentativna pojedinačna aptamera, izabrana s visokim "H" ili niskim "L" normaliziranim brojevima iz podataka L3 NGS nakon vezanja skupljene plazme s negativnih davatelja biopsije dojke. Postoji barem 5 puta veća razlika između broja H i L ssODN. Ove 23 sekvence ponovno su sintetizirane i testirane pojedinačno u istom ispitivanju vezivanja, ali u jednakim koncentracijama, za razliku od njihove originalne reprezentacije u L3. PEG-istaloženi kompleksi aptamera / plazme izravno su podvrgnuti qPCR-u (donja ploča). Inlay: Povećanje qPCR rezultata ssODN-ova inkubiranih s PBS-om umjesto plazme (crveno). ( d ) Srebrno obojeni reducirajući SDS-PA gel razrušenih proteina iz PPT plazme s naznačenim ssODNs (H1, H11, L4, L15), imobiliziran na streptavidin magnetske kuglice i kontrola bez ssODN (NO). Isječene strelice označavaju srušene proteine ​​C1QA, C1QB i C1QC. Točkasta strelica označava teški lanac IgM (IgM HC ). SA: streptavidin. RC: obrnuti redoslijed komplementa.

Slika pune veličine

Da bismo testirali pojedinačne performanse ssODN-a iz L3, sintetizirali smo 12 ssODN-ova koji su bili u velikom obilju (nazvani "H") i 11 koji su bili u malom obimu (nazvani "L") (Dodatna tablica S6). Odabrali smo H- i L-sekvence temeljene na najmanje 5-kratnoj promjeni normaliziranog broja iz NGS podataka okupljene plazme L3 sondiranim od strane negativnih davalaca biopsije dojke (Dopunska tablica S6). Ove sekvence su ponovno sintetizirane i testirane pojedinačno na istom plazma skupini, ali u jednakim koncentracijama (dopunska slika 3), koristeći qPCR kao očitavanje. NGS kvantificirani oporavak svakog niza u L3 (Sl. 2c, gornja ploča) može se izravno usporediti s kopijama tih nizova, kvantificirano qPCR-om (Sl. 2c, donja ploča). Tijek rada ovog eksperimenta opisan je na Dodatnoj slici 3. Pojedinačni testovi vezanja potvrdili su da H-sekvence obično imaju veći broj kopija od L-sekvenci (Sl. 2c, donja ploča), u skladu s našim selekcionim obrazloženjem na temelju NGS-kopija brojevi. Nadalje, L11, na primjer, ima veći relativni oporavak u usporedbi s NGS-om, gdje je bio podzastupljeno u L3. Međutim, povećanje koncentracije nije omogućilo da L-sekvence pokazuju usporedivu razinu vezanja. Prema tome, količina oporavljenog ssODN ukazuje na obilje cilja. Sekvence H4, H9 i H14 pokazale su oporavak sličan L-sekvenci; oni vjerojatno predstavljaju nespecifične vezive. Kada je eksperiment ponovljen u nedostatku plazme, oporavak ssODN-a bio je jedva iznad pozadine (Sl. 2c, inlay, crveni stupovi).

Sljedeći smo pokušaj identificirali ciljane proteine ​​pojedinačnih sekvencija puštanjem pokusa. Dva ssODN-a s visokim oporavkom (H1, H11) i dva ssODN s niskim oporavkom imobilizirana su na magnetskim zrncima streptavidina i inkubirana s plazmom taloženom PEG-om iz baze zdravih davatelja. Proteini koji su ostali vezani nakon pranja eluirani su i analizirani denaturiranjem PAGE (Sl. 2d). Specifične pojaseve vidljive u H1 i H11 eksperimentima spuštanja (Sl. 2d, isječene strelice) izrezani su i analizirani pomoću LC-MS / MS. Ova analiza otkrila je 23, 24 proteina C1Q koja je povezana sa plazmom i egzosom kao metom sekvenci H1 i H11. Verzije H1 i H11 s obrnutim dopunjavanjem nisu povukle C1Q. Također smo otkrili da su H1 i H11 istodobno istaložili IgM sa C1Q (Sl. 2d, isprekidana strelica), što je u skladu s prethodnim opažanjima gdje je pronađeno da IgM ostaje složen sa C1Q u serumima koji su oborinili s PEG25.

Da bismo dodatno potvrdili interakciju aptamera H1 i H11 sa C1Q, izveli smo test zadržavanja filtra (Sl. 3a). Radioaktivno označeni H1 i H11 inkubirali su se s povećanim koncentracijama pročišćenog C1Q i potom prolazili kroz nitroceluloznu membranu. Količina ssODN zadržana na C1Q imobiliziranoj na membrani je zatim kvantificirana autoradiografijom. Ovi eksperimenti pokazuju da H1 i H11 pokazuju koncentraciju ovisnu o C1Q, dok H11RC nije. Slični rezultati dobiveni su s H11 i H11rc u testu oligonukleotida povezanog s enzimom (ELONA; sl. 3b). Ovo ponašanje vezanja ukazuje da H1 i H11 identificirani pomoću ADAPT-a posebno djeluju na C1Q s visokim afinitetom. Ovi rezultati naglašavaju svojstva interakcije slična aptameru ssODN-a koji su obogaćeni ADAPT-om i pokazuju da su proteini povezani s egzozom metama ssODN obogaćivanja ADAPT-om.

Image

( a ) Analiza zadržavanja filtra za vezanje C1Q pomoću ssODNs H1 (tamno sivi stupci) i H11 (blijedosivi stupci) pri navedenim koncentracijama C1Q. Kao kontrola korišten je reverzni komplement Hl, H1RC (crni stupovi). ( b ) ELONA analiza C1Q-vezivanja ssODNs H11 (krugovi) u naznačenim koncentracijama i fiksnoj koncentraciji C1Q (0, 625 nM). Kao kontrola korišten je reverzni komplement H11, H11RC (kvadratići). Kontrola „Bez aptamera“ (trokuti) pokazuje slabo pozadinsko vezanje detektora Streptavidin-HRP. H11 specifično veže C1Q (procijenjeno KD oko 40 nM). ( c ) PAGE analiza proteina koji su oborinili PEG i ssODN-a i povučena je s L2. Staza 1: Marker molekularne težine; traka 2: Ulazna biblioteka L2; linija 3: Frakcija povučena biotiniliranim L2; traka 4: Frakcija povučena ne-biotiniliranim L2; linija 5: Frakcija pronađena u nedostatku DNK knjižnice; crvene strelice označavaju ssODN biblioteku; žute strelice označavaju proteinske trake isečene i analizirane pomoću LC-MS / MS; crne strelice označavaju monomere streptavidina koji istječu iz perlica. ( d ) Četveronožni Vennov dijagram koji je detektirao LC-MS / MS iz nefrakcionirane plazme, plazme taložene PEG, plazme taložene PEG u prisutnosti L0 ili L2, pročišćen magnetskim zrncima streptavidina (pozadina oduzeta; tj. biotinilirani minus nebiotinilirane knjižnice). ( e ) Analiza obogaćivanja stanične komponente genetske ontologije (GO) podskupina proteina povezanih s L0 (crvene trake) i L2 (sive trake) koji pokazuju ap vrijednosti najmanje 6 × 10 −12 . Navedeni proteini su: 1 dio izvanćelijske regije, 2 izvanstanične regije, 3 vanćelijski egzozom, 4 vanćelijski membrana omeđeni organelom, 5 izvanstanične organele, 6 izvanstanične vezikule, 7 vezikule vezane na membranu, 8 vezikula, 9 organela, 10 organela omeđenih membranom, 11 vanćelijski prostor, 12 žarišta adhezije, 13 spoj za stanični supstrat, spoj za stanicu i supstrat, spoj za stanično supstrat, 15 spojni spoj, 16 sidreni spoj, 17 stanična komponenta, 18 stanični spoj, 19 mikro čestica krvi. Umetanje: 108 proteina povučenih s L2 (inset, 96 + 12), izrezano iz gela prikazanog u ( c ), i analizirano pomoću LC-MS / MS, 13 proteina jedinstvenih za L0 oduzetu pozadinu (inset, 13) i 12 proteina koji se preklapaju (inset, 12).

Slika pune veličine

Da bismo u potpunosti iskoristili masovno multipleksnu prirodu L2, iskoristili smo čitavu biblioteku za karakterizaciju biološkog sustava, značajno povećavajući robusnost kojom možemo karakterizirati molekule i molekularne komplekse koji se pojavljuju na površini egzooma. Da bismo testirali je li istodobna identifikacija više mogućih proteinskih ciljeva ssODN-ova sadržanih u L2, izveli smo afinitetni test afiniteta spuštanjem prema L0 i L2 pomoću objedinjene plazme zdravih davatelja stratificiranih denaturacijom i smanjenjem PAGE (Sl. 3c ). Pojedinačne trake (MW 30–80 kDa) izrezane su iz gela, digestirane i analizirane pomoću LC-MS / MS. Kao kontrola, pozadina je utvrđena analizom PPT-a i uredne plazme. Preklapanje broja jedinstvenih proteina otkrivenih u ovim preparatima prikazano je na Venn-dijagramu na slici 3d i navedeno u Dodatnoj tablici S7. Značajno je da je 81 jedinstveni protein proteina razgradio L2 koji se nije otkrio u PPT i urednoj plazmi, što ukazuje da su se ti niski obilno potencijalno informativni proteini obogatili zahvaljujući njihovoj interakciji s L2 ssODN. Značajno je da su neki proteini obogaćeni L2 poznati po svojoj ulozi u supresiji tumora (Dodatna tablica S7; ID gena: HIST1H2BK, MORC, AHNAK, TRIM29, ANXA1, ANXA2P2, ZDBF2, 1433S, LGALS7, SFPQ ), dok su neki proteini poznati za regulirati p53 IRES mRNA također su detektirani (dopunska tablica S7; gen gena: SFPQ, hnRNPA1 / A2, VCP, ANXA2P2, HSP90AA1 / AB1, eIF3 i RPS19 ). Odsutnost ovih proteina u L0 posredovanom pada pokazuje da je biblioteka L2 obogaćena za ssODN koji se vežu za specifične proteine ​​i proteinske komplekse, od kojih su neki poznati i u normalnoj homeostazi i u bolesti.

Podvrsta proteina povezanih s L0 i L2, tada je analizirana genetskom obogaćivanjem stanične komponente 26 (Sl. 3e i Dodatne tablice S8 [L0], 9 [L2]). Na slici 3e prikazane su klasifikacije identificiranih proteina pomoću L2 (siva) i L0 (crvena) boja koja imaju p- vrijednost manju od 6 × 10 −12 . L2 je u stanju da veže i razgrađuje specifične proteine. Štoviše, kategorije GO „Molekularna funkcija“ (Dodatna tablica S10) i „Biološki proces“ (Dodatna tablica S11) identificirali su proteine ​​obogaćene za posebne GO pojmove u padajućim uzorcima L2 koji se ne mogu prepoznati u padajućem L0. Značajno je da je analiza obogaćivanja molekularne funkcije GO (dopunska tablica S10) pokazala značajno obogaćivanje proteina koji se veže nukleinskom kiselinom (p <10 - 9 ). Funkcionalni odnos prema egzosomima 108 proteina koje je povukao L2 i 25 proteina koji su povučeni za L0 (Sl. 3e, inlay) dodatno je naveden u Dodatnoj slici 4. Ovi podaci sugeriraju da ssODN djeluju kao aptameri, vežući specifični egzozom udruženi proteini i proteinski kompleksi.

Analiza zasnovana na MS-u potvrdila je da obogaćena knjižnica veže znatno više ciljeva u usporedbi s roditeljskom, neobogaženom bibliotekom. Kao sljedeći korak, ssODN-ovi dobiveni od NGS-a oporavljeni tijekom sondiranja uzoraka plazme korišteni su na masovno paralelni način za razvoj multi-analitičkih potpisa za razvrstavanje pacijenata koji pripadaju određenoj populaciji bez preciznih podataka o stvarnom temeljnom ssODN-cilju para. Dakle, vrijedne kvantitativne informacije koje omogućuju diferencijaciju bolesničkih uzoraka mogu se generirati NGS analizama oporavljenih ssODN iz pojedinih uzoraka bolesnika i usporedbom relativnog broja kopija pojedinačnih sekvenci. Ovaj novi pristup nazvan je ADAPT i ovdje smo pokazali njegovu korisnost u oboljelih od karcinoma dojke u usporedbi s biopsijskim negativnim i normalnim darivateljima.

Opći tijek rada ADAPT-a koji se koristi za profiliranje egzooma / proteina kod pojedinih pacijenata prikazan je na slici 4a. L3 se inkubira s uzorcima plazme od pojedinaca, nakon čega slijedi PPT (Sl. 4a, korak 1). ssODN su oporavljeni (slika 4a, korak 2) i kvantificirani korištenjem NGS za stvaranje ssODN profila specifičnih za pacijenta (slika 4a, korak 3).

Image

( a ) Radni tijek: U 1. koraku uzorci plazme bolesnika s karcinomom dojke inkubiraju se pomoću knjižnice za profiliranje L3 (dobivene u obogaćenju prikazanom na slici 1d). Nakon inkubacije EV se istaloži i supernatant se ukloni (korak 2). EV-povezani oligonukleotidi podvrgavaju se sekvenciji sljedeće generacije (korak 3, NGS) da bi se dobio pojedinačni profil pacijenta. ( b ) Povezanost tehničkih replika i bioloških uzoraka za L3. Grafikon raspršenja prikazuje raspodjelu normaliziranog broja aptamera oporavljenih iz ADAPT-a alikvotima plazme istog pacijenta (plave točke, r> 0, 99; unutar uzorka: pacijent 27) ili uzorcima plazme različitih pacijenata (crvene točke, r = 0, 90), Svaka pojedinačna točka predstavlja jedinstveni niz s brojem tog niza koji odgovara reprezentaciji u različitim uzorcima ili tehničkim replikama. ( c ) Povezanost tehničkih replika i bioloških uzoraka za L2000. Skica scattera prikazuje raspodjelu normaliziranog broja aptamera oporavljenih od ADAPT-a alikvotima plazme istog pacijenta (plave točke, r> 0, 99; unutar uzorka: pacijent 27) ili uzorcima plazme različitih bolesnika (crvene točke, r = 0, 80). Svaka pojedinačna točka predstavlja jedinstveni niz s brojem tog niza koji odgovara reprezentaciji u različitim uzorcima ili tehničkim replikama.

Slika pune veličine

Da bi se procijenila tehnička obnovljivost i složenost bioloških podataka koji se zrcale u ADAPT profilu, uspoređeni su normalizirani brojevi svake jedinstvene sekvence unutar (slika 4b, dopunska slika 5, plava) i između pacijenata (slika 4b, dopunska slika 5, crvena) za biblioteku sastavljenu od 10 6 jedinstvenih ssODN. U svim slučajevima, raspodjela sekvenci bila je visoko povezana između tehničkih replika (plava; R2 > 0, 99). Suprotno tome, raspodjela sekvenci između različitih jedinki vrlo je varijabilna (crvena; R2 = 0, 74–0, 90). Stoga, ispitivanje kvantificira broj događaja vezivanja za 10 6 ssODN po pacijentu, pri čemu se izmjenama normaliziranog broja ssODN može utvrditi razlika između pacijenata i populacije. Ovi rezultati pokazuju da L3 sadrži ssODN koji mogu odražavati biološke razlike između pojedinih uzoraka plazme bolesnika. Prema tome, ADAPT može otkriti profile bolesnika povezane s bolešću.

L3 je enzimski, in vitro odabrana ssODN biblioteka koja sadrži oko 106 molekula svake prisutne u različitoj koncentraciji. Kako bismo poboljšali učinkovitost profiliranja pacijenata i stekli kontrolu nad sastavom knjižnice i koncentracijama pojedinih ssODN-a, razvili smo sintetsku knjižnicu koja je u mogućnosti razlikovati oboljele od karcinoma od kontrola. Na taj je način odabrano 2000 ssODN-ova (dopunska tablica S2) iz četiri različite sheme obogaćivanja (dopunska tablica S2) slijedeći opći obris prikazan na slici 1d o različitim kohortama bolesnika (dopunska tablica S12). Pojedinačni ssODN odabrani su iz ovih knjižnica na temelju njihovog značaja u t-testu i promjenama nabora uspoređujući ili skup uzoraka bolesnika (rak u odnosu na kontrole) ili pri testiranju male skupine bolesnika (Dopunska tablica S13). Svaka od 2000 ssODN sintetizirana je i zatim miješana u ekvimolarnim koncentracijama kako bi se dobila knjižnica L 2000 . Biološka i tehnička raznolikost za L 2000 pokazala je isti odnos kao L3 za iste pacijente prikazane na slici 4b (slika 4c i dodatna slika 6), potvrđujući tako da su podaci sadržani u L3 sačuvani u L 2000 .

Da bi se procijenila korisnost knjižnice L 2000 u pružanju razlika o specifičnim informacijama o pacijentu, profilirano je 500 pacijenata [206 pacijenata s karcinomom (dopunska tablica S14), 177 negativnih biopsija dojke (dopunska tablica S15), 117 samoproglašenih zdravih] u oporavljenom broju primjerka mjerenom NGS-om u usporedbi s utvrđivanjem sposobnosti ADAPT-a da stratificira populaciju bolesnika povezanih sa bolešću. S obzirom na veliki broj ssODN-a koji se mogu istovremeno testirati, postoji značajan rizik od lažnog otkrivanja ssODN-ova koji izgledaju informativno kad nisu. Stoga smo za ublažavanje rizika lažnog otkrivanja koristili permutacijsko testiranje kako bismo provjerili sadrži li knjižnica informacije specifične za svaku skupinu bolesnika. Ukratko, broj ssODN-a s p <0, 05 utvrđen je korištenjem ANOVA F-testa u 500 uzoraka između pozitivnih na biopsiju, negativnih i zdravih skupina. Ova vrijednost je tada uspoređena s brojem ssODN-ova pronađenih kada su uzorci nasumično grupirani i neovisno o statusu raka. Raspodela broja značajnih ODN-a u permutiranim i kontrolnim skupinama raka prikazana je na slici 5a. Primjećena razlika (p = 0, 026) u uspješnosti slučajnih skupina u usporedbi s izvornom skupinom za kontrolu karcinoma pokazuje da postoji značajan broj odabranih ssODN iz L 2000 koji otkrivaju informacije koje razlikuju biopsijski pozitivne, biopsijski negativne i zdrave skupine, potvrđujući da strategija obogaćivanja i logika odabira ssODN proizvode informativne knjižnice.

Image

( a ) F-test za rak naspram ne-rak prema negativnom na izvornim (crvenim linijama) i permutiranim (stupci) skupovima podataka. Broj ssODN-ova koji razlikuju pozitivnu biopsiju raka dojke od negativnih i samo-deklarisanih normalnih uzoraka znatno je veći od tada se može nasumično postići u 1000 permutacija originalnog skupa podataka. To pokazuje da odabrani ssODN iz L 2000 otkrivaju informacije koje razlikuju analiziranu populaciju karcinoma od druge, potvrđujući primjenjivost strategije obogaćivanja i pravilnog sastavljanja male knjižnice za profiliranje L 2000 . ( b ) OOB AUC iz čitavog skupa od 500 kliničkih uzoraka i permutacijskom analizom njegove pouzdanosti. AUC u izvornom skupu podataka iznosi 0, 66 (crvena linija), što je znatno više u usporedbi s većinom od 1000 permutacija (p = 0, 002; stupci). ( c ) ROC krivulja za rak prema kontrolnim uzorcima s AUC = 0, 66; p = 0, 002. ( d ) ROC krivulja raka do zdravih davatelja s AUC = 0, 73; p = 0, 001. ( e ) ROC krivulja za rak naspram biopsije negativne s AUC = 0, 64; p = 0, 024. ( f) Vjerojatnost incidenta karcinoma zasnovana na RF-u i u biopsiji pozitivnih i negativnih vrsta uzoraka i odgovarajućih radiografskih B-RAD C&D rezultata koji sugeriraju da ADAPT pouzdano razlikuje rak od kontrolnih skupina čak i kada koristi uzorke žena s gustim tkivom dojke (BI-RAD A&B i C&D Rak / kontrola raka <<0, 001).

Slika pune veličine

Zatim smo izgradili klasifikator pomoću algoritma slučajnih šuma (RF) kako bismo procijenili mogu li ssODN prepoznati različite populacije u studiji. Odabir značajki zasnovan je na značaju određenog ssODN-a između karcinoma i kontrola za svih 500 uzoraka pomoću t-testa (p <0, 05), Wilcoxon-ovog testa (p <0, 05), Kolmogorov-Smirnov-testa (p 1, 2) Stvaranje RF algoritama; 289 ssODN uključeno je u RF algoritam i korišteno je na 1000 stabala. Vrijednosti područja ispod krivulje (AUC) temeljene na predviđanju uzoraka izvan vreće (OOB) (obuka 316, test 184) korištene su za procjenu kombinirane korisnosti ssODN-a za razlikovanje skupine bolesnika s rakom od kontrolne populacije ( Sl. 5b, crvena linija, AUC = 0, 66). Specifičnost L 2000 za razlikovanje karcinoma od kontrole u odnosu na slučajne skupine ispitanih pacijenata procijenjena je permutacijskom analizom (sl. 5b sive trake, permutacija p = 0, 002). Samo 0, 2% nasumično permutiranih skupova podataka premašilo je performanse izvornog skupa. Ovaj rezultat ukazuje da se podaci sadržani u ssODN-ima obogaćeni na različitoj podskupini pacijenata protežu u skupini od 500 pacijenata i prikupljaju informacije specifične za status raka ispitanih osoba. Razlučujuća snaga ssODN-a procijenjena je korištenjem RF za rak nasuprot biopsiji negativan, rak na zdrav i rak naspram svih kontrola. Specifične AUC vrijednosti za svaku usporedbu bile su 0, 64, 0, 73 i 0, 66 (Slika 5c-e) s permutacijskim p- vrijednostima 0, 024, 0, 001 i 0, 002.

Značajno je značajno povećanje sposobnosti L 2000 da razlikuje zdrave davatelje od karcinoma u odnosu na biopsijski negativne bolesnike. Ovo sugerira da L 2000 mjeri komponente povezane s abnormalnostima unutar dojke. Budući da nije bilo utvrđene razlike u podacima zbog grupiranja Bi-RAD, metoda je neovisna o gustoći tkiva dojke (slika 5f). Ovi rezultati sugeriraju da bi poboljšanje dijagnostičke izvedbe moglo dovesti do dragocjenog alata koji će pomoći u dijagnostici karcinoma dojke kada mamografija nije deformativna.

Zaključak

Naše istraživanje pokazuje da se profil vezivanja različitih ssODN biblioteka, obogaćen "plazmom-SELEX", može koristiti za identificiranje karcinoma dojke i otkrivanje razlika u biologiji tumora. U principu, ADAPT platforma nudi nov alat s visokim značajkama za nepristrano precizno profiliranje molekularnih biosignata u zdravim i bolesnim stanjima. Potpis koji pruža ADAPT profiliranje egzooma i drugog sadržaja plazme također nudi robusnu metodu za prepoznavanje i karakterizaciju pojedinih molekula kao i multi-molekularnih kompleksa koji sadrže sveobuhvatne interakcije povezane sa zdravljem i bolestima koji mogu dovesti do novih terapijskih ciljeva i / ili dijagnostike markeri.

ADAPT-ovo profiliranje egzosoma u plazmi kombinira mnoge prednosti drugih alata za profiliranje na cijelom proteumu, poput ćelije 16 - ili tkiva-SELEX 17, i aptamera 27 ili nizova antitijela 28, 29, izbjegavajući određene nedostatke: i) ADAPT predstavlja minimalno invazivnu platforma koja bi trebala biti kompatibilna s tekućim biopsijama; ii) probir zasnovan na egzozomu zaobilazi potencijalna ograničenja povezana sa SELEX-om 16, 30, 31 baziranim na stanicama, posebno „problem mrtvih ćelija“ koji može ometati efikasno obogaćivanje aptamera 32 ili činjenicu da većina izvještaja o ćeliji-SELEX zapošljava kultivirano linije tumorskih stanica koje često, nakon mnogih prolazaka, više ne odražavaju izvorni sastav tumora; iii) nije potrebno prethodno poznavanje prirode informativnih ciljeva; iv) prikupljanje informacija sadržanih u uzorcima bolesnika zasnovano na ADAPT-u nije ograničeno na određenu bolest, proteine ​​ili proteinske komplekse, ali načelno može uključivati ​​druge klase molekula, poput miRNA, obrazaca glikozilacije ili kompleksa nukleinske kiseline / proteina koji mogu nositi informacije važne za smislenu stratifikaciju pacijenta; v) ADAPT postiže obogaćivanje i identificiranje ciljeva s malim obiljem.

Do danas je objavljeno nekoliko pristupa molekularnom profiliranju temeljenih na aptamerima, a jedan od najistaknutijih je platforma SOMAscan koja koristi definirani skup od više od 1000 kemijski modificiranih aptamera, od kojih je svaki odabran tako da veže specifični poznati cilj 33 . SOMAscan je primijenjen za proteomsku analizu egzooma iz stanične linije karcinoma prostate DU145, a identificirano je više od 100 proteina koji su obogaćeni egzosom u odnosu na stanice 27 . Dakle, SOMAscan i slično antitijelo / ELISA temeljene platforme 34 koriste se za provjeru da li je neki od pokrivenih ciljeva povezan sa specifičnim biološkim stanjem. Ovi se pristupi mogu smatrati pristupom "obrnutog kemijskog profiliranja" [analogno obrnutoj (kemijskoj) genetici] 35 . ADAPT se razlikuje od ovih pristupa po tome što se unaprijed obučeno bez ikakvog prethodnog znanja o ciljnim ssODN knjižnicama koristi za cijelo sistemsko ispitivanje uzoraka plazme od stotina pojedinaca paralelno. ADAPT je stoga analogan pristupu „naprijed kemijskog profiliranja“ koji svojstveno omogućava identifikaciju skupa novih ciljeva. ADAPT-sODOD se mogu naknadno koristiti za identificiranje ciljeva koji su povezani s određenim biološkim stanjem (ovdje: rak nasuprot ne-raku). Naša uzorna identifikacija C1Q kao proteinske mete koja je povezana s pojedinačnim nizom pokazuje da prepoznavanje ciljeva može doći putem aptamernih mehanizama vezivanja. Da li aptamerno prepoznavanje proteina predstavlja jedini mehanizam pomoću kojeg se ssODN obogaćuje tijekom treninga u ADAPT biblioteci, zasad je nepoznato, ali u principu, ADAPT bi trebao omogućiti i obogaćivanje ODN-ova koji ciljaju biomolekule osim proteina, poput RNK vezanih na protein, posttranslacijske modifikacije ili miRNA. Platforme „obrnutog kemijskog profiliranja“ koje se temelje na aptamer-, SOMAmer- ili antitijelo trenutno su ograničene na točno proteinske ciljeve koje pokrivaju.

Iako ADAPT u svom sadašnjem obliku još uvijek zahtijeva daljnje usavršavanje kako bi ga se prilagodio kliničkom standardu, predviđamo da će s opsežnijim usavršavanjem postati dostupne biblioteke sve veće kvalitete, informacijskog sadržaja i veće AUC vrijednosti koje će masovno pružiti koristan alat paralelna analiza složenih interaktivnih mreža biomolekula u njihovom rodnom stanju u zdravim i bolesnim uvjetima.

metode

pacijenti

Bio uzorci korišteni u ovom eksperimentu dobiveni su prema protokolu bioloških spremišta koje je odobrio IRB (vidi popis IRB odbora u nastavku). Svi su subjekti odobreni od odobrenja IRB obrasca i u skladu sa 21 CFR 50.20 smjernicama. Informirani pristanak dobiven je od svih ispitanika. Sve eksperimentalne postupke u ovoj publikaciji pregledao je Western Institutional Review Board (WIRB) i smatra se da potpadaju pod izuzeće IRB-a po 45 CFR 46.101 (b) (4). Svi eksperimenti odobreni su od WIRB-a i izvedeni su u skladu s Kodeksom saveznih smjernica i propisa.

Popis povjerenstava: Western IRB (Središnji IRB sponzora). Dodatni lokalni IRB-ovi sastoje se od: CAMC / WVU Charleston IRB; Memorijska bolnica Phoebe Putney (PPMH) IRB; MedCentral IRB; LVHN IRB; Memorijalna bolnica Margaret R. Pardee IRB; Središnji sustav zdravstvene zaštite u zajednici; Hartford Healthcare IRB; Renomirani regionalni medicinski centar IRB; John Muir Health IRB; Medicinski centar Jupiter IRB; Bolnica u Middlesexu IRB; Orlando Health / Orlando; Regionalni zdravstveni sustav IRB; MPM-SAH IRB; Bolnica i zdravstvena mreža Svetog Luke IRB; CCHC IRB; MCW / FH IRB; Bon Secours Richmondov zdravstveni sustav IRB; Roper-St. Francis Healthcare IRB; CPHS; Greater Glasgow & Clyde Health Board.

Demografske i kliničke karakteristike pacijenata korištenih u ovom istraživanju mogu se naći u Dodatnim tablicama S3, S4, S12, S13, S14 i S15.

Karakteristike uzorka

Krvna plazma prikupljena je na više mjesta sakupljanja koristeći standardizirani protokol i centrifuge koje je osigurala tvrtka Caris Life Sciences. Krv je uzeta pomoću standardne tehnike venepunkture u četiri epruvete s ljubičastim vrhom, lagano okretajući svaku epruvetu 8–10 puta nakon uzimanja. Nakon što su sjedili uspravno na sobnoj temperaturi najmanje 30 min, ali ne duže od 6 sati, epruvete su se vrtele u Labofuge 200 tijekom 10 minuta pri 5300 o / min uz pravilnu ravnotežu. Epruvete su pažljivo uklonjene iz centrifuge kako bi se izbjeglo naglo pomicanje u nastojanju da se osigura razdvajanje krvi. Plazma je sakupljena (3 × 1, 2 ml) iz epruveta u redoslijedu za prikupljanje i prenesena u kriovaskularne redoslijede rednim redoslijedom (a, b, c), koristeći pipetu koja djeluje od gornjeg sloja plazme prema Buffy kaputu, pažljivo poremetiti Buffy kaput. Svi kriosali odmah su stavljeni u zamrzivač pri -20 ° C. Ukupno prikupljeno je 12 kriosa (3 frakcije iz 4 epruvete). Uzorci su isporučeni pomoću Kit za suhi led nakon najmanje 24 sata u zamrzivaču, u zatvorenoj vrećici za biološku opasnost. Uzorci su isključeni ako je rezultat hemolize premašio 100 mg / dl koncentracije hemoglobina (//www.mayomedicallaboratories.com/articles/communique/2008/12.html).

Kombinacije uzoraka i volumen za sljedeća ispitivanja:

Obogaćenje

1, 2 ml × 59/60 biopsija raka dojke Pozitivni / negativni uzorci u bazenu. Za poseban krug obogaćivanja potrebno je 300 μl skupljene plazme.

profiliranje

200 μl plazme iz pojedinačnih 500 uzoraka u 3 tehničke replike.

ssODN dizajn i proizvodnja knjižnica

Koristili smo slučajnu ssODN biblioteku molekula koja sadrži 35-nt varijabilno područje uz bok dva fiksna mjesta vezivanja za primer (Sl. 6a). Biblioteka je sintetizirana pomoću integrirane DNA tehnologije (IDT, USA) kao "ultramer" (verzija visoke sinteze vjernosti sinteze) i pročišćena standardnim otapanjem.

Image

( a ) Dizajn ssODN biblioteke. Obrnuto je korišten za obogaćivanje i prikazan je ovdje. Prajmer označen plavom bojom sadrži niz koji je komplementaran Illumina sekvencirajućem temeljnom premazu koji omogućava preskakanje jednog PCR-a u NGS preparatu (vidi detalje u NGS dijelu dolje). SsODN knjižnica ima postepeni dizajn kako bi se osigurala raznolikost, istodobno sekvencionirajući konstantnu regiju. Rezultirajuća knjižnica sastoji se od 4 ssODN-a, koji se međusobno razlikuju po duljini za + 1, +2 i +3 nukleotida (prikazani zelenom bojom; detalje pogledajte u NGS dijelu u nastavku). Nije moguća značajna homo-dimerizacija između konstantnih regija, što osigurava da će prvenstveno varijabilno područje potaknuti konformacijske promjene u kompletnim nizovima aptamera. Dodatno uravnoteženje uvedeno je u dizajn 5-postotne regije kako bi se osigurala raznolikost tijekom NGS-a (prikazano crvenom bojom). ( b ) Obrasci prednjih niti indeksnog PCR proizvoda. 3'-kraj je bio pričvršćen na površinu protočne ćelije. Strelica: početak slijeda.

Slika pune veličine

Dizajn ssODN biblioteke, zajedno s Illumina HiSeq preciznim sekvenciranjem, omogućili su nam da kontinuirano slijedimo ovu biblioteku bez raznolikosti. Sadržaj GC se izjednačava na 50% u varijabilnim i konstantnim regijama. Prije obogaćivanja, svaka je knjižnica pojačana s 5'-fosforiliranim prednjim primerom 5'-TCG TCG GCA GCG TCA-3 '(Tm: 62, 6 ° C) i 5'-biotiniliranim reverznim temeljnim premazom 5 '-CTA GCA TGA CTG CAG TAG GT -3 '(Tm: 61, 1 ° C). Umnožavanje DNK izvršeno je na 96-jažnom Veritijevom termičkom ciklusu (ABI). Konačne koncentracije reagensa bile su 1X Q5 reakcijski pufer Q5 (# M0493L, NEB), 0, 2 mM dNTPs (# 362271, Life Technologies), 1 μM svakog anti-smisla (5 'fosforiliranog) i smisla (5' biotinilirani) prajmer ( IDT), 2 jedinice Q5 DNK polimeraze (# M0493L, NEB), 0, 01 pmol čiste biblioteke (ili 33 μl uzorka biblioteke aptamera oporavljenog u PEG oborini, vidi protokole obogaćivanja / profiliranja u nastavku), a konačni volumen je doveden do 100 µl s molekularnom vrstom H2O. Q5 DNA polimeraza odabrana je zbog visoke vjernosti i sposobnosti rada u širokom rasponu GC sadržaja, što je presudno za rukovanje aptamer bibliotekama. Profil termičkog biciklizma počeo je inkubacijom od 98 ° C tokom 30 s, zatim 10 ciklusa od 98 ° C tokom 30 s, 60 ° C tokom 30 s i 72 ° C tijekom 1 minute, a konačno produženje na 72 ° C tijekom 5 minuta min. PCR proizvod je pročišćen pomoću NucleoSpin PCR kompleta za čišćenje (# 740609, Macherey-Nagel) u puferu NTI prema preporuci proizvođača. DNK je kvantificiran QuBit ds BR / HS test testom (# Q32853, Q32854, Life Technologies). Knjižnica dsDNA je pomiješana s Lambda eksonukleazom (# M0262L, NEB) u omjeru 100 ng / 5 jedinica, 1X Lambda puferom, a konačni volumen je podešen molekularnim stupnjem H20. Smjesa za probavu inkubirana je na 37 ° C za 2 sata Nakon toga, enzim je inaktiviran na 80 ° C 10 min. ssDNA je pročišćena pomoću NucleoSpin stupaca s NTC puferom (740654.1, Macherey-Nagel). Eluirana ssDNA kvantificirana je QuBit ssDNA testom (# Q10212, Life Technologies).

Obogaćivanje biblioteke aptamera

Kao početni korak u razvoju ADAPT-a, obogaćena biblioteka nasumičnih jednolančanih DNK ssDNA-sekvenci, nazvana profilirajuća knjižnica L3, generirana je iz otprilike 2 × 10 13 različitih sintetičkih ssDNA (slika 1d, biblioteka L0). U koraku 1, inkubirana je alikvota od 10 11 sekvenci L0-amplificiranog L0 (dodatni podaci Sl. D) inkubirana u skupljenoj krvnoj plazmi kod 59 pacijenata s karcinomom dojke s pozitivnim biopsijama (Izvor A, Dodatna tablica S3). Paralelno, inkubirana je još jedna alikvota od 10 11 sekvenci s objedinjenom krvnom plazmom od 30 pacijenata s sumnjom na karcinom dojke koji su se pokazali negativno na biopsiju i 30 zdravo proglašenih zdravih žena (Izvor B, (Dopunska tablica S4). EV-i su precipitirani iz oba L0 uzoraka (slika 1d, korak 2). Oligodeoksinukleotidi povezani s EV-om (ODN) prikupljeni su iz odgovarajućih peleta. Da bi se pokrenuo selekcijski tlak prema obogaćivanju ODN-a posebno povezanih sa svakom skupinom uzoraka, proveden je korak suprotnog odabira inkubacijom svake obogaćene biblioteke s plazmom iz različitih kohorti (Sl. 1d, korak 3), gdje su sekvence sadržane u EV peletima odbačene. U drugom pozitivnom izboru (Sl. 1d, korak 4) u odgovarajućim supernatantima (sn) iz koraka 3 pomiješani su s plazmom iz druge alikvote svake pozitivne kontrolne skupine uzoraka i EV su ponovo izolirani. ODN-ovi povezani s EV-om su PCR amplificirani izravno iz taloga jeli i pretvorili u ssDNA kao što je gore opisano. Dakle, obnovljene knjižnice predstavljaju dvije jednokružne biblioteke nazvane knjižnica L1 za pozitivne biopsijske bolesnike i knjižnica L2 za kontrolne bolesnike. U završnom koraku, L1 i L2 su amplificirani PCR-om, vraćeni u ssDNA i pomiješani kako bi se dobila knjižnica L3. Ovaj je program obogaćivanja ponovljen dva puta više koristeći L3 kao ulaz da bi se dodatno smanjila složenost knjižnice za profiliranje na otprilike 10 6 različitih slijeda. Prva iteracija koristila je UC za podjelu za povećanje specifičnosti za EV frakciju. Druge dvije iteracije koristile su istu shemu (Sl. 1d), osim za podjelu izvedenu PEG-taloženjem. Treba napomenuti da su u prvom krugu obogaćivanja L3 korišteni ukupno biopsivno pozitivni (n = 59), biopsijski negativni (n = 30) i samoproglašeni normalni (n = 30), dok su samo rak i ne -uzorci kancera korišteni su u sljedećim krugovima.

Tehnička napomena o UC nasuprot pročišćavanju PEG EV iz uzoraka plazme

Kao što smo pokazali na Dodatnoj slici 1b-e, broj proteina povezanih sa EV sličan je u EV pročišćavanju koje se provodi ili s UC ili PEG. Međutim, UC protokol traje 6–8 sati, dok PEG protokolu treba najviše 30 min. Ova tehnička prednost potaknula je odluku o prelasku s UC-a na PEG tijekom obogaćivanja, a posebno na korištenje PEG-a za masivno promatranje naivnih uzoraka s obučenim knjižnicama. Budući da je sadržaj proteina (određen MS) i veličina (određena DLS; vidi dolje) bila u skladu između UC i PEG PPT s egzosomima, ova obogaćena EV populacija naziva se egzosomima.

Protokol za profiliranje kliničkih uzoraka s obogaćenim ili sintetičkim knjižnicama

Smrznuta plazma (1, 0 ml) tretirana je sa 50 μl inhibitora proteaze (20X zaliha inhibitora proteaze; iz dvije tablete kompletnog inhibitora proteaze bez ULTRA MINI EDTA (5892791001, Roche) u 1050 μl H20) i odmrznuta, Stanice / krhotine su uklonjene centrifugiranjem (10000 × g, 20 min, 4 ° C) i supernatant je sakupljen. U 1, 0 ml supernatanta dodano je 1, 0 ml 2X PBS (SH3025601, GE Healthcare) koji sadrži 6, 0 mM MgCl2 i temeljito se pomiješa. Natjecatelji su dodani u 3 alikvota od 400 μl za konačnu koncentraciju 0, 01 mM dekstran sulfata (APT-B006, Aptamer Sciences), 0, 8 ng / μl DNA sperme lososa (15632-011, Life Technologies) i tRNA (AM7119, Life Technologies) u 1X PBS, 3, 0 mM MgCl2 i temeljito izmiješan. Knjižnici za ispitivanje ssDNA aptamera dodana je konačna koncentracija 2, 5 pg / μl s razrjeđenjima napravljenim u 1X PBS, 3, 0 mM MgCl2 i inkubirana 1 sat pri sobnoj temperaturi sa rotacijom. Za podjelu pripremljena je 20% -tna otopina PEG8000 (P1458-50ML, Sigma-Aldrich) u 1X PBS koja sadrži 3, 0 mM MgCl2 i dodana je uzorku do konačne koncentracije PEG od 6%. Uzorci su invertirani dva puta da se miješaju, inkubiraju tokom 15 minuta na 4 ° C i centrifugiraju (10 000 × g, 5 min, temperatura okoline). Supernatant je uklonjen, dodano je 1, 0 ml 1X PBS-a s 3, 0 mM MgCl2 i pelet je ispran blagom inverzijom. Tampon je uklonjen; pelet se ponovo suspendira u 100 μl H20 tresenjem na miješalici (Eppendorf, 900 o / min, 10 min, temperatura okoline). Kompletna resuspenzija potvrđena je pipetiranjem gore-dolje, a resuspendirani uzorak korišten je izravno u pripremi za sekvenciranje sljedeće generacije (NGS).

Priprema biblioteke za slijedeću generaciju i protokol za slijeđenje HiSeq-a

Da bismo pripremili svaku biblioteku za redoslijed, usvojili smo Illumin dvostupanjski PCR pristup (//support.illumina.com/content/dam/illumina-marketing/documents/products/other/16s-metagenomics-faq-1270-2014-003 pdf). Kako bismo preskočili prvi PCR, uvrstili smo Illuminin slijed ampliksona premaza prema naprijed u konstantno područje ssODN knjižnice (vidi plavo istaknuto na slici 6a). Illumina također preporučuje korištenje 4 naprijed premaza u prvom PCR-u kako bi se omogućilo sekvenciranje biblioteka male raznolikosti. Budući da preskačemo prvi PCR, ugradili smo stupnjevani dizajn izravno u knjižnicu (vidi označeno zelenim bazama na slici 6a). Prednosti pripreme NGS biblioteka u jednom koraku su: (i) priprema probnog uzorka NGS zbog 5 sati kraćeg protokola; (ii) poboljšana specifičnost NGS podataka uslijed preskakanja jednog koraka PCR u protokolu i, sukladno tome, smanjenog broja mutanata u ssODN biblioteci; (iii) poboljšana kvaliteta podataka i prinos zbog sekvenciranja polazne točke varijabilne regije biblioteke, jer varijabilna regija pruža dovoljnu raznolikost u ranim ciklusima sekvenciranja, što je kritično za uspostavljanje lokacije klastera i njihove gustoće; (iv) niža stopa pogreške i kraće vrijeme sekvenciranja zbog očitavanja sekvenciranja kroz konstantnu regiju i indeks, što omogućava nedvosmislenu identifikaciju ssODN sekvenci kao i de-multipleksiranje, bez potrebe za odvojenim sekvenciranjem indeksnog niza.

Jednostežni NGS pripremni protokol

Biblioteka obrnutog vlakna (0, 01 pmol čistog predloška knjižnice; 1 / 2-1 / 3 PEG istaloženih uzoraka nakon određenog kruga obogaćivanja ili ispitivanja profiliranja) umnožena je s 1 µM indeksnih prajmera (IDT) (N7xx: CAA GCA GAA GAC GGC ATA CGG AT [i7] CTA GCA TGA CTGCAG TAC GT i S5xx: AAT GAT ACG GCG ACC ACC GAG ATC TA AC [i5] TCG TCG GCA GCG TCA), 1X Q5 PCR reakcijski međuspremnik (# M0493L, NEB), 0, 2 mM dNTPs (# 362271, Life Technologies), 2 jedinice Q5 DNA polimeraze (# M0493L, NEB) i konačni volumen doveden je do 100 μl s molekularnim stupnjem H 2 O. Profil toplinskog biciklizma počeo je inkubacijom od 98 ° C 30 s, a zatim slijedi 10 ciklusa (18 za uzorak nakon vezanja) od 98 ° C tokom 30 s, 60 ° C tokom 30 s i 72 ° C tijekom 1 minute, te konačno produženje na 72 ° C 5 minuta. Indeksni PCR proizvodi pročišćeni su zrncima AMPure (Beckman Coulter) prema Illumina standardnom protokolu. Pročišćeni proizvod je kvantificiran s QuBit dsDNA kitom (Q32854, Life Technologies), koncentracije uzoraka su normalizirane i razrijeđene na 14 nM prije multipleksiranja.

Postavljanje sekvenciranja HiSeq2500 za način brzog trčanja (pojedinačno čitanje)

5 μl svakog uzorka (2 nM) je pomiješano da se dobije određeni multipleks, zatim je 5 μl bazena pomiješano sa 5 μl 0, 2 M NaOH i inkubirano 5 minuta na RT. Otopina je dalje razrijeđena do 7 pM ohlađenim HT1 puferom, denaturirana 2 minute na 96 ° C i brzo hlađena u 3: 1 ledenom vodenom kupelji tijekom 5 minuta. Sekvenciranje je provedeno na HiSeq 2500 (Illumina) pomoću klaster kit # GD-402-4001 TruSeq Rapid SR Cluster Kit - HS i kit za sekvenciranje # FC-402-4002 TruSeq Rapid SBS Kit (50 ciklusa, dovoljno za 74 ciklusa) (Illumina ). Nije pronađeno nikakvo povećanje raznolikosti za sekvenciranje početnih i obogaćenih knjižnica. NGS biblioteke L2000 zahtijevalo je 25% povećanja ne obogaćene biblioteke zbog ograničenog broja jedinstvenih ssODN.

Verzija HCS-a : 2.2.58 (studeni 2014.); Verzija knjižnice : 3.8.346; Skener : RTA verzija 1.18.64; Kemija : v2.0340.

Post-NGS obrada podataka

Nakon završetka redoslijeda pregledani su mjerni pokazatelji kvalitete HiSeq Q kako bi se osigurala visoka točnost osnovnog poziva. Razmotrene su samo vožnje s najmanje 85% baza iznad Q30 (vjerojatnost ispravnog osnovnog poziva je 99, 9%). Ponavljaju se postupci s nižim postotkom.

HiSeqovi neobrađeni podaci o slijedu pretvaraju se u datoteku ".fastq" prema specifikaciji paketa bcl2fastq iz Illumina. Za poravnavanje i uklanjanje multipleksiranja korišteni su obrasci ispravne konstantne regije (označeni crvenom bojom na slici 6b), kao i redoslijedi indeksa (i7) i adaptera za sidrenje (crna). Pojedinačni uzorak NGS-a dalje je analiziran ekstrakcijom sekvenci s ispravnom desnom konstantnom regijom i generiranjem izlazne datoteke sa brojem sirovih ssODN sljedova. Za preliminarnu analizu ssODN knjižnica koristili smo: ukupni izlazni redoslijedni broj; ukupni važeći redoslijedni broj (poravnat ili mapiran na konstantno područje ssODN knjižnice); ukupni broj jedinstvenih ssODN-ova i pri različitom presjeku čitanja; postotak jedinstvene ssODN sekvence pri različitim presjecima od ukupnog broja jedinstvenih ssODN; ukupan broj neobrađenih jedinki ssODN-a s različitim presjekom; percentage of that total raw counts from unique ssODNs at different cut-off out of the total output for particular samples; average raw count per unique ssODNs sequence. The depth of the sequencing run was defined as the number of sequence tags, mapped to the constant region of the ssODN library. For comparison between different samples the normalized counts were used, which is reflecting the relative abundance of a particular ssODN sequence in the total NGS outcome for a particular sample. Detailed data mining is described in the Chapter “NGS data analysis” below.

qPCR

Quantitative real-time PCR (qPCR) amplification was performed with regular amplification primers (see PCR protocol above) using SYBR Green Master Mix (VWR, #101414-286). The final concentrations of reagents in qPCR were 1X SYBR Green Mix, 1.0 μM of each forward and reverse primer (IDT), 5 μl of aptamer library probing sample, and volume was brought to 20 μl with molecular grade H 2 O. DNA standard was set in the range 5 × e 2 to 5 × e 8 copies. Each sample and standard was run in duplicate. qPCR was performed on the ViiA 7 Real-Time PCR System (Applied Biosystems). The thermal cycling profile began with a 95 °C incubation for 30 s, followed by 40 cycles of 95 °C for 10 s, 60 °C for 1 min. ViiA 7 software was used to generate a standard curve and to calculate the number of copies of the recovered ssODN library.

Cell culture and exosome isolation

Stanična kultura

FBS (20% in DMEM) was depleted of bovine exosomes by centrifugation at 100, 000 × g for 16 h at 4 °C. VCaP cells were cultured in DMEM supplemented with 10% depleted FBS, 2 mM L-glutamine, 1 U/mL penicillin, and 1 μg/mL streptomycin at 37 °C and 5% CO 2 . Exosomes were isolated from VCaP cell culture supernatant by sucrose density centrifugation. Briefly, supernatant was cleared of cells and cellular debris by sequential centrifugation at 400 × g for 10 min and 2000 × g for 20 min at 4 °C. Cleared supernatant was concentrated by centrifugal filtration (Centricon Plus-70, 100 kDa NMWL), layered on a 30% sucrose cushion and centrifuged at 100, 000 × g for 75 min at 4 °C. Supernatant was removed and discarded without disrupting the cushion interface, which was then collected, diluted 6-fold with PBS and centrifuged at 100, 000 × g for 70 min at 4 °C. The resulting exosome pellet was resuspended in PBS by pipetting and incubation overnight at 4 °C, then stored at −80 °C.

Ultracentrifugation

Exosomes were isolated from human plasma by direct ultracentrifugation. Pooled plasma from normal female donors was diluted 1:1 with PBS then centrifuged at 2000 × g for 30 min at 4 °C to eliminate contaminating cells, followed by 12, 000 × g for 45 min at 4 °C to clear any remaining platelets and cellular debris. Exosomes were pelleted by centrifugation at 120, 000 × g for 2 h at 4 °C. Pellets were washed twice by resuspension in PBS and subsequent centrifugation at 120, 000 × g for 70 min at 4 °C. The final exosome pellet was resuspended and stored as described above.

Protok citometrija

Plasma exosomes were prepared by the direct ultracentrifuge method described above and diluted to 0.04 μg/μL in binding buffer (1X PBS plus 3 mM MgCl 2 ). Exosomes (0.02 μg/μL) were blocked with 0.8 ng/μL salmon sperm DNA, 0.8 ng/μL tRNA, 0.01 mM dextran sulfate in binding buffer for 1 h at RT. Biotinylated aptamer libraries were incubated with equimolar streptavidin-phycoerythrin (SAPE, Invitrogen) in binding buffer for 30 minutes at RT. SAPE-labeled aptamers were then diluted to 12 nM with blocked exosomes (1 μg) and incubated for 1 h at RT. In some cases, subsequent to aptamer binding, exosomes were stained with 32 μM CFDA SE and 5 μM DiD (Invitrogen) for 15 min at 37 °C. To assess aptamer binding to exosomes, PE fluorescence intensity associated with exosome events was measured by flow cytometry (A50-Micro, Apogee Flow Systems).

Aptamer library pull-down of target proteins from plasma

SBED library conjugation, binding and crosslinking

The L2 library enriched against normal female plasma and L0 (as control) were conjugated with sulfo-SBED (Thermo Scientific) as described 36 with minor modifications. SBED library functionalization was tested by performing the ADAPT™ assay with SBED vs DMSO mock conjugated control C6-amine library and sequenced on a HiSeq 2500 TM (Illumina) as described above. The aptamer precipitation was then done with forty-eight ADAPT™ reactions incubated for 1 h with end-over-end rotation at room temp with a 5 ng input of SBED conjugated library per 200 μL of plasma (pre-spun to remove cellular debris at 10, 000 × g for 20 min, 4 °C) in 1X PBS, 3 mM MgCl 2, 0.01 mM dextran sulfate, 40 ng/μl salmon sperm DNA and 40 ng/μl yeast tRNA, and cOmplete ULTRA Mini EDTA-free TM protease inhibitors (Roche) equivalent to ~240 ng library and 9.6 mls plasma. A duplicate set of 48 reactions was prepared with the DMSO control C6-amine library. Aptamer library-protein complexes were precipitated with incubation in 6% PEG8000 for 15 min at 4 °C then centrifuged at 10, 000 × g for 5 min. Pellets were washed with 1 ml 1X PBS, 3 mM MgCl 2 by gentle inversion to remove unbound aptamers. The washed pellets were resuspended in 100 μL of water and subjected to photo-cross-linking at 365 nm with a hand-held 3UV (254NM/302NM/365NM) lamp, 115 volts (Thermo Scientific) for 10 min on ice with 1–2 cm between the 96-well plate and lamp.

Aptamer precipitation and target identification

Cross-linked reactions were subsequently pooled (~4.8 ml) per library or 4.8 ml of 1X PBS (AP bead only control) and incubated with 10 μL of Prepared Dynabeads ® MyOne™ Streptavidin C1 (10 mg/ml)(Life Technologies) (pre-washed with 1X PBS, 0.01% Triton X-100) shaking for 1 h at room temp. Beads were transferred to an eppendorf tube and lysed for 20 min with lysis buffer (50 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl 2, 200 mM NaCl, 0.5% Triton X-100, 5% glycerol, pH 7.5) on ice, washed 3 times with wash buffer 1 (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, 2 M NaCl, 1% Triton X-100), followed by 2 times with wash buffer 2 (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, 2 M NaCl, 0.01% Triton X-100) as described 2 . Cross-linked proteins were eluted by boiling 15 min in 1X LDS sample buffer with reducing agent added (Life Technologies) and loaded on a 4–12% SDS-PAGE gradient gel (Life Technologies). Proteins and DNA were detected with double staining with Imperial Blue Protein Stain (Thermo Scientific) followed by Prot-SIL2 TM silver stain kit (Sigma) according to manufacturers instructions in order to enhance sensitivity and reduce background. Band slices were cut out and sent to TGen Center for Proteomics (Phoenix, AZ) for in-gel digestion and detection on a Thermo LTQ Orbitrap Velos. Bands common to both SBED-conjugated and control libraries were subtracted and those unique to the SBED-conjugated library were analysed for GO enrichment analysis (//geneontology.org/page/go-enrichment-analysis).

Identifikacija cilja

Prepared Dynabeads ® MyOne™ were immobilized with 100 μL H1, H11, L4, or L15 @ 0.15 mg/ml or No Oligo control in 50 mM HEPES, pH 8.3, 3 mM MgCl 2, 0.5 M NaCl, 0.2 mM EDTA, 0.1% Tween-20 for 30 min at room temperature. Unbound ssODNs were removed by washing with the immobilization buffer and beads were equilibrated with 1X PBS, 3 mM MgCl 2 . PEG precipitation of plasma from healthy donors was performed as described in section “ Protocol for profiling clinical samples with enriched or synthetic libraries”, except bead-immobilized ssODNs were used. Prepared beads were incubated for 30 min at room temperature with 100 μL of a 10-fold dilution of PEG-precipitated plasma from healthy donors, subjected to end for end rotation for 10 min at room temperature with 0.8 ng/μL of sheared salmon sperm DNA, 0.8 ng/μL yeast tRNA, and 0.01 mM dextran sulphate. Beads were then lysed in 20 mM HEPES-KOH, 3 mM MgCl 2, 200 mM NaCl, 0.5% Triton X-100, 0.1% Tween-20, pH 7.4, and subsequently washed with 2 additional times with lysis buffer and three times with 20 mM HEPES-KOH, 3 mM MgCl 2, pH 7.4 and eluted in 0.3% TFA, 6 M Urea. 4X Pierce™ LDS Sample Buffer (Life Technologies) was added to 1X final concentration with 1X NuPAGE ® Sample Reducing Agent (Life Technologies) and loaded onto a NuPAGE™ Novex™ 4–12% gradient gel (Life Technologies). Proteins were separated for either 45 min (for Fig. 5) or 10 min (barely run in to remove PEG), and detected by staining gels with Imperial Blue Protein Stain (Thermo Scientific). A band slice from the 10 min separation encompassing the entire range >10 kDa to the stack were cut out. Peptides were extracted from sliced bands with a Thermo In-Gel Tryptic digestion kit ™ according to manufacturer's instructions and cleaned up with Pierce™ C18 Tips. 50% of the sample was injected onto a PepMap RSLC column (C18, 2 μm, 100 Å, 75 μm × 25 cm) with a Thermo Scientific™ Acclaim™ PepMap™ RSLC Nano Trap Column, and eluted at a flow rate of 300 nL/min with a 35 min gradient (0.1% HCOOH, 1.6% CH 3 CN to 0.1% HCOOH, 40% CH 3 CN) with a Dionex UltiMate 3000 RSLCnano system, and detected using a Thermo Q-Exactive HF Hybrid Quadrupole-Orbitrap Mass Spectrometer (QE HF). A blank run was injected between each sample and eluted with the same gradient. The QE HF was operated in data-dependent mode with the top 10 most intense ions determined from the high resolution (60, 000) MS survey scan (scan range: m/z 375–1800; AGC 3 × e 6 ) followed by HCD acquisition (resolution 15, 000; scan range m/z 200–2000, AGC 1 × e 5 ). Dynamic exclusion was applied with repeat count and exclusion duration of 1 s and 5 s, respectively. Protein identifications were performed using Proteome Discoverer version 2.1 and Sequest HT Search as the database search engine on Homo sapiens (SwissProt TaxID = 9606), Streptomyces avidinii (SwissProt TaxID = 1895) v. 2015-09-16 exported from Swissprot. and custom cRAP v. 2012.01.01 (//www.thegpm.org/crap/) databases (for common contaminants) filtered by high confidence.

Prijenosna elektronska mikroskopija (TEM)

EM and immuno-EM analysis of vesicles were performed as described previously 37 with minor modifications. Specifically, the vesicle pellet was resuspended in 1X PBS and deposited onto a Formvar coated slide of copper mesh EM grids (FF300-Cu-50, Electron Microscopy Sciences). The vesicle-coated grids were washed, stained with 1% UO 2 (CH 3 COO) 2 and then viewed for transmission EM (TEM) using a Philips CM12; camera: Gatan model 791. For the immuno-gold labelling with antibodies, blocked grids were transferred to a drop of the antibody in 0.1 M NaPO 4 pH 7.2/150 mM NaCl/1% BSA/0.01% Tween20 and incubated for 30 min. The grids were then washed, incubated with gold-labeled secondary antibody in 1X PBS/1% BSA/0.01% Tween20 for 20 min. After washing with the same buffer and deionized water, the grids were stained with 0.5% UO 2 (CH 3 COO) 2 and then imaged by TEM.

Dynamic Light Scattering

Exosomes samples were prepared by PEG-precipitation of blood plasma as described above, with titration of PEG 1%, 2%, 4%, 5%, 6%, 8%. Vesicle size distribution was measured with DynaPro Plate Reader II (Wyatt Technology Corporation, Santa Barbara, CA) using equal volumes of each sample, in three replicates, having 5 acquisitions of 5 seconds each at 25 °C. PBS buffer and UC-isolated exosomes were used as control.

Western Blot

PEG precipitation of plasma sample was performed according to the probing protocol described above using 4, 5, and 6 final % of PEG without the addition of competitor or aptamer library. After final re-suspension step sample protein content was measured by nanodrop. Samples (50 μg of recovered plasma sample) were separated on 4–12% Bis Tris protein gel (NP0322BOX, Invitrogen). Control for Ab performance was 0.05 μg exosome sample from the VCaP cell line, isolated by UC. Proteins were transferred to a nitrocellulose membrane (IB301001, Invitrogen) by iBlot standard procedure. Primary antibody probing was performed with 1 μg/mL mouse anti -CD9 ab (MAB1880, R&D Systems) followed by 1:10, 000 diluted goat anti -mouse HRP secondary antibody (115-035-062, Jackson Immuno Research) and final development of signal by 5 min incubation with vendor recommended concentration of chemiluminescent substrate (34096, Thermo). Image of blot was captured by imager (PXi, Syngene) following 10 s exposure.

Filter retention assay

ssODN-C1Q interaction analysis

Radioactively labelled ssODNs were obtained by in vitro kinase reactions using T4 PNK and γ-[ 32 P]-ATP (PerkinElmer, Waltham, USA). Reaction mixtures were purified using NucleoSpin PCR and Gel Clean-up kits (Machery and Nagel, Düren, Germany) according to the manufacturers instruction. Trace amounts of 32 P-labelled ssODNs were incubated with increasing C1Q concentrations in binding buffer (PBS, pH7.4, supplemented with 6 mM Mg 2+ and 10% C1Q-depleted serum) and incubated at 37 °C for 30 min. Afterwards, the mixture was passed through nitrocellulose membranes (0.45 μM, Schleicher and Schuell Biosciences GmbH, Dassel, Germany) and washed with 800 μl binding buffer w/o serum. The amount of radioactively labelled ssODNs bound to protein was detected with a FLA-3000 (Fujifilm, Tokyo, Japan) and quantified using AIDA image software (raytest GmbH, Straubenhardt, Germany).

Enzyme-Linked Oligonucleotide Assay (ELONA)

Purified C1Q Protein (CompTech, Tyler, USA) was directly coated overnight at 4 °C onto a high binding 96 well plate (Corning Costar, Corning, USA). Plates were then blocked with PBS, pH7.4, supplemented with 3 mM MgCl 2, 0.1 mg/ml sheared salmon sperm DNA, 0.1 mg/ml yeast tRNA, 0.08 mg/ml dextran sulfate and 3% BSA) for 1 h at 22 °C. The wells were then washed 3 times each with wash buffers 1 (20 mM HEPES-KOH, pH 7.4, 3 mM MgCl 2, 200 mM NaCl) and wash buffer 2 (20 mM HEPES-KOH, pH 7.4, 3 mM MgCl 2 ) respectively. Biotinylated ssODN was pre-incubated with streptavidin-poly HRP (Pierce, Waltham, USA) for 15 min at 22 °C. This mixture was added to the wells and incubated for 1 h at 22 °C. The wells were washed 3 times each with wash buffer 1 and 2. The amount of ssODN bound to protein was detected with a HRP substrate with absorbance at 450 nm (Biotek, Vinooski, USA).

NGS data analysis

See preliminary data analysis above in post-NGS processing part.

The number of copies of a particular ssODN sequence was normalized by dividing this number by the total number of counts and multiplying it by the global mean.

ANOVA Permutation test

Number of ANOVA F test significant aptamers was tested by 1000 permutations of the sample labels. A one-way ANOVA model was built for each aptamer using normalized count. Aptamers were considered significant when their F test p values were less than 0.05.

Random Forest Models

Random forest models were realized using the random Forest function from the random Forest R package. Specifically, the model contained 1000 decision trees. The number of random features was determined by the square root of number of features input into the model (default). The prediction probability was computed based on out-of-bag (OOB) samples. Area under the ROC curve was calculated to evaluate the model performance. The OOB AUC was also tested by 1000 permutations of the sample labels. The permutated labels were then used to compute the corresponding AUCs.

dodatne informacije

How to cite this article: Domenyuk, V. et al . Plasma Exosome Profiling of Cancer Patients by a Next Generation Systems Biology Approach. Sci. Rep. 7, 42741; doi: 10.1038/srep42741 (2017).

Napomena izdavača: Springer Nature ostaje neutralan s obzirom na tvrdnje o nadležnosti u objavljenim mapama i institucionalnoj pripadnosti.

Dodatna informacija

PDF datoteke

  1. 1.

    Dodatna informacija

Excel datoteke

  1. 1.

    Dopunska tablica S1

  2. 2.

    Dopunska tablica S2

  3. 3.

    Dopunska tablica S3

  4. 4.

    Dopunska tablica S4

  5. 5.

    Dopunska tablica S5

  6. 6.

    Dopunska tablica S6

  7. 7.

    Dopunska tablica S7

  8. 8.

    Dopunska tablica S8

  9. 9.

    Dopunska tablica S9

  10. 10.

    Dopunska tablica S10

  11. 11.

    Dopunska tablica S11

  12. 12.

    Dopunska tablica S12

  13. 13.

    Dopunska tablica S13

  14. 14.

    Dopunska tablica S14

  15. 15.

    Dopunska tablica S15

komentari

Slanjem komentara slažete se s našim Uvjetima i smjernicama zajednice. Ako ustanovite da je nešto zloupotrebno ili nije u skladu s našim uvjetima ili smjernicama, označite to kao neprimjereno.