Primarna kultura goveda chromaffin ćelija | protokoli prirode

Primarna kultura goveda chromaffin ćelija | protokoli prirode

Anonim

Sažetak

Ovaj protokol opisuje primarnu kulturu pojedinih kromafinskih stanica dobivenih enzimskim probavljanjem iz nadbubrežne medule goveđe nadbubrežne žlijezde. Od kasnih 1970-ih, takve su stanice pružile koristan model modela za proučavanje biosinteze neurotransmitera, skladištenja i oslobađanja u kateholaminergičkom sustavu. Protokol se može podijeliti u tri stupnja: izolacija stanica (4-6 h), određivanje održivih brojeva stanica (približno 30 min) i rast kulture (3–7 d). Alternativni postupak je izvođenje studija u staničnoj liniji kromafina (feokromocitom), poput PC12, iako su takve transformirane stanice obično manje diferencirane od primarnih stanica. Postupak s goveđim kromafinim stanicama trebao bi dati oko 10–20 milijuna stanica, što je prikladno za nekoliko pokusa tijekom sljedećih 3–7 d. Tipični eksperimenti uključuju biosintezu odašiljača, spremanje vezikula, egzocitotsko otpuštanje, spajanje podražaja (transdukcija signala) prema sekreciji ili transkripciji ili morfologiju, uključujući ultrastrukturu. Ukupno vrijeme, od žetve nadbubrežne žlijezde do funkcionalnih pokusa, obično je 4–8 d.

Uvod

Kromafinska ćelija naširoko se koristi kao model za neuroendokrinske sekretorne stanice općenito i noradrenergičke neurone. Zapravo, čini se da su struktura i funkcija komponenata sekretornog aparata prilično analogne stanicama i kromonima kromma. Sposobnost dobivanja razmjerno homogenih kromafinskih stanica u kulturi i njihovi karakteristični sekretorni odgovori doveli su do njihove široke uporabe u neurobiologiji. Kao dodatak funkcionalnim istraživanjima staničnih procesa na kojima se nalazi lučenje sekreta, nadbubrežna medula je također bogat preparativni izvor njene sekretorne organele, granule kromafina, koja se može dobiti visokom čistoćom diferencijalnim i gradijentnim centrifugiranjem nadbubrežnih medularnih homogenata; doista, mnogo onoga što znamo o strukturi neuroendokrinih sekretornih granula proizlazi iz takvih pripravaka kromafinskih zrnaca iz nadbubrežne medule.

Kromafin stanice obično se održavaju u kulturi na čvrstim plastičnim posudama ili poklopcima. Stanični pripravci mogu se koristiti za ispitivanja izlučivanja kateholamina i peptida, transkripcije, transdukcije signala, intracelularnog prometa ili morfologije / ultrastrukture. Većina eksperimenata na staničnoj biologiji kromafina provodi se sada s PC12 stanicama feokromocitoma štakora zbog lakoće kulture kontinuirane, transformirane stanične linije. Međutim, primarne kulture goveda kromromafinskih stanica nude prednosti koje mogu biti korisne u mnogim eksperimentima. Prvo, ove ćelije zadržavaju svoj visoko diferencirani fromatip kromafina, s gustim jezgrovitim sekretornim (kromafin) granulama raspoređenim u citosolu; nasuprot tome, kromafin granule u liniji PC12 su relativno rijetke i uglavnom su usidrene na unutarnjem licu plazma membrane. Drugo, goveda kromromafinske stanice u primarnoj kulturi se ne transformišu; doista, čini se da su krajnje diferencirani i nesposobni za podjelu, te stoga mogu biti više reprezentativni za ponašanje normalnih stanica in situ unutar žlijezde in vivo . Ovdje opisani postupak dobivanja takvih stanica prilično je zahtjevan i dugotrajan, ali tijekom 1-2 dana daje dovoljno stanica za nekoliko eksperimenata.

Primarna kultura goveda kromromafinskih stanica prvi je puta izvedena u kasnim 1970-ima. Raniji opisi ili pregledi postupka mogu se naći u br. 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13. Livett 4 daje posebno opsežan i sistematičan pregled uvjeta za kromafinsku staničnu kulturu, uključujući optimizaciju nekoliko važnih parametara. Kasnije perspektive o kulturi kromafinskih stanica mogu se pronaći u literaturi. 14, 15, 16, 17. Ovaj je protokol razvijen za goveda kromromafinske stanice, jer su takve stanice uobičajeni model modela za proučavanje biologije kromafinskih stanica i zbog blizine goveđih klaonica u mnogim velikim gradovima. Međutim, ako je primarna kultura goveđih kromosnih stanica previše teška za laboratorij, zbog udaljenosti od klaonice ili nedostatka opreme, istražitelji mogu razmotriti suradničke studije s drugim laboratorijima širom svijeta koji proučavaju goveđe stanice. Opisi nedavnih sastanaka istraživača kromafinskih stanica dostupni su na Internetu: //www.cnv.cl/isccb13/ (2006); //webpages.ull.es/users/isccb12 (2003); i //www.medicine.ucsd.edu/hypertension/ISCCB/home.html (2001). Alternativno, mogu se koristiti različite vrste nadbubrežnih stanica (kao što je prikazano u ref. 18); na primjer, mnogi eksperimenti mogu se provesti u pogodnijem sustavu PC12 stanica, staničnoj liniji feokromocitoma štakora, koja se koristi od 1976. (ref. 19). Iako se stanice kromromafina drugih vrsta uspješno uzgajaju, takve kulture danas su mnogo manje rutinske i danas ih ne koriste redovno mnogi (ako postoje) laboratoriji u svijetu. Sustavni pregled Livett-a 4 također obuhvaća kulturu kromafinskih stanica drugih vrsta. Konkretno, za krommafinske stanice glodavaca (miš, štakor) vjerovatno će prinos stanica dozvoliti samo studije na pojedinačnim stanicama, ali u dobi transgenih miševa i ciljane ablacije gena takve će stanice generirati sve veći interes. Na raspolaganju je mrežni protokol za dobivanje stanica kromosina štakora u primarnoj kulturi 20 .

Jednom izolirane i kultivirane, krommafinske stanice mogu biti predmet različitih eksperimentalnih postupaka, biokemijskih, fizioloških, farmakoloških, radiokemijskih i morfoloških, mada takve daljnje primjene uzgojenih kromromafinskih stanica nisu obuhvaćene u ovom protokolu, koji detaljno opisuju samo metode njihove izolacije. i kultura.

Također je moguće daljnje odvajanje krommafinskih stanica na različite vrste, poput adrenergičkih i noradrenergičkih. Većina ćelija adrenomedullarnih kromafina pohranjuje i oslobađa prije svega epinefrin (adrenalin), a manji dio stanica oslobađa prije svega norepinefrin (noradrenalin). Povremeno bi istraživači mogli poželjeti odvojeno proučavati ove dvije stanične populacije. U tom slučaju objavljene metode korištenjem gradijentnog centrifugiranja na kromafinim stanicama prije nanošenja mogu dati određeni stupanj (iako nepotpuno) diferencijalnog odvajanja i obogaćivanja dviju vrsta stanica, na principu da epinefrinske stanice imaju tendenciju da su nešto gušće od stanica norepinefrina. Izvješće o gradijentima uključuje Renografin, a zatim Percoll (Moro i sur . 21 ) ili 10-23% BSA (Dumont i sur . 12 ).

materijali

Reagensi

  • Goveđe nadbubrežne žlijezde

    Oprez

    U principu, goveđe tkivo može biti kontaminirano goveđim mikrobiomima ili virusnim patogenima, ali u praksi je to protokol vrlo niskog rizika. Istražitelj nosi rukavice tijekom pripreme sterilnih ćelija, antibiotici su prisutni u nekoliko koraka i nismo naišli na probleme s infekcijom ljudi.

  • 100 × penicilin – streptomicin – GIN (Invitrogen, kat. Broj 10378-016)

  • Fungizon (amfotericin B; Invitrogen, kat. Br. 15290-018)

  • DMEM medij s niskom glukozom (Invitrogen, kat. Br. 11885-084) (vidi POSTAVAK REAGENTA)

  • Toplotno inaktivirani FBS (Gemini Bio-Products, kat. Br. 100-106)

  • AraC zaliha (citozin arabinozid; 3 mg AraC po 10 ml DMEM; Sigma, kataloški broj C1768)

    Oprez

    Može biti štetno ako se nenamjerno guta u velikim dozama.

  • 5-FDU zaliha (5-fluorodeoksiuridin; 24, 6 mg FDU po 10 ml Locke-a; Sigma, kataloški br. F0503)

    Oprez

    Može biti štetno ako se nenamjerno guta u velikim dozama.

  • Tripan plava zaliha (Sigma, kat. T8154) (vidi POSTAVAK REAGENTA)

  • 0, 2% kolagenaza P (Roche, kat. Br. 11213857001) (vidi REAGENT SETUP)

  • 0, 5% BSA (Sigma, kat. Br. A9418)

  • Percoll (sterilna otopina; GE-Amersham Biosciences, kat. Br. 17-0891-01)

  • Etanol (dokaz 95% / 190; proizvođač nije kritičan)

  • KCl

  • Lockeovo rješenje s Percollom (vidi REAGENT SETUP)

  • NaHCO 3

  • 10 × Lockeov međuspremnik (vidi REAGENT SETUP)

  • 1 × Lockeov međuspremnik (vidi REAGENT SETUP)

  • Lockeov transportni pufer (dopunjen antifungalnim sredstvom) (vidi REAGENT SETUP)

  • Glukoza

  • HEPES kiselina

  • 10 M NaOH

  • Poly-L -Lys

  • Poly-D -Lys

Oprema

  • Spinner tikvica; bilo staklene (Bellco, kat. 1965-00100) ili plastične (za jednokratnu upotrebu; Corning, kat. br. 3152)

  • Čaše od 100-, 250- i 500 ml

  • Boca od 500 ml

  • 250-μm najlonska mrežica plus filter spremnik

  • Staklena šipka Douge homogenizirajuće posude

    Kritično

    • Sva gornja oprema treba biti omotana u aluminijsku foliju i sterilizirana autoklaviranjem prije upotrebe u sterilnoj pripremi stanica.

  • Petrijeva posuda od 15 cm od stiropora

  • 1, 5-ml epruvete za mikrocentrifugu

  • Konusne epruvete od 50 ml (Corning, Cole-Parmer, kat. Broj EW-17400-34)

  • Prozirne epruvete za centrifugu od 50 ml (npr. Nalgene)

  • Ploče od kultura tretirane polistirenskim stanicama s kulturom od 24 jažice (npr. Becton Dickinson-Falcon; Corning-Costar)

  • 10- i 25 ml plastične pipete

    Kritično

    • Gore navedeni predmeti od plastike trebaju biti zamotani i sterilni.

  • 37 ° C, 5% CO 2 inkubator kulture

  • Mikroskop obrnutog svjetla

  • Neubauerov hemacitometar (stanica za brojanje stanica; npr. Canemco H4247-1N) s poklopcem

  • Jednokanalni pipeti

  • Motorno pomagalo za pipetiranje

  • Napa kulture ćelije (sa sterilnim laminarnim protokom zraka)

  • Jedinica za filtraciju, veličine pora 0, 22 µm

  • 40 µm (BD-Falcon 352340) i 100 µm (BD-Falcon 352360) filtri (npr. BD-Falcon cjevovod za jednokratnu uporabu; stapa se u konusnu cijev od 50 ml)

POSTAVKA REAGENTA

  • 10 × Lockeov pufer 90 g NaCl, 4, 17 g KCl, 3, 02 g NaHCO 3, 10, 09 g glukoze, 50 ml 1 M HEPES kiseline. Podesite pH 7, 4 s 10 M NaOH i dopunite volumen vode do 1 l. Filtrirati se sterilizirati s 0, 22 µm filtrom veličine pore. Čuvajte smrznute (mjesecima) ili hlađene (tjednima).

  • 1 × Lockeov međuspremnik Razrijedite 10 × Lockeov međuspremnik 10 puta

  • Lockeov transportni pufer (dopunjen antifungalnim agensom) 1.500 ml 10 × Lockeov pufer koji sadrži 100 U ml -1 penicilina, 100 μg ml -1 streptomicina (kao 100 × penicilin – streptomicin – GIN; dodajte 1%, vol / vol) i 0, 5 μM fungizon. Filtrirati se s 0, 22 µm porezna jedinica za filtriranje i staviti u hladnjak. Pripremite se na dan postupka.

  • Medij za staničnu kulturu DMEM DMEM s niskim sadržajem glukoze koji sadrži 100 U ml -1 penicilina, 100 μg ml -1 streptomicina (kao 100 × penicilin - streptomicin - GIn; dodajte 1%, vol / vol), 10% toplinski inaktiviranog FBS-a, 1 % AraC zaliha (10 μM konačne koncentracije) i 0, 1% 5-FDU zaliha (10 μM konačna koncentracija). Filtriraj se s sterilizacijskom jedinicom veličine pora od 0, 22 µm. Čuvajte smrznute (mjesecima) ili hlađene (tjednima).

  • 0, 1% osnovna otopina trypan plave otopine u Lockeovoj otopini Skladištiti u hladnjaku (tjednima).

  • 0, 2% otopina kolagenaze P 50 ml 0, 2% kolagenaza P u 1 × Lockeovom puferu, dopunjena 0, 5% BSA. Pripremite i filtrirajte na dan postupka.

  • Lockeova puferirana otopina Percoll Za 20 ml pomiješajte 2 ml sterilni 10 × Lockeov pufer s 18 ml Percoll-a.

Postupak

Izolacija goveda kromromafinskih stanica

Vreme: 4–6 h

  1. Skupite goveđe nadbubrežne žlijezde od dobavljača ili goveđe klaonice (obično ih dobijemo deset odjednom). Žlijezde transportirajte u sterilnu bočicu s kulturama od 500 ml s 300 ml 1 × Lockeova pufera s fungizonom (1: 1.000 od 1.000 × dionica, gdje zaliha iznosi 250 μg ml -1 amfotericina B). Držite bocu na ledu.

    Kritični korak

    • Ovaj se protokol daje za tri žlijezde; kada pripremate više žlijezda, prilagodite količinu prema tome. Od koraka 2 treba slijediti sterilnu tehniku: istražitelj treba nositi rukavice i raditi u kapuljači za staničnu kulturu. Treba koristiti steriliziranu opremu, a kirurški instrumenti tijekom postupka mogu se ponovno sterilizirati uranjanjem u 100% etanol u 500 ml čašu i zatim plamenom.

  2. Škarama uklonite okolno masno i vezivno tkivo sa žlijezde i isperite žlijezde perfuzijom 1 ml 1 × Lockeova pufera kroz nadbubrežnu venu pipetom, sve dok pufer koji izađe iz žlijezde ne bude čist i bez krvi (otprilike 10 ml po žlijezdi ); Obimno ispiranje žlijezde na ovaj način pomaže smanjiti crvene krvne stanice u konačnoj pripremi. Oprane žlijezde čuvajte u 1 × Lockeovom puferu u sterilnoj čaši.

  3. Svaku žlijezdu napuhajte tri do četiri puta kroz nadbubrežnu venu s 1 ml 0, 2% otopine kolagenaze P (izbacujući otpadnu vodu koja curi iz žlijezde) i inkubirajte žlijezdu (bez dodatnog pufera) 15 min na 37 ° C u 250 –500 ml sterilne staklene čaše prekrivene sterilnom aluminijskom folijom. Ponovite ovaj korak.

  4. Da biste izdvojili medulu, otkidajte donji pol / vrh žlijezde (najudaljenije od vene) i presjecite uzdužno (duž duge osi žlijezde). Na konveksnoj (zaobljenoj) vanjskoj površini urezajte žlijezdu jednom uzdužno, od vrha do dna škarama, do ružičaste moždine, približno 5 mm ili tako nešto. Lagano ogulite korteks i stavite medule u sterilnu Petrijevu posudu promjera 15 cm.

  5. Manjim škaricama sitno isjecite medule.

    Kritični korak

    • Medoze se moraju sitno samljeti kako bi se dobio dobar prinos stanica. Kopanje bi trebalo trajati 8–10 min.

  6. Ulijte mljevenu medulu u preostalu sterilno filtriranu 0, 2% otopinu kolagenaze P u sterilnu tikvicu. Petrijevu posudu isperite nekoliko puta s 0, 2% otopinom kolagenaze P i dodajte u tikvicu.

  7. Inkubirajte smjesu kolagenaze / medule laganim miješanjem (uz nekoliko okretaja u sekundi) 30 minuta na 37 ° C.

  8. Filtrirajte smjesu kolagenaze / medule kroz 250 µm sterilnu najlonsku mrežicu u sterilnu staklenu čašu; ako je potrebno, koristite sterilnu staklenu šipku i olakšajte filtriranje upravljajući šipkom dok se ispire 1 × Lockeovim puferom.

  9. Prebacite filtrat u konusnu epruvetu od 50 ml, prilagodite volumen na 50 ml pomoću Lockeovog pufera i nježno peletirajte stanice centrifugiranjem 10 minuta, na sobnoj temperaturi (20-25 ° C), na približno 400 g .

  10. Pažljivo uklonite supernatant pipetom i odložite. Za tri žlijezde ponovo suspendirajte staničnu pelet u 20 ml 1 Lockeovom puferu.

  11. Filtrirajte staničnu suspenziju u sterilnu konusnu epruvetu od 50 ml koristeći 100 µm cjevovodni filter za jednokratnu upotrebu.

  12. Da biste razdvojili stanice pomoću gradijenta Percoll, dodajte 20 ml Locke-ovog puferiranog percoll-a u 20 ml staničnu suspenziju i lagano promiješajte (razvlačenjem zatvorene epruvete za centrifugu s okruglim dnom).

  13. Centrifugirajte na 20 000 g na sobnoj temperaturi 20 min. Crvena krvna zrnca skupljaju se blizu dna epruvete. Kromafinske ćelije se nalaze u sredini cijevi (iako zapravo ne možete vidjeti diskretni kromafin stanični pojas; magloviti sloj), a stanični krhotine se nakupljaju u gornjem dijelu gradijenta.

  14. Uklonite nečistoće (otprilike jednu desetinu gradijenta) na vrhu pomoću pipete i odbacite.

  15. Sakupi srednji sloj kromafinskih ćelija (otprilike 50–60% gradijentnog volumena, 10–15 ml) s 10 ml pipetom.

    Kritični korak

    • Neki laboratoriji izbjegavaju Percoll-ov stupnjev gradijent ponovljenim (× 4) nježnim koracima centrifugiranja, tijekom kojih se kromafinske stanice sakupljaju na dnu, a krhotine i crvena krvna zrnca mogu se pažljivo ukloniti sa strane epruvete i vrha peleta, odnosno.

  16. Filtrirajte srednji sloj gradijenta koji sadrži kromafin stanice kroz 40 µm cjevovodni filtar za jednokratnu upotrebu.

  17. Stavite filtrat (10–15 ml, koji sadrži stanice) u sterilnu bočicu od 500 ml i dodajte 200 ml sterilnog DMEM medija sa niskom glukozom.

    Kritični korak

    • U ovoj fazi nisu potrebni antibiotici ili serumi.

  18. Razdijelite 200 ml u četiri 50-ml stožaste epruvete i stanice se zrnca centrifugiranjem pri približno 400 g tijekom 10 minuta na sobnoj temperaturi.

  19. Supernatant pažljivo uklonite i odbacite. Nježno ponovno suspendirajte staničnu pelet u 20 ml medijuma kulture DMEM pomoću motoriziranog pipeta.

Određivanje broja održivih stanica

Vrijeme: oko 30 min

  1. Očistite hemacitometar etanolom i montirajte poklopac preko presječenih dijelova dvije komore.

  2. Pripremite alikvotu staničnog uzorka za brojanje dodavanjem 100 μl 0, 1% reaktivne otopine tripano plave boje (krajnja koncentracija 0, 05% tripano plave boje) i 80 μl 1 × Locke-ovog pufera do 20 µl suspenzije stanica u 1, 5 ml mikrocentrifugnoj epruveti.

  3. Sadržaj epruvete pomiješajte laganim miješanjem rukom. Ostaviti da odstoji nekoliko minuta, ali ne duže od 10 min.

  4. Napunite brojile sa staničnom otopinom.

  5. Pomoću mikroskopa prebrojite sve neodržavane ćelije (održive stanice) u četiri velika uglasta kvadrata u obje komore za brojanje.

    Kritični korak

    • Vrlo male okrugle stanice odgovaraju onečišćujućim crvenim krvnim stanicama (iako se crvene stanice obično učinkovito uklanjaju gradijentom Percoll); visok postotak stanica obojenih u plavo-plave boje ukazuje na staničnu smrt.

  6. Izračunajte broj održivih ćelija na sljedeći način: odredite prosječni broj ( x ) održivih (neobrađenih) ćelija po velikom kvadratu (računajte četiri velika kvadrata i podijelite s 4). Zatim koristite sljedeću formulu za izračun ukupnog broja stanica: ukupni broj stanica [[]] [10 000 (= faktor hemacitometra)] [10 (= faktor razrjeđenja)] [20 ml (vidi korak 19)].

    Kritični korak

    • Očekivani raspon je promjenjiv, iako je oko 10–20 milijuna stanica po nadbubrežnoj žlijezdi pristojan prinos.

Stanična kultura

Vreme: 3–7 d

  1. Stanice se razrijede do odgovarajuće gustoće u mediju za staničnu kulturu DMEM.

  2. Pipetirajte suspenziju ćelija u polistirensku ploču ili posudu, željene veličine jažice. Stanice će se vremenom naseljavati i pripojiti u inkubator.

    Kritični korak

    • Za studije izlučivanja, na primjer 22, 23, 24, 25, stanice se razmnožavaju na približno 250 000 stanica po ml po jažici u pločicama s kulturom od 24 jažice (svaki otvor je promjera 1, 5 cm).

    Kritični korak

    • Oblaganje se može smanjiti prema gore ili dolje na druge veličine posude podešavanjem volumena proporcionalno površini.

  3. Kulture se obično održavaju u sterilnim uvjetima u 37 ° C po 5% CO 2 inkubatoru.

    Kritični korak

    • Eksperimenti se obično izvode 3–7 d nakon nanošenja, tako da obično nije potrebno mijenjati medij. Međutim, ako medij postane žut, može doći do onečišćenja (obično gljivice).

    Rješavanje problema

Rješavanje problema

Sterilnost, infekcije i antibiotici

Kao i kod svake primarne kulture, rizik od bakterijske infekcije stanica je velik, mada se donekle smanjuju antibiotici u mediju za kultivaciju. Bakterijska infekcija obično se očituje rano (unutar 1 d) padom pH srednjeg (žute boje) i mikroskopskom pojavom brojnih šipki u mediju. Prema našem iskustvu, liječenje dodatnim antibioticima ne može „spasiti“ mikrobne infekcije u uzgojenim stanicama. Gljivična infekcija može se pojaviti tijekom ljetnih mjeseci, počinje sporije i obično se mikroskopski povezuje s pojavom micelija. Amfotericin B (fungizon) može biti od pomoći u sprečavanju gljivične infekcije.

pH / kiselost medija za kulturu

Pokazatelj pH (crveni fenol) u puferiranom DMEM postaje žut kad padne pH; takva izvanstanična acidoza obično ukazuje ili na iscrpljivanje hranjivih sastojaka ili, vjerojatnije, na staničnu smrt. Tijekom 3–7-dnevnog tijeka stanične kulture, može se jednom pokušati promjena svježeg medija ako srednji pH padne.

Stanična smrt i održivost

Često nuklearno bojanje tripanoplavom bojom (neposredno prije presvlačenja stanica) ukazuje da vitalne stanice nisu rezultat pripreme. Mogući uzroci uključuju pretjerano odgađanje postmortema i kontaminante u pripravku kolagenaze. Prekomjerno odumiranje nakon smrti može se smanjiti brzim transportom žlijezda u laboratorij; i alternativno je prijevoz nekoliko sati leda obično uspješan. Suboptimalne pripravke kolagenaze moguće je identificirati sustavnim testiranjem nekoliko serija enzima i rezerviranjem dovoljnih količina uspješne partije za buduća ispitivanja; enzim se može pohraniti smrznut. Ako je kolagenaza suptimalna i stanice se ne odvoje prije mljevenja, to može dovesti i do mehaničkih oštećenja; u ovom kontekstu, korisno je povećati vrijeme inkubacije kolagenaze unutar žlijezde prije nego što je izrežete.

Promjenjivost kolagenaze

Više od dva desetljeća istražitelji su komentirali varijabilnost pripravaka kolagenaze od izvora do izvora, pa čak i od serije do serije 4 . Nismo se susreli s takvim poteškoćama, ali logičan je pristup možda testirati više serija kolagenaze, a zatim kupiti uspješnu seriju za buduće pripravke u stanici. Neki istraživači uključuju DNAseI u otopine za probavu kolagenaze; Obrazloženje je da genomska DNK koja se oslobađa od mrtvih stanica može tvoriti agregate, ćelije koje hvataju trag. Postigli smo prihvatljive rezultate sa i bez upotrebe DNAseI, ali nismo sustavno testirali njegovu vrijednost.

Ostali tipovi stanica u ovim kulturama

Iako korak gradijenta Percoll obogaćuje prisutnost kromafinskih stanica u tim kulturama, rezultirajući tipovi stanica još uvijek su pomalo heterogeni; druge vrste stanica identificirane u kulturama uključuju endotelne stanice 26 i kortikalne stanice nadbubrežne stanice 27, iako se specifična identifikacija ostalih stanica u određenoj kulturi obično ne provodi, a takve ćelije se često specifično nazivaju "fibroblasti". Kako (za razliku od kromafinskih stanica), ove ostale stanice nadbubrežne stanice nisu vremenski diferencirane i nastavljaju se dijeliti, antimetaboliti (AraC i 5-FDU) obično su uključeni da ograniče rast nehromafinskih stanica. Kromafinske ćelije mogu se obogatiti diferencijalnim premazivanjem prije konačnog oplata 4, a mogu se identificirati 4 iz heterogene stanične smjese koristeći mrlje kao što je fluorescencija izazvana formaldehidom (u kojoj oksidirani kateholamini postaju fluorescentni) ili neutralna crvena (koja vizualizira kisele odjeljke, poput kromafina granula); međutim, naše kulture ne podvrgavamo se rutinski takvim mikroanatomskim istraživanjima. U svakom slučaju, istraživač treba biti svjestan da tipovi stanica nisu homogeni, a događaji koji se događaju u kulturi ne moraju se nužno pripisati kromafinim stanicama. Ako se dogodi takva nesigurnost, eksperimenti s klonalnim stanicama (poput PC12) mogu biti korisni.

Supstrat za rast stanica

Mi obično pločaste stanice na polistirenskim pločicama ili staklenim pokrivačima tretiranim kulturama tretiranim kulturom; ako stanična vezanost nije čvrsta za vrijeme rasta, promjene medija, ispiranje puferom ili izlučivanje, prilog se može povećati prethodnom obradom polistirena sterilnom otopinom poly-Lys, inkubiranjem ploča sa 100 µg ml −1 poly-L -Lys ili poly - D -Lys (Sigma) u sterilnom PBS-u 1 sat na 37 ° C, nakon čega slijedi ispiranje ploče sterilnom vodom. Stanice se mogu posaditi na staklene pokrivače obložene otopinom kolagena inkubiranjem poklopca sa 100 µg ml –1 rep rep kolagena u sterilnom PBS-u tokom 120 minuta na sobnoj temperaturi.

Navigacija na klaonicu goveda

Dobivanje pristupa nadbubrežnoj žlijezdi u lokalnom klaonici goveda možda nije sasvim jednostavno. Prvo, vaš laboratorij može biti na znatnoj udaljenosti od objekta. U našem slučaju, najbliži je objekt sada udaljen više od 100 milja od našeg laboratorija; stoga zapošljavamo komercijalnog kurira za izvlačenje žlijezda unaprijed uz dogovor s upraviteljem objekta. Čak i ako je klaonica blizu, istražitelju može biti teško iz razloga odgovornosti ili osiguranja izvući žlijezde izravno od životinja. Ako to nije moguće, veterinar u Ministarstvu poljoprivrede SAD-a obično je postavljen kao inspektor u svaku klaonicu, koji je obično dobro upoznat s anatomijom goveda i običajima radnog kata određenog objekta i može biti u mogućnosti da pomogne istražitelju u pribavljanju potrebnog materijala.

Vrijeme

Koraci 1-19, izolacija goveda kromromafinskih stanica: otprilike 4-6 h

Koraci 20–25, određivanje broja održivih stanica: oko 30 min

Koraci 26–28, stanična kultura: 3–7 d

Očekivani rezultati

U roku od približno 4–8 d od početka ispitivanja, istraživač bi trebao imati dovoljno ćelija za nekoliko pokusa.

Broj pokusa

S tipičnim prinosom od oko 10–20 milijuna stanica po žlijezdi, počevši od tri žlijezde i zahtjeva za približno 250 000 stanica po jažici, tada će za eksperimente biti na raspolaganju otprilike 120–240 jažica.

Performanse ćelije

Obično se stanice najbolje proučavaju u roku od 3 do 7 dana od plojanja. Nakon toga, razni čimbenici mogu ometati kontinuirano funkcioniranje ovih stanica, uključujući mikrobnu infekciju (unatoč antibioticima), toksičnost antimetabolita (AraC i 5-FDU), porast nehromafinskih stanica u kulturi (unatoč antimetabolitima) ili iscrpljenost hranjivih sastojaka u mediju. Iscrpljivanje hranjivih sastojaka u mediju može se zaobići zamjenom medija.

Izgled stanica

Nakon vezanosti i rasta stanica tijekom 3–7 d, krommafinske stanice daju pomalo heterogen izgled na fazno kontrastu (Sl. 1) i imunofluorescenciji (Sl. 2a i b) mikroskopiji. Klasični izgled kromatofinske stanice u kulturi obično se opisuje kao zaobljen (vidi sliku 1); međutim, specifično imunoizovanje kromromafinskih stanica u kulturi rezultira u obliku jedra (Sl. 2a i b).

Image

Obratite pažnju na klasičan izgled zaobljenih ćelija kromromaina. Prosječni promjer zaobljenih kromafinskih stanica je ∼ 20 µm.

Slika pune veličine

Image

Postignuto je dvostruko obojenje za jezgru (s Hoechst boja 33342; plavo) i kromafin granule (za kromogranin A). Kromogranin A je vizualiziran sa zečjim antihromograninom A, a zatim sekundarnim antitijelom (anti zečjim) povezanim s crvenim bojom AlexaFluor 594 (Molekularne sonde / Invitrogen). ( a ) Polje niže snage. ( b ) Polje veće snage. Promjer nuklearne energije je otprilike 10 µm.

Slika pune veličine

Primjer primjene kultiviranih kromromafinskih stanica: upotreba stanica u studijama oslobađanja kateholamina

Unutar 3–7 d, stanice bi trebale biti u stanju da prihvate i skladište [3H] - L-norepinefrin, a zatim otpuštaju kateholamin kao odgovor na tipičnu stimulaciju sekretagoga, kao što je membrana depolarizacija s 55 mM K + u izvanćelijskom mediju ili 10–20 µM nikotina (djeluje kao nikotinski holinergički agonist), u vremenskom trajanju od 10–30 min. U zdravoj staničnoj pripremi bazalno (nestimulirano) oslobađanje [3H] - L-norepinefrina treba biti ispod 5% ukupnih zaliha stanica, a stimulacija sekretagoga trebala bi donijeti barem tri do četiri puta bazalno (nestimulirano) otpuštanje. Za naše rezultate ispitivanja izlučivanja pomoću goveda kromromafinskih stanica, pogledajte ref. 22, 23, 24, 25. Daljnje informacije o studijama oslobađanja kateholamina, uključujući kateholamin označavanje i protokole otpuštanja dostupne su na //medicine.ucsd.edu/hypertension.

komentari

Slanjem komentara slažete se s našim Uvjetima i smjernicama zajednice. Ako ustanovite da je nešto zloupotrebno ili nije u skladu s našim uvjetima ili smjernicama, označite to kao neprimjereno.