Proteomski screening identificira calreticulin kao mir-27a izravnu metu koja potiskuje izloženost mhc klase i površine u kolorektalnom karcinomu | stanična smrt i bolest

Proteomski screening identificira calreticulin kao mir-27a izravnu metu koja potiskuje izloženost mhc klase i površine u kolorektalnom karcinomu | stanična smrt i bolest

Anonim

teme

  • apoptoza
  • Stanična signalizacija
  • Rak debelog crijeva
  • miRNAs

Sažetak

Pogoršanje imunološkog odgovora i aberantna ekspresija mikroRNA nastaju, kao znak mutacije gena pokretača i epigenetskih modifikacija, novi su znak pokretanja / napredovanja tumora. Obavili smo preliminarno istraživanje neovisnih adenova i kolorektalnog karcinoma (CRC) miRnoma skupova podataka, a među najreguliranijim miRNA-ima odabrali smo miR-27a i otkrili da je on već reguliran u adenomu te se tijekom evolucije dalje povećava u adenokarcinomu. Da bismo identificirali nove gene i putove regulirane ovom miRNA, upotrijebili smo diferencijalnu analizu 2DE-DIGE proteome. Pokazali smo da miR-27a modulira skupinu proteina uključenih u izloženost stanične površine MHC klase I i, mehanički gledano, pokazao je da je kalreticulin izravni cilj miR-27a koji je odgovoran za većinu učinaka nizvodno u eksperimentima s epistazama. In vitro miR-27a utjecao je na proliferaciju stanica i angiogenezu; mišji ksenografti ljudske CRC stanične linije koji izražavaju različite razine miR-27a potvrdili su varijacije proteina i rekapitulirali rast stanica i efekte apoptoze. In vivo miR-27a obrnuto je povezan s MHC molekulama klase I i ekspresijom kalreticulina, infiltracijom CD8 + T stanica i citotoksičnom aktivnošću (izloženost LAMP-1 i oslobađanje perforina). Tumori s visokim infiltracijom miR-27a, niskim kalreticulinom i CD8 + T stanicama bili su povezani s udaljenim metastazama i lošom prognozom. Naši podaci pokazuju da miR-27a djeluje kao onkomiRNA, potiskuje ekspresiju MHC klase I putem smanjene regulacije kalreticulina i utječe na progresiju tumora. Ovi rezultati mogu otvoriti put za bolju dijagnozu, stratifikaciju i novi terapeutski pristup.

Glavni

Kolorektalni karcinom (CRC) treći je glavni uzrok raka u svijetu. 1, 2 Uz mutacije gena i epigenetske modifikacije, slabljenje imunološkog odgovora i disregulacija mikroRNA nastaju obilježjem pokretanja / progresije tumora. 3, 4, 5 Tumorske stanice izazivaju nativni i adaptivni imunološki odgovor posredovan različitim tipovima stanica čiji je cilj iskorjenjivanje tumora. 6 Prerada antigena i prezentacija glavnih molekula histokompatibilnosti (MHC) klase I kritičnog su događaja za postizanje specifičnog antitumorskog odgovora. 7 Antigenski peptidi klase I potječu od proteasom-posredovane razgradnje unutarćelijskih proteina i transportiraju se u endoplazmatski retikulum preko transportera povezanih s proteinima za obradu antigena (TAP1 i 2). Ovdje se učitavaju na kompleks koji opterećuje peptide (PLC) formiran od GRP78, kalnexina i tapasina na kojem se kalreticulin i ERp57 regrutuju za interakciju s molekulama MHC klase I. 8, 9 Nakon što se napune 'optimalnim' antigenima, ove se posljednje molekule odvajaju od PLC-a i premještaju na staničnu površinu gdje ih stanice imunološkog sustava prepoznaju, doprinoseći imunološkom nadzoru. 9, 10, 11

Defekti prezentacije antigena klase MHC javljaju se velikom učestalošću solidnih tumora i obilježje je imunološke evazije tumora koja stanice raka čini nevidljivim za citotoksične T stanice. Selektivni gubitak ili smanjena razina MHC klase I općenito je povezana s napredovanjem bolesti i smanjenim preživljavanjem bolesnika. Naime, smanjivanje regulacije MHC klase I otkriveno je u> 74% kolorektalnih tumora i povezano je sa znatno kraćim srednjim preživljavanjem specifičnim za bolest u usporedbi s MHC-visoko-ekspresivnim tumorima klase I. 6, 12

Disregulacija mikroRNA je uobičajena značajka ljudskih maligniteta jer djeluju kao onkomiRNA ili miRNA-supresorski tumori. 4, 5, 13 Doprinos miRNAs antitumorskom imunološkom odgovoru još uvijek nije definiran i tema je u kojoj se intenzivno istražuje. U ovoj smo studiji izveli preliminarno istraživanje neovisnih skupova podataka miRnoma adenoma i CRC-a, a među najreguliranijim miRNA-ima odabrali smo miR-27a i pokazali da je on već reguliran u adenomu i dodatno se povećava tijekom evolucije do adenokarcinoma. Nakon toga, koristeći proteomski pristup, identificirali smo niz novih proteina moduliranih miR-27a koji su uključeni u površinsku izloženost stanica MHC klase I. U eksperimentima s dobitkom i gubitkom funkcije pružamo dokaze da miR-27a narušava taj put izravno ciljajući na kalreticulin. Nadalje, miR-27a uvelike utječe na proliferaciju stanica i angiogenezu in vitro te na ksenografte miša gdje se ovi rezultati rekapituliraju. Dosljedno tome, miR-27a je prekomjerno izražen u velikom postotku sporadičnih CRC-a čovjeka, obrnuto je u korelaciji s MHC molekulama klase I, infiltracijom i aktivnošću stanica i CD8 + T stanica. Kombinacija visokog miR-27a / niskog kalreticulina povezana je s udaljenim metastazama i lošijim ishodom.

Rezultati

miR-27a je reguliran u ljudskom adenomu i CRC-u

Preliminarno smo analizirali javno dostupni skup podataka o adenom za profil ekspresije miRNA (E-MTAB-813); 14 toplotna karta izvještava popis onih koji su regulirani ili regulirani. Analizirali smo i dva neovisna skupa podataka miRnoma CRC-a (GSE35602_microarray i TCGA_miRNA-seq) 15, 16 i, presijecajući rezultate prikazane u Vennov dijagramu, identificirali smo tri uobičajena neregulirana miRNA (Slike 1A-C). Odabrali smo miR-27a za daljnju analizu i procijenili njegovu ekspresiju u našoj seriji adenomi ( n = 32) i sporadičnim CRC-ima ( n = 80) kvantitativnom RT-PCR analizom. miR-27a je već povišen u oko 60% adenomi i dodatno je porastao tijekom progresije tumora (stadiji I-II, n = 48; stadiji III-IV, n = 32), što sugerira da je njegov aberantni izraz rani događaj u tumorerigeze debelog crijeva. (Slika 1D). Ti su podaci potvrđeni in situ hibridizacijom koja je pokazala visoku razinu adenoma koji su se povećali u diferenciranim, a još više u nediferenciranim uzorcima tumora (Slika 1E).

Image

Uregulacija mir-27a prepoznata je u silikonu i potvrđena je analizom adenoma i CRC tkiva. ( A ) Toplinska karta prikazuje različito izraženu mikroRNA u nizu tkiva adenoma ( n = 21) u odnosu na normalnu sluznicu (E-MTAB-813). 14 Crvena strelica označava miR-27a visoku razinu u uzorcima adenoma. ( B ) različito izražene miRNA u 13 epitelnih CRC uzoraka i četiri normalna tkiva (GSE35602) prikazani su na vulkanskoj parceli (crveni kvadrati; promjena nabora> 2, P ≤ 0, 05); 15 miR-27a (zeleni kvadrat) je strelicom. Zelene linije označavaju promjenu nabora i P- vrijednosti praga. ( C ) Vennov dijagram prikazuje broj različito izraženih miRNA identificiranih u neovisnim i javno dostupnim CRC skupovima podataka analiziranim mikrorezom (plavo; GSE35602) 15 ili RNA-seq (žuto; skup podataka TCGA COAD). 16 U tablici ispod dijagrama navedene su samo zajedničke miRNA i njihove relativne razine ekspresije. Promjena preklopa> 1, 5; P <0, 01 ( D ) Okvirni okvir prikazuje nivo miR-27a procijenjene kvantitativnom reverznom transkriptazom-PCR u našim normalnim tkivima, uzorcima adenom ( n = 32) i CRC ( n = 80) klasificiranim prema stadijuma tumora (stadiji I-II, n = 48; faze III – IV, n = 32). ( E ) Reprezentativna hibridizacija in situ (ISH) miR-27a u različitim fazama kolorektalne tumourigeneze (izvorna uvećanja × 10 i × 5)

Slika pune veličine

Identifikacija novih gena i putova reguliranih miR-27a diferencijalnom analizom proteoma

Da bismo identificirali nove proteine ​​i puteve modulirane od miR-27a, koristili smo proteomski pristup. Prvo smo procijenili njegovu ekspresiju u nizu ćelijskih linija nastalih CRC-om i odabrali HCT116 među onima koji prekomjerno izražavaju (Slika 2a). Plazmidni vektor koji nosi kratku ukosnicu anti-miR-27a RNA (shRNA) i GFP (zeleni fluorescentni protein) kasetu stabilno je transfektiran u HCT116 stanice (CTRL); za daljnja ispitivanja odabran je stanični klon, ovdje definiran miR27a_KD (Slika 2b). Učinkovitost prigušivanja utvrđena je procjenom smanjenja miR-27a i povećanja potvrđenih ciljeva ( PPARG , ZBTB10 i FBXW7 ) (slika 2c i dodatna slika S1A). 17, 18, 19, 20 Transficirali smo i stanice HCT116 plazmidom koji nosi miR-27a mimiku i među klonovima koji prekomjerno eksprimiraju odabrali smo jednu u nastavku nazvanu miR27a_OE. Ekstrakti iz CTRL i miR27a_KD stanica analizirani su usporednim proteomskim 2DE-DIGE pokazujući različite ekspresijske profile i dosljednu eksperimentalnu obnovljivost (Dodatna slika S1B, Dopunska tablica S1). Od 51 različito izražene točke, 27 je identificirano pomoću LC-MS / MS, korelirano s odgovarajućim mrljama i razvrstano u 9 funkcionalnih klasa prema njihovim biološkim aktivnostima (slike 2d i e, dopunska tablica S2). Kvantifikacija odabranih mrlja prikazana je u trodimenzionalnom prikazu zajedno s odgovarajućim standardnim obiljem u dvije različite stanične linije (slika 2f). Validacija zapadnom blot analizom otkrila je porast kalreticulina (CRT), tapasina (TAPBP), GRP78, ERp57 i aneksina A1 (ANXA1) i smanjenje TRAP1 u miR27a_KD u odnosu na stanice CTRL; inverzni rezultati dobiveni su u miR27a_OE (slika 2g).

Image

Proteomskim (2DE-DIGE) profiliranjem identificiraju se novi proteini i putevi modulirani miR-27a u CRC staničnim linijama. ( a ) Ekspresija miR-27a analizirana je kvantitativnom reverznom transkriptazom-PCR u naznačenim CRC staničnim linijama. Histogram izvještava o promjeni nabora u odnosu na stanice HT29 uzete kao kontrola. U6 RNA upotrijebljena je kao kalibrator. ( b ) HCT116 stanice su stabilno transficirane vektorom miR-Zip-27a, noseći miR-27a antisens i GFP reporterski gen, ili s praznim vektorom kao kontrolom. Stanice su izolirane za GFP ekspresiju i za miR-27a niskoekspresirajuće klonove (miR27a_KD); ** P ≤0, 01 (dvostrani t-test učenika). ( d ) Shematski prikaz postupka 2DE-DIGE / MS od pripreme uzorka i označavanja do analize gela i identifikacije proteina. Prikazana je reprezentativna slika gela napunjenog ekstraktima iz HCT116 CTRL i miR27a_KD stanica: oko 1200 proteinskih mrlja identificirano je, kvantificirano, normalizirano i podudarano između gela. Proteini su prepoznati po promjeni puta na odgovarajućim mrljama. ( e ) Proteini identificirani pomoću 2DE-DIGE razvrstani su u devet funkcionalnih klasa, prema njihovim biološkim aktivnostima, kako je prikazano na grafikonu pita. ( f ) Trodimenzionalni prikaz kvantifikacije 2DE-DIGE prikazan je zajedno sa standardnim obiljem interesantnih mjesta identificiranih u gelovima dobivenim iz HCT116 CTRL i miR27a_KD ekstrakta stanica. ( g ) Western blot analiza analize odabranih proteina identificiranih kao različito izražena u 2DE-DIGE / MS analizi u HCT116 CRTL, miR27a_KD i miR27a_OE stanicama (HCT116 izvedena stanična linija koja prekomjerno izražava egzogeni miR-27a). Relativna promjena nabora proteina, dobivena denzitometrijskom analizom i normalizacijom na β -Aktin, izvještava se u odgovarajućem histogramu. * P ≤ 0, 05; ** P ≤0, 01 (dvostrani t-test učenika). Podaci su reprezentativni za tri neovisna eksperimenta, a trake pogrešaka predstavljaju SD tehničkih replika (srednja vrijednost ± SD) na ploči ( a ), ( b ), ( c ) i ( g )

Slika pune veličine

miR-27a downmodulira površinsku izloženost stanica MHC klase I

Da bismo prepoznali puteve u koje su uključeni identificirani proteini, ispitivali smo algoritam Analize puta intenziteta (IPA) algoritam: 21 prezentacija antigena, imunološki i upalni putevi bili su najviše obogaćeni (Slika 3a, Dopunska slika S1C). U skladu s tim, procijenili smo izloženost stanične površine molekula MHC klase I u tri različite stanične linije (HCT116, HT29 i RKO) i njihove derivatne klonove bilo miR-27a ili prigušenim ili prekomjerno izraženim. U protočnoj citometriji stanice miR27a_KD prikazale su više MHC proteina klase I na površini nego roditeljski CTRL ćelije, dok miR27a_OE stanice pokazuju manje proteina (Slika 3b). Slično tome, u imunofluorescentnom bojenju specifično antitijelo prepoznalo je malu količinu proteina klase MHC I na membrani nepermeabiliziranih HCT116 CTRL stanica koje su se značajno povećale na površini miR27a_KD, dok su se smanjile u miR27a_OE stanicama (slika 3c). Specifičnost bojenja potvrđena je suprotstavljanjem jezgara s DAPI: spajanjem, dvije bojenja su ostale odvojene dok označavaju različit subcelularni odjeljak. Da bismo imali kvantitativniju procjenu proteina izloženih na staničnoj površini, uspostavili smo postupak za selektivnu izolaciju proteina plazma membrane i procjenu uključenih proteina. Membranska frakcija miR27a_KD sadržavala je najmanje četiri puta više molekula MHC klase I od CTRL i čak više od miR27a_OE stanica. Da trake odgovaraju stvarnim membranskim proteinima, potvrđeno je izazivanjem iste frakcije s E-kadherinom, integralnim membranskim proteinom, kao pozitivnom kontrolom, i s β- Aktinom, citosolnim proteinom kao negativnom kontrolom (Slika 3d). Svi zajedno ovi podaci pokazuju da je površinska ekspresija molekula MHC klase I smanjena miR-27a.

Image

Izloženost MHC klase I površine je smanjena miR-27a u CRC stanicama. ( a ) Na crtežu su prikazane najbogatije mreže stvorene s popisa različito eksprimiranih (DE) proteina (crveni elementi = uregulirani proteini; zeleni elementi = silazno regulirani proteini) nakon prigušivanja miR-27a pomoću IPA. ( b ) Analiza protočne citometrije otkriva različitu izloženost stanica molekula MHC klase I površini HCT116, RKO, HT29 i njihovim derivatnim klonovima miR27a_KD ili miR27a_OE. ( c ) Imunofluorescentno bojenje koristeći antitijelo protiv humanih MHC molekula klase I u HCT116 CTRL i njihovim derivatnim klonovima miR27a_KD ili miR27a_OE (ljestvica skale, 50 µm). ( d ) Obogaćivanje molekula MHC klase I u izoliranoj frakciji plazma membrane. Pozitivnost na E-kadherin, membranski protein i negativnost na β -Aktin, citosolni protein, dokazali su da su identificirani proteini doista integralne komponente membrane. Opisana je relativna promjena nabora, dobivena denzitometrijskom analizom i normalizacijom na E-kadherin, ispod pojasa. * P ≤ 0, 05; ** P ≤0, 01 (dvostrani t-test učenika). Podaci su reprezentativni za tri neovisna eksperimenta, a trake pogrešaka predstavljaju SD tehničkih replika (srednja ± SD)

Slika pune veličine

miR-27a izravno cilja kareticulin koji utječe na izloženost MHC klase I

Da bismo identificirali izravnu metu miR-27a među različito izraženim proteinima, ispitivali smo nekoliko algoritama i predvidjeli kalreticulin kao vjerojatni cilj zahvaljujući sačuvanom slijedu prepoznavanja sjemena u 3'UTR odgovarajuće mRNA (slika 4a). 22 MiScript ciljni zaštitnik (TP) dizajniran je protiv ove sekvence prepoznavanja da selektivno spriječi vezanje miR-27a na odgovarajuću mRNA, ne ometajući djelovanje miRNA na druge ciljeve. Nakon transfekcije TP-om, kalreticulin se povećao u HCT116 i miR27a_OE više od miR27a_KD stanica (Slika 4b). Zanimljivo je da se također povećala kognitivna mRNA, vjerojatno zahvaljujući efektu stabilizacije, pridonoseći povećanju proteina otkrivenim u HCT116 i miR27a_OE stanicama (Slika 4c). Transfekcija triju neovisnih siRNA protiv kalretikulinske mRNA u HCT116, miR27a_KD i miR27a_OE stanicama uspješno je ušutkala protein, a siRNA # 3 kao najučinkovitiji (Slika 4d). Da bismo odredili utjecaj osi miR-27a / calreticulin na površinsku izloženost molekula MHC klase I, transfektirali smo calreticulin TP i siRNA u tri stanične linije. U protočnoj citometriji TP nije stvorio značajne razlike, dok siRNA, posebno siRNA # 3, povećavaju prikaz MHC klase I za 50% u miR27a_KD i 25-30% u CTRL i miR27a_OE ćelijama (slika 4e), u skladu s ukupni sadržaj izolirane frakcije membrane plazme (slika 4f). Kalreticulin je, dakle, izravna meta miR-27a i posreduje učinke na izloženost MHC klase I.

Image

Kalreticulin je miR-27a meta i utječe na izloženost stanica MHC klase I površine. ( a ) Shematski prikaz mRNA ljudskog kalreticulina (CRT): visoko očuvano mjesto za vezanje miR-27a smješteno u 3'UTR prikazano je crvenom bojom. ( b ) Imunoblotska analiza nivoa CRT u HCT116 CTRL i derivatnim klonovima miR27a_KD ili miR27a_OE ćelija nakon transfekcije specifičnim ciljnim zaštitnikom (CRT-TP) ili negativnom kontrolom (NC-TP) tijekom 72 h. P- Aktin je korišten kao kontrola opterećenja. * P ≤ 0, 05, ns = neznačajno. ( c ) CRT mRNA qRT-PCR analiza HCT116 CTRL i derivatnih klonova miR27a_KD ili miR27a_OE stanica transfektirane sa specifičnim CRT-TP ili negativnom kontrolom (NC-TP) u trajanju od 72 h. * P ≤0, 05 (Student's t -test). ( d ) CRT imunoblotskom analizom HCT116 CTRL i derivatnih klonova miR27a_KD ili miR27a_OE stanica transficiranih s tri specifične CRT siRNA ili kontrolne siRNA tijekom 72 h. Densitometrijska analiza prikazana je ispod pojasa. ** P ≤0, 01 (Student's t -test). ( e ) Procitavanje protočne citometrije staničnih molekula MHC klase I u istim ćelijama kao u ( b ) nakon transfekcije s CRT-TP ili CRT-siRNA ili relativne negativne kontrole tijekom 72 h. ( f ) Imunoblotska analiza molekula MHC klase I prisutnih u frakciji plazma membrana HCT116 CTRL stanica i njihovih derivacijskih klonova miR27a_KD ili miR27a_OE transficirani s CRT-siRNA ili kodiranom siRNA kontrolom (Ctrl-siRNA). Podaci normalizirani na E-kadherin prikazani su u histogramima. * P ≤ 0, 05, ** P ≤ 0, 01 u odnosu na HCT116 CTRL stanice; # P ≤0, 05 nasuprot Ctrl-siRNA transfektiranim stanicama

Slika pune veličine

Miševi ksenografti rekapituliraju efekte miR-27a na proteomski profil i rast stanica

Da bismo istražili modulaciju miR-27a na proteinima identificiranim pomoću 2DE-DIGE in vitro , napravili smo ksenografte miša. HCT116 i HT29, koji su zastupljeni za miR-27a-ove ekspresije ili -dowxpressing stanice, potkožno su transplantirani u gole miševe. Nakon 2 tjedna, miR-27a inhibitor ili kodirana kontrola intratumualno su se ubrizgavali svakih 7 dana četiri puta u tumore koji su dobiveni od HCT116. Alternativno, miR-27a mimične ili kodirane kontrole ubrizgavaju se u tumore dobivene HT29. Na dan 36 od transplantacije izmjerene su, izrezane i analizirane tumorske mase. Veličina malignih oboljenja dobivenih od HCT116 bila je nevjerojatno veća (> 50%) od onih ubrizganih u miR-27a antisens. Također, tumori dobiveni injekcijom miR-27a mimike u mase dobivene stanicama HT29 bili su> 50% veći od onih iz roditeljskih stanica (Slika 5a). Specifičnost i učinkovitost inhibicije ili prekomjerne ekspresije miR-27a potvrđena je qRT-PCR na ukupnim RNA izdvojenim iz dvije različite vrste tumora. U skladu s veličinom, pozitivnost na Ki67 bila je jača u visokim miR27a eksprimirajućim tumorima od donjih, što je podržavalo ulogu ove miRNA u staničnoj proliferaciji (dopunske slike S3A i B). Suprotno tome, apoptoza je znatno smanjena kod istih tumora, dok su velika područja apoptoze otkrivena u onima koji izražavaju niski miR-27a testom krajnjeg deoksinukleotidil-transferaze (TdT) posredovanog dUTP-ovog testa za označavanje krajnjim označavanjem (TUNEL) (slike 5b i c).

Image

miR-27a djeluje kao onkogena miRNA u mišjim ksenografima. ( a ) Reprezentativne fotografije mase ksenografta tumora izrezane iz svake eksperimentalne skupine. miR-27a inhibitor (anti-miR-27a; n = 5) i kodirana kontrola (miR-Ctrl; n = 5) u HCT116 stanicama ili miR-27a mimična (miR-27a; n = 5) i kodirana kontrola (miR- Ctrl; n = 5) u stanice HT29 intratumualno se ubrizgavalo svakih 7 dana tijekom četiri ciklusa počevši od dana kada su tumori dostigli volumen od 200 mm3. Krivulja tumora rasta prijavljena je za obje vrste ksenografta. ( b ) reprezentativne fotomikrografije bojenja hematoksilinom i eozinom, kalreticulina i IHC analize IHC klase IHC klase MHC, odnosno TUNEL testa, rađene na dijelovima istih tkiva ugrađenih parafinom; ljestvice, 200 μ m. ( c ) Histogram prikazuje apoptotički indeks određen TUNEL testom. ( d ) Analiza zapadnog blotiranja odabranih proteinskih gena identificiranih pomoću 2DE-DIGE provedena na ukupnim proteinskim ekstraktima mišjih ksenografta i ( e ) njihova relativna kvantifikacija. Podaci su prikazani kao sredstva ± SD iz najmanje dva neovisno liječena tumora; * P ≤ 0, 05; ** P ≤0.01 ( t- test učenika)

Slika pune veličine

Calreticulin, ERp57, GRP78 / BiP, Annexin1 i Tapaxin smanjeni su u zapadnoj blot-analizi ekstrakata HCT116 tumora, dok su svi regulirani u onima sa tihom miR-27a. TRAP1 je pokazao obrnuto ponašanje, u skladu s rezultatima 2DE-DIGE in vitro (slike 5d i e). Analiza istih markera u HT29 tumorima proizvela je suprotan scenarij, u skladu s nižim izrazom miR-27a koji je obrnut nakon injekcije odgovarajuće mimike. Nisu primijećene varijacije za sve navedene proteine ​​u zapadnim mrljama ekstrakata tumora ubrizganih kodiranom kontrolom u odnosu na tumore koji su dobiveni HCT116 ili HT29 (podaci nisu prikazani).

Ekspresija MHC klase I praćena je imunohistokemijom (IHC). Signal otkriven na tkivnim dijelovima iz miR-27a antisens ubrizganih tumora bio je jači nego kod kodiranih tumora ubrizganih ili roditeljskih stanica. Pri većem povećanju obojenje je lokalizirano na staničnoj membrani, što je u skladu sa stimulacijom MHC-a translokacije stanične površine klase I nakon prigušivanja miR-27a. Kvantitativnija analiza zapadnog mrlja na ekstraktima iz istih tumora potvrdila je na mišjem modelu da je prigušivanje miR-27a povezano s ukupnim povećanjem proteina MHC klase I (slike 5b, d i e). Dosljedno, kareticulin pokazuje slabu i uglavnom citosolnu pozitivnost na odsjecima HCT116 tumora od strane IHC. Bojenje je umjesto toga bilo izrazito lokalizirano kao "mrlje" na staničnim membranama kod tumora ubrizganih antisense miR-27a (slika 5b). Western blot analizom ekstrakata iz istih tkiva pokazalo se ukupno povećanje kalreticulina samo kod onih masa sa smanjenim miR-27a (slike 5d i e). Kolektivno, mišji ksenografti potvrdili su da miR-27a utječe na rast stanica i apoptozu također u CRC-u i jasno pokazali da negativno modulira specifični skup proteina identificiranih in vitro koji posebno doprinose ekspresiji MHC klase I. Ovi rezultati definitivno pokazuju da je miR-27a faktor koji uzrokuje CRC tumor koji djeluje kao onkomiRNA.

ekspresija miR-27a u CRC obrnuto je u korelaciji s MHC klasom I i kalreticulinskom ekspresijom te s infiltracijom / aktivacijom CD3 + i CD8 + T stanica

Da bismo povezali podatke dobivene in vitro i na ksenografima miša s ljudskim CRC-ovima, napravili smo kvantitativnu analizu Western blottinga nekih reprezentativnih uzoraka: CRC-ovi visoki miR-27a koji eksprimiraju pokazuju niske molekule klase I MHC i kalreticulin (slike 6a i b). U skladu s tim, IHC tkivnih mikroračuna pokazao je da visoki miR-27a ekspresionirajući tumori često pokazuju slabo ili odsutno membrano obojenje molekula MHC klase I i kareticulina; bojanje je bilo jače kod malih tumora koji eksprimiraju miR-27a (slika 6c). Nadalje, miR-27a je obrnuto koreliran s infiltracijom CD3 + i CD8 + T stanica i pozitivnom perforinom čija je relativna brojnost određena (slike 6c i d). Perforin i LAMP-1 su dva membranska proteina koja se koriste kao surogat markeri citotoksične aktivnosti CD8 + T stanica. 23 Dakle, CD8 + / perforin + i CD8 + / LAMP-1 + dvostruko pozitivne stanice, detektirane imunofluorescencijom na uzorcima CRC-a, bile su veće u tumorima koji eksprimiraju niski miR-27a (slike 7A i B). Sve u svemu, ovi rezultati sugeriraju da miR-27a može smanjiti infiltraciju, aktivaciju, proliferaciju i degranulaciju T stanica. 24 Dosljedno, Kaplanova i Meierova analiza preživljavanja pacijenata pokazale su da su niska kalreticulinska ekspresija ( P <0, 001) i CD3 + i CD8 + niski infiltrati ( P <0, 001), uzimani sami, značajno povezana s kraćim ukupnim preživljavanjem, dok je visoki miR -27a je pokazao samo trend ( P = 0, 104; dopunske slike S4A i B). Niska kalretikulinska / visoka miR-27a povezanost ( n = 26) bila je ona s najgorim ishodom kada su se te karakteristike kombinirale; Analiza omjera rizika svih mogućih udruga identificirala je kalreticulin kao dominantnu varijablu koja je bila još diskriminiranija u kombinaciji s visokom ekspresijom miR-27a. Kad su CD8 + infiltrati bili povezani s razinama miR-27a, kombinacija niska CD8 + / visoka miR-27a imala je lošiju prognozu; Analiza omjera rizika svih mogućih udruga istaknula je prisutnost CD8 + infiltrata kao dominantne varijable (slike 7C i D). Visoki miR-27a / nizak kalreticulin bio je također povezan s razvojem jetrenih metastaza, a infiltrati CD3 + / CD8 + T stanica su smanjeni u metastazama u usporedbi s matičnim primarnim tumorima (dopunske slike S4C-E).

Image

Porast regulacije miR-27a u uzorcima CRC korelira sa smanjenom MHC klase I i kalreticulinskom ekspresijom i infiltracijom CD3 + i CD8 + T stanica. ( a ) Western blot analiza analiza CRT i MHC molekula klase I u reprezentativnoj skupini normalnih tkiva ( n = 5) i uzoraka CRC ( n = 9) klasificiranih prema miR-27a izrazu; P- Aktin je korišten kao kontrola opterećenja. ( b ) Okvirne ploče prijavljuju razinu CRT i MHC klase I u normalnim nasuprot tumorskim tkivima (gornji) i u tumorskim tkivima u skladu s razinama miR-27a (donja). ( c ) IHC analiza stanica MHC klase I, CRT, CD3 + i CD8 + T infiltrira se u uzorke ugrađene parafinom normalnih i CRC uzoraka klasificiranih u skladu s razinama miR-27a (ljestvica skale, 50 μm). ( d ) Nacrtni okviri izvještavaju o infiltraciji CD3 + i CD8 + T stanica povezane s razinama miR-27a. P- vrijednosti su izračunate pomoću uparenog t- testa u panelima ( b ) i ( d )

Slika pune veličine

Image

miR-27a je obrnuto povezan sa infiltracijom i aktivacijom CD8 + T stanica što utječe na agresivnost tumora i preživljavanje pacijenata. ( A ) IHC analiza miR-27a, CD8 + T stanica i perforina u uzorcima CRC-a ugrađenih u parafin klasificirani prema različitim stupnjevima tumora (stupnjevi I – II nasuprot III – IV) (ljestvica skale, 50 µm). Histogrami u nastavku navode kvantifikaciju obojenja CD8 / perforinom izraženu kao srednji broj pozitivnih ćelija u poljima velike snage (HPF). ( B ) Imunofluorescentna analiza dvostruko obojenih CD8 + (crvena) i LAMP1 + (zelena) ili CD8 + i perforin + stanice (ljestvice ljestvice: 20 µm u pločama a i b, i 5 µm u pločama b i d ), Histogrami s desne strane pokazuju postotak dvostruko pozitivnih CD8 + / LAMP1 + i CD8 + / perforin + stanica u tumorskim tkivima prema razinama miR-27a ** P ≤ 0, 01 (dvostruki studentov t- test). ( C i D ) Kaplan-Meierova analiza preživljavanja bolesnika s CRC-om na temelju kombinacija ( C ) CRT / miR-27a i ( D ) CD8 + / miR-27a. Test rangiranja zapisa; P = 0, 012, P = 0, 096. Analize omjera opasnosti prikazane su u okvirima s desne strane

Slika pune veličine

Biološku relevantnost ovih podataka potvrdila su dva javno dostupna skupa podataka. Izraz 15, 16 miR-27a izrazito se povećao stabiliziranjem tumora i obrnuto je korelirao s općim preživljavanjem bolesnika, u skladu s rezultatima našeg skupa podataka (dopunska slika S5A). Zanimljivo je da je mRNA kalreticulina povišena u svim skupima podataka, a odgovarajući protein je smanjen, a odstupanje je objašnjeno posttranskripcijskom kontrolom posredovanom miR-27a ovdje (Dodatne slike S6A i B; Slike 6a-c). miR-27a obrnuto je također povezana s mRNA-ima CD3 + i CD8 + T stanica iz ranih stadijuma tumora i povezana je s lošom prognozom, podupirući rezultate naše serije (dopunske slike S6C-E). MiR-27a kolektivno djeluje kao onkomiRNA iz ranih faza tumorerigeze debelog crijeva, smanjuje ekspresiju MHC klase I i kalreticulin, korelira s infiltracijom CD3 + / CD8 +, razvojem udaljenih metastaza i lošijim ishodom koji vjerojatno utječe na imunološki odgovor domaćeg antitumorskog odgovora in vivo ,

Rasprava

Otkrivanje čitavog spektra funkcija mikroRNA glavni je zadatak jer su uključene u ogroman niz bioloških procesa. Pored toga, istodobno ciljaju mnoge gene koji djeluju na različite putove, čije interakcije stvaraju mrežu koja može biti različita u različitom kontekstu i vrsti stanica. 4, 5, 13 Proteomskim pristupom 2DE-DIGE identificiramo niz proteina moduliranih miR-27a koji su uključeni u ekspresiju MHC klase I. Naime, miR-27a suzbija površinsku izloženost MHC klase I, izravno ciljajući na kalreticulin, protein uključen u kontrolu kvalitete sklopa ovog više podjedinica, što doprinosi njegovoj stabilnosti i pronalaženju suboptimalno sastavljenih molekula MHC klase I. 7, 8, 9, 10, 11 Mehanički, kareticulin je glavni efektor miR-27a nizvodno pri suzbijanju površinske izloženosti MHC klase I, što je najvažniji događaj u postizanju učinkovitog imunološkog odgovora i iskorjenjivanju tumora. Defekti u ovom procesu su uobičajeno sredstvo da stanice raka izbjegnu prepoznavanje T stanica. 25, 26 In vivo podaci podržavaju ovaj pojam: visoki miR-27a-ekspresionirani tumori obrnuto su u korelaciji s ekspresijom MHC klase I u našoj CRC seriji. Iako su potrebna daljnja ispitivanja kako bi se pružio mehanički uvid u vezu između miR-27a i MHC prezentacije antigena klase I, u konačnici, prepoznavanja i aktivacije CD8 + T stanica, naši sadašnji podaci pokazuju da os miR-27a / calreticulin regulira klasu MHC I stanična ekspresija. Povišenje regulacije miR-27a nastaje od najranijih faza kolorektalne tumorerigeneze i traje kroz progresiju, što čini agresivniji razvoj. U skladu s tim, CRC-i koji izražavaju kombinaciju visokog miR-27a / niskog kalreticulina povezani su sa smanjenom infiltracijom CD3 + / CD8 + T stanica i citotoksičnom aktivnošću, agresivnijim ponašanjem, širenjem metastaze i lošijim ishodom. Novi scenarij je da tumor i susjedne stanice, posebno infiltrirajuće imunološke stanice, uspostavljaju specifično mikro okruženje putem zamršene mreže unakrsnih veze. 27, 28 miR-27a je presudno u imunološkim stanicama, jer inhibira sazrijevanje DC-a i proliferaciju i aktiviranje T-stanica, dok inducira sazrijevanje podtipova M2b i M2c makrofaga. 29, 30, 31 Ovdje pružamo dokaze da miR-27a ima ključnu ulogu i u tumorskim stanicama represirajući izloženost MHC klase I površine površine. Čini se da je miR-27a višestruka signalna molekula koja može utjecati na imunološke interakcije stanica-domaćina i vjerojatno onesposobiti komponente imunološkog sustava koje su otpremljene da ih eliminiraju.

Zaključno, prvi put pokazujemo da miR-27a modulira površinsku izloženost MHC klase I izravnim ciljanjem na kalreticulin. Naši podaci podržavaju da miR-27a ima kritičnu ulogu u tumourigenezi debelog crijeva koja vjerojatno utječe na antitumorski imuni odgovor. Identifikacija regulatorne osi miR-27a-kareticulina otvara putove za traženje novih strategija usmjerenih na poboljšanje prognoze pacijenta i poboljšanje terapijskog odgovora.

Materijali i metode

Stanična kultura

Stanične linije raka ljudskog karcinoma HCT116, HT29, CaCo-2, LoVo, RKO i SW480 kupljene su iz američke zbirke kultura tipova (ATCC, Rockville, MD, USA). Sve stanične linije održavane su u Dulbeccovom modificiranom mediju Eagle ili RPMI 1640 uz dodatak 10% fetalnog goveđeg seruma, 2 mM L-glutamina, penicilina i streptomicina. Stanice su kultivirane u vlažnom 37 ° C inkubatoru pri 5% C02. Endotelne stanice ljudske pupčane vrpce kupljene su od ATTC-a i održavane u EGM BulletKit medijumu (Lonza, Allendale, NJ, USA).

Transfekcija oligonukleotida i plazmida

Sintetički miR-27a oponašajući (Syn-hsa-miR-27a), inhibitor miR-27a (anti-hsa-miR-27a) ili odgovarajuće kodirane kontrole (AllStar ili mirScript Inhibitor-Negative Control) kupljeni su od Qiagena (Hilden, Njemačka ). MiR-27a-antisens (MZIP27a-PA-1), ekspresivni pre-miR-27a konstrukti (PMIRH27a-onlyPA-1) i kodirani kontrolni miRNA (MZIP000-PA-1; PMIRH000PA-1) plazmidi (Sustav Biosciences, Mountain View, CA, USA) su transficirane u različitim CRC staničnim linijama. funkcionalna ispitivanja mikroRNA provedena su inhibicijom interakcija miRNA-mRNA bilo s prilagođenim dizajniranim kalreticulinom-miScript ciljnim zaštitnikom ili s negativnim kontrolnim miScript ciljnim zaštitnikom (MTP0075035; Qiagen). Otkrivanje nikakvih promjena u nepovezanim proteinima s validiranom specifičnošću TP-a. Za prolazne transfekcije korišten je gensko-specifični paket od tri prethodno odabrana siRNA protiv kalreticulina (Flexi Tube siRNA GS811) ili negativnog kontrolnog siRNA (SI03650325) (Qiagen). Funkcionalna ispitivanja, analiza RNA i proteina provedena je u roku od 24/72 h od transfekcije. U svakom pokusu, procjena miR-27a prigušivanja / prekomjerne ekspresije i kalreticulinskog ćutanja određena je qRT-PCR i zapadnom blotting analizom. Plazmidi i oligonukleotidi transfektirani su primjenom Lipofectamine 2000 (Thermo Fisher, Waltham, MA, SAD), HiPerFect Transfection reagens (Qiagen) ili RNAi Max (Thermo Fisher), u skladu s preporukama proizvođača.

ekstrakcija mRNA / miRNA i qRT-PCR analiza

Ukupna RNA ekstrahirana je iz stanica i tkiva pomoću TRIzola (Thermo Fisher) i tretirana s DNazom I. mikroRNA su ekstrahirane Qiagen miRNeasy Mini Kit (Qiagen) prema protokolu proizvođača. Procjena čistoće i količine RNA provedena je kako je opisano. 32 Slijed specifičnih primera prikazan je u Dodatnoj tablici S3.

Western blot analiza

Proteinski ekstrakti iz staničnih linija i tkiva pripremljeni su i analizirani kao što je ranije izvješteno. 32 Antitijela na kalreticulin (ab2907), TAPBP (ab140982), ERP57 (ab13506) i MHC klase I (ab70328) bila su iz tvrtke Abcam (Cambridge, MA, SAD); PPAR y (sc-7273), TRAP1 (sc-9134), GRP78 (sc-13968), anti-miš (sc-2031) i anti zec (sc-2004) bili su iz Santa Cruz Biotechnology (Dallas, TX, SAD) ); ANXA1 (71–3400) iz Thermo Fishera, β- Aktin (F-3022) iz Sigma-Aldricha (Milano, Italija); E-kadherin (BD 610405) iz BD transdukcije (BD Biosciences, San Jose, Kalifornija, SAD). Za analizu površinskih proteina koristili smo metodu ekstrakcije temeljenu na objavljenom postupku. Pozitivnost za E-kadherin, protein plazma membrane i negativnost za β -Aktin, citosolni protein, dokazali su da su identificirani proteini doista integralne komponente membrane. Comassie plavo obojenje također je korišteno za procjenu ekvivalentne opterećenja bjelančevinama. Proteini su tada analizirani Western blotom kako je ranije objavljeno. 32, 33

2DE DIGE analiza

Diferencijalna analiza proteoma na HCT116 CTRL i HCT116 miR27a_KD izvedena je kao što su ranije opisali Milone i sur. 34 Proteomski eksperimenti uključuju: (a) pripremu proteina i obilježavanje DIGE bojama; (b) izoelektrofokusiranje (IEF); (c) prikupljanje, analiza i obrada slike; i (d) identifikacija proteina pomoću LC-MS / MS. Eksperimentalni dizajn pomoću tri boje je prikazan u Dodatnoj tablici S1.

Pokusi na životinjama

Za generiranje ksenografa, 20 × 106 6 CRC-izvedenih stanica (HCT116 ili HT29) supkutano je transplantirano u bok 20 ženskih atimičnih golih miševa (starih 6–8 tjedana; Charles River, Lecco, Italija). Miševi su održavani prema smjernicama Ujedinjenog Kraljevstva za koordinaciju istraživanja karcinoma, a količina tumora, izračunata kao (dužina tumora × širina2) / 2, praćena je dvaput tjedno mjerenjem kaliperom. 35, 36 Dva tjedna nakon transplantacije, kada su tumori dostigli volumen od 200 mm 3, miševi su bili grupirani ( N = 5 / grupa) i intratouralno ubrizgavani svakih 7 dana četiri puta s anti-miR-27a (4 ng / mm 3 ) za HCT116 ili s miR-27a mimikom (2 ng / mm 3 ) za HT29 ksenograft modele. U oba slučaja korištene su odgovarajuće kodirane RNA (naznačene kao anti-miR-Ctrl i miR-Ctrl). Na 36. dan, izmjerene su, izrezane i dalje analizirane tumorske mase; qRT-PCR izveden je na RNA s ksenografta da bi se utvrdila učinkovitost miR-27a inhibicije / prekomjerne ekspresije. Ovaj je eksperiment izveden u dvojniku. Nisu primijećeni štetni ili toksični učinci Svi pokusi na životinjama pregledali su i odobrili Etička komisija u Menarini Ricerche, u skladu sa smjernicama Europske direktive (2010/63 / UE).

TUNEL test

Za procjenu apoptotičke stope na tkivima ksenografta, tumorske mase ugrađene parafinom analizirane su DeadEnd Fluorometric TUNEL sustavom (Promega, Madison, WI, USA), prema uputama proizvođača. Prikupljanje slika i analiza podataka provedeni su pomoću Carl Zeiss LSM700 laserskog skenirajućeg mikroskopa (Carl Zeiss, Jena, Njemačka).

Imunofluorescencija i IHC

Imunofluorescentno bojenje izvedeno je na nepermeabiliziranim HCT116 i derivatnim klonovima. Stanice su posađene na pokrivačima, fiksirane u para-formaldehidu (4% u PBS-u) na sobnoj temperaturi 10 min, blokirane u albumu goveđeg seruma (3% u PBS-u) 30 minuta prije inkubacije sa specifičnim antitijelima za MHC klasu I (1: 100 razrjeđivanja) 1 sat na sobnoj temperaturi. Nakon toga, antitijelo IgG-R sekundarno antitijelo (sc-2092, razrjeđenje 1: 1000) (Santa Cruz Biotechnology) se inkubira 1 sat na sobnoj temperaturi. Pokrivači su isprani PBS-om, obojeni s DAPI i, nakon još tri pranja hladnim PBS-om, postavljeni u mowiol 4–88 (Merck-Millipore, Darmstadt, Njemačka) na staklenim toboganima. For double-immunofluorescence staining, after an initial block with 10% normal serum in PBS, tissue sections were incubated overnight at 4 °C with an unconjugated primary antibody specific for CD107a (also known as LAMP-1) FITC (ab25406) or a monoclonal antibody to perforin (Clone 5B10; Diagnostic Biosystems, Pleasanton, CA, USA) and CD8-PerCP-Cy5.5 fluorescence conjugated (BD Biosciences). For negative controls, primary antibodies were replaced with preimmune serum and IgG isotype controls. The fluorescence signals were observed and captured using a Carl Zeiss LSM700 laser-scanning microscope (Carl Zeiss). IHC and haematoxylin and eosin staining on human CRC tissues and mouse xenografted tissues were performed and evaluated as previously reported 32 using antibodies against Ki67 (Dako, Milan, Italy), Calreticulin and MHC class I, CD3 (CD3-565-L-CE) and CD8 (CD8-295-CE) (Novocastra, Milan, Italy) and perforin (Diagnostic Biosystems). Image acquisition and analysis were performed on DM100 Leica Photosystem 40.106.206 (Leica, Milan, Italy).

Protok citometrija

Flow cytometry was employed to detect MHC Class I molecules on the cell surface of HCT116, RKO and HT29 and their derivative clones miR27a_KD or miR27a_OE. Briefly, cells were plated, harvested and washed twice with PBS and incubated for 1 h in darkness at 4 °C with PE-Cy-7-labelled anti-MHC class I (561349) (BD Biosciences). Cells were then washed and resuspended in cold PBS for FACS analysis. All flow cytometry results were analysed with the FACSuite Software v.1.0.5.3841 (BD Biosciences).

In vitro angiogenesis assay

The tube-formation assay was performed as previously described 32 and is illustrated in Supplementary Figure S2A.

In situ RNA hybridization

Formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) sections of tubular adenomas with low-grade/high-grade dysplasia or colorectal adenocarcinomas (G1, G2 and G3) were stained for miR-27a. Three cases per pathological sub-group were analysed. Three normal colonic mucosa biopsy samples, used as control, were obtained from patients who underwent colonoscopy for irritable bowel syndrome. miR-27a probe was labelled with 5-digoxigenin and synthesized by Exiqon (Vedbaek, Denmark). In situ hybridization was performed as described, with minor modifications. 37 Negative controls included omission of the probe and the use of a scrambled LNA probe; U6 was used as positive control (Exiqon). Slides were counterstained in fast red solution. For miR-27a/CD8 + /perforin expression analysis, primary sporadic CRCs were considered. Serial sections obtained from the original paraffin blocks were stained for miR-27a, CD8 + and perforin. Only cytoplasmic miR-27a intensity was retained for scoring, and miRNA expression was quantified analysing chromogen-specific intensity by Image J. 38 IHC for CD8 + (Clone C8/144B; Dako) and perforin (Diagnostic Biosystem) were performed on the Benchmark LT automated system from Leica Microsystems Bondmax (Leica, Wetzlar, Germany) according to the manufacturer's specifications. The results of CD8 + /perforin staining are expressed as the mean number of positive cells in high-power fields.

Klinički uzorci

Paraffin-embedded and liquid nitrogen–frozen specimens from adenoma ( n =32) and primary sporadic CRCs ( n =80) (stages I–II, n =48; stages III–IV, n =32) were included in this study. Each sample was matched with the adjacent apparently normal mucosa ( n =80) removed during the same surgery. Patients' familial history and tumour classification have been reported. 32 Patients were followed up for a median of 89.79 months or until death. All patients gave informed consent for sample collection, and study protocols were approved by the Institutional Review Board of the Fatebenefratelli Hospital in accordance with the ethical guidelines of the Declaration of Helsinki.

Independent data sets' analysis

The following independent, publicly available adenoma and CRC data sets, deposited in the Gene Expression Omnibus (GEO) as adenoma E-MTAB-813, 14 (GEO) GSE35602 series (//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo website) and TCGA COAD series (//tcga-data.nci.nih.gov/docs/publications/coadread_2012), respectively, were analysed for miR-27a expression in adenoma and CRC tissues to evaluate its prognostic significance. The adenoma data set consists of 21 patients while the data set GSE35602 counts on 59 RNA samples separately extracted from stroma and epithelium of 13 CRC tissues and four normal tissues. 15 mRNA expression analysis was performed on Agilent-014850 Whole Human Genome Microarray 4x44K (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA); for miRNA analysis, Agilent-019118 Human miRNA Microarray 2.0 G4470B was used. Robust multichip average normalization was performed using GeneSpring 11.5 (Agilent Technologies). 39 The information from this data set was used to identify differentially expressed miRNAs having a fold change ≥2 and P <0.05, as determined by Welch t -test statistical analysis. We performed Volcano plot analysis to visualize differential expression. TCGA COAD data set 16 consists of 224 colorectal tumours and normal pairs. Normalized Level 3 data were used for our analysis. IPA (Ingenuity Systems, (//www.ingenuity.com website) was used for gene set enrichment analysis and gene network analysis.

statistika

All statistical analyses were made using Statistical Package from Social Science (SPSS; version 16.0) for Windows (SPSS Inc., Chicago, IL, USA) and R/Bioconductor (Seattle, WA, USA). Association between miRNA expression and tumour stage was assessed using Fisher exact test or Pearson χ2 test (where indicated). The Kaplan–Meier method was used to estimate survival; log-rank test was used to test differences between the survival curves; the hazard ratios were calculated by combining the variables at 95% confidence interval to correlate the chance of events. Data are reported as means±SD, and mean values were compared using Student's t -test or Mann–Whitney test. Results were considered statistically significant when P ≤0.05 was obtained.

Dodatna informacija

Word dokumenti

  1. 1.

    Dodatna informacija

Glosar

CRC

Rak debelog crijeva

PLC

peptide-loading complex

MHC

major histocompatibility complex

Dodatne informacije nalaze se u ovom radu na web stranici Cell Death and Disease (//www.nature.com/cddis)