Porphyromonas gingivalis gingipaini uzrokuju neispravnu migraciju makrofaga prema apoptotskim stanicama i inhibiraju fagocitozu primarnih apoptotskih neutrofila | stanična smrt i bolest

Porphyromonas gingivalis gingipaini uzrokuju neispravnu migraciju makrofaga prema apoptotskim stanicama i inhibiraju fagocitozu primarnih apoptotskih neutrofila | stanična smrt i bolest

Anonim

teme

  • Bakterijska infekcija
  • Migracija stanica
  • patogeneza
  • parodontitis

Sažetak

Parodontna bolest je prevladavajuće kronično upalno stanje karakterizirano odstupnim odgovorom domaćina na biofilm patogenih plakova što rezultira lokalnim oštećenjem tkiva i frustriranim zacjeljivanjem što može rezultirati gubitkom zuba. Cisteinske proteaze (gingipaini) ključnog parodontalnog patogena Porphyromonas gingivalis uključene su u patogenezu parodontne bolesti inhibiranjem rezolucije upale i povezane su sa sustavnim kroničnim upalnim stanjima kao što je reumatoidni artritis. Učinkovit klirens apoptotičkih stanica je važan za rješavanje upale i obnavljanje tkiva. Ovdje smo pokušali karakterizirati urođeni imunski klirens od apoptotskih stanica i njihovu modulaciju gingipainom. Ispitali smo sposobnost makrofaga liječenih gingipainom da migriraju prema apoptotskim stanicama i fagocitozama. Liječenje gizipainom lizinom makrofaga oslabilo je migraciju makrofaga prema apoptotskim neutrofilima. Nadalje, liječenje lizin gingipainom smanjilo je površinsku ekspresiju CD14, ključnog receptora makrofaga za apoptotske stanice, što je rezultiralo smanjenom interakcijom makrofaga s apoptotskim stanicama. Pored toga, dok se pokazalo da apoptotičke stanice i njihovi izvedeni tajkom inhibiraju TNF- a- induciranu ekspresiju lipoposaharidom P. gingivalis , pokazali smo da pripravci gingipaina induciraju brzi upalni odgovor u makrofazima koji su bili otporni na protuupalni učinak apoptotskih stanica ili njihova tajna. Uzeti zajedno, ovi podaci pokazuju da P. gingivalis može poticati kroničnu upalu koju viđaju pacijenti s parodontnom bolešću pomoću više mehanizama, uključujući brzu, snažnu upalu posredovanu gingipainom, zajedno s cijepanjem receptora što dovodi do neispravnog čišćenja apoptotskih stanica i smanjenog protuupalnog odgovora., Stoga gingipaini predstavljaju potencijalnu terapijsku metu za intervenciju u liječenju kronične parodontne bolesti.

Glavni

Čvrsto regulirana homeostaza tkiva važan je fiziološki proces, koji se održava finom ravnotežom stanične proliferacije, diferencijacijom stanica i staničnom smrću. Proces apoptoze koji nastaje tijekom upalnog odgovora podupire razrješenje upale izlučivanjem protuupalnih citokina i molekula koje razrjeđuju propuste, a koje blokiraju daljnju infiltraciju u stanicu i potiču regrutovanje fagocita koji obnavljaju homeostazu tkiva. Nedavno djelo pokazuje da razni faktori promiču uklanjanje apoptotskih stanica (AC) i da oni posreduju različite faze u složenom višestupanjskom procesu čišćenja apoptotskih stanica profesionalnim apoptotičkim ćelijama izvedenim izvanstaničnim vezikulama i topivim faktorima (u zajednici poznat kao apoptotska stanica secreome) može promicati regrutovanje fagocita na mjesta stanične smrti, nakon čega interakcije ligand i receptori omogućuju privezanje i propadanje staničnih leševa. 3, 4, 5, 6 Neuspjeh u bilo kojem od stadija AC klirensa može dovesti do upalne bolesti kao posljedice sekundarne nekroze AC, zbog oslobađanja unutarćelijskih antigena i imunološke stimulacije. 7, 8, 9

U usnoj šupljini gingivalna tkiva izložena su širokom rasponu mikroorganizama. Dokazi govore da lokalna apoptoza tkiva pokreće regulaciju imuno-upalnih reakcija koje nastaju kao odgovor na mikrobe koji proizvode protuupalne signale koji utječu na fagocite na mjestu infekcije. 10 Neispravna kontrola upalnog odgovora u ovom složenom mikrookolju može dovesti do kronične, hiper-upalne bolesti parodontitisa. Značajno je da je Porphyromonas gingivalis povezan s izazivanjem i širenjem ovog nesavjesnog odgovora domaćina. 11 Nerazlučivi hiper-upalni odgovor rezultira lokalnim oštećenjem tkiva i, na kraju, gubitkom zuba. Bolest je također povezana s nekoliko kroničnih upalnih sustavnih bolesti. Navodno P. gingivalis smanjuje upalni odgovor domaćina, što podupire patogenezu parodontalne bolesti. 12, 13, 14

Niz faktora virulencije izražava se P. gingivalis , uključujući važne cistein-proteaze gingipaine, koji mogu biti specifični za arginin (RgpA i RgpB) ili za lizin (Kgp). Gingipaini igraju glavnu ulogu u nastanku upale pomoću više mehanizama, uključujući: izmjenu sustava komplementa; aktivnost matriks metaloproteinaze; neutrofilna funkcija; vaskularna struktura i reakcije parodontalnog tkiva; razina receptora mreže domaćina i receptora stanične površine. 15 Značajno je da gingipaini cijepaju receptore prepoznavanja ključnih obrazaca, 16, 17 za koje se pokazalo da posreduju u prepoznavanju i uklanjanju AC. 18 Dosadašnji rad je također pokazao da proizvodi P. gingivalis mogu modulirati AC klirens kroz višestruke promjene na površini apoptotske stanice. 19 Ovdje se bavimo hipotezom da gingipaini potiču napredovanje bolesti djelujući tako da inhibiraju više faza procesa uklanjanja AC. Procjenjujemo učinak gingipaina na sposobnost makrofaga da identificiraju AC, interakciju s AC i uklanjanje AC te reagiraju na rješavanje upale. Ova studija stoga pruža nove uvide u potencijalne mehanizme važne u progresiji parodontitisa.

Rezultati

Pročišćavanje i karakterizacija proteolitičkih enzima iz P. gingivalis

Preliminarni eksperimenti za izolaciju gingipaina provedeni su korištenjem dva soja P. gingivalis (sojevi W83 i HG66). Kulture su frakcionirane i prisutnost gingipaina ocijenjena je korištenjem ispitivanja aktivnosti proteaze u membrani, supernatantu kulture i frakcijama vanjske membrane (Slike 1a i b). Ova ispitivanja otkrila su da su oba oblika gingipaina (Rgp i Kgp) puštena u supernatant kulture u znatno višim aktivnim količinama soja HG66 u usporedbi sa sojem W83 (Slika 1a). Nakon toga, supernatanti kulture iz soja HG66 korišteni su kao izvor i Rgp i Kgp, a enzimi su pročišćeni pomoću gel filtracije i afinitetne kromatografije sa Sephadex G-150 i arginin-Sepharose. Nakon pročišćavanja, aktivnost cisteinske proteaze potvrđena je korištenjem specifičnog inhibitora TLCK, koji je specifičan za tripsin slične proteaze kao što su Kgp i Rgp (slika 1b). Analiza molekularne mase (Slika 1c) pročišćenih proteina pokazala je jednu glavnu vrpcu za Kgp i dvostruku vrpcu za Rgp predviđene molekularne mase ≃ 60 kDa, odnosno ≃ 50 kDa, respektivno. 20, 21 Pročišćavanje gingipaina potvrđeno je masenom spektrometrijskom analizom (dopunska tablica 1). Kontaminacija lipopolisaharida (LPS) procijenjena je unutar pročišćenih frakcija gingipaina primjenom testa Limulus amoebocita lizata, koji je potvrdio prisutnost endotoksina u razinama 2, 9 U / ml (RgpB) i 1, 9 U / ml (Kgp). Nakon uspješnog pročišćavanja gingipaina, procijenjen je utjecaj ovih važnih enzima koji potiču od patogena na uklanjanje AC.

Image

Određivanje amidolitičke aktivnosti i molekulske težine pročišćenih proteolitičkih enzima iz P. gingivalis . Sojevi W83 ili HG66 su uzgajani i kulture frakcionirane kako je opisano. Amidolitička aktivnost enzima procijenjena je ( a ) za Rgp aktivnost prema Bz-L-Arg-pNA (lijeva ploča) i za Kgp aktivnost prema ZL-LYS-pNA (desni panel) za: ekstrakt stanične membrane (crna traka), supernatant kulture bez stanica (bijela traka) i frakcije vanjske membrane (siva traka). Statistički testovi usporedili su razlike između sojeva. Enzimi su pročišćeni kromatografijom. ( b ) Uspoređuje inhibiciju TLCK kao mjeru aktivnosti cisteinske proteaze u pročišćenim gingipainima. ( c ) SDS-PAGE elektroforeza P. gingivalis HG66 pročišćenog Rgp i Kgp gingipaina. Statističke analize provedene su korištenjem ANOVA praćene Bonferroni post hoc- testom * P <0, 05, ** P <0, 01, *** P <0, 001. Prikazani podaci su prosječni ± SEM za tri neovisna pokusa bakterijske kulture log faze koje su uzgajane u trajanju od 24 sata (OD 600 nm)

Slika pune veličine

Gingipaini smanjuju ekspresiju CD14, receptora čišćenja apoptotičkih stanica

Raspon receptora fagocita uključen je u prepoznavanje AC i CD14, važne urođene imunološke komponente, identificiran je kao ključni vezivni receptor za AC. Naše prethodne studije pokazale su da humana monocitna stanična linija THP-1, kada je diferencirana, daje učinkovit model za proučavanje uloge makrofaga (MØ) u AC klirensu i za procjenu uloge citokina i drugih upalnih posrednika koji se oslobađaju tijekom taj proces. 5, 24, 25 Da bismo razumjeli utjecaj gingipaina na ekspresiju važnih receptora fagocita, ispitali smo ploču urođenih imunoloških receptora na fagocite prije i nakon liječenja gingipainima.

THP-1 stanice tretirane dihidroksivitaminom D3 (VD3) korištene su kao modelni fagocit, koji izražava visoku razinu CD14, koji je funkcionalan za klirens AC. 5, 24 MØ ili primarni humani neutrofili (NØ) tretirani su pročišćenim RgpB ili Kgp, a ekspresija panela molekula (CD14, CD36, ICAM-3 i CD91) za koje je poznato da posreduju AC klirens procijenjena je pomoću indirektne imunofluorescencije i protočne citometrije (Slika 2a). Kgp je posebno smanjio ekspresiju CD14, ali ne i ICAM-3 ili CD36, na površini i MØ i NØ s 1 h tretmana. Međutim, iako je Rgp također specifično smanjio ekspresiju CD14 na NØ uz tretman od 1 h, bilo je potrebno produženo razdoblje inkubacije da bi se vidjelo isto smanjenje na MØ (slika 2b), smanjenje koje nije bilo povezano s gubitkom MØ održivosti (dopunska slika 1). Pored toga, brzo smanjivanje CD14 uočeno na MØ-tretiranom Kgp-om spasilo se pomoću specifičnog inhibitora TLCK (slika 2c), što sugerira da se gingipaini cijepaju CD14. Ono što je presudno, takav tretman gingipainom MØ nije inducirao otkriti citotoksičnost (slika 2d). Ovi podaci sugeriraju da su gingipaini sposobni za specifično cijepanje receptora za vezivanje apoptotske stanice CD14, podaci u skladu s prethodnim izvještajima. 16, 26, 27

Image

Pročišćeni gingipaini cijepaju CD14 s površine makrofaga i NØ. ( a ) MØ ljudske primarne NØ ili THP-1 dobivene MØ tretirane su naznačenim pročišćenim gingipainima 1 sat na 37 ° C prije neizravnog bojenja imunofluorescencije za receptore / ligande upletene u apoptotski ćelijski klirens. Razine fluorescencije prikazane su kao postotak stanica pozitivnih na antigen (lijevo) i srednjeg intenziteta fluorescencije (desno). ( b ) MØ dobivene THP-1 ćelije dobivene su Rgp do 12 h na 37 ° C prije indirektnog bojenja imunofluorescencije za CD14 u naznačeno vrijeme. Razine fluorescencije prikazane su kao postotak stanica pozitivnih na antigen i srednjeg intenziteta fluorescencije. ( c ) MØ su tretirane s Kgp 1 sat u prisutnosti ili odsutnosti inhibitora TLCK prije procjene CD14 ekspresije protočnom citometrijom. ( d ) Reprezentativne protočne citometrijske analize MØ ili NØ izvedenih THP-1 tretirane s RgpB ili Kgp 1 sat na 37 ° C i obojene aneksinom V i propidijevim jodidom kako bi se otkrila vitalnost stanica. Prikazani podaci o protoku prikupljeni su iz najmanje 5000 događaja. Podaci su prosječni ± SEM za najmanje tri neovisna pokusa. Statistička analiza izvršena je primjenom ANOVA-e, a potom Bonferronijevim post-hoc- testom. ** P <0, 01; *** P <0, 0001 u usporedbi s neobrađenim stanicama

Slika pune veličine

Gingipaini inhibiraju usmjerenu migraciju fagocita u AC

Kako su prethodni rezultati pokazali specifično i brzo cijepanje CD14 od strane gingipaina, naknadno smo procijenili utjecaj toga na učinkovito čišćenje AC. Ovdje smo procijenili utjecaj liječenja gingipainom kako na migraciju fagocita prema umirućim stanicama, tako i na uklanjanje staničnih leševa.

Da bi se razmotrio učinak gingipaina na migraciju MØ, THP-1 MØ tretirani su u početku s Kgp jer brzo djeluje na MØ receptore (slika 2a), a zatim su izloženi AC kulturama (primarni NØ ili Burkitt limfom (BL) stanice u vodoravnom položaju) Dunn sustav kemotaksije. Prije smo pokazali da apoptotičke BL stanice služe kao relevantan model za proučavanje vezanja i unosa fagocita 5, 22, te su korištene kao pozitivna kontrola. Migracija fagocita zabilježena je 2 sata na 37 ° C pomoću vremenske mikroskopske video snimke (slika 3). Fagociti su bili jasno pokretni tijekom cijelog razdoblja ispitivanja čak i u nedostatku pretpostavljenog atraknata (lijeva ploča, slike 3a i c). Međutim, kada su fagociti bili izloženi apoptotskim NØ (srednja ploča, slika 3a) ili apoptotičkim B stanicama (srednja ploča, slika 3c), vidljivo je brzo i usmjereno kretanje MØ. MØ liječen Kgp-om nastavio je migrirati, međutim, migracija fagocita liječenih gingipainom prema AC značajno je smanjena (desni panel, slike 3a i c). To je pokazao smanjeni indeks migracije naprijed za apoptotične BL stanice i primarni apoptotski NØ u usporedbi s neobrađenom MØ migracijom prema izmjeničnom strujanju (slike 3b i d). Ono što je također važno, ostale mjere migracije (konkretno brzina, akumulirana udaljenost i euklidska udaljenost) nisu bile pogođene (dopunska slika 2). Stoga je tretman MØ-om s Kgp značajno smanjio samo usmjeravanje migracije MØ prema stanicama koje umiru, što je oslabilo učinkovitu regrutaciju MØ-a za umiranje stanica. Daljnje studije upotrebljavale su vertikalni sistem migracije za rješavanje daljnje migracije MØ nakon liječenja gingipainom. Ova istraživanja pokazuju da Rgp tretman također inhibira MØ migraciju u apoptotski NØ (slika 3e).

Image

Gingipaini inhibiraju migraciju makrofaga prema AC. MØ-stanice dobivene iz THP-1 izložene su sumnjivim atraktantima u horizontalnom ili vertikalnom testu migracije. Za horizontalni pokus ( a - d ), MØ su posijane na staklene pokrivače i tretirane ili neobrađene gingipainovima prije utovara u Dunn horizontalnu komoru i izložene potencijalnim atraktantima ( a - d ). Migracija MØ praćena je 2 sata na 37 ° C pomoću video-mikroskopije s vremenskim odmakom. Migracija 40 stanica po ispitivanju izmjerena je korištenjem ImageJ i Ibidi Chemotaxis and Migration Tool (V2.0). Ruta putovanja MØ prikazana je linijom od početne točke (postavljene na poprečnim dlačicama parcele) do konačnog MØ položaja nakon 2 sata (crna točka). Relativno mjesto izmjenične struje bilo je na vrhu parcele (crni dijamant). ( a ) Reprezentativne parcele koje prikazuju: lijeva ploča: neobrađena MØ (MØ) migracija s kontrolom, medij bez ćelija kao potencijalno privlačno sredstvo za otkrivanje bazalnih razina migracije MØ. Središnja ploča: neobrađena MØ (MØ) migracija s apoptotičkim NØ kao privlačnim sredstvom. Desna ploča: MØ (Kgp-MØ) liječen Kgp migracijom s apoptotičkim NØ kao atraktantom. ( b ) Naprijed migracijski indeks (Y FMI) za kvantificiranje migracije MØ u smjeru od navodnog gradijenta. ( c ) Reprezentativne parcele koje prikazuju: lijeva ploča: neobrađena MØ (MØ) migracija s kontrolom, medij bez ćelija kao potencijalno privlačno sredstvo za otkrivanje bazalnih razina migracije MØ. Središnja ploča: neobrađena MØ (MØ) migracija s apoptotičkim B stanicama kao atraktantima. Desna ploča: MØ (Kgp-MØ) tretirana s Kgp migracijom s apoptotičkim B stanicama kao atraktantima. ( d ) Naprijed migracijski indeks (Y FMI) za kvantificiranje migracije MØ u smjeru pretpostavljenog gradijenta. ( e ) Za test vertikalne migracije, MØ (neobrađen ili tretiran gingipainom) posijan je u prorez iznad donjeg bušotina koji sadrži sekreom iz apoptotske NØ i MØ migracije u donju komoru procijenjen nakon 10 sati brojenjem stanica. Podaci prikazani u ( b i d ) reprezentativni su za četiri različita pokusa s dvije replike u svakom pokusu. Statistička analiza provedena je pomoću ANOVA-e, a potom Bonferroni post-hoc -test * P <0, 05, ** P <0, 01, *** P <0, 001

Slika pune veličine

Gingipaini inhibiraju interakciju AC s MØ

Neefikasno uklanjanje apoptotičkog NØ može rezultirati značajnim oštećenjem parodontalnog tkiva ako ih MØ ne očisti brzo. 28

Prethodni rad pokazao je važnost CD14 kao vezivnog receptora za izmjeničnu struju upotrebom životinja s manjkom anti-CD14 mAbs 22, 23 ili CD14. 29 Ove su studije pokazale da se MØ CD14 veže za, do sada još neidentificirane, ligande na površini širokog raspona izmjeničnog napona. S obzirom na smanjenje ekspresije CD14 posredovanog gingipainom (slika 2) procijenjen je utjecaj liječenja gingipainom na uklanjanje AC. THP-1 MØ kokultivirani su s AC (BL ili NØ) i postignuta je razina interakcije AC-MØ i uspoređena s ekvivalentnom MØ gingipainom. Fotomikroskopija otkrila je dokaze o MØ interakciji s izmjeničnom strujom (slika 4a), gdje je "interakcija" definirana kao izmjenična ili fagocitozirana izmjenična struja, bez obzira na broj izmjenične ili internalizirane na izmjeničnu struju. Kad je postignuta ova razina interakcije, bilo je jasno da je postotak MØ koji su reagirali s apoptotičkim NØ stanicama značajno smanjen nakon liječenja gingipainom MØ (lijeva ploča, slika 4b). Taj je učinak bio vidljiviji kod bodovanja srednjeg broja izmjeničnih vrijednosti po MØ (desna ploča, slika 4b). Međutim, kada su korištene apoptotske BL stanice, gingipaini nisu uzrokovali pad interakcije (lijeva ploča, slika 4c), što je posljedica njihovog neuspjeha da potpuno inhibiraju interakciju apoptotskih BL stanica s MØ. Jasan učinak inhibicije gingipaina primijećen je, međutim, kada je postignut srednji broj AC po MØ (desni panel, slika 4c). U tim ispitivanjima oba su gingipaina ispitivana smanjenim AC zračenjem što ukazuje da se ovaj efekt ne posreduje isključivo smanjenom ekspresijom CD14 jer je u ovom vremenskom okviru samo Kgp smanjio površinske razine MØ CD14. Važno je da liječenje gingipainom nije imalo značajnog utjecaja na održivost MØ (dopunska slika 1).

Image

Liječenje Gingipainom MØ inhibira interakciju MØ s apoptotskim NØ i apoptotičkim BL stanicama. MØ dobiveni THP-1 tretirani su ili neobrađeni gingipainima prije ko-kulture s AC tijekom 1 sata. ( a ) Fotomikrografije Jenner-Giemsa obojene neobrađenom ili gingipainom tretiranom THP-1 dobivenom MØ staničnom MØ u interakciji s apoptotskim BL stanicama (AC BL) ili primarnim apoptotičkim NØ (AC NØ). Neobrađen THP-1 MØ koji prikazuje privezivanje i fagocitoziranje apoptotičkih BL (gornja lijeva ploča) i NØ (donja lijeva ploča). THP-1 MØ tretiran gingipainom (Rgp: središnje ploče; Kgp: desni paneli) koji pokazuje interakciju s manje apoptotskih BL stanica (gornja ploča) i NØ (donja ploča) s povećanim brojem nevezanih / nefagocitoziranih, vanćelijskih izmjeničnih AC (strelice) ). THP-1 MØ može se vidjeti u svijetloplavoj boji, a na AC su obojene karakteristično intenzivno plavo. Strelice u donjem desnom zaslonu pokazuju primarne apoptotičke NØ koje ne preuzimaju fagociti. Sve slike snimljene su pri × 40 uvećanju. ( b ) Histogrami koji prikazuju postotak MØ koji djeluje (vezanje ili fagocitoziranje) s apoptotskim NØ stanicama (lijeva ploča) ili prosječni broj AC po MØ (desni panel) sa ili bez tretmana gingipainom MØ ili ( c ) histograma koji prikazuje postotak interakcije MØ (vezivanje ili fagocitoziranje) s apoptotskim BL stanicama (lijeva ploča) ili srednji broj AC po MØ (desni panel) sa ili bez Gingipain tretmana MØ. Prikazani podaci su prosječni ± SEM za najmanje tri neovisna pokusa. Statistička analiza provedena je pomoću ANOVA-e, a potom Bonferroni post-hoc- test: *** P <0, 001

Slika pune veličine

Proizvodnju TNF- a od strane MØ kao odgovor na P. gingivalis LPS inhibira AC ili njihovi izvedeni secreomi

AC klirens poznat je po svom neflogističkom fenotipu, a za AC se široko javlja da ima snažne protuupalne učinke za promicanje rješavanja upale. 30, 31, 32 Da bi se istražila priroda upalnih reakcija MØ u prisutnosti AC, proizvodnja MØ TNF- a kao odgovora na LPS iz P. gingivalis procijenjena je u prisutnosti ili odsutnosti apoptotskih NØ ili apoptotičkih BL stanica. Nadalje, poznato je da AC oslobađa niz faktora (tajnogome), uključujući apoptotske ćelije izvedene izvanstanične vezikule, u svoj supernatant koji može modulirati klirens apoptotičkih stanica. 3, 5, 6, 33 P. gingivalis LPS bio je sposoban izazvati snažnu proizvodnju TNF- a koja je bila inhibirana nakon inkubacije MØ bilo s AC ili s njihovim derivatnim tajinom (slika 5a). To sugerira da je moguće da AC ima dominantan protuupalni učinak na produkciju TNF- a induciran patogenom P. gingivalis .

Image

Apoptotski NØ inhibira LPS-induciranu, ali ne i gingipainsku proizvodnju ( a ) MØ (VD3 / PMA) koji je dobiven THP-1 ko-kultivirani su s AC (NØ ili BL) ili njihovim izvedenim tajkama 18 sati prije dodatak LPS-a iz P. gingivalis . Nakon 4 sata stimulacije, proizvodnja TNF- a procijenjena je primjenom ELISA. ( b ) MØ-derivirani THP-1 (crni: diferencirani VD3 THP-1; sivi: THP-1 diferencirani VD3 / PMA) tretirani su naznačenim gingipainom 1 sat neposredno prije ELISA-e za proizvedeni TNF- a . ( c ) MØ (VD3 / PMA) dobiven THP-1 ko-kultiviran s AC (NØ ili BL) ili njihovim izvedenim tajkama 18 sati prije tretiranja gingipainom iz P. gingivalis u ELISA za dobiveni TNF- a . Prikazani podaci su prosječni ± SEM za tri neovisna pokusa. Statistička analiza provedena je pomoću ANOVA-e, a potom Bonferroni post-hoc- test: ** P <0, 01, *** P <0, 001

Slika pune veličine

Gingipaini induciraju stvaranje TNF- a pomoću MØ koji ne inhibira AC

Razmatrajući učinke gingipaina na sposobnost AC da modulira upalu, primijetili smo da je samo liječenje gingipainom od MØ bilo dovoljno za indukciju proizvodnje TNF- a u samo 1 sat (slika 5b). Ovaj je efekt opažen kod dva različita modela MØ-a (VD3 ili PMA / VD3) izvedenog od THP-1, za koji se zna da imaju duboko različitu osjetljivost na LPS (dopunska slika 3). 24 Značajno je da su reakcije ovih stanica na pripravke gingipaina bile slične, što ukazuje da otkriveni upalni odgovor nije bio uzrokovan LPS kontaminacijom preparata gingipainom. Ovo opažanje povećava mogućnost da kronična upala može proizaći iz izravnog djelovanja gingipaina na pro-upalne reakcije, a ne samo posrednim učincima (npr., Inhibiranim uklanjanjem AC).

S obzirom na ovu unutarnju indukciju upale, zanimalo nas je razmotriti sposobnost AC ili njihovih izvedenih tajimeta da moduliraju ovaj odgovor. U skladu s prethodnim eksperimentima (slika 5a), MØ su tretirane s AC ili tajkomom prije dodavanja stimulanse za upalu (Rgp ili Kgp) i analize proizvodnje TNF- a . Iako AC ili njihovi izvedeni tajkomi inhibiraju stvaranje TNF- α izazvanog LPS-om (slika 5a), ove stanice ili njihovi sekreomi nisu imali sposobnost smanjenja upale izazvane gingipainom (Slika 5c). Ovi podaci povećavaju mogućnost da gingipaini induciraju lokalnu upalu tkiva koja je rezistentna na uobičajene mehanizme kojima je cilj promicanje rješavanja upale.

Ovdje uzeti podaci podržavaju tvrdnju da ključni gingivalni patogen P. gingivalis potiče upalu različitim mehanizmima. Oni uključuju inhibiciju klirensa apoptotičkih stanica djelovanjem gingipaina na mehanizme čišćenja apoptotskih stanica, uključujući CD14, i izravnom indukcijom gingipaina upale, što je rekreirajuće na uobičajene inhibitorne učinke apoptoze.

Rasprava

Prethodne studije pokazale su da je glavni faktor parodontne bolesti značajno proteolitičko djelovanje P. gingivalis, uključujući tri genska proizvoda koji kodiraju gingipaine. 26, 34, 35 U ovoj studiji karakteriziramo dva gingipaina (Kgp i Rgp) zbog njihove sposobnosti da moduliraju ključni događaj u rješavanju upale, odnosno brzom uklanjanju AC. Prvi put poduzimamo cjelovitiji pristup in vitro analizi AC klirensa i razmatramo utjecaj gingipaina ne samo na vezanje i fagocitozu AC, već i na migraciju fagocita prema stanicama leševa i njihovu imunološku modulaciju umiranjem Stanice. Migracija fagocita u AC ključni je događaj u procesu čišćenja koji se često zanemaruje u in vitro ispitivanjima uklanjanja AC.

Ovdje izvješćujemo o izolaciji Kgp i Rgp iz P. gingivalis primjenom utvrđenih metoda. Naše analize proteaznih aktivnosti u skladu su s uspješnom izolacijom u skladu s prethodnim radom. 20, 21, 34, 36

Parodontna bolest je kronično, nerazlučujuće upalno stanje koje karakterizira uporno neutrofilno djelovanje. Tijekom akutne upale, regrutovanje neutrofila prati neutrofilna apoptoza i brzi neflogistički klirens AC od strane MØ. Tok AC čišćenja složen je, višestepeni proces koji započinje s AC priopćavanjem njihove prisutnosti putem svojih tajometa (tj. Izvanstaničnih vezikula dobivenih iz apoptotičkih stanica i topivih faktora), koji djeluju kao "pronađi me" signal fagocitima (pregledano u br. 37). Nakon regrutacije fagocita, niz liganda, receptora i mostova molekula djeluje na vezanje i uklanjanje staničnih leševa (pregledano u ref. 37). Uz to, imunološka modulacija mikrookoline podržava prolupacijsko i protuupalno djelovanje. 38 S obzirom na važnost klirensa AC za kontrolu upale, pokušali smo definirati utjecaj gingipaina na ove procese kako bismo bolje razumjeli nedostatke koji mogu pridonijeti parodontnoj bolesti.

Zapošljavanje fagocita na mjestima stanične smrti je bitan proces za promicanje učinkovitog rješavanja upale. Ovdje pokazujemo da su MØ tretirani gingipainom manje direktni u njihovoj migraciji prema stanicama koje umiru. Iako naši podaci sugeriraju povezanost između gubitka CD14 i inhibirane migracije nakon tretmana proteazom, to formalno ne identificira uzročno-posljedičnu vezu. Zapravo, Rgp je duboko inhibirao MØ migraciju u trenucima kad je cijepanje CD14 bilo malo. Dakle, precizan molekulski mehanizam kojim se vrši ova inhibicija posredovana gingipainom ostaje u potpunosti rasvijetljen, međutim, i dalje ostaje mogućnost da se on posreduje putem CD14. Prethodni rad 33 sugerira da CD14 nije potreban za 'osjetanje' umiranja stanica iako studija nije procijenila usmjerenost kao što je ovdje proučeno. Uz to, nedavna izvješća o migraciji leukocita posredovanih CD14 39, 40 sugeriraju da uloga CD14 u migraciji makrofaga prema AC zaslužuje pomnu pozornost. Daljnja su ispitivanja potrebna za definiranje alternativnih mehanizama djelovanja, moguće posredovanih putem GPCR hemokinskih receptora, na primjer, proteinaze iz P. gingivalis cijepaju humani C5a receptor. 41 Prema tome, CX 3 CR1, koji potiče migraciju u AC, ili cijepanje receptora za tajne čimbenike (npr. Izvanstanične vezikule izvedene iz apoptotičkih stanica) koji također promiču migraciju 3, 5, 6, 33, mogu biti vjerojatni ciljevi gingipaina. Bez obzira na mehanizam, svako smanjenje usmjerene migracije vjerojatno će utjecati na tijek upale u parodontitisu. To može biti i mehanizam pomoću kojeg se pojavljuju sistemski učinci gingipaina, s loše kontroliranim pronalaskom MØ u cijelom tijelu.

Ovdje ćemo pokazati gingipains cijepanje MØ CD14 u skladu s prethodnim studijama. 16, 26 Samo liječenje LPS-om nije imalo takav učinak. Pokazujemo da Kgp cijepa CD14 brže od Rgp-a, u skladu s prethodnim opažanjima relativne aktivnosti gingipaina. 42 To može biti zbog prisutnosti hemaglutinin / adhezijske domene prisutne u Kgp, ali ne i RgpB. Naši podaci u korelaciji su s prethodnim kliničkim istraživanjima koja navode manju ekspresiju CD14 u uzorcima kroničnog parodontitisa nego u zdravim uzorcima parodontnog gingiva, što potvrđuje tvrdnju da ekspresija CD14 korelira sa zdravljem parodonata. 43 Takvo cijepanje unutar 1 sata nakon izlaganja proteazi povećava mogućnost brzog početka štetnih učinaka povezanih s gubitkom CD14. Pored toga, velika je vjerojatnost da se ostali receptori mogu cijepati iako nismo otkrili smanjenje ICAM-3, CD36 ili CD91. To je iznenađujuće, s obzirom na prisutnost vjerojatnih mjesta cijepanja gingipaina unutar proteinskih sekvenci, ali naglašava da pristupačnost mjesta cijepanja može biti ključna u određivanju može li se cijepiti bilo koji dati molekulski cilj. Zanimljivo je da pokazujemo i da se neutrofilni CD14 cijepa, što sugerira da ligandi na umirućim leukocitima mogu utjecati u parodontnom mikrookruženju. Prethodni rad sugerira da gubitak CD31 iz NØ tretiranog s Rgp, ali ne i Kgp, može promicati uklanjanje NØ od strane MØ. 19 Iako pokazujemo cijepanje CD14, vjerojatno je da su i drugi ligand / receptori cijepani i potpuna procjena svih molekularnih meta bila bi vrijedna.

Mehanizmi uklanjanja umirućih stanica pokazuju visoku razinu suvišnosti. 44 Međutim, CD14 je ključni vezivni receptor za AC 22 koji nije suvišan jer životinje s manjkom CD14 nose povećavanje postojanih staničnih leševa. 29 Zanimljivo je da su Truman i sur. 33 sugerira da MØ CD14 može biti reguliran tijekom migracije prema AC jer postaju sve kompetentniji za uklanjanje staničnih leševa. Uzeti zajedno, čini se da će brzo cijepanje CD14 i posljedično neuspjeh u učinkovitom uklanjanju izmjenične struje promicati neispravnu kontrolu upale u parodontitisu. Stanična perzistencija hiperaktivnog NØ iz gingivnog pukotina bolesnika s parodontitisom uzrokovat će kolateralno oštećenje tkiva 45, a neuspjelo uklanjanje aktiviranog NØ može uzrokovati uništavanje tkiva jer prolaze kroz sekundarnu nekrozu, što dovodi do oštećenja parodontopatija. 28 Naše istraživanje povezano je i s prethodnim istraživanjima koja ukazuju na razinu nekrotične stanice, vjerovatno kao rezultat neuspjelog čišćenja, u NØ; 46, 47 uz oslobađanje razornih hidroliznih enzima 48, 49, 50 koji se nalaze u gingivalnoj krevikularnoj tekućini iz aktivne faze parodontitisa. Oni podržavaju ideju da će neuspjeh u prenošenju apoptotskog NØ nakon cijepanja gingipaina specifičnih receptora, na primjer, CD14, potaknuti nekrozu što rezultira razaranjem matrice vezivnog tkiva u parodontitisu.

Također je primjetno da su prethodna istraživanja također pokazala da cijepanje CD14, pomoću humane neutrofilne elastaze, može inhibirati klirens AC 51, iako je bio potencijal za inhibiciju proteaze, davanjem inhibitora, da se dobije djelotvoran AC koji pruža jasnu terapijsku racionalu unutar parodontna bolest. Nadalje, ovo prethodno djelo naglašava vjerojatnu važnost cijepanja CD14 na staničnu funkciju fagocita.

Ravnoteža protuupalnih i prorevolucijskih / protuupalnih staničnih odgovora odlučit će o prirodi i trajanju upalnog odgovora u tkivu. Utvrđeno je da AC imaju snažne protuupalne učinke 30, 31 i da pojava upale pokreće događaje koji u konačnici potiču razrješenje. 38 Ovdje smo procijenili sposobnost apoptotskog ljudskog NØ i njihovog izvedenog sekreta da inhibiraju upalu inducirane P. gingivalis LPS-om. U skladu s prethodnim izvještajima pomoću E. coli LPS, 24, 30, 31, 32 primijetili smo snažan protuupalni učinak koji sugerira da će umiruće stanice u parodontu zaraženom P. gingivalis trebale biti sposobne promicati razrješenje upale. However, we noted that gingipain treatment of MØ alone was sufficient to induce inflammatory responses. Recently, gingipains have been reported to promote monocyte inflammatory responses 52 via protease-activated receptors and Toll-like receptors/NOD-like receptor ligation. 53 Furthermore, gingipains have been shown to cleave protease-activated receptors on oral keratinocytes resulting in innate immune responses. 54 Kgp is capable of generating a keratin fragment from epithelial cells, which induces inflammatory responses in epithelial and fibroblast cells. 55 Importantly, this gingipain-induced inflammation was not modulated by AC suggesting that gingipain-induced inflammation may be dominant within the periodontal microenvironment, possibly as a result of loss of key immune modulatory receptors and/or induction of potent inflammatory responses. This may be responsible for driving a continued inflammatory response.

Although our study has focused on the impact of gingipains on the sensing and handling of dying leukocytes, it is important to note that CD14 is an innate immune receptor and the modulation of CD14, and other such receptors, by gingipains is likely an immune evasion strategy of the pathogen. 16 Thus, when considering the complete periodontal environment, one should also assess the impact of gingipain treatment on phagocyte migration towards P. gingivalis and subsequent immune clearance.

Taken together, we propose that gingipains can have profound and varied effects on the resolution of inflammation. The inhibition in directional migration of MØ towards dying cells, coupled with reduced efficiency of apoptotic cell clearance and induction of dominant pro-inflammatory responses by gingipains, will promote the chronic inflammatory milieu characteristic of the progressive and debilitating periodontal disease. Thus, we support gingipains as an attractive target for therapeutic intervention.

Dodatna informacija

Datoteke slika

  1. 1.

    Dopunska slika 1

  2. 2.

    Dopunska slika 2

  3. 3.

    Dopunska slika 3

Word dokumenti

  1. 1.

    Dodatna informacija

    Dodatne informacije nalaze se u ovom radu na web stranici Cell Death and Disease (//www.nature.com/cddis)