Resveratrol regulira homeostazu reaktivnih mitohondrijskih vrsta kisika kroz signalni put sirt3 u endotelnim stanicama ljudskog vaskularnog sustava | stanična smrt i bolest

Resveratrol regulira homeostazu reaktivnih mitohondrijskih vrsta kisika kroz signalni put sirt3 u endotelnim stanicama ljudskog vaskularnog sustava | stanična smrt i bolest

Anonim

teme

  • Kardiovaskularne bolesti
  • Stanična signalizacija
  • homeostaza
  • Prirodni proizvodi

Sažetak

Homeostaza mitohondrijskih reaktivnih kisika (mtROS) igra ključnu ulogu u sprječavanju oksidativnih ozljeda u endotelnim stanicama, što je početni korak u aterogenezi. Resveratrol (RSV) ima razne kardioprotektivne aktivnosti, međutim, malo se zna o učincima RSV-a na mtROS homeostazu u endotelnim stanicama. Sirt3 je mitohondrijalna deacetilaza koja ima ključnu ulogu u mitohondrijskoj bioenergetici i usko je povezana s oksidativnim stresom. Cilj studije je istražiti može li RSV ublažiti oksidativne povrede u endotelnim stanicama putem regulacije mtROS homeostaze putem signalnog puta Sirt3. Otkrili smo da je predobrada s RSV-om potisnutom tert-butil hidroperoksidom (t-BHP) -induciranom oksidacijskom oštećenjem endotelnih stanica pupčane vene (HUVEC) povećavajući vitalnost stanica, inhibirajući apoptozu ćelija, potiskujući kolaps potencijala mitohondrijske membrane i smanjujući stvaranje mtROS. Nadalje, enzimske aktivnosti izocitrat dehidrogenaze 2 (IDH2), glutation peroksidaza (GSH-Px) i mangan-superoksid-dismutaza (SOD2), kao i deacetiliranje SOD2, povećane su predradom RSV-a, što sugerira da je RSV znatno pojačan mtROS-skeniranje u t-BHP-u. inducirane endotelne stanice. U međuvremenu, RSV je značajno smanjio stvaranje mtROS-a promičući obogaćivanje Sirt3 unutar mitohondrija i naknadnom ugulacijom ekspresije gena ATP6, CO1, Cytb, ND2 i ND5 posredovane mitohondrijom u prednjoj glavi, što dovodi do povećane aktivnosti I aktivnosti i ATP sinteza. Nadalje, RSV je aktivirao ekspresije fosforilirane proteinske kinaze aktivirane adenozin monofosfatom (p-AMPK), gama koaktivatorom aktiviranim peroksisom proliferatorom-1 α (PGC-1 α ) i Sirt3, kao i estrogenski povezanim receptor- α (ERR α ) -odvisna transkripcija mRNA- a o Sirt3, koja je ukinuta u prisutnosti inhibitora AMPK i transfekcije AMPK , PGC-la ili Sirt3 siRNA, što ukazuje na učinke RSV na regulaciju homeostaze mtROS- a ovisili su o AMPK-PGC-1 α -ERR α - Sirt3 signalni put. Naši nalazi pokazali su novi mehanizam da je RSV-atenuirana oksidativna ozljeda u endotelnim stanicama kroz regulaciju mtROS homeostaze, koja je dijelom posredovana aktivacijom signalnog puta Sirt3.

Glavni

Aterosklerotska kardiovaskularna bolest ostaje glavni uzrok smrti u Sjedinjenim Državama. Brojna su istraživanja pokazala da je ateroskleroza (AS) rezultat produljenog i pretjeranog odgovora na ozljede krvožilnog zida, koje započinju oksidativnim oštećenjem endotela, karakterizirano endotelnom disfunkcijom. 1 Oksidativni stres, koji se može definirati kao neravnoteža između proizvodnje endogenih vrsta reaktivnih kisika (ROS) i prisutnosti antioksidacijskih molekula, jedan je od najvažnijih mehanizama koji pridonose endotelnoj disfunkciji. 2 Prepoznato je da su mitohondriji glavni izvor ROS intracelularno, a čimbenici rizika od kardiovaskularnog rizika povezani su s prekomjernom proizvodnjom mitohondrija ROS (mROS) koji potiče oksidativni stres i upale i smanjuje bioraspoloživost dušičnog oksida. Nadalje, vaskularne endotelne stanice su visoko glikolitične, a sadržaj mitohondrija je relativno nizak u usporedbi s drugim tipovima stanica s većim energetskim potrebama. 3, 4, 5 Dakle, naznačeno je da mitohondriji u endotelnim ćelijama imaju ograničenu ulogu u proizvodnji energije, ali osjetite lokalno okruženje s kojim se endotelne stanice suočavaju i orkestriraju staničnu homeostazu i funkcioniraju zahvaljujući svom kapacitetu koji proizvodi ROS, 6 mtROS u normalnom stanju sudjeluje u kritičnim signalnim putovima kako bi posredovao adaptivne odgovore i regulirao različite biološke funkcije. Međutim, prekomjerna proizvodnja mtROS može izravno inducirati endotelnu disfunkciju poticanjem proizvodnje protuupalnih citokina. Dakle, razvoj lijekova koji održavaju mtROS homeostazu mogao bi biti presudan za sprečavanje endotelne disfunkcije.

Resveratrol (3, 4 ', 5-trihidroksistilbene, RSV) je polifenolni spoj koji se nalazi uglavnom u kožama grožđa i bobičastog voća (brusnica, jagoda, murva itd.), U kikirikiju i crnom vinu. Nakupljanje dokaza upućuje na to da je RSV visoko pleiotropna molekula koja modulira obilne mete i tako utječe na brojne biokemijske i molekularne funkcije. 7 Epidemiološke studije pokazuju da je mediteranska prehrana, bogata RSV-om, povezana sa smanjenim rizikom od karotide AS. Dokazi iz kliničkih ispitivanja pokazali su da RSV može zaštititi protiv AS-a poboljšanjem ekspresije gena u vaskularnom endotelu i može se smatrati preventivnim sredstvom. 9 Prethodno smo otkrili da RSV može prodrijeti u vaskularne endotelne stanice i ublažiti endotelnu upalu inducirajući autofagiju kroz ciklički adenozin monofosfat (cAMP) signalni put. 10, 11 Unatoč tome, malo je dostupnih podataka o učincima RSV-a na regulaciju mtROS homeostaze u endotelnim stanicama.

Nedavna istraživanja sugeriraju da tiho reguliranje tipa parenja 2 homolog 3 (Sirt3) igra ključnu ulogu u regulaciji mtROS homeostaze. 12 Sirt3 je usmjeren na mitohondrijsku matricu gdje orkestrira oksidativni metabolizam mitohondrija, poput TCA ciklusa i oksidativne fosforilacije (OXPHOS), deacetilacijom raznih supstrata. Intrigantno, Sirt3 također upravlja razinom mtROS deacetilacijom glavnih mitohondrijskih antioksidacijskih enzima, uključujući mangan-superoksid-dismutazu (SOD2), izokitrat dehidrogenazu 2 (IDH2) i glutation-peroksidazu (GSH-Px), kao i komponente za mtRO lanac transporta elektrona (ETC), kao što su kompleks I i kompleks III. 13, 14 Štoviše, objavljeno je da Sirt3 djeluje kao silazna meta cilja koaktivatora-proliferatora aktiviranog proliferatorom (PPAR y ) koaktivatora-1 α (PGC-1 α ), koji izravno regulira protein kinaza aktivirana adenosinovom monofosfatom (AMPK ), čime se stimulira deacetilacija mitohondrijskih enzima koji sudjeluju u mtROS homeostazi i aktiviranju transkripcije mitohondrijalne DNA (mtDNA) posredovane glave OxA (FoxO3A) kako bi se smanjilo oksidacijsko oštećenje. 12, 15, 16 Nedavni rad naglašava kritičnu važnost Sirt3 u regulaciji energetskog metabolizma RSV tretmanom u jetri kroz poticanje aktivnosti složenih I. 17 Dakle, hipotetirali smo da RSV može ublažiti oksidativne ozljede endotelnih stanica putem regulacije mtROS homeostaze putem signalnog puta Sirt3. Kao što se i očekivalo, naši su rezultati pokazali prvi put da je RSV-atenuirana oksidirana povreda u endotelnim stanicama izazvana oksidativnim oštećenjem regulacijom mtROS homeostaze koja je, dijelom, posredovana aktivacijom signalnog puta Sirt3. Ovi rezultati pružaju nove dokaze o vaskularnim zaštitnim učincima RSV-a i mogu otvoriti nove načine pronalaženja novih lijekova koji se mogu primijeniti na endotelnu zaštitu i prevenciju AS-a.

Rezultati

Inhibicijom RS-inhibiranog oštećenja endotela izazvanog t-BHP ljudskim endotelnim stanicama pupčane vene

Kao što je prikazano na slikama la i b, tert-butil hidroperoksid (t-BHP) smanjio je životnu sposobnost stanica na način ovisan o dozi (slika 1a) i vremenski ovisan (slika 1b) u endotelnim stanicama pupčane vene kod ljudi (HUVEC). Stabilnost stanica je smanjena na 52 ± 2, 16% kada je tretirana t-BHP (80 µM ) 4 sata u odnosu na kontrolnu skupinu. Međutim, RSV-ova obrada značajno je umanjila štetni utjecaj t-BHP-a na vitalnost stanica i apoptozu u HUVEC-ovima ( P <0, 05; Slike 1c-e). I samo RSV (0, 1, 1, 10 i 15 µM ) nije imalo značajnih učinaka na vitalnost stanica i apoptozu u HUVEC-ovima ( P > 0, 05; Slike 1c-e). Štoviše, ekspresije faktora povezanih s apoptozom, uključujući faktor koji inducira apoptozu (AIF), citokrom c (Cytc), X protein (Bax) povezan s Bcl-2 i B-stanični limfom-2 (Bcl-2), izmjereni su protokom citometrijom. Kao što je prikazano na slikama 1f-h, ekspresija Baxa je značajno smanjena u mitohondrijalnoj frakciji, ali značajno povećana u citosolnoj frakciji u HUVEC-ima kada je tretirana s t-BHP, u usporedbi s kontrolom. Međutim, Bcl-2 se značajno smanjio u citosolnoj frakciji kao rezultat t-BHP tretmana, dok se činilo da nema značajnih promjena ekspresije Bcl-2 u mitohondrijskim frakcijama. Posljedično, omjer Bax / Bcl-2 nakon tretmana t-BHP značajno se smanjio u mitohondrijalnoj frakciji, ali se povećao u citosolnoj frakciji u HUVEC-ima, dok je tretman resveratrolom inhibirao t-BHP-inducirane promjene omjera Bax / Bcl-2 uzrokovane t-BHP-om i u citosolnoj i frakcije mitohondrija. U međuvremenu, RSV tretmanom smanjuje se citosolna ekspresija AIF i Cytc u endotelnim stanicama uzrokovanim t-BHP (slike 1i i j). Uzeto zajedno, ovi rezultati sugeriraju da je RSV tretman izrazito oslabio oksidacijsku ozljedu izazvanu t-BHP-om u HUVEC-u.

Image

RSV inhibira t-BHP izazvane ozljede u HUVEC. ( a i b ) Stanice su tretirane t-BHP s različitim koncentracijama (20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 i 100 μM ) 4 h ( a ) ili za različite vremenske intervale (1, 2, 4, 8, 12 i 24 h; b ), respektivno. Stanična vitalnost je određena korištenjem testa CCK-8, a podaci su izraženi kao postotak kontrole. ( c ) Spojne stanice su prethodno obrađene tijekom 2 sata s različitim koncentracijama RSV (0, 1, 0, 5, 1, 5, 10 i 15 μM ). Nakon uklanjanja supernatanta, stanice su se inkubirale sa svježim medijem u prisutnosti ili odsutnosti t-BHP (80 μM ) dodatna 4 sata. Stanična vitalnost određena je korištenjem testa CCK-8. ( d ) Reprezentativne slike protočne citometrijske analize dodatkom obojenja u aneksinu V-FITC / PI. Donji desni kvadrant predstavlja stanice obojene od aneksina V-FITC (apoptotske stanice rane faze), a gornji desni kvadrant predstavlja stanice obojene PI i aneksinom V-FITC (apoptotske / nekrotične stanice kasne faze). ( e ) Apoptotičke stanice predstavljene su kao postotak jednopozitivnih aneksina-V plus dvostruko pozitivnih stanica aneksin-V / PI. ( f ) Nakon naznačenih tretmana, stanice su sakupljene i lizirane kako bi se utvrdila citoplazmatska i mitohondrijska razina Bax i Bcl-2 pomoću Western blot analize. ( g ) Vrijednosni grafikoni prikazuju omjer Bax / Bcl-2 u citosolnoj frakciji u endotelnim stanicama. ( h ) Vrijednosni grafikoni prikazuju omjer Bax / Bcl-2 u mitohondrijalnoj frakciji u endotelnim stanicama. ( i ) Otkriveni su ekspresija AIF i CytC u citosolnoj frakciji endotelnih stanica. ( j ) Vrijednosni grafikoni prikazuju kvantifikaciju navedenih proteina. Svi su rezultati reprezentativni za tri neovisna pokusa, a vrijednosti su predstavljene kao sredstvo ± SEM ( n = 3). a P <0, 05, b P <0, 01 u odnosu na kontrolnu skupinu; c P <0, 05, d P <0, 01 u odnosu na skupinu koja je tretirana t-BHP

Slika pune veličine

Kopiranje mitohondrijskog membranskog potencijala u HUVEC-u izazvalo RSV

Učinak RSV na mitohondrijski membranski potencijal izazvan t-BHP (Δ ψ m) u HUVEC-ima izmjeren je pomoću JC-1 sonde. JC-1 može selektivno ući u mitohondrije i reverzibilno mijenja boju kako se mijenja Δ ψ m. 18 Kao što je prikazano na slikama 2a i b, došlo je do značajno povećane zelene fluorescencije u stanicama izloženim t-BHP (80 μM ; P <0, 05), što sugerira da je mitohondrijska membrana depolarizirana. Međutim, RSV (10 µM ) tretmanom potisnuo je promjene Δ ψm inducirane t-BHP-om, naznačene smanjenjem zelene fluorescencije i obnavljanjem crvene fluorescencije. Nadalje, transfekcija Sirt3 siRNA ukinula je učinke RSV na t-BHP-inducirane promjene Δ ψ m u HUVEC-ima. Ovi rezultati sugeriraju da je RSV izrazito suzbio kolaps potencijala mitohondrijske membrane izazvan t-BHP na način ovisan o Sirt3 u HUVEC-ima.

Image

Raspad mitohondrijskog membranskog potencijala u HUVEC-u potisnuo je t-BHP-om. Sirt3 je srušen transfekcijom Sirt3 siRNA kao što je opisano u odjeljku Materijali i metode. Na 24 sata nakon transfekcije, stanice su prethodno tretirane s RSV od 10 μM u trajanju od 2 sata, isprane i zatim tretirane sa ili bez t-BHP od 80 μM dodatnih 4 sata. ( a ) Određivanje Δ ψ m izvršeno je pomoću CLSM-a. Crvenu fluorescenciju emitirali su agregati JC-1 u zdravim mitohondrijama s polariziranim unutarnjim mitohondrijskim membranama, dok je zelena fluorescencija emitirana citosolnim JC-1 monomerima, što ukazuje na si ψ m disipaciju. Spojene slike označavaju zajedničku lokalizaciju JC-1 agregata i monomera. ( b ) Δ ψ m u svakoj skupini izračunato je kao omjer crvene i zelene fluorescencije. Svi su rezultati prikazani kao srednja vrijednost ± SEM za najmanje tri neovisna pokusa. b P <0, 01 u odnosu na kontrolnu skupinu; d P <0, 01 u odnosu na t-BHP tretiranu skupinu; e P <0, 05 nasuprot RSV (10 µM ) i t-BHP (80 µM ) liječenoj skupini s kontrolnom siRNA transfekcijom

Slika pune veličine

RSV atenuirana t-BHP-inducirana mitohondrijska disfunkcija inhibiranjem stvaranja mtROS-a u HUVEC-ima

Učinci RSV-a na regulaciju mitohondrijskog redoks statusa procijenjeni su korištenjem MitoSOX Red (Invitrogen, Carlsbad, CA, SAD), visoko selektivne fluorescentne sonde za detekciju O2 generirane unutar mitohondrija. MitoSOX Red reagens je živa stanica i provodi se selektivno na mitohondrije. Jednom u mitohondrijama, MitoSOX Red oksidira O2 • - i pokazuje crvenu fluorescenciju. 19 Kao što je prikazano na slikama 3a i b, t-BHP je značajno povećao stvaranje mitohondrija O2 • - u usporedbi s kontrolnom skupinom, što je znatno smanjeno RSV tretmanom ( P <0, 05). Štoviše, taj je učinak RSV naglo uklonjen transfekcijom Sirt3 siRNA.

Image

RSV oslabljena t-BHP-inducirana mitohondrijska disfunkcija inhibiranjem stvaranja mtROS-a u HUVEC-u. Stanice su transficirane s Sirt3 siRNA kao što je opisano u odjeljku Materijali i postupci. 24 sata nakon transfekcije, stanice su prethodno obrađene sa RSV (0, 1, 1 i 10 μM ) tijekom 2 sata, isprane, a zatim inkubirane svježim medijem u prisustvu ili odsutnosti t-BHP (80 μM ) za dodatnih 4 h. ( a ) Razine mitohondrija O2 procijenjene su korištenjem MitoSOX Red, a vrijednosti fluorescencije očitane su pri valnoj dužini pobuđenja od 510 nm i emisijskoj valnoj dužini od 579 nm. ( b ) Vrijednosne karte pokazuju kvantifikaciju nivoa mitohondrijala O2 izraženih kao promjena nabora u odnosu na kontrolnu skupinu. Svi su rezultati predstavljeni kao sredstvo ± SEM za najmanje tri neovisna pokusa. b P <0, 01 u odnosu na kontrolnu skupinu; c P <0, 05, d P <0, 01 u odnosu na skupinu koja je tretirana t-BHP; e P <0, 05 nasuprot RSV (10 µM ) i t-BHP (80 µM ) liječenoj skupini s kontrolnom siRNA transfekcijom

Slika pune veličine

RSV je smanjio stvaranje mtROS poticanjem aktivnosti mitohondrijalnih enzima posredovanih Sirt3 i deacetilacijom SOD2

U ovoj studiji mjereno je enzimske aktivnosti IDH2, SOD2 i GSH-Px koji su uključeni u čišćenje mtROS-a u endotelnim stanicama. Kao što je prikazano na slikama 4a-c, t-BHP je doveo do naglo smanjenih enzimskih aktivnosti IDH2, SOD2 i GSH-Px, dok je RSV tretmanom značajno oporavio ove enzimske aktivnosti ( P <0, 05). Pored toga, analiza zapadne mrlje mitohondrijskih ekstrakata s acetil-SOD2 (ac-SOD2) antitijelom otkrila je da t-BHP povećava acetilaciju SOD2, koja je potisnuta RSV tretmanom (slika 4d). Međutim, učinci RSV na uklanjanje radikala u HUVEC značajno su poništeni transfekcijom Sirt3 siRNA, što ukazuje da Sirt3 igra ključnu ulogu u uklanjanju suvišnih mtROS u HUVEC-ima tretiranim s RSV.

Image

RSV je smanjio stvaranje mtROS poticanjem aktivnosti mitohondrijalnih enzima posredovanih Sirt3 i deacetilacijom SOD2. Stanice su transficirane s Sirt3 siRNA kao što je opisano u odjeljku Materijali i postupci. Na 24 sata nakon transfekcije, stanice su prethodno tretirane s različitim koncentracijama RSV (0, 1, 1 i 10 μM ) tijekom 2 sata, a zatim su tretirane sa ili bez t-BHP od 80 μM dodatnih 4 sata. ( a - c ) Enzimske aktivnosti IDH2 ( a ), GSH-Px ( b ) i SOD2 ( c ) određene su korištenjem odgovarajućih seta za analizu, prema uputama proizvođača. ( d ) Nakon naznačenih tretmana, stanice su sakupljene i lizirane kako bi se otkrila razina proteina ac-SOD2 analizom western blota. Svi su rezultati predstavljeni kao sredstvo ± SEM za najmanje tri neovisna pokusa. a P <0, 05, b P <0, 01 u odnosu na kontrolnu skupinu; c P <0, 05, d P <0, 01 u odnosu na skupinu koja je tretirana t-BHP; e P <0, 05, f P <0, 01 nasuprot RSV (10 µM ) i t-BHP (80 µM ) liječena skupina s kontrolnom siRNA transfekcijom

Slika pune veličine

RSV je smanjio stvaranje mtROS uregulacijom Sirt3 posredovane mtDNA transkripcije

Dosadašnji nalazi pokazali su da je FoxO3A su istaložila sa Sirt3 u mitohondrijskim frakcijama stanica sisavaca. Pokazalo se da 20 za Sirt3 efikasno deacetilira FoxO3A, što je bitno za regulaciju sposobnosti vezanja FoxO3A DNA. 15 U trenutnoj studiji otkrili smo da RSV povećava ekspresiju Sirt3 (zelena fluorescencija testom imunofluorescencije) u mitohondrijama (crvena fluorescencija s crvenim mito-traktorom) u HUVEC-ima, podupirući hipotezu da RSV stimulira obogaćivanje Sirt3 u mitohondrijama (slike 5a i b), Dodatak RSV također je inducirao ekspresije mtRNA polimeraze (mtRNAPol) i FoxO3A unutar mitohondrija (Slike 5c i d). Analiza imunoprecipitacije kromatina (ChIP) pokazala je da su FoxO3A i Sirt3 istovremeno regrutovani u mtDNA tretmanom RSV, što je dovelo do ponovne regulacije mtDNA gena, uključujući ATP sintazu 6 (ATP6), citokrom c oksidazu pseudogen 1 (CO1), citokrom b (Cytb ), NADH dehidrogenaza 2 (ND2) i NADH dehidrogenaza 5 (ND5; Slike 5e i f). Štoviše, izloženost t-BHP-u rezultirala je značajnim gubitkom aktivnosti složenog I (slika 5 g) i smanjenom sintezom ATP-a (slika 5h) u HUVEC-ima ( P <0, 05), dok je prethodna obrada RSV-om znatno poboljšala t-BHP-inducirano smanjenje mitohondrija ETC funkcija. Nadalje, transfekcija Sirt3 siRNA smanjila je stimulativne učinke RSV na transkripciju mtDNA i ekspresiju kodiranih gena, zajedno sa složenom I aktivnošću i ATP sadržajem, što se može pripisati smanjenoj deacetilaciji FoxO3A posredovanoj od strane Sirt3. 21 Ovi su rezultati jasno pokazali da je RSV predobrada uzrokovala obogaćivanje Sirt3 u mitohondrijama, što je bilo potrebno za aktiviranje transkripcije mtDNA i sintezu ATP-a, što je konačno dovelo do smanjenja mtROS-a kao nusprodukta OXPHOS-a u endotelnim stanicama.

Image

RSV je smanjio stvaranje mtROS-a kroz promociju Sirt3-posredovane mtDNA transkripcije. Stanice su prethodno obrađene sa RSV (10 µM ) tijekom 2 sata, potom isprane i praćene dodatnim 4 sata sa ili bez t-BHP (80 µM ). ( a ) Reprezentativne slike pokazuju ekspresiju Sirt3 unutar mitohondrija u HUVEC-ovima imuofluorescentnim testom. Crvena fluorescencija ukazuje na mitohondrije označene s Mito-tracker Red. Zelena fluorescencija potječe od označavanja anti-Sirt3. A plava fluorescencija ukazuje na jezgre obojene DAPI. ( b ) Vrijednost grafikona pokazuje kvantifikaciju ekspresije Sirt3 u mitohondrijama. ( c ) Izrazi mtRNAPol, FoxO3A i Sirt3 u mitohondrijama određeni su od zapadne mrlje. ( d ) Vrijednost grafikona prikazuje kvantifikaciju naznačenih proteina. Sirt3 je srušen transfekcijom Sirt3 siRNA kao što je opisano u odjeljku Materijali i metode. Stanice su prethodno tretirane s RSV od 10 μM tijekom 2 sata, zatim isprane i nakon toga slijede inkubacija sa svježim medijem u prisustvu ili odsutnosti t-BHP od 80 μM tijekom dodatnih 4 sata. ( e ) Stanice su sakupljene za ChIP analizu, a novačenje FoxO3A izmjereno je PCR testom u stvarnom vremenu pomoću primera ciljanih na Sirt3 . Rezultati su prikazani u odnosu na one ukupnih ulaznih kontrola (neobrađeni kromatin). ( f ) Ekspresije gena ATP6, COl, Cytb, ND2 i ND5 kodiranih mtDNA, zajedno s genima održavanja β- aktina, GAPDH i 18s rRNA, određene su PCR testom u stvarnom vremenu. Da bi se stvorio relativni omjer ekspresije, izrazi gena koji su od interesa bili su normalizirani na geometrijski prosjek gena za domaćinstvo. ( g ) Enzimska aktivnost kompleksa I određena je pomoću odgovarajućeg kompleta za ispitivanje, prema uputama proizvođača. ( h ) Sadržaj ATP-a određen je korištenjem kompleta za određivanje ATP-a. Svi su rezultati predstavljeni kao sredstvo ± SEM za najmanje tri neovisna pokusa. a P <0, 05, b P <0, 01 u odnosu na kontrolnu skupinu; c P <0, 05, d P <0, 01 u odnosu na skupinu koja je tretirana t-BHP; e P <0, 05, f P <0, 01 nasuprot RSV (10 µM ) i t-BHP (80 µM ) liječena skupina s kontrolnom siRNA transfekcijom

Slika pune veličine

RSV aktivirani AMPK-PGC-1 α -ERR α -sirt3 signalni put u HUVECs

Kao što je prikazano na slikama 6a i b, liječenje samo RSV-om povećalo je ekspresije proteina p-AMPK, PGC-l α i Sirt3, koje su bile paralelne s povećanom ekspresijom mRNA Sirt3 (Slika 6c). Međutim, transfekcija siCRK PG-1a spriječila je indukciju Sirt3 mRNA i ekspresiju proteina u HUVEC-ima (slike 6c i d), što ukazuje da je PGC-l α potreban za aktivaciju RSV na ekspresiju Sirt3. A uloga AMPK-a dodatno je procijenjena primjenom AMPK inhibitora i agonista, kao i transfekcijom AMPK siRNA. RSV-aktivirana AMPK aktivacija inhibirana je u prisutnosti spoja C (snažnog inhibitora AMPK) od 10 µM ili AMPK siRNA, praćenog smanjenom ekspresijom PGC-l α i Sirt3. Suprotno tome, kemijska aktivacija AMPK od strane AICAR-a (500 μM ) rezultirala je pojačanom ekspresijom fosforiliranog AMPK (p-AMPK) i PGC-1 α (slike 6e i f). Ovi rezultati podrazumijevaju da je AMPK-PGC-1 α -sirt3 os bila bitna za učinak RSV na regulaciju mtROS homeostaze u endotelnim stanicama.

Image

RSV je stimulirao AMPK-PGC-1 α -ERR α -Sirt3 signalni put u HUVEC. ( a ) Stanice su prethodno tretirane s RSV (0, 1, 1 i 10 µM ) tijekom 2 sata, a zatim su tretirane sa ili bez t-BHP od 80 µM kroz dodatna 4 sata. Stanice su sakupljene i lizirane da bi se utvrdila razina proteina AMPK, p-AMPK, PGC-1 a i Sirt3 testom Western blot. ( b ) Vrijedne karte pokazuju kvantifikaciju navedenih proteina. Stanice su transficirane PGC-la siRNA kao što je opisano u odjeljku Materijali i postupci. ( c ) Razine mRNA gena Sirt3 određene su PCR testom u stvarnom vremenu. ( d ) Stanice su sakupljene i lizirane, a razina proteina Sirt3 otkrivena je analizom western blota. Stanice su prethodno inkubirane sa spojem C (10 µM ), AMPK siRNA ili AICAR (500 µM ) kako je opisano u odjeljku Materijali i postupci. Zatim su stanice prethodno obrađene sa RSV od 10 µM tijekom 2 sata, nakon čega je slijedila inkubacija u prisustvu ili odsutnosti t-BHP od 80 µM tijekom dodatnih 4 sata. ( e ) Izrazi AMPK, p-AMPK i PGC-l α izmjereni su western blotom. ( f ) Vrijedne karte pokazuju kvantifikaciju navedenih proteina. Stanice su transfencirane PGC-la siRNA kao što je opisano u odjeljku Materijali i postupci. Na 24 sata nakon transfekcije, stanice su prethodno obrađene sa RSV od 10 μM tijekom 2 sata, a zatim su tretirane sa ili bez t-BHP od 80 μM dodatnih 4 sata. ( g ) Stanice su sakupljene primjenom ChIP testa, a PCR test u stvarnom vremenu je proveden pomoću primera specifičnih za promotor Sirt3 . Rezultati su određeni u odnosu na ukupne ulazne kontrole (neobrađeni kromatin). ( h ) Stanice su kofeficirane s pRL-TK reporter plazmidom suplementiranim ERRE-luc ili NEG-PG04 (kontrola vehikla), respektivno. ERR α srušen je ERRα siRNA transfekcijom, kako je opisano u odjeljku Materijali i metode. I zatim su stanice prethodno obrađene sa RSV od 10 µM tijekom 2 sata, nakon čega je slijedila obrada sa ili bez t-BHP od 80 µM tijekom dodatnih 4 sata. Aktivnosti krijesnica i luciferaze Renilla mjereno su uzastopno koristeći sustav reportera Dual-Glo luciferaze. Svi su rezultati predstavljeni kao sredstvo ± SEM za najmanje tri neovisna pokusa. a P <0, 05, b P <0, 01 u odnosu na kontrolnu skupinu; c P <0, 05, d P <0, 01 u odnosu na t-BHP tretiranu skupinu; e P <0, 05, f P <0, 01 nasuprot RSV (10 µM ) i t-BHP (80 µM ) liječena skupina s kontrolnom siRNA transfekcijom

Slika pune veličine

Nadalje, pokazano je da estrogenski povezani receptor- a (ERR α ) ne samo da djeluje kao meta nizme PGC-1 α , već je ko-aktivira ovaj transkripcijski koaktivator. 22 Dakle, izveli smo test luciferaze kako bismo utvrdili da li se aktiviranje Sirt3 mRNA RSV-om dogodilo putem PGC-1 α- ovisnog ERR α vezanja na Sirt3 promotor. Transficirali smo HUVECs reportorom ERRE-luc koji sadrži fragment promotora Sirt3 spojen na reporterski gen luciferaze. Nisu mjerene aktivnosti luciferaze krijesnica u grupi nosača, što sugerira da su aktivnosti luciferaze u stanicama kofeficirane s ERRE-luc i pRL-TK vektorom specifične. Kao što je prikazano na slici 6 g, izlaganje t-BHP rezultira smanjenom aktivnošću luciferaze u usporedbi s kontrolnom skupinom ( P <0, 05). Suprotno tome, RSV tretman je značajno povećao ERRE posredovanu aktivnost Sirt3 transkripcije, dok je ovaj učinak umanjen dodatkom PGC-la siRNA. Ovi rezultati otkrili su da je RSV aktivirana Sirt3 mRNA transkripcija putem PGC-1 α- ovisnog ERR α- posredovanog signalnog puta.

Pored toga, napravili smo test ChIP-a (Thermo Scientific, Waltham, MA, SAD) kako bismo potvrdili da je vremenski utjecaj RSV aktivirao vezivanje ERR α na Sirt3 promotor. Kao što je prikazano na slici 6h, t-BHP je inhibirao pojačavanje fragmenta promotora Sirt3 koji sadrži ERRE, dok je predradnja RSV povećala njegovo pojačavanje, učinak koji je ukinut ERRα siRNA transfekcijom. Nalazi su jasno pokazali da ERR α igra važnu ulogu u posredovanju PGC-1 α- inducirane Sirt3 ekspresije. Općenito, čini se da je AMPK-PGC-1 α -ERR α -Sirt3 signalni put potreban za mVROS induciranu mtROS homeostazu i kasnije oksidativne ozljede endotelnih stanica.

Rasprava

Rezultati ovog istraživanja po prvi put podržavaju model kojim RSV aktivira AMPK-PGC-1 α signalizaciju, koja je potrebna za ERR α- ovisnu Sirt3 transkripciju i kasnije obogaćivanje unutar mitohondrija. To zauzvrat dovodi do deacetilacije i aktiviranja enzima koji uklanjaju mitohondrijalne radikale i transkripcije gena kodiranih mtDNA i sinteze ATP-a, što konačno pridonosi mtROS homeostazi u HUVEC-ima (Slika 7). Naši nalazi pokazuju ključnu ulogu Sirt3 u inhibicijskim učincima RSV-a na oksidativne ozljede endotelnih stanica, pružajući tako novi uvid u kardiovaskularne prednosti RSV-a.

Image

Predloženi mehanizam za RSV u regulaciji mtROS homeostaze kroz Sirt3 signalni put u HUVEC. RSV pokreće signalni put AMPK-PGC-1 α , koji je potreban za ERR α- ovisnu transkripciju Sirt3 i kasnije obogaćivanje unutar mitohondrija, što dovodi do deacetilacije i aktiviranja mitohondrijskih enzima koji su uključeni u regulaciju mtROS, kao i poticanja učinkovitosti mitohondrija ETC-om putem regulacija mcDNA-kodirane ekspresije gena i ATP sinteza, što je konačno pridonijelo mtROS homeostazi u HUVEC-ima. Ja, složen sam; II, kompleks II; III, kompleks III; IV, kompleks IV; Enzimi V, ATP sintaze; Q, CoQ; Cytc, citokrom c

Slika pune veličine

Povećani oksidativni stres igra važnu ulogu u patogenezi kardiovaskularnih bolesti. Trenutno istraživanje usredotočeno je na ulogu RSV-a u endotelnim stanicama uzrokovanim oksidacijskim stresom. Oksidativni stres posljedica je poremećaja stanične redoks homeostaze, koji je dalje povezan s brojnim štetnim posljedicama za stanicu (npr. Peroksidacija lipida ili čak stanična smrt) i može igrati kritičnu ulogu u endotelnoj disfunkciji. 14 U ovoj studiji, t-BHP, analog kratkog lanca lipidnih hidroperoksida, korišten je kao pro-oksidacijsko sredstvo za izazivanje oksidativnog stresa u endotelnim stanicama. Peroksi radikali mogu se stvoriti iz t-BHP u citosolu njegovom interakcijom s željeznim željezom u reakciji sličnoj Fentonovoj reakciji, što dovodi do ozljede mitohondrija. Rezultati sugeriraju da t-BHP smanjuje vitalnost stanica i povećava apoptozu u endotelnim ćelijama, praćeno depolariziranom ψ ψm i prekomjernom stvaranjem O2 u mitohondrijama, koje su znatno oslabljene tretmanom RSV-a. Ovi nalazi otkrili su RSV-posredovani farmakološki učinak predkondicioniranja u endotelnim stanicama.

Poznato je da je povećani ROS iz žila u patološkim uvjetima glavni uzrok endotelne disfunkcije. Dokazi govore da su mitohondriji glavni izvor ROS-a, a na homeostatsku regulaciju mtROS utječu različiti enzimi uključeni u trikarboksilnu kiselinu (TCA), ETC, OXPHOS i sisteme uklanjanja slobodnih radikala u mitohondrijama. 23, 24 Poznato mjesto proizvodnje mtROS-a je mitohondrijalni ETC, posebno kompleksi I i III, gdje se O2 • - formira i nakon toga smanjuje dismutacijom na H202. H20 može reagirati sa reduciranim Fe2 + i Cu2 + da proizvode visoko toksične hidroksilne radikale (· OH), a mogu prodrijeti i kroz membrane i napustiti mitohondrije. O2 • -, H2O2 i · OH smatraju se primarnim ROS-om. Sustav čišćenja mtROS uglavnom uključuje SOD2, sustav glutationa i tioredoksina, koji održavaju normalan omjer GSH / GSSG, NADPH / NADP + i NADH / NAD + . U trenutnoj studiji, liječenje RSV-om rezultira pojačanim enzimskim aktivnostima IDH2, GSH-Px i SOD2, koji su potrebni za uklanjanje prekomjernog mtROS-a u mitohondrijama. Štoviše, MitoSOX Red, visoko selektivna fluorescentna sonda za O2 • - unutar mitohondrija, primijenjena je za otkrivanje mtROS-a i ROS generiran u mitohondrijima, tako da se može razlikovati od citoplazmatskih i egzogenih izvora.

Sirtuini su enzimi ovisni o NAD +, koji su primijenjeni u širokom rasponu fizioloških i patofizioloških stanja kroz deacetilaciju brojnih supstrata. Sirtuini su važni regulatori fiziologije sisavaca i imaju različite razine aktivnosti deaktilaze proteina deacetilaza od NAD + . 25, 26 Pokazano je da Sirt3 regulira metabolizam mitohondrija deacetilacijom nekoliko enzima koji sudjeluju u oksidaciji masnih kiselina, sintezi ketonskog tijela, TCA, OXPHOS, stvaranju ROS-a i tako dalje. Proteomska istraživanja pokazala su da nekoliko podjedinica enzima u mitohondrijalnom ETC i TCA ciklusu ima višestruka mjesta modifikacije acetilacije, a povećana acetilacija primijećena je u tkivima Sirt3 / /, što ukazuje da aktivnosti enzima mogu regulirati Sirt3. 27, 28, 29 Pored toga, miševi kojima nedostaje Sirt3 pokazali su upečatljivu hiperacetilaciju mitohondrijskih proteina, koji su bili povezani s ubrzanim razvojem metaboličkog sindroma. 30, 31, 32 Our current findings suggested that RSV promotes SOD2 deacetylation in mitochondria, which was suppressed by Sirt3 siRNA transfection, suggesting that Sirt3 plays a critical role in RSV-induced deacetylation in endothelial cells. SOD2 expression is believed to be an important cellular defense mechanism against to oxidative stress, whereas SOD2 deacetylation enhances mitochondrial scavenging capacity. 33, 34

Recent studies have revealed that Sirt3 is involved in mtDNA transcription. 35 Sirt3 mediates FoxO3A binding to mtDNA, and transcription of mitochondrial-encoded core or catalytic subunits of the OXPHOS machinery increases respiration, which in turn decreases the byproducts of mitochondrial electron transfer reactions from the incomplete reduction of oxygen. The decrease of mitochondrial ETC efficiency and ATP synthesis affects mtROS homeostasis, and alterations in mitochondrial physiology can increase the ATP/ROS ratio. A favorable balance in the ATP/ROS ratio may represent a common mechanism for extending the life span. Mitochondria in mammals undergoing caloric and dietary restrictions have been reported to show increased ATP/ROS ratios, in which cells generate the same amount of ATP with reduced oxidative stress and damage, with potential beneficial effects on life span. 36 A similar positive effect on the ATP/ROS ratio was detected in adult flies, in which mitochondrial uncoupling in neurons was increased, and the life span extended. 37 Interventions that maintain a beneficial mitochondrial ATP/ROS ratio could provide therapeutic opportunities for extending healthy life span and preventing disease. 38 A previous study suggested that FoxO3A phosphorylation may be important for its mitochondrial import, and that once in the mitochondria, FoxO3A forms a complex with Sirt3 and mtRNAPol to activate transcription. 35 As expected, RSV triggered the enrichment of Sirt3 in the mitochondria and activated the transcription of mtDNA-encoded OXPHOS units, which might be crucial for improving mitochondrial ETC efficiency (eg, increased enzymatic activity of complex I) and reducing ROS generation, leading to sustained mtROS homeostasis. Our findings thus revealed a novel mechanism whereby RSV induction leads to an appropriate balance between mitochondrial energy production and mtROS generation, which is in turn responsible for the homeostatic regulation of redox status in HUVECs.

An expanding body of preclinical evidence suggests that RSV is associated with potential health benefits. Oral administration of RSV resulted in enhanced agonist-stimulated, endothelium-dependent relaxation in animal experiments 39 and human trials; 40 however, the exact molecular mechanisms remain unknown. To investigate the mechanism of RSV-induced Sirt3 activation, we examined the activation of AMPK and PGC-1 α , sensors of energy molecules. AMPK, which is known to act as a fuel gauge and a master switch regulating glucose and lipid metabolism, senses metabolic stress and integrates diverse physiological signals to restore the energy balance. 41, 42 It also serves as a regulator of cell survival or death in response to pathological stresses, such as hypoxia, osmotic stress and oxidative stress. 43 AMPK thus plays a key role in intracellular metabolism and is an attractive therapeutic target, especially for energy-related diseases. 44 In addition, fasting or nutrient excess may trigger the switching on/off of AMPK, which leads to alteration in PGC-1 α activity. 45 Furthermore, a previous report suggested that PGC-1 α stimulated mouse Sirt3 activity in both muscle cells and hepatocytes, 46 indicating that PGC-1 α acts as an endogenous regulator of Sirt3. We therefore postulated that RSV regulates mtROS homeostasis through activation of the AMPK-PGC-1 α -Sirt3 axis. As expected, our results demonstrated that RSV triggered AMPK phosphorylation and activation, which are required for PGC-1 α expression. PGC-1 α activated ERR α to cause ERR α coupling with ERRE in the Sirt3 promoter region, leading to Sirt3 mRNA transcription. These results are supported by those of Kong and colleagues. 46 The AMPK-PGC-1/ α -Sirt3 signaling pathway could be a key route in the regulation of mtROS homeostasis by RSV treatment in endothelial cells.

HUVECs were used in the study, though there might be differences between the endothelial cells from arterial and venous system. 47, 48, 49 The first and most important difference between the two is the arteriovenous oxygen difference. As well, the endothelial cells in arteries and veins might be exposed to other different physical conditions (eg, shear stress). However, the extent to which mitochondrial physiology varies in the endothelium of different tissues is unknown, although certainly some mitochondrial functions, such as mtDNA repair ability, appear to differ even among pulmonary arterial, venous and microvascular endothelial cells. 50 On the opposite, both of the arterial and venous mitochondria in endothelial cells share similar characteristics. Particularly, the endothelial mitochondria from the arteries and veins are both proposed as the central oxygen sensors of local environments. 51 Furthermore, from the perspective of developmental biology, it was found that arterial and venous endothelial cells have molecularly defined identities that are evident before circulatory flow or even tubulogenesis. 52 Although AS only occurs in arteries but never in veins (mainly attributed to the higher blood pressure in arteries), isolation of vascular endothelial cells from veins (such as HUVECs) is commonly applied in several in vitro studies. Indeed, endothelial cells can also be harvested from arterier tissues, such as from the large vessels by mechanical removal or collagenase digestion, 53 or from human internal mammary arteries obtained from donors undergoing coronary artery bypass graft surgery. 54 However, direct study of vascular endothelial function in humans is also difficult in part because of limited access to arteries. Therefore, access to peripheral veins is more practical and the umbilical vein has been used due to its wide availability. To our knowledge, use of cells collected from veins to study the endothelial cells is a widespread way at present, even if the arterial-venous differences in endothelial cells might be present.

In conclusion, the results of this study provide novel insights into the interpretation of the potential mechanisms responsible for the homeostatic regulation of mtROS levels by RSV in endothelial cells, in which Sirt3 plays a key role. These results may provide valuable clues in the search for new drugs that can be applied to endothelial protection.

Materijali i metode

Kemikalije i antitijela

Cell culture media HyQ M199/EBSS (M199) and fetal bovine serum were provided from HyClone Laboratories (Logan, UT, USA). RSV, t-BHP, dimethylsulfoxide (DMSO) and compound C were purchased from Sigma–Aldrich (St. Louis, MO, USA). The 5, 5, '6, 6'-tetrachloro-1, 1', 3, 3'-tetraethylbenzimidazolylcarbocyanine iodide (JC-1), 5-aminoimidazole-4-carboxamide 1- β -D-ribofuranoside (AICAR) and the antibody against β -actin were purchased from Beyotime Institute of Biotechnology (Beyotime Biotech, Beijing, China). A cell counting kit (CCK-8) was purchased from Dojindo Laboratories (Dojindo Molecular Technologies, Rockville, MD, USA). Antibodies against PGC-1 α , Sirt3, Bcl-2, Bax, AIF and Cytc, mtRNAPol, FoxO3A, caspase 3, phosphorylated adenosine monophosphate-activated protein kinase (p-AMPK) and AMPK were obtained from Cell Signaling Technology (Beverly, MA, USA). MitoSOX Red mitochondrial superoxide indicator for live-cell imaging was obtained from Life Technologies (San Diego, CA, USA).

Stanična kultura

HUVECs were isolated from umbilical veins from fresh cords obtained at normal deliveries as reported before. 55 The study protocol was approved by the Ethics Review Committee of Third Military Medical University. The cells purity was identified >95% by immunofluorescence with specific anti-von Willebrand factor (vWF) antibody. HUVECs were cultured with M199 medium supplemented with 10% fetal bovine serum at 37 °C in a humidified atmosphere containing 5% CO 2 . All experiments were performed on the cells following 3–6 passages when the cells reached 80–90% confluence.

Analiza vitalnosti stanica

Cell viability was measured by the CCK-8 assay according to the manufacturer's protocol. Briefly, cells were seeded in a 96-well microplate at a density of 8 × 10 3 cells per well and then treated with different doses (20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 and 100 μ M) of t-BHP for 4 h. Meanwhile, cells were exposed to t-BHP of 80 μ M for different time intervals (1, 2, 4, 8, 12 and 24 h). In addition, cells were preincubated with RSV for 2 h at a series of concentrations (0.1, 0.5, 1, 5, 10 and 15 μ M, respectively). After removing the supernatant, cells were treated with or without t-BHP of 80 μ M for an additional 4 h. The control group was treated with 0.2% DMSO. Subsequently, CCK-8 solution (10 μ l/well) was added to each well and the plate was incubated at 37 °C for 2 h. The absorbance was measured using a monochromator microplate reader (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA) at a wavelength of 450 nm. The percentage of living cells was calculated by the ratio of the optical density of the experimental cells to that of the normal cells (set as 100%).

Citometrijska analiza protoka

Cell apoptosis was detected with annexin-V-fluorescein isothiocyanate (FITC) apoptosis detection kit (Beyotime Biotech, Beijing, China) as described by the manufacture's instructions. Briefly, cells were pretreated with different concentrations of RSV (0.1, 1 and 10 μ M) for 2 h, washed, and then treated with or without t-BHP (80 μ M) for another 4 h. Thereafter, cells were collected and washed with ice-cold PBS twice, gently resuspended in the binding buffer and incubated with annexin V-FITC and propidium iodide (PI) for 15 min in dark. Cells were analyzed on a FACScan flow cytometer (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA). The total apoptosis rate of cells was calculated as the sum of the rates of cells observed in the lower-right quadrant and the upper-right quadrant.

Separation of cytosolic and mitochondrial fractions

The cytosolic and mitochondrial fractions were isolated as described. 56 Briefly, 1 × 10 7 cells were harvested by centrifugation at 800 × g , washed in PBS and re-pelleted. Cells were digitonin-permeablilized for 5 min on ice at a density of 3 × 10 7 /ml in cytosolic extraction buffer (75 mM NaCl, 1 mM NaH 2 PO 4, 8 mM Na 2 HPO 4, 250 mM sucrose, 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF), 5 μ g/ml leupeptin, 5 μ g/ml aprotinin and 0.05% digitonin). Following the centrifugation step at 800 × g at 4 °C for 10 min, the supernatant was separated from the pellet comprising mitochondria and cellular debris. The supernatant containing cytoplasmic protein was further purified by centrifugation at 13 000 × g at 4 °C for 10 min. The precipitated mitochondrial fractions were collected and quantified for the protein content (3.5 mg/ml). And then, the pellets were solubilized in the same volume of mitochondrial lysis buffer (50 mM Tris (pH 7.4), 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 2 mM EGTA, 0.2% Triton X-100, 0.3% NP-40, 1 mM PMSF, 5 μ g/ml leupeptin and 5 μ g/ml aprotinin). After centrifugation at 12 000 × g at 4 °C for 10 min, supernatants were collected and used as the mitochondrial fraction, precipitation were collected and used as the cytoplasmic fraction.

Western blotting

Cells were collected by scraping with ice-cold PBS containing PMSF, and were lysed in the buffer. The protein concentration of the lysates was determined by Bradford method. Protein (80 mg for each sample) was separated by sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel (SDS-PAGE) and transferred to nitrocellulose membranes. After blocking (4% non-fat milk), the membranes were probed with the indicated primary antibody overnight at 4 °C, washed and incubated with a 1 : 6000 dilution of horseradish peroxidase (HRP)-conjugated secondary antibody for 1 h. The proteins were visualized by enhanced chemiluminescence (ECL; Amersham, UK) reagents for 1 min and exposed to CL-Xposure film (Pierce, Rockford, IL, USA). Finally, the blots were scanned, and densitometric analysis was performed on the scanning images using Scion Image-Release Beta 4.02 software (Scion Corporation, Frederick, MD, USA).

Smetnje RNA

The siRNAs for AMPK (human, sc-45312), PGC-1α (human, sc-38884), estrogen-related receptor α ( ERRα ; human, sc-44706) and Sirt3 (human, sc-61555) along with control siRNA (human, sc-44230) and siRNA transfection reagent (human, sc-29528) were purchased from Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA). HUVECs were transfected with 100 nM siRNA for 5–7 h according to the manufacturer's protocol. Then, cells were switched into fresh complete medium and incubated for an additional 24 h. Thereafter, cells were harvested for further experiments.

Mitochondrial membrane potential (Δ ψ m) determination

Mitochondrial membrane potential (Δ ψ m) was detected using the fluorescent, lipophilic dye, JC-1. JC-1 can easily penetrate cells with healthy mitochondria. A green fluorescent JC-1 probe exists as a monomer at low membrane potentials; however, at higher potentials, JC-1 forms red-fluorescent 'J-aggregates'. The cells were incubated with 5 mg/l JC-1 for 1 h, washed twice with PBS and resuspended in the serum-free medium. The fluorescence intensity was determined by confocal laser scanning microscope (CLSM; model TCS SP2; Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Germany). For simultaneous visualization of the green fluorescence from JC-1 monomer and the red fluorescence from JC-1 J-aggregates, a long pass filter system was used (excitation lines 488 and 561 nm). Fixed exposure time and laser intensities were used during all acquisitions. The quantitative analysis of the red/green fluorescence signal was detected and the built-in evaluation software (Leica LAS AF Lite, Mannheim, Germany) was used for calculation. The ratio of green (JC-1 monomers) and red fluorescence (JC-1 J-aggregates) were measured within randomly selected cells. In both the experimental and control groups 30 individual cells were measured in six identical cultures. All data were statistically evaluated using the Mann–Whitney test and the Kolmogorov–Smirnov test. The Δ ψ m was represented as the ratio of red to green fluorescence intensity.

Mitochondrial O 2 •− assessment

The mitochondrial O 2 •− generation was assessed using the MitoSOX Red (Invitrogen), a highly selective fluorescent probe for the detection of O 2 •− generated within mitochondria. HUVECs were added to glass coverslips at 8 × 10 3 cells per well and were treated as indicated. MitoSOX Red reagent stock solution was diluted with HBSS/Ca/Mg buffer to make a working solution of 5 μ M. Then, cells were incubated with 5 μ M MitoSOX Red reagent in dark at 37 °C for 10 min. Cells were washed gently three times with warm buffer and were stained with counterstains as desired amount for imaging. Fluorescence intensities of mtROS were determined using an Infinite M200 microplate reader (Tecan Group Ltd., Männedorf, Switzerland) and images were visualized by a CLSM (model TCS SP2; Leica Microsystems GmbH) with the emission wavelength of 579 nm and the excitation wavelength of 510 nm, respectively.

Mitochondrial enzyme activities

The enzyme activities of complex I, IDH2, SOD2 and GSH-Px were assessed in mitochondrial homogenates, which contained protease inhibitors only. The complex I activity was measured with complex I enzyme activity microplate assay kit (Abcam, Cambridge, UK) and its activity was determined from the oxidation of reduced nicotinamide adenine dinucleotide (NADH/NAD + ) to NAD + . The IDH2 activity was assayed by IDH activity assay kit (Sigma–Aldrich) with a temperature-controlled spectrofluorometer (Hitachi F-4500, Tokyo, Japan) at the excitation wavelength of 366 nm and emission wavelength of 450 nm. And the activities of SOD2 and GSH-Px in the mitochondria were determined by commercial assay kits purchased from Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute (Nanjing, Jiangsu, China), according to the manufacturer's instructions, respectively.

Immunoprecipitation of acetyl lysine-modified SOD2

Mitochondrial proteins (150 μ g) were incubated at 4 °C with 5 μ g of antibody against acetyl lysine (K68) SOD2 (ac-SOD2; Cambridge, MA, USA) in a total volume of 250 μ l for 24 h. Following addition of protein A/G-agarose (50 μ l; Santa Cruz Biotechnology) the solution was incubated for 2 h at 4 °C, centrifuged and the agarose complexes extensively washed with Tris-buffered saline containing 0.05% (v/v) Tween 20 (Sigma–Aldrich). Pellets were stored at −20 °C until further analysis by SDS-PAGE.

Immunofluorescence imaging

Confluent HUVECs were grown on glass coverslips and then harvested. The slides were incubated with the Mito-Tracker Red (Invitrogen) of 80 nM for 20 min, and then were fixed with 4% (v/v) paraformaldehyde for 20 min at 37 °C and permeabilized with 0.1% Triton X-100 for 10 min at room temperature. The slides were blocked with PBS supplemented with 0.1% (w/v) BSA and 0.1% (w/v) Tween 20, thereafter, incubated with anti-Sirt3 antibody (1 : 50 dilution) overnight at 4 °C. After washing with PBS, the slides were incubated for 1 h at room temperature with a FITC-conjugated secondary antibody (1 : 1000 dilution; Molecular Probes, Eugene, OR, USA). Finally, the slides were washed twice with PBS and the nuclei were counterstained with 4′, 6′-diamidino-2-phenylindole (DAPI) for 5 min at room temperature. Images of the stained cells were obtained using CLSM (model TCS SP2; Leica Microsystems GmbH) and the intracellular fluorescence intensity was expressed as the percentage relative to the control group (set as 100%), respectively.

PCR u stvarnom vremenu

Total cellular RNA was extracted by Trizol RNA isolation kit (Invitrogen) according to the manufacture's protocol. Then, cDNA was synthesized from 1 μ g RNA for each sample with random primers according to the protocol of Invitrogen. Quantitative real-time PCR was performed on the iQ5 multicolor real-time PCR detection system (Bio-Rad, Hertfordshire, UK) with specific primers (Table 1). All primers were designed by the software Primer Premier 5.0 and synthesized by Invitrogen (Shanghai, China). In the reaction, 1 μ l cDNA of each sample was mixed with SYBR Green JumpStart Taq ReadyMix (Fisher Scientific, Atlanta, GA, USA) according to the manufacture's instructions. And the PCR conditions: denaturation step of 5 min at 95 °C; amplification for 40 cycles (denaturation: 30 s at 95 °C; annealing: 30 s at corresponding temperature; extension: 30 s at 72°C); final extension for 7 min at 72°C. All the samples have three parallel wells and the experiments were repeated at least three times. The melt-curve analysis was used to confirm specific product formation. Housekeeping genes used in this study were β -actin, glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) and 18s ribosomal RNA (18s rRNA). In order to generate a relative expression ratio, the mRNA level of the gene of interest was normalized to the geometric average mRNA level of the housekeeping genes.

Tablica pune veličine

Chromatin immunoprecipitation analysis of genomic and mtDNA

ChIP analysis for genomic DNA and mtDNA was performed with Pierce Agarose ChIP kit as described previously with minor modifications. 57 Briefly, formaldehyde was added directly to tissue culture medium to a final concentration of 1%. Cross-linking was allowed to proceed for 15 min at room temperature and then stopped by the addition of glycine to a final concentration of 0.125 M. Cross-linked cells were scraped, washed with PBS, and then lysed in CLB (10 mM Tris (pH 8.0), 10 mM NaCl and 0.2% NP-40) with protease inhibitors (1 mM phenylmethylsulphonylfluoride, 5 mM NaF, 1 mM Na 3 VO 4, 1, 5 μ M pepstatin, 2 μ M leupeptin, 10 μ g/ml aprotinin, 1 mM NaB and 40 μ M bestatin). The mitochondrial fraction was enriched and lysed by mitochondrial lysis buffer (50 mM Tris–Cl pH 8.1, 10 mM EDTA and 1% SDS) or purified using the Qproteome mitochondria isolation kit (Qiagen, Valencia, CA, USA). The chromatin solution was sonicated, cleared by centrifugation and the supernatant was collected; 1% of the supernatant was taken as input. Five micrograms of antibody per point was used to immunoprecipitate chromatin-bound complexes. Immunoprecipitation was performed on a rotating platform overnight at 4 °C. Antibodies against PGC-1 α (for genomic DNA) and Sirt3 (for mtDNA) were used for ChIP analysis, respectively. And the monoclonal IgG was used as unrelated antibodies. Immunocomplexes were pulled down using protein G (GE Healthcare, Milwaukee, WI, USA). Following extensive washing, bound DNA was reverse cross-linked and purified, then analyzed by real-time PCR assay as described previously. 44 The primers for Sirt3 promotor was 5′-AGTAAGACCCGAGGTAGGAG-3′ (forward) and 5′-GGAATAAGAGGGATGACAGA-3′ (reverse).

Adenosine triphosphate quantification

HUVECs were grown on glass coverslips at a density of 1.0 × 10 6 cells per well and then harvested. Cells were treated as indicated, then ATP content was measured using an ATP determination kit (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) according to the manufacturer's instructions. Briefly, the cells were washed twice in PBS and lysed with 500 μ l of 0.2 M HCLO 4 and centrifuged at 5000 × g for 10 min. The supernatant was mixed with the ATP determination kit reaction buffer containing luciferin and luciferase. After gentle mixing, the readings for the above mixtures were taken with the luminometer (Turner Designs, Sunnyvale, CA, USA). ATP contents were calculated by using an ATP standard curve.

Analiza luciferaze

HUVECs (1 × 10 5 cells per well) were maintained in 24-well plates until 60–70% confluence. Transient transfection was preformed by Lipofectamine 2000 (Invitrogen) transfection reagent according to the manufacturer's protocol. Briefly, cells were co-transfected with 0.2 μ g/well of estrogen receptor response element (ERRE)-luc plasmid HPRM24033-PG04 (Promega, Madison, WI, USA; Supplementary Figure 1A) and pRL-TK reporter plasmid (Promega; Supplementary Figure 1B), respectively. The mass of transfected plasmids was balanced with empty vector NEG-PG04 (Promega; Supplementary Figure 1C). After transfection for 48 h, cells were treated with RSV (10 μ M) for 2 h and followed by t-BHP (80 μ M) treatment for an additional 4 h. Thereafter, cells were lysed and both of the firefly and Renilla luciferase activities were measured sequentially with the Dual-Glo luciferase reporter assay system (Promega) according to the manufacturer's instructions.

Statistička analiza

All the experiments were performed at least three times and results are expressed as the mean±SEM Raw data were analyzed with SPSS 13.0 software (Chicago, IL, USA). Statistical analysis for multiple group comparisons was performed by one-way analysis of variance, followed by post hoc least significant difference tests. Dvostrana P- vrijednost <0, 05 smatrana je statistički značajnom.

Dodatna informacija

Datoteke slika

  1. 1.

    Dopunska slika 1

Glosar

ACO

aconitase

AIF

faktor koji izaziva apoptozu

AMPK

adenosine monophosphate-activated protein kinase

KAO

ateroskleroza

ATP

adenozin trifosfat

ATP6

ATP synthase 6

Bax

Bcl-2-associated X protein

Bcl-2

B-cell lymphoma-2

BSA

albumin od goveđeg seruma

CAD

cardiovascular disease

CCK-8

cell counting kit

cDNA

complementary DNA

Čip

Kromatinske imunoprecipitacije

CO1

cytochrome c oxidase pseudogene 1

Cytb

cytochrome b

Cytc

Cytochrome c

DAPI

4′, 6′-diamidino-2-phenylindole

DMSO

dimethylsulfoxide

ETC

electron transport chain

ETFDH

electron transfer flavoprotein dehydrogenase

ERR α

estrogen-related receptor α

ERRE

estrogen receptor response element

FITC

fluorescein isothiocyanate

FoxO3A

Forkhead box O3A

GAPHD

glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase

GPD2

glycerol phosphate dehydrogenase

GSSG

oxidized glutathione

GSH-Px

glutathione peroxidase

HUVECs

endotelne stanice humane pupčane vene

IDH2

isocitrate dehydrogenase 2

JC-1

5, 5, '6, 6'-tetrachloro-1, 1', 3, 3'-tetraethylbenzimidazolylcarbocyanine iodide

KGDH

α -keto glutaric dehydrogenase

mtROS

mitochondrial reactive oxygen species

NAD +

nicotinamide adenine nucleotide, oxidized form

NADPH

nicotinamide adenine dinucleotide, reduced form

ND2

NADH dehydrogenase 2

ND5

NADH dehydrogenase 5

OXPHOS

oksidativne fosforilacije

PDH

pyruvate dehydrogenase

PGC-1 α

peroxisome proliferator-activated receptor- γ coactivator-1 α

PI

propidium iodide

ROS

reaktivne vrste kisika

RSV

resveratrol

SDS-PAGE

sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel

siRNK

small-interfering RNA

Sirt3

silent mating-type information regulation 2 homolog 3

SOD2

manganese superoxide dismutase

t-BHP

tert-butyl hydroperoxide

TCA

trikarboksilna kiselina

Δ ψ m

mitochondrial membrane potential

Dodatne informacije nalaze se u ovom radu na web stranici Cell Death and Disease (//www.nature.com/cddis)