Pml poremećaj nuklearnog tijela oštećuje DNK dvostruko praćenje i ispitivanje loma u apl | stanična smrt i bolest

Pml poremećaj nuklearnog tijela oštećuje DNK dvostruko praćenje i ispitivanje loma u apl | stanična smrt i bolest

Anonim

teme

  • apoptoza
  • Dvostruka razbijanja DNA
  • Leukemija
  • onkogcnczom

Sažetak

Proteini koji sudjeluju u popravku DNK dvostrukih lomova (DSB) lokaliziraju se unutar nuklearnih tijela promielocitne leukemije (PML-NBs), čiji je poremećaj u korijenu patogeneze akutne promeelocitne leukemije (APL). Tretman all- trans -retinoičnom kiselinom (RA) izaziva razgradnju PML-RAR α , obnavlja funkcije PML-NB i uzrokuje diferencijaciju terminalnih stanica APL blasta. Ipak, još uvijek ne postoji precizna uloga onkoproteina povezanog s PML-RAR α i PML-NB u DSB odgovoru u APL leukemogenezi i supresiji tumora. Eksplozije primarne leukemije izolirane od APL bolesnika pokazale su visoku razinu fosforilacije H2AX ( γ -H2AX), inicijalnog DSBs senzora. Baveći se posljedicama DSB-a izazvanog ionizirajućim zračenjem (IR) u primarnim APL eksplozijama i mijeloidnim staničnim linijama koje reagiraju na RA i nose endogene ili ektopično izražene PML-RAR α , prije i nakon liječenja RA-om, otkrili smo da poremećaj PML-NBs povezan je s odgođenim DSB odgovorom, što je otkriveno oslabljenom kinetikom nestanka žarišta γ -H2AX i 53BP1 i aktiviranjem ATM-a i njegovih supstrata H2AX, NBN i CHK2. Poremećaj integriteta PML-NB PML-RAR α također utječe na IR-inducirani DSB odgovor u preleukemičnom mišjem modelu APL in vivo . Predlažemo poremećaj PML-NB ovisnog o onkoproteinu i oštećenje DDR-a kao relevantne rane događaje u APL tumorigenezi.

Glavni

Odgovor oštećenja DNA (DDR) uključuje zaustavljanje staničnog ciklusa i transkripciju i post-translacijsku aktivaciju gena uključenih u popravak DNK i pokretanje apoptoze. Nedostaci DDR-a bitni su za etiologiju većine karcinoma kod ljudi. 1

Prekidi dvostruke vrpce DNA (DSB) proizlaze iz endogenih i egzogenih izvora, uključujući pogreške u replikaciji, kemijske mutagene i ionizirajuće zračenje (IR). 2 Senzorska faza DSB odgovora uključuje njihovo prepoznavanje kompleksom MRE11 / RAD50 / NBN, aktivaciju proteina ATM, fosforilaciju histona H2AX kod Ser139 ( γ -H2AX), MDC1 i regrutaciju 53BP1. γ-H2AX je početni DSB senzor za naknadno nakupljanje i post-translacijsku modifikaciju (PTM) signalizacije i popravka proteina kako bi se formirali takozvani IR-inducirani žarišta (IRIF). 3, 4, 5, 6, 7, 8 Konačno, DSB-ovi se uklanjaju ili nehomolognim krajnjim spajanjem (NHEJ) ili putem homologne obnove rekombinacije (HRR). 9

Mnogi proteini uključeni u DDR lokaliziraju se unutar nuklearnih tijela promeelocitne leukemije (PML) (PML-NBs). 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 PML-NB su nuklearne organele uključene u stanične procese relevantne za supresiju tumora (npr. PTM, DDR, transkripcijska regulacija, indukcija apoptoze i starenje). 16, 17, 18, 19, 20, 21 PML-NB se povećavaju i mijenjaju svoju subnuklearnu raspodjelu kao odgovor na oštećenja DNK i predstavljaju strukture u kojima su proteinski kompleksi sastavljeni, usidreni i / ili posttralacijsko modificirani. 11, 13, 15, 16, 22 PML također prolaze PTM-ove, SUMOylation koji predstavlja jednu od glavnih izmjena potrebnih za pravilnu NB-biogenezu i regulaciju staničnog odgovora na oštećenje DNA. 23

Aberantne razine PML proteina i gubitak integriteta PML-NBS prijavljeni su kod akutne promeelocitne leukemije (APL) i kod drugih tumora. 24 PML gen prvotno je kloniran u APL leukemijskim stanicama koje su nosile t (15; 17) koji se može detektirati u preko 95% APL-a. Ova translokacija uključuje PML i receptore gena retinoične kiseline- a (RAR α ) i stvara fuzijski gen PML-RAR α . 25, 26, 27 PML-RAR α djeluje kao transkripcijski represor koji antagonizira mijeloidnu diferencijaciju i promiče sposobnost samoobnavljanja stanica koje iniciraju APL. 28, 29 PML-RAR α također konkurentno inhibira oligomerizaciju PML proteina divljeg tipa (WT), što dovodi do poremećaja PML-NBs u nuklearnim 'mikrospekcijama'. 30 U stanicama APL-a, tretman all- trans retinoičnom kiselinom (RA) vraća integritet NB, preokreće PML-RAR α- posredovanu inhibiciju transkripcije i izaziva PML-RAR α razgradnju i diferencijaciju terminalnih stanica. 29, 31, 32

Do danas je još uvijek nejasno u kojoj mjeri popravak DSBS-a ovisi o funkciji PML-a i PML-NBS-a. Ovdje je istražen odnos između PML-NBS integriteta i IR-induciranog DSBS osjetila, signalizacije i popravljanja u leukemijskim stanicama izvedenim od APL jedinki, mijeloidnih staničnih linija koje izražavaju ili ne PML-RAR α i PML-RAR α preleukemijski model miša in vivo . Dobiveni podaci pokazuju da ekspresija PML-RAR α u mijeloidnim stanicama uzrokuje bazalno oštećenje i neispravan DSBS odgovor, ističući ključnu ulogu PML-NB-a u koordinaciji i regulaciji ranih i kasnih događaja DDR-a u APL-u. Sveukupno, naši rezultati sugeriraju da su PML-RAR α- ovisni PML-NBS poremećaji i slabljenje DDR-a relevantni rani događaji u APL tumorigenezi.

Rezultati

Cjelovitost PML-NB-a potrebna je za pravilno spajanje DSB-ova

Dvostruko imunofluorescentno bojenje anti-PML i anti -γ -H2AX antitijelima omogućilo je otkrivanje rastavljenih PML-NBs i velikog broja γ- H2AX žarišta u primarnim blastima izoliranim kod dijagnoze kod tri APL bolesnika, koji su održavali kromosomsku translokaciju t (15; 17 ) što rezultira fuzijskim produktom PML-RAR α (također potvrđeno RT-PCR, slike 1a i b). Biološka i klinička obilježja ovih slučajeva APL-a navedena su u Dodatnoj tablici S1. Slični rezultati opaženi su u AP4-staničnoj staničnoj liniji, koja je proizvedena iz APL-a, i u njegovom subklonu izvedenom od otpornog na RA, NB4-MR4.

Image

Integritet PML-NB i kinetika defosforilacije γ -H2AX. ( a ) Reprezentativne slike dvostruke imunofluorescentne analize γ -H2AX (Alexa Fluor 488, zeleni fluorofor) i PML (Alexa Fluor 610, crveni fluorofor) žarišta u APL eksplodiraju neobrađene (Ctrl) i izložene 1 Gy rendgenima i fiksirano nakon 0, 5, 3 i 24 h (slika ćelije: svijetlo polje; slike konfokalne mikroskopije, uvećanje × 63) i stanice NB4 tretirane 72 sata u 1 1 M M RA, a zatim izložene IR i fiksirane nakon 0, 5, 3, 24 i 48 h (kontrasta: DAPI; slike konfokalne mikroskopije, uvećanje × 63). ( b ) Kvantifikacija srednjeg broja žarišta / ćelija γ -H2AX i ( c ) analiza sposobnosti ponovnog spajanja izmjerena kao postotak DSB-a u netretiranim i ozračenim APL eksplozijama dobivenim od 3 različite jedinke, a stanice NB4 i NB4-MR4 neobrađene ili obrađen je s 1 µM RA u trajanju od 72 sata, a zatim je ozračen sa 1 Gy. Za grafike ponovnog spajanja NB4 i NB4-MR4 DSB; * i ** ukazuju na značajne razlike NB4-tretiranih RA-stanica u odnosu na RA-netretirane stanice NB4 i NB4-MR4 stanice. Srednje vrijednosti dobivene su iz analize 100 stanica u 3 neovisna pokusa ± SD Za DSB-ove, srednji broj žarišta γ -H2AX / stanica koji se može mjeriti u 0, 5 h nakon IR-a uzet je za 100%. * P <0, 05; ** P <0, 01. Konfokalna analiza provedena je pomoću LCS Leica konfokalnog mikroskopa (Leica Microsystems, Heidelberg, Njemačka)

Slika pune veličine

Sposobnost popravljanja DSB nakon 1 Gy rendgenskih zraka ocijenjena je kao srednja vrijednost γ -H2AX žarišta / ćelije i kao postotak zaostalih DSB u svakoj točki. U primarnim APL eksplozijama broj žarišta γ -H2AX dostigao je vrhunac nakon 0, 5 h od IR-a, a polako se smanjio nakon 3 h (∼ 45 fokusa / stanica i 80% neispravljenih DSB-a). Veliki broj nepopravljenih DSB-a nastavio se i nakon 24 sata od IR-a, naglašavajući kašnjenje u popravku DSBS-a u eksplozijama APL-a (∼ 12 žarišta / ćelija i 24% ne-popravljenih DSB-a) (slike 1b i c).

Konfokalna mikroskopija također je otkrila velik broj γ -H2AX žarišta / stanica u neobrađenim NB4 i RA-rezistentnim NB4-MR4 stanicama (slike 1 i b i dopunska slika S1). Vrhunac srednje vrijednosti γ -H2AX žarišta / ćelije dosegnut je na 0, 5 h od IR-a i u stanicama tretiranim RA i u RA-obradi. Značajna razlika u srednjoj vrijednosti γ -H2AX žarišta / stanice i u postotku zaostalih DSB-a uočena je nakon 3 sata od IR-a (~ 80% nepopravljenih DSB-a u NB4, NB4-MR4 i RA4-tretiranim NB4-MR4 stanicama ; ~ 60% neodržavanih DSB u stanicama NB4 tretiranim RA; P <0, 05; Slike 1b i c). Slično APL eksplozijama, profil spajanja DSB u stanicama NB4 pokazao je da je za 24–48 h od IR broj perzistentnih DSB bio značajno veći u NB4 stanicama i u NB4-MR4 stanicama, nego u NB4 stanicama tretiranim RA (slike 1b i c). U tim ćelijama obnovljeni su PML-NB nakon degradacije PML-RAR α, a granulopoeza je inducirana na vremenski ovisan i IR neovisan način, što je otkriveno pojačanom ekspresijom markera mijeloidne mijeloidnosti CD11b (dopunske slike S1B i C).

Imunoblotskom analizom nadalje smo opazili da je γ -H2AX neodrediv ili se jedva detektira u stanicama humanih CD34 + hematopoetskih progenitora (HPC) i mononuklearnih ćelija CD34 (MNC), dok su visoke razine γ- H2AX primijećene u PML-RARα-eksprimirajućem uzorci triju APL bolesnika, kao i u stanicama NB4 i NB4-MR4 (slika 2a). Tretman RA-a u stanicama NB4 smanjio je razinu γ -H2AX u usporedbi s netretiranim stanicama. Nakon IR-a, u stanicama NB4 najviši nivoi γ -H2AX detektirali su se nakon 3 sata, trajajući do 24 sata, dok su u stanicama tretiranim RA-om razine γ -H2AX dostigle vrhunac na 0, 5 h i postupno se smanjivale do 24 h (slika 2b), IR liječenje nije imalo utjecaja na razinu ekspresije RAR α ili PML-RAR α u primarnim APL blastima i NB4 stanicama (Slika 2c).

Image

( a ) Reprezentativna imunoblotska analiza fosforilacije H2AX i H2AX na ostatku Ser139 u neobrađenim ljudskim CD34− i CD34 + stanicama izoliranim iz periferne krvi normalnih davatelja, kod tri APL bolesnika, u stanicama NB4 i NB4-MR4. ( b ) Reprezentativna imunoblotska analiza fosforilacije H2AX u stanicama NB4 tretirane ili ne s 1 µM RA u toku 72 h, a potom je ozračena s 1 Gy X-zraka i lizirana nakon 0, 5, 3 i 24 sata. ( c ) Reprezentativna imunoblotska analiza nivoa ekspresije RAR α i PML-RAR α u APL blastima, NB4, U937 / PR9 i U937 / MT ćelijama izloženim IR i lizirana nakon 0, 5 h; prije zračenja stanice NB4 tretirane su 72 sata s 1 µM RA, dok su stanice U937 / PR9 tretirane ili nisu sa 100 µM ZnS04 tijekom 8 sati, a zatim s 1 µM RA kroz 72 sata, kao što je naznačeno; filteri su ispitivani sa anti-RAR α antitijelom, a tubulin je korišten kao kontrola opterećenja. ( d ) Kvantifikacija srednjeg broja žarišta / ćelije γ- H2AX i ( e ) analiza sposobnosti spajanja, izmjerena kao postotak DSB-a u stanicama U937 / PR9, U937 / MT i U937 / WT tretiranim ili ne sa 100 μM ZnS04 za 8 sati i / ili s 1 µM RA za 72 sata, kako je naznačeno; Tada su stanice bile izložene IR-u i fiksirane su na određeno vrijeme. Srednje vrijednosti dobivene su iz analize 100 stanica u tri neovisna pokusa ± SD Za DSB-ove, srednji broj γ -H2AX žarišta / stanica mjerljivih 0, 5 h nakon što je IR uzet kao 100%. ** P <0, 01. Za grafiku ponovnog spajanja U937 / PR9 DSB; ** označava značajne razlike U937 / PR9 stanica tretiranih ZnSO 4 u odnosu na kontrolne stanice U937 / PR9. Konfokalna analiza provedena je pomoću LCS Leica konfokalnog mikroskopa (Leica Microsystems)

Slika pune veličine

IR9-tretirane U937 / PR9 stanice inducirane da eksprimiraju PML-RAR α onkoprotein ZnS04 dala su rezultate slične onima opaženim u APL blastima i NB4 stanicama. U937 / PR9 + ZnSO 4 stanice su pokazale ~ 80%, 20% i 10% perzistentnih DSB nakon 3, 24 i 48 h od IR, respektivno (Slike 2d i e). Nakon RA tretmana u stanicama U937 / PR9 + ZnSO 4, što je rezultiralo degradacijom PML / RARa i reformacijom PML-NBS, postotak perzistentnih DSB bio je 60%, 10%, i 2% nakon 3, 24, i 48 h. Zanimljivo je da su slične prosječne vrijednosti γ -H2AX žarišta / stanice i profili spajanja DSBS bili mjerljivi, prije ili nakon tretmana sa ZnSO 4 i / ili RA, u mijeloidnim staničnim linijama koje eksprimiraju WT PML protein poput U937 / MT, U937 / WT, HL60 i HL60-R, subklona otporna na RA od HL60 (Slike 2d i e i Dodatne slike S2A-C). Napominjemo, IR liječenje nije imalo utjecaja na razinu ekspresije RARα ili PML-RARα u stanicama U937 / PR9 i U937 / MT (Slika 2c). Nadalje je sugerirala ulogu za poremećaj PML-NB nakon ekspresije PML-RAR α u DSB koji je ponovno posjedovao mijeloidne stanice.

Cjelovitost PML-NB potrebna je za zapošljavanje 53BP1 u DSB-ove

53BP1 akumulira se u PML-NB-ima i regrutuje se u IRIF nakon DSBS indukcije, promičući aktiviranje signala za popravak. 33 Stoga smo proučavali kinetiku DSB računanjem broja žarišta od 53BP1 u primarnim stanicama APL-a i stanicama NB4 i NB4-MR4 nakon 0, 5, 3 i 24 sata od zračenja s 1 Gy. Otkrili smo da je integritet PML-NBS potreban za lokalizaciju 53BP1 u jezgri i za formiranje žarišta 53BP1 nakon indukcije DSBS. U stvari, 53BP1 je bio jedva otkriti u nezračenim APL eksplozijama i NB4 stanicama, vjerojatno zbog slabe bazne ekspresije 53BP1 ili njegove paneuklearne disperzije u rastavljenim PML-NB-ima. Suprotno tome, 53BP1 se kolokalizira s PML unutar obnovljenih PML-NB nakon RA obrade NB4 stanica (Slika 3a). Nakon oštećenja izazvanog IR-om, broj žarišta od 53BP1 i kolokalizacija s PML bio je značajno niži u RAL blastiranim netretiranim RA i NB4 i NB4-MR4 stanicama u usporedbi s NB4 stanicama tretiranim RA (slike 3a-c). Stoga se obnavljanje žarišta 53BP1 unutar reformiranih PML-NBs može dogoditi kao posljedica degradacije PML-RAR α izazvane RA.

Image

Integritet PML-NB i regrutacija 53BP1 u DSB-ove. ( a ) Reprezentativne slike nestanka žarišta 53BP1 u APL eksplozijama su neobrađene (Ctrl) i izložene 1 Gy i fiksirane nakon 0, 5, 3 i 24 sata, te u stanicama koje nisu tretirane s RA (NB4) i RA (NB4 + RA). nezračeni (Ctrl) i izloženi IR-u i fiksirani nakon 0, 5 h (stanična slika: svijetlo polje; slike konfokalne mikroskopije, uvećanje × 63; 53BP1 (Alexa Fluor 488, zeleni fluorofor); PML (Alexa Fluor 610, crveni fluorofor)), ( b ) Kvantificiranje 53BP1 žarišta / ćelije, prijavljeno kao srednja vrijednost 53BP1 žarišta u APL eksplozijama, NB4 i NB4-MR4 stanicama neobrađenim ili obrađenim s 1 µM RA u toku 72 h, a U937 / PR9 stanice ili neobrađene ili izložene za 8 h do 100 μM ZnS04, a zatim je obrađen ili ne sa 72 µM RA tijekom 72 sata. Nakon tretiranja ZnSO4 i / ili RA, stanice su ozračene s 1 Gy i fiksirane na naznačene vremenske točke. ( c ) Kvantifikacija događaja asocijacije žarišta 53BP1 s PML po jezgri u APL eksplozijama, NB4, NB4-MR4 i stanicama U937 / PR9. ( d ) Kvantifikacija fokusa / stanica stanica 53BP1 i događaja pridruživanja žarišta 53BP1 s PML po jezgri u stanicama U937 / MT. Prije ozračivanja, U937 / MT stanice su ili neobrađene, ili izložene 8 h do 100 µM ZnS04, a potom su obrađene s 1 µM RA u toku 72 h. Srednje vrijednosti su dobivene analizom 100 stanica u tri neovisna pokusa ± SD * P <0, 05; ** P <0, 01. Konfokalna analiza provedena je pomoću LCS Leica konfokalnog mikroskopa (Leica Microsystems)

Slika pune veličine

Procijenili smo ponovnu učinkovitost DSB-a u stanicama koje eksprimiraju PML-RAR α onkoprotein i u stanicama koje eksprimiraju WT PML brojeći broj 53BP1 žarišta / stanice u neobrađenim i ozračenim stanicama (slike 3b i d i dodatna slika S2D). Nakon 0, 5 h od IR-a, APL blasti i stanice NB4 pokazali su prosječan broj foca / stanica 53BP1 niži od onih izračunatih u stanicama koje eksprimiraju WT PML ili u stanicama gdje je PML-RAR α razgradio RA. Nakon 3 sata od IR-a, APL blasti i stanice NB4 pokazali su broj 53BP1 žarišta značajno viših od onog mjerljivog u stanicama koje eksprimiraju WT PML ili gdje je PML-RAR α razgradio RA. Konačno, nakon 24 i 48 sati od IR-a, zaostala srednja vrijednost foca / stanica 53BP1 utvrđena u stanicama koje eksprimiraju fuzijski protein PML-RAR α bila je značajno veća u usporedbi s onima koja eksprimiraju WT PML (slike 3b i d i dodatna slika S2D).

PML-RAR α ne povećava kromosom u stabilnosti, S fazi i staničnoj smrti

Da bi se procijenilo mogu li rezidualni γ -H2AX i 53BP1 žarišta / stanice primijećeni nakon 24 i 48 h od IR-a u APL eksplozijama i PML-RAR α- ekspresijskim stanicama biti u korelaciji s kromosomskom nestabilnošću, izvršena je višebojna FISH (mFISH) analiza u NB4 stanicama, bilo neobrađena ili izložena RA, u kombinaciji s izlaganjem 1 Gy. Kariotip NB4 uspostavljen je s obzirom na sačuvane translokacije koje se pojavljuju u> 90% stanica analiziranih u kontrolama. Kariotip je bio hipotetraploidan i može se sažeti na sljedeći način: 80 XX, −X, −X, −1, −3, −5, +7, −8, −14, −15, −18, −19, −19, 19, −19, −21, −22, t (8′ – 9), (9′ – 8), t (10–19), t (10–19), t (14–19), t (15 ′ –17), t (16–5) t (17′ – 15), t (17′ – 15) (slike 4a i b). Analiza kromosomskih izmjena u svakom uzorku izvedena je ignorirajući bazalne translokacije opažene u kontrolnim stanicama. Dobiveni rezultati pokazuju da RA samo po sebi nije utjecao na učestalost kromosomskih aberacija na kontrolne vrijednosti i nije mijenjao frekvenciju prekida izazvanog IR-om (Slika 4b). Iako prekidna frekvencija ostaje nepromijenjena, predobrada RA smanjila je učestalost izmjena kromosoma izazvanih IR-om (s 2 na 0, 9 razmjene / stanicu u kontroliranim uzorcima s NB4, odnosno RA-obrađenim uzorcima), dok je povećala učestalost kromosomskih viška fragmenata (s 1, 8 do 3, 9 fragmenata / stanica u NB4 kontroliranim i RA-obrađenim ozračenim uzorcima, respektivno) (Slika 4b). Jedina razlika koja je primijećena kod RA-tretiranih u odnosu na netretirane uzorke NB4 bila je u kvaliteti oštećenja izazvanih IR-kromosomom, a ne u količini (ukupni prekidi). Nažalost, citogenetska analiza nije mogla biti izvršena na primarnim uzorcima APL zbog vrlo sporog proliferacije eksplozije izolirane iz periferne krvi koja je blokirana u fazi G0 / G1 staničnog ciklusa (slika 4c).

Image

Hromosomsko oštećenje, raspodjela staničnog ciklusa i apoptoza u stanicama koje eksprimiraju PML-RAR α . ( a ) Reprezentativna slika kariotipa obojenog mFISH-om NB4. Kariotip je uspostavljen uzimajući u obzir sačuvane translokacije koje se pojavljuju u> 90% stanica analiziranih u kontrolama. Metafaze su zarobljene mikroskopom Axio Imager M1 (Carl Zeiss, Oberkochen, Njemačka). Kariotipizacija i citogenetska analiza svakog pojedinog kromosoma izvedena je softverom ISIS. ( b ) Učestalost po stanici kromosomske aberacije (tj. fragmenti, razmjene i lomovi) nakon ozračivanja s 1 Gy u NB4 stanicama koje nisu obrađene ili izložene 72 µM RA 72 sata. ( c ) Raspodela staničnog ciklusa APL blasta i NB4 ćelija neobrađena ili tretirana s 1 µM RA u toku 72 h, a zatim je ozračena i fiksirana nakon 24 sata. ( d ) Raspodjela staničnog ciklusa U937 / PR9 stanica neobrađena ili tretirana sa 100 µM ZnSO 4 u trajanju od 8 h da se inducira ekspresija PML-RAR α, a zatim se ozrači i fiksira nakon 24 sata. ( e ) Sub-G1 populacija analizirana protočnom citometrijom u APL blastima i u stanicama NB4 neobrađena ili tretirana s 1 µM RA u toku 72 h, a zatim je ozračena i fiksirana nakon 24 sata. ( f ) Sub-G1 populacija analizirana protočnom citometrijom u stanicama U937 / PR9 neobrađena ili tretirana sa 100 µM ZnS04 tijekom 8 sati, a potom je ozračena i fiksirana nakon 24 sata. Srednje vrijednosti su izvedene iz tri neovisna pokusa ± SD ** P <0, 01

Slika pune veličine

Kako je H2AX fosforiliran bilo tijekom S faze staničnog ciklusa ili kao posljedica indukcije stanične smrti, 34 analizirali smo profil staničnog ciklusa i sub-G1 populaciju APL blasta i mijeloidnih staničnih linija. U APL eksplozijama>> 90% stanica bilo je u G1, 2% u S i 8% u G2 / M fazama staničnog ciklusa (Slika 4c), dok je populacija ispod G1 bila ~ 4% (Slika 4e). Analiza staničnog ciklusa u stanicama NB4 i U937 / PR9 tretirana ili ne s RA i ZnSO 4, neobrađena ili ozračena s 1 Gy, pokazala je da je veliki broj γ -H2AX žarišta / stanica zabilježen u PML-RAR α- ekspresionirajućim stanicama nije u korelaciji s postotkom stanica u S fazi (slike 4c i d). Štoviše, u stanicama NB4 i U937 / PR9 nije uočena povezanost između broja γ -H2AX žarišta / stanica i stanične smrti, kako u bazalnim uvjetima, tako i nakon 24 sata od izlaganja IR-u (Slike 4e i f). Sveukupno, dobiveni podaci pokazuju da visoke bazne razine γ -H2AX žarišta opažene u APL eksplozijama i stanicama koje eksprimiraju PML-RAR α nisu povezane sa S-fazom staničnog ciklusa niti sa staničnom smrću.

Cjelovitost PML-NB-ova potrebna je za aktiviranje bankomata

ATM kinaza, kritični regulator DDR-a, brzo se fosforilira na ostatu Ser1981 kao odgovor na IR, a njegov aktivni oblik zauzvrat fosforilira H2AX kod Ser139, kao i nekoliko drugih komponenti DDR-a (npr. NBN u Ser 343 i CHK2 na Thr68). 2 Procijenili smo ulogu integriteta PML-NBS u fosforilaciji ATM-a u Ser1981 i aktiviranju kao odgovor na IR. ATM je rezultirao slabo aktiviranim ne-ozračenim PML-RAR a- eksprimirajućim APL eksplozijama, njegov Ser1981-fosforilirani oblik kolokalizira se s PML u 3 sata od zračenja s 1 Gy (slika 5a). Slično kao u primarnim APL eksplozijama, žarišta pSer1981-ATM jedva su se otkrila u ne-ozračenim stanicama NB4 i U937 / PR9 + ZnSO 4 (Slike 5b i c). U stanicama koje eksprimiraju PML-RAR α , aktiviranje ATM i kolokalizacija s PML dobro se detektira nakon 3 sata od IR-a, dok se u stanicama koje eksprimiraju WT PML (tj. U937 / WT i U937 / PR9) dolazi do nakupljanja pSer1981-ATM-a u PML-u žarišta su bila vidljiva već nakon 0, 5 h od IR-a (slika 5c i dodatna slika S3A). Zanimljivo je da je RA tretmanom u stanicama NB4 i U937 / PR9 izazvanom Zn obnovio pSer1981-ATM / PML uzorak kolokalizacije u PML-NB nakon 0, 5 h od IR (Slike 5b i c).

Image

Integritet PML-NB i aktiviranje bankomata. Dvostruka imunofluorescencija pSer1981-ATM (Alexa Fluor 488, zeleni fluorofor) i PML (Alexa Fluor 610, crveni fluorofor) žarišta izvedena u stanicama neobrađenim ili ozračenim s 1 Gy i fiksiranim nakon 0, 5 i 3 sata. Reprezentativne slike analize provedene u ( a ) APL eksplozijama (slika ćelije: svijetlo polje), ( b ) NB4 stanice neobrađene ili tretirane s 1 μM RA 72 sata prije IR-a (kontrastain: DAPI) i ( c ) U937 / PR9 stanice ili neobrađene ili izložene 8 h do 100 μM ZnS04, a zatim netretirane ili tretirane s 1 μM RA 72 sata prije IR-a (kontrastain: DAPI). Neki signali kolokalizacije istaknuti su i označeni unutar ćelije bijelim kvadratom. Konfokalne mikroskopske slike, uvećanje × 63; LCS Leica konfokalni mikroskop (Leica Microsystems)

Slika pune veličine

Cjelovitost PML-NB potrebna je za pretvorbu DSBS signala

Ko-imunofluorescentni eksperimenti s anti-pSer1981-ATM i anti-pSer343-NBN protutijelima pokazali su da je fosforilacija ATM i NBN značajno inducirana nakon 3 sata od zračenja s 1 Gy u stanicama koje eksprimiraju PML-RAR a (Slika 6). U PML-RAR α stanicama tretiranim RA (NB4 + RA i Zn-induciranim U937 / PR9 + RA) i u stanicama koje eksprimiraju WT PML (U937 / WT i U937 / PR9 stanice), velik broj pSer1981-ATM žarišta, kolokalizacija s pSer343-NBN, bila je vidljiva na 0, 5 h od IR; u 3 h iz IR-a nestalo je žarišta pSer1981-ATM-a dok su NBN žarišta i dalje postojala (slike 6b i c i dodatna slika S3B). Ovi su nalazi u skladu s predloženom funkcijom NBN-a u nekoliko faza DDR-a. 35, 36

Image

Integritet PML-NB i NBN-ovisna fosforilacija. Dvostruka imunofluorescencija pSer1981-ATM (Alexa Fluor 488, zeleni fluorofor) i pSer343-NBN (Alexa Fluor 610, crveni fluorofor) žarišta izvedena u stanicama neobrađenim ili ozračenim s 1 Gy i fiksirana nakon 0, 5 i 3 sata. Reprezentativne slike analize provedene u ( a ) APL eksplozijama (slika ćelije: svijetlo polje), ( b ) NB4 stanice neobrađene ili tretirane s 1 μM RA 72 sata prije IR-a (kontrastain: DAPI) i ( c ) U937 / PR9 stanice ili neobrađene ili izložene 8 h do 100 μM ZnS04, a zatim tretirane ili ne s 1 µM RA 72 sata prije IR-a (kontrastain: DAPI). Neki signali kolokalizacije istaknuti su i označeni unutar ćelije bijelim kvadratom. Konfokalne mikroskopske slike, uvećanje × 63; LCS Leica konfokalni mikroskop (Leica Microsystems)

Slika pune veličine

Imunoblotska analiza nadalje pokazala je da se u PML-RAR a- eksprimirajućim stanicama, ATM, NBN i CHK2 proteini fosforiliraju u odgovoru na IR, iako s odgođenom kinetikom (Slika 7a). Zapravo, fosforilacijski signal ATM-a, NBN-a i CHK2 dostigao je vrhunac nakon 3 sata od IR-a, a fosforilacija ATM-a vidljiva je do 24 sata od zračenja (slike 7a i b), dok je u stanicama koje izražavaju WT PML, ATM, NBN, i CHK2 proteini su fosforilirani nakon 0, 5 h od IR-a, a signal fosforilacije se nakon 3 i 24 sata snažno smanjio (slike 7a i b i dodatna slika S4A). Ovi podaci govore da je integritet PML-NBS potreban za ispravnu aktivaciju osi ATM-CHK2. 22 Nadalje, imunoblotska analiza pokazala je da nivo ekspresije H2AX, NBN i CHK2 i fosforilacija nisu utjecali u stanicama U937 / PR9 tretirane ili nisu sa ZnSO 4, zatim izložene cikloheksimidu i konačno ozračene, sugerirajući tako da sinteza de novo proteina nije uključena u oštećenjima DDR signalizacije otkrivenim u APL ćelijama (slika 7c).

Image

Fosforilacija ATM kinaze i njenih supstrata u stanicama koje eksprimiraju PML-RAR a . ( a ) Imunoblotska analiza pSer1981-ATM, pSer343-NBN i pThr68-CHK2 fosforilacije u APL blastima, NB4, NB4-MR4 i U937 / PR9 stanicama. Prethodne stanice IR, NB4 i NB4-MR4 bile su ili neobrađene, ili izložene 1 μM RA 72 sata, dok su stanice U937 / PR9 bile neobrađene ili izložene 8 h do 100 µM ZnSO 4, te su potom obrađene ili nisu 1 μM RA u toku 72 h. Stanice su tada bile izložene 1 Gy X-zraka i lizirane nakon 0, 5, 3 i 24 sata. ( b ) Imunoblot analiza ATM fosforilacije na Ser1981 ostatku nakon 24 sata iz IR u stanicama NB4 i U937 / PR9. ( c ) U937 / PR9 stanice najprije su obrađene sa 100 µM ZnS04, zatim izložene 10 µg / ml cikloheksimida, te na kraju ozračene s 1 Gy i lizirane nakon 0, 5 h. Imunobloti su izvedeni upotrebom antitijela anti- y- H2AX, anti-pSer343-NBN, anti-NBN, anti-pThr68-CHK2 i anti-CHK2. Predstavljene mrljice su primjer rezultata rezultata dobivenih iz dva neovisna pokusa

Slika pune veličine

Neispravno DSBS ispitivanje i popravak u preleukemičnom modelu miša APL-a

Da bismo procijenili ulogu PML-RAR α ekspresije u DSBS senziranju i signalizaciji in vivo , koristili smo preleukemski model APL (tj. PR miševa). 37 U ovom se modelu bolest razvija nakon dužeg kašnjenja, što sugerira da dodatne promjene surađuju s PML-RAR α za razvoj leukemije. Potvrdili smo da u Lin - HPC-u kod ovih miševa razina ekspresije RAR α i PML-RAR α nije utjecala na IR. Treba napomenuti da su razine γ- H2AX više u netretiranom PR-u u usporedbi s WT miševima (slike 8a i b).

Image

In vivo validacija DDR-a u preleukemijskom modelu miša APL-a. WT i preleukemijski miševi za PML-RAR a (PR) su ozračeni s 5, 5 Gy X-zraka i žrtvovani su nakon 0, 5, 3, 6 i 24 sata. Lin-stanice izolirane su iz koštane srži tri združena miševa. ( a ) Imunoblotska analiza ekspresije RAR α i PML-RARa i fosforilacije H2AX na ostatku Ser139, u netretiranim i ozračenim WT i PR miševima. ( b ) Reprezentativne slike dvostruke imunofluorescentne analize γ -H2AX (Alexa Fluor 488, zeleni fluorofor) i PML (Alexa Fluor 610, crveni fluorofor) žarišta u netretiranim i ozračenim WT i PR miševima. ( c ) Reprezentativne slike žarišta 53BP1 u netretiranim i ozračenim WT i PR miševima. ( d ) DSB-ovi za ponovno spajanje analizirani su kao srednja vrijednost γ- H2AX žarišta / stanica i kao postotak zaostalih DSB-a u netretiranim i ozračenim WT i PR miševima. Popravak DSBS je također analiziran brojenjem broja 53BP1 žarišta / ćelija u netretiranim i ozračenim WT i PR miševima. Srednje vrijednosti su dobivene analizom 100 stanica iz tri neovisna pokusa ± SD * P <0, 05, ** P <0, 01. ( e ) Reprezentativne slike dvostruke imunofluorescentne analize pSer1981-ATM (Alexa Fluor 488, zeleni fluorofor) i pSer343-NBN (Alexa Fluor 610, crveni fluorofor) žarišta u WT i PR miševima. ( f ) Imunoblot analiza ATM fosforilacije na ostatu Ser1981, NBN fosforilacija kod Ser343, CHK2 fosforilacija kod Thr68, DNA-PK fosforilacija kod Ser2056 i RAD51 ekspresija. Slika ćelije: svijetlo polje; slike konfokalne mikroskopije, uvećanje × 63; LCS Leica konfokalni mikroskop (Leica Microsystems)

Slika pune veličine

PRC miševi HP-ova pokazali su nuklearni uzorak PML-NB mikrospolno, čiji se broj povećao nakon ozračenja s 5, 5 Gy (Slika 8b). Kinetika i γ -H2AX defosforilacije i 53BP1 regrutovanja kod DSB-a kasnila je u preleukemijskim PR miševima u usporedbi s WT životinjama, uz postojanost značajno viših razina nepovrijeđenog oštećenja nakon 24 sata od IR-a ( P <0, 05; Slike 8b-d), Povrh toga, aktiviranje ATM-a kao i fosforilacija njegovih supstrata NBN i CHK2 kasne u PR miševima u usporedbi sa WT miševima (Slike 8e i f). Da bismo analizirali put popravljanja DSBS koji je aktivan u WT i PR miševima, pogledali smo stanje DNA-PK i RAD51 koji igraju ključne uloge u NHEJ popravku i HRR. Rezultati 9 pokazali su da DNA-PK nije fosforiliran nakon IR-a niti u WT niti u PR miševima, dok je RAD51 induciran u 3 sata na ozračenim WT miševima (Slika 8f). Ovi rezultati sugeriraju da PML-RAR α ekspresija smanjuje IR-induciranu aktivaciju HRR in vivo .

Rasprava

Poremećaj PML-NBs PML-RAR α odlika je APL-a, bolesti modela za razumijevanje leukemogenih putova usmjerenog onkoproteinom. 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 Ovdje izvješćujemo da PML-NB-ovi igraju ključnu ulogu u regulaciji ranih i kasnih koraka IR-induciranih DSB-a, senzoriranja, signalizacije i popravljanja mijeloidnih ćelija u vitro i in vivo . Ti događaji mogu ovisiti o staničnom kontekstu jer iscrpljivanje / prekomjerna ekspresija PML i ektopična ekspresija PML-RAR α u ne-hematopoetskim stanicama i čvrstim tumorima samo narušavaju kasne faze HRR-a. 16

Rezultati dobiveni na PML-RAR α preleukemijskom modelu miša snažno sugeriraju da je poremećaj PML-RARa izazvan PML-NBs povezan s oštećenjem DDR-a i predstavlja rani događaj u patogenezi APL-a. Dokazi dobiveni u mijeloidnim stanicama koje izražavaju ili ne PML-RAR α i u linijama mijeloidnih ćelija rezistentnih na RA i sugeriraju da su reformacija PM-NBs i razgradnja onkoproteina uzrokovana RA, dva događaja koja pridonose terapijskom učinku RA u APL-u, čvrsto povezana. s obnavljanjem DDR u APL stanicama. Štoviše, naši rezultati ukazuju na izravno uključivanje RA vezivanja za endogeni PML-RAR α u obnavljanju integriteta PML-NB i DDR.

U skladu s prethodnim nalazima dobivenim u APL staničnim linijama i u hematopoetskim prekursorima miševa koji su eksprimirali PML-RAR α , 14, 38, pokazali smo da su primarni APL blasti i Lin - HPC iz PR miševa karakterizirani višom razinom γ- H2AX od onih koje se mogu detektirati u normalnim ljudskim i mišjim HPC-ima. Zanimljivo je da su visoke razine γ -H2AX žarišta pronađene u ljudskim tumorima i kultiviranim stanicama, 39 tijekom S faze staničnog ciklusa i tijekom apoptoze. 34 Čini se da analiza staničnog ciklusa u APL eksplozijama i u stanicama koje eksprimiraju PML-RAR α isključuje mogućnost da H2AX fosforilacija ovisi o postotku stanica u S fazi ili apoptotskim događajima. Zanimljivo, ekspresija PML-RAR α povećava sposobnost inhibitora histon deacetilaze (HDACi) da induciraju oštećenje i apoptozu DNA utječući na ekspresiju gena uključenih u mehanizam popravljanja DNA. 38 Ovo može objasniti HDACi selektivnost u izazivanju smrti karcinoma u određenim transformiranim stanicama. 40

Kako γ -H2AX predstavlja biomarker DSB-a, ali ne i funkcionalnu komponentu DDR-a, 2, 3, 4, dodatno smo analizirali DSBS-senzor pomoću 53BP1, proteina koji se akumulira unutar PML-NB-a i uključen je u popravak DSB-a. 41, 42 Analiza vremenskog tijeka zapošljavanja 53BP1 na DSB-u in vitro i in vivo modela APL pokazala je da poremećaj PML-NB usporava njegovo zapošljavanje u DSB-ovima nakon IR-a. 53BP1 bio je nasumično povezan s PML-NBs i njegova raspodjela unutar jezgre ovisila je o integritetu PML-NBs. Nadalje, primijetili smo da u mijeloidnim stanicama broj 53BP1 i PML asocijacija slijedi profil ponovnog spajanja DSB, što ukazuje na povezanost dvaju proteina u DSB žarištima in vivo . Doista, opaženo je oštećenje 53BP1 na oštećena mjesta u PML-RAR α- eksprimirajućim stanicama, pri čemu se odgovarajućom lokalizacijom ponovo uspostavio tretman RA.

Sveukupno, naša otkrića sugeriraju da ekspresija PML-RAR α fuzijskog proteina uništavanjem integriteta PML-NBS usporava ponovnu spajanje kinetike DSBS u ljudskim APL eksplozijama i staničnim linijama te u hematopoetskim potomcima iz mišjeg modela APL. To može doprinijeti postojanju većeg broja žarišta γ -H2AX i 53BP1 u duljim vremenskim intervalima od IR u stanicama APL (u usporedbi s mijeloidnim progenitorima koji izražavaju normalan PML protein i PML-NB), što nalikuje manjku u popravljanju određenog podskupina od DSB opisanih u stanicama koje su oštećene DDR. 43 Kako su PML-NB definirani kao košare koje sadrže bjelančevine uključene u DSBS odgovor, njihov poremećaj može uzrokovati paneuklearnu disperziju DDR proteina i posljedično oštećenje privezavanja DSBS. 10, 11, 13, 15, 16, 44

Poremećaj PML-NB ekspresije PML-RAR α ne povećava kromosomsku nestabilnost u NB4 stanicama koje su tretirane ili nisu sa RA i / ili IR, iako je predložena kompromitirana sposobnost održavanja genomske stabilnosti kao dio patogeneze APL-a. 16 Većina somatskih događaja u APL genima izgleda kao slučajna mutacija u hematopoetskim stanicama koje su stekle PML-RAR α inicirajući događaj. 45, 46 Širok spektar stečenih i ponavljajućih kromosomskih poremećaja, koji mogu djelovati kao sekundarni događaji i mogu objasniti leukemogenezu APL-a, zabilježeni su analizom s nukleotidnom polimorfizmom visoke rezolucije (SNP-A) u ~ 50% podudarnoj dijagnozi i remisiji uzorci iz 48 slučajeva APL. Ove genetske nepravilnosti konvencionalna citogenetika nije bila otkrivena. 47 Gotovo 90% ovih lezija nije bilo isključeno od APL-a, već su se ponavljale u akutnim mijeloidnim leukemijama bez APL-a i drugim hematološkim novotvorinama. 47, 48, 49, 50 Značajno su mutacije prisutne u ljudskim leukemijama također identificirane sekvenciranjem APL mišjeg genoma. 51 Dakle, PML-RAR α inicirajući događaj može biti potreban, ali nije dovoljan da uzrokuje APL; mogu se pojaviti dodatni pogoci, uglavnom nepoznati i možda povezani s HPC-ovim sposobnostima ispravnog popravljanja DNK lezija, 52 i na kraju dovesti do klonskog širenja leukemijskih eksplozija.

PTM-ovi reguliraju više bioloških funkcija PML-a i demontaže i obnove PML-NBS-a tijekom DDR-a 21, a zauzvrat PML-NB-i reguliraju PTM nuklearnih proteina ovisnih o ATM i ATR kinazama. 11, 12, 13, 53 U ovom kontekstu, naši rezultati sugeriraju postojanje mehanizma povratne sprege između PML-NB i osi ATM – NBN – CHK2 u odgovoru DSBS. Uz izravnu ulogu ovih proteina u modulaciji PML-NB uloga u IR-induciranom DSBS odgovoru, 11 PML-NBS integriteta može biti potrebno za brzo aktiviranje DSBS osjetila, signalizacije i popravka. Naši rezultati ističu da poremećaj PML-NBS PML-RAR α snažno utječe na aktivaciju ATM-a, kao i na CHK2 i NBN fosforilaciju. To sugerira da je integritet PML-NB potreban za pravilno osjećanje DSB-a kako bi se aktivirao ATM i omogućila fosforilacija proteina ovisna o ATM-u lokalizirana unutar PML-NB-a. 11, 12, 52 Odloženo zapošljavanje 53BP1 u DSB-u u PML-RAR α- ekspresijskim stanicama, u kojima se nalaze poremećeni PML-NB, zajedno s oštećenim porastom razine RAD51 u PR miševima, sugerira da HRR mehanizam olakšava netaknuti PML -NB in vivo .

Podaci ovdje dobiveni u ljudskim primarnim APL blastima i u mijeloidnim stanicama, dodatno potvrđeni u preleukemijskom modelu miša APL-a, istaknuli su relevantnu ulogu PML-NB-ova u koordiniranju i reguliranju DDR-a. Ovi rezultati dodatno osvjetljavaju događaje koji su se dogodili na početku APL-a, sugerirajući da izraz PML-RAR α remeti PML-NB, uzrokuje oštećenje DNK i odgovoran je za kvar u ranim i kasnim fazama DDR-a koji u zaokret igraju ulogu u patogenezi i progresiji APL-a.

Dodatna informacija

Word dokumenti

  1. 1.

    Dodatna informacija

Datoteke slika

  1. 1.

    Dopunska slika 1

  2. 2.

    Dopunska slika 2

  3. 3.

    Dopunska slika 3

  4. 4.

    Dopunska slika 4

Glosar

APL

akutna promielocitna leukemija

DDR

Odgovor oštećenja DNA

DSB

Slom dvostrukog lanca DNA

IR

Ionizirana radiacija

γ- H2AX

H2AX fosforilacija kod Ser139

HDACi

inhibitor histon deacetilaze

HPC

hematopoetski potomci

HRR

homologni popravak rekombinacije

IRIF

žarišta izazvana ionizirajućim zračenjem

mFISH

višebojne RIBE

NHEJ

nehomološko krajnje spajanje

PML

promielocitna leukemija

PML-NB

PML nuklearno tijelo

PTM

post-translacijska modifikacija

RA

all- trans retinoična kiselina

Dodatne informacije nalaze se u ovom radu na web stranici Cell Death and Disease (//www.nature.com/cddis)