Regeneracija otočića gušterače in vivo genskom terapijom usmjerenom ultrazvukom | genska terapija

Regeneracija otočića gušterače in vivo genskom terapijom usmjerenom ultrazvukom | genska terapija

Anonim

teme

  • Dijabetes
  • Otoci Langerhansi
  • Ultrazvuk

Sažetak

Ova studija koristi novi pristup genskoj terapiji u kojoj je plazmidna DNK usmjerena na gušteraču in vivo koristeći uništavanje mikro-mjehurića ultrazvukom (UTMD) kako bi se postigla regeneracija otočića. Intravenske mikro mjehurići koji nose plazmide se ultrazvukom uništavaju u mikrocirkulaciji gušterače, čime se postiže lokalna genska ekspresija koja je usmjerena na β-stanice modificiranim promotorom inzulina štakora (RIP3.1). Niz gena uključenih u endokrini razvoj isporučen je štakorima 2 dana nakon dijabetesa izazvanog streptozotocinom. Geni, PAX4 , Nkx2.2 , Nkx6.1 , Ngn3 i Mafa , proizveli su hiperplaziju α-stanica, ali nije bilo značajnijeg poboljšanja u β-staničnoj masi ili razini glukoze u krvi 30 dana nakon UTMD. Suprotno tome, RIP3.1-NeuroD1 potaknuo je regeneraciju otočića iz preživjelih P-stanica, s normalizacijom razine glukoze, inzulina i C-peptida u 30 dana. U dugotrajnom pokusu, četiri od šest štakora imalo je povratak dijabetesa u roku od 90 dana, praćeno β-staničnom apoptozom na Tunel obojenoj. Prethodna obrada s JNK inhibitorom SP600125 uspješno je blokirala apoptozu β-stanica i rezultirala obnavljanjem β-stanične mase i normalizacijom razine glukoze u krvi do 90 dana. Ova tehnika omogućuje in vivo regeneraciju otočića, obnavljanje β-stanične mase i normalizaciju šećera u krvi, inzulina i C-peptida kod štakora bez virusa.

Uvod

Kontrola glukoze u krvi često je neadekvatna kod dijabetesa, jer terapija lijekovima, uključujući zamjenu inzulina, ne može ponoviti regulaciju glukoze u normalnim otočićima. Prema tome, nove strategije liječenja usredotočene su na nadoknadu nedostatka β-stanične mase koja je zajednička za oba glavna oblika dijabetesa transplantacijom otočića ili regeneracijom β-stanica. 1, 2 Transplantacija otočića ograničena je opskrbom otočića donora i potrebom imunosupresivne terapije. 3 Regeneracija otočića bila je uspješna na životinjama, prvenstveno ciljajući jetreno tkivo koristeći virusne vektore 4, 5, 6, 7 koji se iz sigurnosnih razloga vjerojatno neće koristiti na ljudima. Novi pristup genskoj terapiji je ciljanje isporuke DNK na otočiće gušterače pomoću uništavanja mikro-mjehurića ultrazvuka (UTMD). 8, 9 Intravenske mikro-mjehurići koji nose plazmidnu DNA uništavaju se unutar mikrocirkulacije gušterače ultrazvukom, postižući lokalnu ekspresiju gena koja se dalje može ciljati na β-stanice pomoću modificiranog promotora inzulina-I promotora štakora. UTMD se koristi za isporuku betacellulina i PDX1 u štakora sa dijabetesom izazvanim streptozotocinom (STZ), s preokretom dijabetesa do 15 dana reprogramiranjem akinarnih stanica pankreasa u stanice koje proizvode inzulin. 10 Slično tome, pokazalo se da je izravno ubrizgavanje adenovirija koji kodira kombinaciju gena PDX1 , neurogenin3 i Mafa u mišji pankreat reprogramiralo egzokrine stanice u male stanice koje proizvode inzulin bez stvaranja otočića. 11 Međutim, regeneracija otočića unutar gušterače ostala je neuhvatljiv cilj genske terapije. Ovom se studijom pokušalo procijeniti može li se regeneracija otočića unutar gušterače odraslog štakora postići genskom terapijom pomoću UTMD.

Embriološki razvoj endokrinog gušterače povezan je s aktiviranjem niza gena koji kodiraju različite faktore transkripcije i druge proteine. 12, 13 Shvatajući da mogu postojati važne razlike između neonatalnog endokrinog razvoja i regeneracije otočića kod odrasle životinje s dijabetesom, pokušali smo procijeniti može li se ovo posljednje genetskom terapijom usmjeriti na gušteraču od strane UTMD-a. Konkretno smo konstruirali plazmide koji kodiraju cDNA za Ngn3 , Pax4 , Nkx2.2, Nkx6.1, MafA i NeuroD1 , a sve pod kontrolom modificiranog promotora inzulina štakora (RIP3.1). Mikro mjehurići koji sadrže ove gene infuzirani su intravenski tijekom 10-minutnog razdoblja, dok je ultrazvuk upotrijebljen za uništavanje mikro-mjehurića unutar mikrocirkulacije gušterače. UTMD je proveden 48 sati nakon indukcije dijabetesa intraperitonealnim STZ (60 mg kg -1 ). Kontrole uključuju UTMD s markerskim genom (RIP3.1- DsRed ), STZ samo bez genske terapije, kao i normalne kontrole koje nisu primale STZ. Za evaluaciju morfologije otoka i ekspresije gena provedena su tri različita ponavljanja eksperimenata, uz eutanizaciju 10, 20 i 30 dana. Rezultati eksperimenta u trajanju od 30 dana prikazani su na slikama. Dugoročni eksperiment je također izveden pomoću RIP3.1- NeuroD1, nakon što se pokazalo da je ovaj gen optimalan za regeneraciju otočića u ovom modelu.

Rezultati

Učinci endokrinih proliferativnih gena na strukturu otočića

Na slici 1 prikazani su reprezentativni histološki uzorci obojeni anti-inzulinskim antitijelima obilježenim FITC-om (zelena) i protutijela obilježena CY5-anti-glukagonom (crvena). Ovi dijelovi dobiveni su iz skupine štakorica ubijenih 30 dana nakon UTMD-a. Normalni otočići sadrže središnju jezgru β-stanica (zelene) okružene manjim brojem α-stanica (crvenih) na obodu otočića. Nakon STZ-a, uobičajena arhitektura otočića gotovo se ukida, s izoliranim β-stanicama ili malim nakupinama β-stanica. Genska terapija Ngn3 , Pax4 , Nkx2.2 , Nkx6.1 i MafA rezultirala je regeneracijom otočića, ali s nenormalnom arhitekturom otočića, u kojoj su α-stanice prevladavale. Suprotno tome, genska terapija s NeuroD1 rezultirala je regeneracijom otočića s relativno normalnom morfologijom. Zanimljivo je da je u skupini s NeuroDl (Slika 2) bilo kostainirano anti-inzulinom i anti-glukagonom (slika 2), ali ne u normalnim otočićima. Za ovaj je nalaz ranije objavljeno da je oznaka za endokrinu proliferaciju. 13 Konfokalna mikroskopija također je pokazala kolokalizaciju anti-inzulina i anti-Ki67, što ukazuje na proliferaciju β-stanica (podaci nisu prikazani). U usporedbi s normalnim i STZ-tretiranim kontrolnim skupinama, Ki67-pozitivne stanice bile su statistički i značajno brojnije (10 ± 2% inzulin-pozitivnih stanica, P <0.0001) u skupini NeuroD1 nego u kontrolnim skupinama (samo rijetke Ki67-pozitivne stanice), Kako je NeuroD1 bio pod kontrolom promotora RIP3.1, pretpostavili smo da je primijećena regeneracija otočića posljedica replikacije β-stanica koje su preživjele STZ. To su potkrijepila tri zapažanja. Prvo, nije bilo dokaza o regeneraciji otočića kada je RIP3.1- NeuroD1 dostavljen UTMD 7 dana nakon STZ-a, točka u kojoj nisu utvrđene zaostale β-stanice u STZ kontroli. Drugo, niti jedan otočić izazvan RIP3.1- NeuroD1 nije izrazio CK19, što ukazuje da novi otočići nisu izvedeni iz duktalnih stanica. Treće, kolokalizacija Ki67 i inzulina sugerirala je proliferaciju β-stanica.

Image

Rezultati imunofluorescentne mikroskopije. Skupina slikovnih ploča s lijeve strane prikazuje reprezentativne primjere otočića iz 30-dnevnih pokusa. P-stanice su obojene anti-inzulinom (zeleno), dok su α-stanice obojene anti-glukagonom (crveno). Gornji lijevi panel prikazuje normalan otočić s središnjom jezgrom β-stanica okružen α-stanicama na periferiji otoka. Kontrole liječene streptozotocinom (STZ), ali bez aktivne genske terapije, pokazuju gubitak integriteta otočića, s nekoliko vrlo β-stanica koje su okružene α-stanicama (gornja srednja i desna). Ultrazvučno usmjerena genska terapija s Nkx2.2 , Nkx6.1 , Pax4 , Ngn3 i MafA rezultirala je formiranjem otočića dominantnih α-stanica. Suprotno tome, štakori tretirani s NeuroDl imali su gotovo normalnu otočnu arhitekturu, sa središnjim p-stanicama okruženim perifernim α-stanicama (slika s donje desne strane). Grafikoni prikazuju razinu glukoze u krvi (desna gornja ploča), razine inzulina u krvi (desna srednja ploča) i C-peptida (desna donja ploča) u 30-dnevnom eksperimentu. 3. dana, svi štakori tretirani STZ-om imali su značajno povišenu glukozu u krvi i smanjenje inzulina i C-peptida u odnosu na normalne kontrole ( P <0, 0001). Međutim, do 30. dana, samo su štakori liječeni NeuroDl obnavljali glukozu u krvi, inzulin i C-peptid do normalne ili gotovo normalne razine.

Slika pune veličine

Image

Gornji paneli prikazuju reprezentativni otočić od štakora tretiranog NeuroD1 . Na lijevoj ploči prikazan je anti-inzulin (zeleni), zajedno s slikama protiv glukagona (u sredini) i konfokalnim (desno). Konfokalna slika pokazuje kolokalizaciju inzulina, a glukagon je neke stanice (žute), što ukazuje na endokrinu proliferaciju. Grafikon pokazuje da je kolokalizacija inzulina i glukagona daleko češća kod štakora koji su tretirani NeuroD1 nego kod kontrolnih skupina ( * P <0, 0001).

Slika pune veličine

Učinak endokrinih proliferativnih gena na glukozu u krvi, inzulin i C-peptid

Na slici 1 prikazane su i koncentracije glukoze u krvi (gore desno), inzulina (srednja desna) i C-peptida (donja desna), po početku, 3 dana nakon STZ i 30 dana nakon STZ. Razina glukoze u krvi dramatično je porasla do 3. dana kod svih štakora liječenih STZ-om (otprilike 400 mg po 100 ml) i ostala je povišena 30. dana, osim u štakora liječenih NeuroD1 . Na dan 30, razina glukoze u krvi bila je 101 ± 11 mg po 100 ml u štakorima tretiranim NeuroDl , što je bilo statistički i značajno niže nego u svim ostalim skupinama liječenim STZ-om ( P <0, 0001), ali ne i u uobičajenoj kontroli. U kratkoročnim eksperimentima, razina glukoze u krvi bila je normalna i u 10. i 20. danu kod štakora liječenih NeuroD1 (podaci nisu prikazani). Razine inzulina i C-peptida bile su izrazito depresirane 3. dana kod svih štakora liječenih STZ-om. Do 30. dana, razina inzulina i C-peptida bile su gotovo normalne vrijednosti za štakore liječene NeuroDl , statistički i značajno veće od one u 3. danu ili veće od svih ostalih skupina liječenih STZ-om ( P <0, 0001).

Učinci endokrinih proliferativnih gena na broj otoka i β-staničnu masu

Morfometrija otoka 30 dana nakon UTMD-a prikazana je na slici 3. Gornji paneli su reprezentativni dijelovi male snage obojeni hematoksilinom (plava) i anti-inzulinom (smeđa) s normalnih kontrola (lijevo), štakorima tretiranim Ngn3 (u sredini) i NeuroD1 -obrađeni štakori (desno). Broj otočića u različitim skupinama za liječenje prikazan je na donjem lijevom grafu slike 3. U normalnim kontrolama bilo je 61 ± 6 otočića po klizištu, u usporedbi s samo 3 ± 2 nakon samo liječenja STZ-om. NeuroD1 je rezultirao s 37 ± 4 otočića po toboganu, što je broj koji je bio statistički i značajno veći od onog u svim ostalim skupinama, osim normalnih kontrola ( P <0, 0001). Masa β-stanica prikazana je u donjem desnom grafikonu na Slici 3. Masa β-stanica je bila normalna kontrola 1, 49 ± 0, 17%, a dramatično je smanjena u kontrolama tretiranim STZ-om (0, 04 ± 0, 01%) i DsRed kontrolama (0, 05 ± 0, 01 %). U skupinama tretiranim PAX4 , Nkx2.2 , Nkx6.1 , Ngn3 i Mafa , masa β-stanica bila je slična (0, 20 ± 0, 04%). Međutim, kod štakora koji su liječeni genskom terapijom NeuroD1 , masa β-stanica obnovljena je na otprilike polovici normalne kontrole (0, 76 ± 0, 07%). Masa p-stanica bila je statistički i značajno veća za štakore tretirane NeuroDl nego za sve ostale gene i kontrole ( P <0, 0001), ali bila je manja od normalne kontrole ( P = 0, 0006).

Image

Rezultati morfometrije otoka. Gornji panel prikazuje reprezentativne otočiće s malom snagom nakon bojenja hematoksilinom i anti-inzulinom (smeđa boja). Normalni kontrolni otočići (lijevo) pokazuju guste dobro formirane jezgre β-stanica obojenih anti-inzulinom (smeđe). Nakon genske terapije Ngn3 (srednja) prisutne su raspršene β-stanice, ali bez dobro formiranih otočkih jezgara. Nakon NeuroD1 genske terapije, otočne jezgre su gotovo normalnog izgleda. Donja lijeva ploča prikazuje broj otočića po dijapozitivu za različite skupine. I normalne kontrole i štakori tretirani s NeuroDl imali su značajno više otočića po toboganu nego sve ostale skupine ( * P <0, 0001 prema ANOVA). Donja desna ploča prikazuje masu β-stanica. Štakori tretirani s NeuroDl imali su masu p-stanica koja je bila upola manja od normalne kontrole ( P <0, 0001). I normalna kontrola i štakori tretirani s NeuroDl imali su značajno veću masu β-stanica nego sve ostale skupine ( * P <0, 0001 prema ANOVA).

Slika pune veličine

Trajanje regeneracije otočića nakon RIP3.1-NeuroD1 genske terapije

Slika 4 prikazuje otočiće obojene anti-inzulinom (zeleno), anti-NeuroDl (crveno) i konfokalne slike na otočićima s normalnih kontrola, STZ-tretiranim kontrolama i NeuroD1 skupinom u dva vremenska razdoblja, 2 i 4 tjedna nakon UTMD-a. Na otočićima normalnih ili STZ tretiranih štakora nije prisutan NeuroD1 signal. Kod štakora koji su liječeni genskom terapijom NeuroD1, NeuroD1 je prisutan u 2 tjedna, ali ne i 4 tjedna nakon UTMD. To je u skladu s našim prethodnim izvješćem, da ekspresija plazmidne DNA po UTMD-u doseže maksimum 4–7 dana nakon tretmana, a praktički je nestala 4 tjedna. Prema tome, prolazna ekspresija gena UTMD pokreće regeneraciju otočića koja ostaje nakon čišćenja isporučenog gena i eksprimiranog proteina. Kako bi se utvrdilo trajanje regeneracije otočića i kontrola glukoze u krvi nakon UTMD-a, skupina od šest štakora je 2 dana nakon STZ-a tretirana genskom terapijom NeuroD1 i ubijena 90 dana kasnije. Rezultati ovog eksperimenta prikazani su na slici 5. Svih šest štakora su bili početno duboko hiperglikemijski (2 dana nakon STZ). U 20 i 30 dana, svih šest štakora imalo je normalnu razinu glukoze u krvi (graf, lijeva ploča). Međutim, do 90. dana, četiri od šest štakora vratile su se jakoj hiperglikemiji, dok su dva štakora ostala normoglikemijska. Konfokalna mikroskopija pokazala je značajan gubitak β-stanica u središtu otočića hiperglikemije štakora (gore desno), u usporedbi s normoglikemijskim štakorima (donje desno), koji su očuvali arhitekturu otočića.

Image

Imunoziranje na prisutnost proteina NeuroD1 u normalnim kontrolama (gornja ploča), štakori tretirani STZ-om (drugi paneli), 2 tjedna nakon NeuroD1 genskom terapijom (treći paneli) i 4 tjedna nakon NeuroD1 genskom terapijom (donji paneli). Lijeva ploča obojena je antiinzulinskim FITC (zelena); središnje ploče s anti-NeuroD1 CY5 (crvena); a desne ploče konfokalne. Otkrivene razine NeuroD1 uočene su u P-stanicama 2 tjedna, ali ne i 4 tjedna nakon uništenja mikro-mjehurića usmjerenih ultrazvukom (UTMD).

Slika pune veličine

Image

Trajanje genske terapije NeuroD1 nakon dijabetesa izazvanog STZ-om. Grafikon pokazuje pojedinačne razine glukoze u krvi tijekom vremena kod šest štakora liječenih UTMD-om 2 dana nakon STZ (BSL). Duboka hiperglikemija vraćena je u normalu kod svih šest štakora putem NeuroD1 genske terapije u danima 20 i 30. Do 90. dana, dva štakora su ostala normoglikemijska, a četiri štakora vratila se u teški dijabetes. Konfokalne mikroskopske slike s reprezentativnih otočića prikazane su na desnim pločama, obojene anti-inzulinom (zeleno) i anti-glukagonom (crveno). Dijabetički štakori imaju malo β-stanica (gore desno), dok su normoglikemijske štakore sačuvale arhitekturu otočića (dolje desno).

Slika pune veličine

Produljenje životne sposobnosti otočića inhibicijom c-juna N-terminalnom kinazom

Pretpostavili smo da je ovaj kasni gubitak otočića posljedica apoptoze. Stoga je eksperiment ponovljen prethodnom obradom sa SP600125, c-Jun inhibitorom N-terminalne kinaze (JNK), za kojeg se pokazalo da blokira JNK-posredovanu apoptozu na otočićima. 14 Slika 6 prikazuje rezultate bojenja tunela u normalnim kontrolama ( n = 3), kod štakora dijabetičara liječenih STZ-om ( n = 3) i u STZ štakora liječenih NeuroD1 genskom terapijom sa ( n = 6) i bez SP600125 ( n = 6). Apoptoza (zeleni signal) je ukinuta u skupini NeuroD1 UTMD koja je prethodno bila tretirana sa SP600125. Slika 7 prikazuje morfometriju otočića i mjerenje glukoze u krvi 90 dana nakon NeuroD1 genske terapije sa i bez SP600125. Na lijevim pločama prikazani su reprezentativni otočići kod štakora koji nisu primili SP600125 (gore) u usporedbi s onima koji su povučeni sa SP600125 (dolje). U skupini s SP600125 uočeni su veliki dobro formirani otočići, u usporedbi s malim nakupinama β-stanica prisutnih u kontrolama (Nema SP600125). Masa β-stanica bila je 0, 61 ± 0, 07% u skupini SP600125 u usporedbi s 0, 37 ± 0, 07% u kontroli ( P <0, 0001; gornji desni graf). Razina glukoze u krvi tijekom 90 dana prikazana je u donjem desnom grafikonu na Slici 7. Razina šećera u krvi bila je značajno niža u skupini koja je liječena NeuroD1 SP600125 nego u skupini NeuroD1 koja nije primala SP600125 ( P <0, 05), ali bila je viša od normalne kontrole ( P <0, 05). To je bilo zbog povratka hiperglikemije kod dva od šest štakora liječenih SP600125.

Image

Bojenje tunela (zeleno) s normalnih kontrola (gore lijevo), STZ kontrola samo (gore desno) i NeuroD1 tretirani štakori bez SP600125 prethodne obrade (dolje lijevo) i sa SP600125 predobradom (desno). Nuklei su obojeni s DAPI (plava) i β-stanice antiinzulinom (crveno); apopotske ćelije su zelene. Prethodna obrada SP600125 štiti regenerirane otočiće od apoptoze (dolje desno).

Slika pune veličine

Image

Rezultati pokusa SP600125 nakon 90 dana. Reprezentativni histološki odsjeci štakora koji su liječeni genskom terapijom NeuroD1 bez SP600125 (gore lijevo) i sa SP600125 (dolje lijevo). Raštrkane p-stanice obojene antiinzulinom (smeđe) prisutne su 90 dana nakon UTMD u odsutnosti SP600125. Dobro oblikovane jezgre otočića prisutne su 90 dana nakon UTMD-a u prisutnosti SP600125. Masa β-stanica je značajno veća u grupi SP600125 ( P <0, 0001; gornji desni graf). Razina glukoze u krvi niža je kod štakora koji su primali NeuroD1 koji su primali SP600125 u usporedbi s onima koji nisu primali SP600125 ( P <0, 05), ali viša je od one u normalnim kontrolama ( P <0, 05).

Slika pune veličine

Rasprava

Koliko znamo, ovo je prva studija koja je pokazala in vivo regeneraciju otočića gušterače oporavkom od dijabetesa bez upotrebe virusnog vektora. Konkretno, NeuroD1 bio je ciljan na gušteraču štakora tretiranih STZ-om s naknadnom regeneracijom gotovo normalnih otočića i obnavljanjem normalnih razina glukoze, inzulina i C-peptida u roku 30 dana. Vrhunska ekspresija reporterskih gena isporučenih kao plazmidi pomoću UTMD uočena je za 4 dana, nakon čega je potom ubrzana razgradnja. 8 Prema tome, prolazna ekspresija gena ovom metodom može inducirati regeneraciju otočića, a teoretski minimizira rizik od insercijske mutageneze koja bi mogla biti povezana s produljenom ekspresijom egzogene genske terapije. Prethodnim tretmanom štakora sa SP600125 za koje se pokazalo da blokiraju apoptozu p-stanica, uspjeli smo produljiti trajanje regeneracije otočića i normoglikemiju na 90 dana u štakorskom modelu dijabetesa izazvanog STZ-om.

NeuroD1 je osnovni faktor transkripcije helix-petlje-helix koji se nalazi u gušterači, crijevima i središnjem živčanom sustavu. NeuroD1 prisutan je u razvoju pupoljka gušterače i ostaje ga otkriti kod svih zrelih vrsta otočnih stanica. U knockout miševima NeuroD1 razvijaju se svi tipovi endokrinih stanica, ali postoji smanjen broj otočića i povećana apoptoza β-stanica. 16 Smatra se da NeuroD1 nije bitan za ranu diferencijaciju, ali ima važnu ulogu u kasnijoj fazi diferencijacije i održavanja β-stanica, te u određivanju sudbine stanica. 17, 18 Ovo gledište o ulozi NeuroD1 u endokrinom razvoju, iako se temelji prvenstveno na transgeničnim studijama na mišima, u skladu je s promatranim nalazom regeneracije otočića kod odraslih štakora u ovoj studiji.

Ostali faktori transkripcije, konkretno Ngn3, Pax4, Nkx2.2, Nkx6.1 i MafA, također su rezultirali obnavljanjem otočića, ali otočići su se sastojali pretežno od α-stanica, a razina glukoze u krvi, inzulina i C-peptida nije normalizirana. Zanimljivo je da transgeni miševi koji eksprimiraju Ngn3 pod regulacijom Pdx1 promotora pokazuju uglavnom glukagon-pozitivne stanice, 19 slično našim nalazima nakon in vivo isporuke Ngn3 . Kada je Ngn3 prekomjerno izražen u razvoju pilećih crijeva, također proizvodi pretežno α-stanice. Izgleda da se uloga ovih faktora transkripcije, kada se egzogeno isporučuju odraslim životinjama s dijabetesom, može razlikovati od njihove uloge u embriološkom razvoju. Također je moguće da bi različite kombinacije gena faktora transkripcije ili drugih gena koji su uključeni u razvoj gušterače ili stanični ciklus doveli do još snažnije regeneracije otočića od one opažene u ovoj studiji. Na primjer, Chen i sur. 10 su pokazali da proizvodnja inzulina od strane acinarnih stanica može biti inducirana u štakorima tretiranim STZ kombinacijom betacellulina i Pdx1 plazmida isporučenih in vivo s obnavljanjem normalne razine glukoze u krvi i inzulina do 15 dana. U novije vrijeme, Zhou i sur. 11 izvijestilo je da kombinacija Ngn3 , MafA i Pdx1 , isporučena izravnom injekcijom adenovirusa u gušteraču miševa sa nedostatkom imuniteta, rezultira reprogramiranjem egzokrinih stanica u fenotip β-stanica. Te nove p-stanice izolirane su u pojedinačne stanice ili male nakupine samo nekoliko stanica, a ne da se spajaju u otočiće. Poboljšane su razine glukoze u krvi, inzulina i C-peptida, ali nisu vraćene u normalne razine. Kad su dostavljeni faktori pojedinačne transkripcije, nove β-stanice nisu primijećene u značajnom broju. Ova se studija razlikuje u dva potencijalno važna aspekta. Prvo smo koristili nevirusnu metodu davanja gena koja, za razliku od izravne injekcije, cilja na cijelu gušteraču. Drugo, koristili smo promotor RIP3.1 za selektivno ciljanje ekspresije gena na endokrini gušterači. Češće korišteni promotor citomegalovirusa učinkovitiji je u egzokrinu nego u endokrinom gušterači. 21 Slično tome, adenovirus je snažniji u egzokrinu nego u endokrinom gušterači. 22 Regeneracija otočića postignuta je kod dijabetesa posredovanog STZ-om primjenom adenovirusa za isporuku različitih gena u jetru, što rezultira obnavljanjem normalne razine glukoze u krvi. 4, 5 Međutim, zbog sigurnosnih razloga nije vjerojatno da će se adenovirus primjenjivati ​​na ljudima. Iako je jetra pogodan organ za regeneraciju otoka i transplantaciju otočića, naša tehnika koristi uništavanje mikro-mjehurića posredovanih ultrazvukom kako bi se plazmidna cDNA donijela cijeloj gušterači s relativno moćnom specifičnošću organa. To nudi teoretsku prednost za regeneraciju i održavanje otočića, jer je gušterača normalni fiziološki milje za otočiće. Kao i u prethodnim studijama isporuke gena pomoću UTMD-a, 8, 9, 10, nismo pronašli nikakve dokaze o oštećenju gušterače UTMD-om, bilo serumskom amilazom ili lipazom, bilo histologijom.

Nismo proveli složena ispitivanja staničnog roda. Međutim, nekoliko opažanja sugeriraju da su regenerirani otočići primijećeni nakon RIP3.1- NeuroD1 rezultat replikacije raštrkanih β-stanica koje su preživjele STZ. Imunofluorescentno obojenje s CK19, duktalnim staničnim markerom, nije pokazalo značajnije unošenje u regenerirane otočiće (podaci nisu prikazani). Regeneracija otoka se dogodila samo kada je primjena gena primijenjena odmah nakon STZ tretmana ili u roku od 48 sati nakon tretmana. Kada su se pokusi ponovili s davanjem gena 7 dana nakon STZ-a, vremenskog razdoblja u kojem nije bilo detektiranih stanica koje obojavaju inzulin kod kontrolnih štakora STZ-a, regeneracija otočića nije primijećena i došlo je do progresije teške hiperglikemije i gubitka težine. Kololizacija Ki67 i inzulina bila je prisutna u regeneriranim otočićima, što sugerira proliferaciju β-stanica. Koristili smo modifikaciju promotora inzulina I štakora štakora, koji je snažno specifičan za P-stanicu, posebno u uvjetima hiperglikemije 8, 9 i ne bi se očekivalo da imaju značajnu aktivnost u egzokrinom gušterači. Ova su razmatranja u skladu s prevladavajućim gledištem da je replikacija β-stanica dominantni mehanizam za povećanje mase β-stanica. 13, 23, 24

Koncept korištenja genske terapije za promicanje regeneracije otočića kod dijabetičara je vjerodostojan. Meier i sur. pokazali su da 88% uzoraka obdukcije odraslih ljudi s dugogodišnjim dijabetesom tipa 1 ima znatan broj β-stanica, kao i apoptozu β-stanica i infiltraciju T-limfiocita. 25 Dakle, postojeće p-stanice potencijalni su cilj regenerativne genske terapije NeuroD1, same ili u kombinaciji s drugim faktorima transkripcije. Međutim, svaka strategija regeneracije otočića također će morati uzeti u obzir potencijalno uništenje novih otočića apoptozom, upalom ili autoimunitetom. 2 Koristili smo SP600125 za smanjenje apoptoze β-stanica i produljenje trajanja učinkovitosti nakon NeuroD1 genske terapije. Trebalo bi biti moguće kombinirati regenerativne gene s genima ili lijekovima koji inhibiraju apoptozu, 14, 26, 27, 28 i / ili autoimuni odgovor. S obzirom na ovo posljednje, nedavni dokazi govore da takrolimus i sirolimus mogu imati izravne toksične učinke na β-stanice. 29 Dakle, optimalni imunosupresivni režim zaštite otočića još uvijek nije utvrđen. Konačno, postoje važne razlike između biologije otočića glodavaca i čovjeka; 2 stoga, ove nalaze je potrebno potvrditi na životinjama višeg reda kako bi se moglo razmatrati na ljudskim ispitivanjima.

Materijali i metode

Promotori promotora inzulina i konstrukcije plazmida

Genomska DNK štakora Sprague-Dawley izvađena je iz periferne krvi štakora QIAamp Blood Blood (Qiagen Inc., Valencia, Kalifornija, SAD) prema uputama proizvođača. Fragmenti promotora gena I I štakora (-412 do +165) amplificirani su iz genomske DNK štakora Sprague – Dawley pomoću štakora. Rezultirajući DNK fragmenti subklonirani su u reporterski pDsRed1-1 (Clonetech, Mountain view, CA, SAD). hMafA cDNA i hrčak Nkx6.1 cDNA donirali su ili srdačno poklonili laboratorija Olson (East Lansing, MI, SAD) na Državnom sveučilištu Michigan i laboratorij Newgard (Durham, NC, SAD) pri Medicinskom centru Sveučilišta Duke. Štakora Ngn3 , NeuroD1 , Pax4 i Nkx2.2 cDNA bili su PCR proizvodi iz baze cDNA novorođenčeta štakora pankreasa pankreasa novorođenčeta Sprague-Dawley koji su prebačeni iz njihove ukupne RNA u skladu s uputama proizvođača. Uzorci gušterače novorođenčeta su trenutačno zamrznuti u tekućem dušiku i čuvani na −86 ° C. Zamrznuti uzorci su odmrznuti u 1 ml otopine RNA-STAT i odmah homogenizirani pomoću politronskog homogenizatora pri 10 000 o / min tijekom 30 s. Ukupna RNA (30 ng) reverzno je prepisana u 20 μl pomoću Sensiscript RT kompleta (Qiagen Inc.) s oligoom (dT) 16. Reakcijska smjesa se inkubira 50 minuta na 42 ° C, nakon čega slijedi daljnja inkubacija na 70 ° C tijekom 15 minuta. PCR je proveden za sve uzorke upotrebom GeneAmp PCR sustava 9700 (PE ABI, Foster City, CA, SAD) u 50 µl volumena koji sadrži 2 μl cDNA, 25 μl HotStarTaq Master Mix (Qiagen Inc.) i 20 pmol svakog prajmera, Odgovarajući PCR proizvodi provjereni su elektroforezom agaroznog gela i pročišćeni QIAquick gelom za ekstrakciju gela (Qiagen Inc.). Za potvrđivanje sekvence, PCR proizvodi su direktno sekvencirani pomoću dRhodamine Terminator Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA, SAD) na genomskom analizatoru ABI 3100 (Van Allen Way, Carlsbad, CA, SAD). Sve cDNA transkripcijskih gena faktora subklonirane su u RIP3.1 pokretačkom vektoru. Digestija, ligacija, subklona, ​​izolacija i pročišćavanje plazmida izvedeni su standardnim postupcima i još jednom sekvencirani kako bi se potvrdilo da nisu prisutne umjetne mutacije.

Životinjski protokoli i UTMD

Sve su studije na životinjama provedene u skladu s preporukama Nacionalnog instituta za zdravlje i nakon dobivanja odobrenja našeg lokalnog IACUC-a. Obrijani su lijevi abdomen i vrat mužjaka štakora Sprague-Dawley (230-270 g) anestezirani intraperitonealnim ketaminom (60 mg kg -1 ) i ksilazinom (5 mg kg -1 ) i polietilenskom cijevi (PE 50, Becton Dickinson), Franklin Lakes, TN, USA) ubačen je u desnu unutarnju jugularnu venu.

Ukupno 45 štakora je primljeno na jedan od devet tretmana: (1) nema tretmana (normalni kontrolni štakori, n = 3); (2) liječenje STZ-om (60 mg kg -1 po intraperitonealnom, Sigma, St Louis, MO, USA) samo bez UTMD ( n = 3); (3) liječenje STZ i UTMD s DsRed ( n = 3); (4) sa STZ i UTMD s ngn3 ( n = 6); (5) STZ i UTMD s NeuroDl ( n = 6); (6) STZ i UTMD s Pax4 ( n = 6); (7) STZ i UTMD s Nkx2.2 ( n = 6); (8) STZ i UTMD s Nkx6, 1 ( n = 6); (9) sa STZ i UTMD s MafA ( n = 6). Svi geni su isporučeni kao plazmidna cDNA pod kontrolom RIP3.1 promotora. Razina glukoze u krvi izmjerena je 12 sati nakon ubrizgavanja STZ. Životinje s razinom glukoze u krvi naglo preko 250 mg na 100 ml smatrane su uspješnim modelima dijabetesa tipa 1 i naknadno su podvrgnute UTMD-u u roku od 48 sati od STZ liječenja. Mikro mjehurići ili kontrolne otopine (0, 5 ml razrijedene sa 0, 5 ml otopine puferirane fosfatom (PBS)) infuzirane su preko 10 minuta pomoću pumpe (Genie, Kent Scientific, Torrington, CT, USA). Tijekom infuzije, ultrazvuk je usmjeren na gušteraču pomoću komercijalno dostupnog ultrazvučnog pretvarača (S3, Sonos 5500, Philips Ultrasound, Bothell, WA, USA). Sonda je bila stegnuta na mjestu. Ultrazvuk je zatim primijenjen u ultraharmoničnom načinu (prijenos 1, 3 MHz / primanje 3, 6 MHz) s mehaničkim indeksom 1, 4. Četiri pojave ultrazvuka pokrenute su na svakom četvrtom sistolu krajnjeg elektrokardiograma koristeći kašnjenje od 45–70 ms nakon vrhunca R vala. Pokazalo se da su ove postavke optimalne za isporuku plazmida od strane UTMD-a pomoću ovog instrumenta. 8 Uništavanje mjehurića bilo je vizualno vidljivo kod svih štakora. Nakon UTMD-a, jugularna vena je vezana, koža je zatvorena i životinjama je dopušteno da se oporave. Uzorci krvi uzimani su nakon preko 12-satnog brze početne vrijednosti i tijekom različitih dana nakon tretmana. Taj se protokol ponovio tri puta sa 135 štakora ubijenih u danima 10 ( n = 45), 20 ( n = 45) i 30 ( n = 45) koristeći prekomjernu dozu natrijevog pentobarbitala (120 mg kg -1 ). Za histološki pregled uzet je gušterača, jetra, slezina i bubrezi. Razina glukoze u krvi mjerena je pomoću test trake za glukozu u krvi (Precision, Abbott, Abbott Park, IL, SAD); Razine inzulina u krvi i C-peptida izmjerene su korištenjem RIA kompleta (Linco Research, Radioimmunoassay, Billerica, MA, USA).

Za 90-dnevne eksperimente, samo RIP3.1- NeuroD1 je upravljao UTMD ( n = 6), zajedno s tri normalne kontrole, kojima STZ nije dodijeljen, i tri STZ kontrole. Ovaj eksperiment je zatim ponovljen prethodnom obradom štakora sa SP600125 ( n = 6) prije UTMD-a s RIP3.1- NeuroD1 i bez takve prethodne obrade ( n = 6).

Proizvodnja mikro mjehurića koji sadrže stanicu plazmida

Mikro mjehurići stabilizirani na lipidu pripravljeni su kako je ranije opisano u našem laboratoriju. Ukratko, pripravlja se osnovna otopina koja sadrži 270 mg 1, 2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfatidilholina (Sigma), 30 mg 1, 2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfatidiletanolamin (Sigma) i 1 g glukoze. Ovi sastojci se rastvaraju u kipućoj vodenoj kupelji 20–30 minuta, s pipetiranjem sadržaja gore-dolje dok ne ostanu vidljive čestice. Ova osnovna otopina se čuva na 4 ° C. Mikro mjehurići koji sadrže plazmid pripravljaju se miješanjem 2 mg osušenog plazmida s 50 μl lipefektamina 2000 (Invitrogen, Carlsbad, Kalifornija, SAD) i inkubiranjem na sobnoj temperaturi tijekom 15 minuta. Ova smjesa liposoma ili plazmidne DNA doda se u 250 ml temeljne otopine lipida, 50 ml čistog glicerola i 5 μl 10% -tne otopine albumina, pomiješa se s pipetom i zatim se stavi u led. Alikvoti od 0, 5 ml ove otopine fosfolipid-plazmida stavljeni su u 1, 5 ml prozirne bočice; zrak u glavnom prostoru bočica zamjenjuje se perfluoropropanskim plinom (Air Products and Chemicals Inc., Allentown, PA, SAD). Each vial was incubated at 4 °C for 30 min and then mechanically shaken for 30 s by a dental amalgamator (VialmixTM, Bristol-Myers Squibb Medical Imaging, N. Billerica, MA, USA). The lipid-stabilized microbubbles appear as a milky white suspension floating on the top of a layer of liquid containing unattached plasmid DNA. The subnatant was discarded and the microbubbles were washed three times with PBS to remove unattached plasmid DNA. The mean diameter and concentration of the microbubbles in the upper layer were measured by a particle counter (Beckman Coulter, Inc., Brea, CA, USA; Multisizer III).

imunohistokemija

Cryostat sections 5–8 μm in thickness were fixed in 4% paraformaldehyde for 15 min at 4 °C and quenched for 5 min with10 m M glycine in PBS. Sections were then rinsed in PBS three times, and permeabilized with 0.5% Triton X-100 in PBS for 10 min. Sections were blocked with 10% goat serum at 37 °C for 1 hr and washed with PBS three times. The primary antibody (mouse anti-insulin antibody, 1:500 dilution (Sigma); rabbit anti-glucagon, 1:500; rabbit anti-somatostatin, 1:500; rabbit anti-pancreatic polypeptide, 1:500; rabbit anti-NeuroD1, 1:500; rabbit anti- Ki-67, rabbit anti-BrDu, 1:500; mouse anti-ck19, 1:2000 dilution (Chemicon, Temecula, CA)) was added and incubated for 2 hrs at room temperture. After washing with PBS three times for 5 min, the secondary antibody (Sigma; anti-mouse IgG conjugated with FITC; anti-rabbit lgG conjugated with Cy5, 1:500 dilution in block solution) was added and incubated for 1 hr at room temperature. Sections were rinsed with PBS for 10 min, five times, and then mounted.

Tunel staining

Tunel staining for detection and quantification of apoptosis in rat pancreas slides was performed using a commercially available kit (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN, USA) according to a standard protocol. DNA strand breaks at the single-cell level were labeled with fluorescein and imaged by fluorescence microscopy.

β-cell mass calculation

β-cell mass was evaluated by the method of Terauchi et al. 30 Sections of rat pancreas were immunostained with monoclonal mouse anti-insulin (1:500 dilution) and a second antibody, peroxidase-conjugated goat anti-mouse IgG (1:500 dilution), and developed in liquid DAB. Images from six consecutive pancreas sections were captured on a monitor screen of a digital imaging system (Olympus BX60, Nikon digital camera DXM1200C and NIS-Elements F2.30, Miami, FL, USA). The total areas of islet β-cells and whole pancreas were measured using NIH ImageJ software (NIH, Bethesda, MD, USA). β-cell mass was calculated as the ratio of β-cells to whole pancreas for six consecutive pancreatic slides from each rat.

Analiza podataka

Data were analyzed with Statview software (SAS, Cary, NC, USA). The results are expressed as mean±1s.d. Differences were analyzed by repeated measures ANOVA with Fisher's post hoc test and considered significant at P <0.05.