Protein retinoblastoma (rb) kao anti-apoptotički faktor: potrebna je ekspresija rb za anti-apoptotičku funkciju proteina vrećice 1 u kolorektalnim tumorskim stanicama | stanična smrt i bolest

Protein retinoblastoma (rb) kao anti-apoptotički faktor: potrebna je ekspresija rb za anti-apoptotičku funkciju proteina vrećice 1 u kolorektalnim tumorskim stanicama | stanična smrt i bolest

Anonim

teme

  • apoptoza
  • Genetika raka
  • Rak debelog crijeva
  • Ciljane terapije

Sažetak

Iako je gen osjetljivosti na retinoblastom inaktiviran u širokom rasponu humanih tumora, kod kolorektalnog karcinoma, funkcija proteina retinoblastoma (Rb) često se čuva, a RB lokus se čak pojačava. Važno je da smo ranije pokazali da Rb djeluje s anti-apoptotičkim bcl-2 povezanim proteinima atanogena 1 (BAG-1), koji je izrazito izražen u kolorektalnoj karcinogenezi. Ovdje prvi put pokazujemo da je ekspresija Rb kritična za anti-apoptotičku aktivnost BAG-1 u stanicama kolorektalnog tumora. Pokazujemo da ekspresija Rb ne samo da povećava nuklearnu lokalizaciju anti-apoptotičkog proteina BAG-1, već je ta ekspresija Rb potrebna za inhibiciju apoptoze pomoću BAG-1, i u γ- ozračenom Saos-2 staničnoj liniji osteosarkoma i kolorektalnoj stanične linije adenoma i karcinoma. Nadalje, u skladu s činjenicom da je za nuklearni BAG-1 prethodno pokazano da potiče preživljavanje stanica povećanjem nuklearnog faktora (NF) - κ B aktivnosti, pokazujemo da je sposobnost BAG-1 da promiče aktivnost NF- κ B značajno inhibirana. potiskivanjem Rb ekspresije. Uzeto zajedno, predstavljeni podaci sugeriraju novu funkciju za Rb, promičući preživljavanje stanica reguliranjem funkcije BAG-1. Kako je BAG-1 izrazito izražen u većini kolorektalnih tumora, ciljanje Rb-BAG-1 kompleksa za promicanje apoptoze ima uzbudljiv potencijal za budući terapeutski razvoj.

Glavni

Evazija apoptoze je znak raka i doprinosi razvoju tumora i vatrostalnoj prirodi tumora u liječenju. 1 Razumijevanje molekularnih osnova otpornosti na apoptozu u stanicama kolorektalnog karcinoma je neophodno ako želimo identificirati nove ciljeve u prevenciji i liječenju kolorektalnog karcinoma.

Retinoblastoma protein (Rb) je dobro utvrđen protein-supresorski protein, koji regulira prijelaz restriktivne točke u staničnom ciklusu. Smatra se da je Rb aktivnost važna i za određivanje sudbine ćelije; Poznato je da Rb stupa u interakciju sa transkripcijskim faktorima specifičnim za rodove, uključujući PU.1 i Id2 (eritroidni razvoj), Runx2 (razvoj kostiju), MyoD (mišić) i Pdx1 (razvoj gušterače). 2, 3 Nadalje, pokazalo se da je gubitak funkcije Rb nedavno dovoljan da izazove nekontroliranu proliferaciju u populaciji matičnih stanica. 4, 5, 6 Međutim, očigledno u suprotnosti s njegovom ulogom proteina klasičnog tumora, stanice kolorektalnog karcinoma zadržavaju ekspresiju proteina-supresira tumora retinoblastoma (Rb); oni pokazuju visoku razinu Rb u usporedbi s susjednim normalnim tkivom, a gubici ili mutacije gena RB su rijetki. 7, 8 Nadalje, studija Ali i sur. 9 je prvi otkrio da tumori debelog crijeva izražavaju potpuno normalne transkripte gena retinoblastoma. 9 Sada je poznato da se funkcija Rb gotovo uvijek očuva, a RB lokus se ponekad čak i pojačava kod kolorektalnog karcinoma. 10, 11

Velik dio rada na funkciji Rb u kolorektalnoj karcinogenezi usredotočio se na njegovu sposobnost inhibicije transkripcije ovisne o E2F. Treba napomenuti, nedavna studija je pripisala zadržavanje funkcije Rb u stanicama kolorektalnog karcinoma njegovu sposobnost potiskivanja inaktivacije β- katenina ovisne o E2F-1. 10, 12 Međutim, također je dobro utvrđeno da ekspresija Rb može pospješiti opstanak stanica potiskivanjem apoptoze izazvane E2F. U stvari, Rb je prvi put prepoznat kao anti-apoptotičan u RB1- knockout miševima, za koje je nađeno da nisu vitalni zbog opsežne apoptoze neuronskih i hematopoetskih stanica. 14, 15, 16 Nadalje, prijavljeno je da su stanice s nedostatkom Rb osjetljivije na apoptozu nego stanice s potpuno funkcionalnom ekspresijom Rb, 17, 18 i Rb inhibiraju staničnu smrt induciranu agentima koji oštećuju DNK. 19, 20 Iako su mnoge studije anti-apoptotičku aktivnost Rb pripisale represiji funkcije E2F-1, u novije vrijeme također se navodi da surađuje s E2F u aktiviranju pro-apoptotičkih gena kao odgovor na genotoksični stres. 21 Sadašnji dokazi sugeriraju da bi status Rb mogao biti kritičan u utjecaju na osjetljivost stanica kolorektalnog tumora na apoptozu. U tom je kontekstu zanimljivo da je i Rb pokazao da djeluje s drugim proteinima koji sudjeluju u regulaciji apoptoze, uključujući anti-apoptotički protein Bcl-2 povezan athanogen 1 (BAG-1), visoko eksprimiran u stanicama kolorektalne tumore. 22, 23

BAG-1 je otkriven kao novi regulator apoptoze zbog njegove sposobnosti da se veže za Bcl-2. 24 Studije su pokazale da je BAG-1 višenamjenski protein uključen u brojne ključne stanične procese, uključujući proliferaciju, diferencijaciju, stanični ciklus, transkripciju i apoptozu. 25, 26 Karakterizira ga BAG domena, BAG-1 je član porodice srodnih proteina kojih ima najmanje šest ljudi. 27 Ljudski BAG-1 gen kodira tri BAG-1 izoforme, BAG-1S (p36), BAG-1M (p46) i BAG-1L (p50), generirane alternativnim mehanizmima prevođenja iz jedne mRNA. 28, 29 Različiti BAG-1 izoforme imaju različite subcelularne lokalizacije u stanici. Rane studije izvijestile su da je manji od izoforma BAG-1S poželjno smješten u citoplazmi, da se izoforma BAG-1M otkriva i u nuklearnom i u citoplazmatskom odjelu, a izoforma BAG-1L nalazi se u jezgri. 28, 30, 31, 32 Razlika u subcelularnoj lokalizaciji izoforma BAG-1 se barem dijelom prenosi signalom nuklearne lokalizacije koji je prisutan u N-terminusu izoforme BAG-1L, ali nije prisutan BAG-1S i skraćen u BAG-1M izoformu. 28, 31, 32, 33 Napominjemo da se, suprotno objavljenoj literaturi, lokalizacija manjih BAG-1 izoforma u kolorektalnim stanicama tumora razlikuje od ostalih tkiva, pri čemu je izoforma BAG-1M pretežno nuklearna, a izoforma BAG-1S koji pokazuju nuklearnu i citoplazmatsku lokalizaciju. 34 Kumulativni rezultat je prevladavajuća nuklearna lokalizacija endogenog BAG-1 proteina u stanicama kolorektalnog epitela (važno za transkripcijsku funkciju proteina 26 ); prethodno povezana s lošom prognozom kolorektalnog karcinoma. 35

BAG-1 je važan protein za preživljavanje u tumorigenezi; Pokazano je da je prekomjerno izražen u velikom broju karcinoma 29 i da inhibira apoptozu kod različitih različitih tipova stanica. 25 Prekomjerno izraženo u kolorektalnom adenomu i karcinomskom tkivu, 23 nuklearnih BAG-1 korelira s lošom prognozom 35 i pospješuje preživljavanje tumorskih stanica. 34 Zanimljivo, funkcija BAG-1 povezana je s promicanjem aktivnosti nuklearnog faktora (NF) - κ B signalnog puta za preživljavanje, 23, a otkriveno je da djeluje kao ko-regulator ekspresije gena kroz interakciju s p50- p50 NF- κ B kompleksa, 36 što sugerira potencijalno važnu ulogu za BAG-1 NF- κ B kompleks u kolorektalnoj karcinogenezi. Nadalje, nedavno je rečeno da je ekspresija BAG-1 kritična odrednica u sprečavanju c-MYC-inducirane apoptoze, 37 što dodatno naglašava potencijalnu važnost BAG-1 funkcije u kolorektalnoj karcinogenezi.

Kao što smo prethodno ustanovili da anti-apoptotski BAG-1 protein djeluje u interakciji s Rb, ostalo je pitanje da li je ekspresija Rb uključena u anti-apoptotičku funkciju BAG-1 u tumorskim stanicama. Ovdje prvi put pokazujemo da je ekspresija Rb zapravo potrebna da BAG-1 inhibira γ -zračenje uzrokovanu staničnu smrt i u Saos-2 osteosarkomu i u stanicama kolorektalnog karcinoma. U skladu s činjenicom da je ranije pokazano da BAG-1 potiče opstanak stanica povećanjem aktivnosti faktora transkripcije NF- κB , 23 sposobnost BAG-1L da poveća NF- κ B aktivnost značajno je inhibirana na represiju Rb ekspresije koristeći siRNA pristup. Uzeto zajedno, predstavljeni podaci sugeriraju novu funkciju za Rb, promičući opstanak stanica zahvaljujući njegovoj sposobnosti promicanja funkcije proteina BAG-1. Budući da je BAG-1 izrazito izražen u kolorektalnim adenomima kasne faze i kolorektalnim karcinomima, ciljanje stanične interakcije Rb / BAG-1 može pružiti selektivni mehanizam za suzbijanje pro-preživljavanja funkcija Rb i BAG-1 i povećati osjetljivost stanice kolorektalnog karcinoma do trenutnih terapijskih režima.

Rezultati

Rb povećava nuklearnu lokalizaciju i funkciju BAG-1 u Saos-2 stanicama dobivenim od osteosarkoma

Kako se Rb eksprimira u stanicama kolorektalnog karcinoma, postalo je hipoteza da ekspresija Rb može pridonijeti preživljavanju tumorskih stanica reguliranjem funkcije anti-apoptotičkog proteina BAG-1. Provedeni su početni eksperimenti kako bi se utvrdilo je li Rb uključen u subcelularnu lokalizaciju i prema tome funkciju proteina BAG-1. Za ove eksperimente koristili smo modelni sustav za usporedbu lokalizacije i funkcije BAG-1 u prisutnosti i odsutnosti Rb ekspresije. Saos-2 stanice osteosarkoma (koje su Rb null) korištene su za stvaranje inducibilnog Rb ekspresijskog sustava, označenog Saos-2 / Rb / DC / R5, koji sadrže Tet / na inducibilni RB1- ekspresijski vektor 38 (ljubazni poklon od S Weintraub, Washington, SAD). Indukcija ekspresije Rb u Saos-2 stanicama dovodi do povećanja nuklearne lokalizacije endogenog BAG-1 proteina (Slika 1a). Da bismo istražili je li promjena u subcelularnoj lokalizaciji posljedica interakcije s Rb, fragmenti koji se vežu za BAG-1 (Rb-ABC) i ne-vežući (Rb-C) Rb fragmenti (stabilno izraženi i karakterizirani 22 ) bili su stabilno izraženi u Saos- Određene su 2 stanice i određena je subcelularna lokalizacija endogenog BAG-1 proteina. Nuklearna lokalizacija fragmenata Rb potvrđena je frakcijom stanica (Slika 1bii). Ekspresija fragmenta koji se veže za BAG-1 povećala je nuklearnu lokalizaciju endogenog BAG-1, dok nepovezujući fragment nije uspio promijeniti lokalizaciju proteina BAG-1 (Slika 1bi). Uzeto zajedno, ovi podaci pokazuju da ekspresija Rb povećava nuklearnu lokalizaciju BAG-1 proteina u Saos-2 stanicama.

Image

( a ) Ekspresija Rb povećava nuklearnu lokalizaciju BAG-1 u Saos-2 stanicama. (ai) Konfokalno snimanje koje pokazuje ekspresiju Rb i BAG-1 u tretmanu Saos-2 / Rb / DC / R5 ± 24 h sa 1 μg / ml Dox. DAPI je korišten za pokazivanje nuklearnih mrlja. (aii) Indukciju ekspresije Rb na liječenju Doxom potvrdila je Western blot; α -tubulin korišten je kao kontrola opterećenja. ( b ) Ekspresija BAG-1 vezanja, ali ne i neobvezujući Rb fragment, povećava nuklearnu lokalizaciju BAG-1 u Saos-2 stanicama. (bi) Konfokalno snimanje stanica Saos-2 stabilno transficirano samo vektorom pCDNA3.1, fragmenta Rb-ABC (BAG-1) ili Rb-C (ne-vežući), što sugerira da učinak vezanja Rb regulira subcelularna lokalizacija endogenog BAG-1 proteina; Za demonstriranje nuklearnih mrlja korišten je DAPI. (bii) Nuklearna lokalizacija oba Rb fragmenta potvrđena je staničnom frakcijom. PARP je korišten kao kontrola nuklearnih proteina. ( c ) BAG-1 može potencirati aktivnost NF- κ B u stanicama Saos-2 nakon ekspresije Rb proteina. (ci) Indukcija NF- κ B aktivnosti, pomoću izvještaja luciferaze, stimulirana s 10 ng / ml TNFa, tokom 16 h u stanicama Saos-2 / Rb / DC / R5. Rezultati su izraženi u postotnom porastu u odnosu na aktivnost NF- k B u TNF α- tretiranim Rb nulto Saos-2 / Rb / DC / R5 stanicama, u kojima je endogena BAG-1 ekspresija potisnuta pomoću siRNA. Podaci predstavljaju sredinu tri neovisna eksperimenta ± SD i statističke razlike određene analizom varijance (ANOVA) s replikacijom, ** P <0, 01 i * P <0, 05. (cii) Western blot koji pokazuje ekspresiju Rb u staničnoj liniji Saos-2 / Rb / DC / R5 gdje se Rb protein inducira tretmanom 1 μg / ml Dox (trake 3 i 4), BAG-1 ekspresija pokazuje BAG -1 supresija proteina siRNA (trake 1 i 3) i endogena BAG-1 ekspresija u nekodiranoj negativnoj kontroli (trake 2 i 4). Izraz α -tubulina prikazan je kao kontrola punjenja

Slika pune veličine

Da bismo odredili može li ekspresija Rb regulirati nuklearnu aktivnost BAG-1, ispitali smo sposobnost Rb proteina da povećava NF- κ B aktivaciju ovisnu o BAG-1 (uključenu u funkciju proživljavanja BAG-1 22 ). U tim eksperimentima istraživali smo učinak ekspresije Rb na endogenu BAG-1 aktivnost; srušili smo BAG-1 aktivnost pomoću siRNA u Saos-2 / Rb / DC / R5 stanicama (± 24 h doksiciklina (Dox)). Te stanice su transfektirane s NF- κB reporter konstruktom, stimulirane faktorom nekroze tumora α (TNF α ) (10 ng / ml) i aktiviranjem NF- κ B utvrđenim nakon 16 h (Slika 1ci). Zanimljivo je da je aktivnost reportera NF- κB bila značajno povećana kada su endogene razine BAG-1 izražene u prisutnosti Rb proteina (Slika 1ci, traka 4). Stoga ovi rezultati sugeriraju da ekspresija Rb u stanicama Saos-2 ne samo da je povećala nuklearnu lokalizaciju BAG-1, već je i značajno povećala nuklearnu funkciju BAG-1, što pokazuje aktiviranje NF- κ B.

Rb povećava nuklearnu lokalizaciju i funkciju BAG-1 u stanicama kolorektalnog karcinoma

Kako nas je zanimala funkcija Rb u kolorektalnim epitelnim stanicama, utvrdili smo da li je ekspresija Rb uključena u pretežnu nuklearnu lokalizaciju ukupnog BAG-1 proteina u kolorektalnim tumorskim stanicama. RNAi pristup korišten je za suzbijanje ekspresije Rb u staničnoj liniji kolorektalnog karcinoma SW480 i konfokalno snimanje kako bi se istražilo subcelularno lokaliziranje proteina BAG-1 (Slika 2a). Utvrđeno je da kada je potisnuta ekspresija Rb došlo je do pomaka od prevladavajuće nuklearne lokalizacije endogenog BAG-1 proteina do ravnomjernije raspodjele proteina BAG-1 u stanici (Slika 2a - rezultati prikazani za jednu Rb siRNA slijed, dobiveni su paralelni rezultati za drugi slijed, ukupne razine ekspresije BAG-1 se nisu mijenjale (Slika 2aii)). Uz to, u skladu s prethodnim nalazima, 22 gubitak vezanja Rb ekspresijom proteina HPV-E7 također je smanjio ukupnu nuklearnu lokalizaciju endogenog BAG-1 proteina u stanicama koje su dobivene kolorektalnim adenomom (Slika 2b). Nadalje, od zanimljivosti je primijetiti da ovaj in vitro nalaz modelira in vivo lokalizaciju proteina Rb i BAG-1 u normalnoj kripti kolonije. Kao što je prikazano na slici 2c, ekspresija nuklearnog fosfoproteina Rb na dnu normalne kripte (prikazana plavom strelicom) podudara se s prevladavajućom nuklearnom lokalizacijom proteina BAG-1 (prikazan crvenom strelicom). Na vrhu kripte (prema lumenu), gdje je Rb ekspresija smanjena, 39 lokalizacija proteina BAG-1 je citoplamičnija (prikazana crnom strelicom). Iako je relativna, relativna subcelularna raspodjela proteina in vivo podržava in vitro nalaz da Rb povećava nuklearnu lokalizaciju BAG-1.

Image

( a ) Supresija ekspresije Rb u stanicama SW480 smanjuje nuklearnu lokalizaciju BAG-1 proteina. (ai) Konfokalno slikanje koje pokazuje Rb i BAG-1 ekspresiju u SW480 ćelijama gdje je Rb ekspresija potisnuta korištenjem siRNA. Za demonstriranje nuklearnih mrlja korišten je DAPI. Pokazalo se da samo sekundarno antitijelo kontrolira nespecifično bojenje. (aii) Western blot koji potvrđuje smanjenje ekspresije Rb u stanicama tretiranim siRNA. Napominjemo da ukupne razine BAG-1 nisu regulirane suzbijanjem Rb ekspresije. α -tubulin se koristi kao kontrola opterećenja. ( b ) HPV-E7 ekspresija smanjuje ukupnu nuklearnu lokalizaciju endogenog BAG-1 proteina u stanicama koje potiču od kolorektalnog adenoma. Konfokalno snimanje koje pokazuje Rb i BAG-1 ekspresiju u RG / C2 ćelijama koje eksprimiraju ili HPV-E7 protein (RG / C2 / RE7) ili vektorsku kontrolu (RG / C2 / Neo). DAPI se pokazao nuklearnim bojenjem. Pokazalo se da samo sekundarno antitijelo kontrolira nespecifično bojenje. ( c ) Ekspresija Rb i BAG-1 proteina u normalnoj kripti kolonije. Odjeljci tkiva normalnog epitela debelog crijeva obojeni Rb antitijelom (ci), pokazujući različitu obojenost za Rb. Intenzivnije bojenje nalazi se na dnu kripte (plava strelica) i s antitijelom TB-3 Bag-1 (cii), što pokazuje da je nuklearno bojenje BAG-1 intenzivnije na dnu kripte (crvena strelica) ) i još citoplazme na vrhu kripte (crna strelica). ( d ) Rb ekspresija je potrebna za pojačavanje TNF- a- inducirane NF- κB aktivnosti pomoću BAG-1 u SW480 ćelijama. (di) Indukcija aktivnosti NF- k B, pomoću izvještaja luciferaze, stimulirana s 100 ng / ml TNFa, tokom 16 h u SW480 stanicama u kojima je BAG-1 i / ili Rb ekspresija potisnuta siRNA. Rezultati su izraženi u postotnom porastu u odnosu na aktivnost NF- k B u stanicama SW480 tretiranim TNF a-om , u kojima je endogena ekspresija BAG-1 i Rb suzbijena pomoću siRNA. Podaci predstavljaju sredinu tri neovisna eksperimenta ± SD, statističke razlike određene ANOVA-om s replikacijom i Tukeyevim post-hoc testom, ** P <0, 01 i *** P <0, 001. (dii) Western blot koji pokazuje ekspresiju Rb i BAG-1 u stanicama SW480 transficiranim siRNA, gdje je ekspresija Rb potisnuta (trake 1 i 2) i ekspresija BAG-1 (oba staza 1 i 3) u oba slučaja, u usporedbi s negativna kontrola koja ne kodira. Izraz α -tubulina prikazan je kao kontrola punjenja

Slika pune veličine

Da bismo istražili je li ekspresija Rb potrebna i za pojačavanje aktivnosti TNF α- inducirane NF- κ B pomoću BAG-1 u kolorektalnim epitelnim stanicama (kao što je prikazano u Saos-2 stanicama, Slika 1c), istraživali smo razinu TNF- a - inducirana aktivnost NF- k B u stanicama SW480, u kojima je ekspresija BAG-1 i Rb bila potisnuta (Slika 2d). Ovaj pristup nam je omogućio da odredimo ulogu endogene razine ekspresije Rb na aktivnost BAG-1 u stanicama kolorektalnog tumora. Za ove eksperimente, BAG-1 i / ili Rb ekspresija je potisnuta siRNA, stanice su transfektirane s NF- κB reporter konstruktom i stimulirane sa 100 ng / ml TNF α (Slika 2d). Važno je da su se BAG-1 i Rb proteini zajedno eksprimirali u stanicama, došlo je do značajnog porasta aktivnosti NF- κB (slika 2di, traka 4). Ovi nalazi sugeriraju da su i BAG-1 i Rb ekspresija potrebni za pojačanu TNF a- induciranu aktivaciju NF- κ B u kolorektalnim epitelijskim stanicama kako se nalaze u stanicama Saos-2.

Ekspresija Rb potrebna je za anti-apoptotičku funkciju BAG-1L u γ- zračenim Saos-2 tumorskih stanica

Ranije smo izvijestili da BAG-1 inhibira apoptozu uzrokovanu γ -zračenjem u stanicama kolorektalnog epitela. 34 Kako je otkriveno da Rb povećava nuklearnu lokalizaciju i funkciju proteina BAG-1 (vidi sliku 1), željeli smo istražiti da li je ekspresija Rb u Saos-2 stanicama potrebna za inhibiciju γ -ovisne o BAG-1 zračenje izazvano apoptozom. Da bi se ovo ispitalo, BAG-1L je eksprimiran u stanicama Saos-2 / Rb / DC / R5 (± Dox) tretiranim zračenjem od 10 Gy, a apoptoza je procijenjena (pokazano cijepanjem kaspaze 3 i PARP, kao što je prethodno detaljno opisano, 40, 41 Slika 3aiii). Zanimljivo je da je, usprkos postizanju visoke razine ekspresije (Slika 3aii), isključivo nuklearno lokalizirani BAG-1L izoform bio u stanju značajno inhibirati apoptozu izazvanu zračenjem u stanicama Saos-2 / Rb / DC / R5 tretirane Dox-om kada je Rb izražen (Slika 3ai, traka 4), u skladu sa zahtjevom za Rb ekspresiju za anti-apoptotičku funkciju BAG-1L. Ovi podaci ističu da nuklearna lokalizacija čak i visokih razina BAG-1 nije dovoljna da inhibira apoptozu izazvanu zračenjem u odsutnosti ekspresije proteina Rb, i naglašavaju da je ekspresija Rb potrebna za inhibiciju apoptoze izazvane radijacijom pomoću BAG-1 u Saos-2 stanice.

Image

( a ) Prekomjerna ekspresija nuklearno lokalizirane BAG-1L izoforme samo inhibira radijacijsku apoptozu u Saos-2 stanicama na ekspresiju Rb proteina. (ai) Indukcija apoptoze u staničnoj liniji Saos-2 / Rb / DC / R5, 72 sata nakon izlaganja zračenju od 10 Gy γ . Stanice su stabilno transficirane praznim ekspresijskim vektorom Iresneo2 ili Bag-1L, sa ili bez ekspresije Rb proteina nakon tretiranja s 1 μg / ml Dox. Rezultati predstavljaju sredstva tri neovisna eksperimenta ± SD, statističke razlike određene ANOVA-om s replikacijom i Tukeyevim post-hoc testom, ** P <0, 01 i * P <0, 05. (aii) Western blot koji pokazuje ekspresiju Rb u neinduciranoj (trake 1 i 2) ili doks tretiranoj (1 μ g / ml) Saos-2 / Rb / DC / R5 (trake 3 i 4), BAG-1 izraz u stanicama koje su stabilno transficirane ili Iresneo2 vektorskom kontrolom (trake 1 i 3) ili Bag-1L (trake 2 i 4). Izraz α -tubulina prikazan je kao kontrola opterećenja. (aiii) Western blot pokazuje cijepljeni PARP i kaspazu 3, potvrđujući apoptozu u ozračenim stanicama. Izraz α -tubulina prikazan je kao kontrola opterećenja. ( b ) Izražavanje BAG-1L izoforme označene GFP-om koja pokazuje nuklearnu lokalizaciju proteina. Saos-2 stanice prolazno su transficirane sa vretenom označenom GFP-om, potvrđujući nuklearnu lokalizaciju egzogenog BAG-1L proteina u odsutnosti Rb ekspresije. Nuklearno bojenje pokazuje DAPI

Slika pune veličine

Ekspresija Rb potrebna je za anti-apoptotičku funkciju BAG-1L u stanicama kolorektalnog tumora

Kako nas zanima regulacija apoptoze izazvane oštećenjem DNA u stanicama kolorektalnog tumora, bilo je važno utvrditi je li Rb ekspresija potrebna i za anti-apoptotičku aktivnost BAG-1 u kolorektalnim epitelnim stanicama. 34 Da bi se odredila funkcija Rb, apoptotički odgovor ozračenih stanica SW480 uspoređivan je s onima u kojima je ekspresija BAG-1 i Rb bila potisnuta (Slika 4a). Stanice su transficirane s BAG-1 i Rb siRNA ili jednakim negativnim kontrolnim kodovima; prikazana je indukcija apoptoze 72 sata nakon 5 Gy γ- zračenja (rezultati su prikazani za pojedinačne sekvence, za dodatne sekvence dobiveni su paralelni rezultati, podaci nisu prikazani). Ekspresija endogenih razina BAG-1 u prisutnosti Rb (slika 4ai, traka 4) rezultirala je značajnim smanjenjem apoptoze u ozračenim SW480 stanicama; Dalje naglašavajući da BAG-1 i Rb djeluju zajedno kako bi suzbili γ -zračenje izazvanu apoptozu u SW480 stanicama dobivenim od kolorektalnog karcinoma.

Image

( a ) Ekspresija Rb potrebna je za anti-apoptotičku funkciju BAG-1 u ozračenim SW480 stanicama. (ai) Indukcija apoptoze u staničnoj liniji SW480 72 h nakon izlaganja zračenju od 5 Gy γ . Stanice su prolazno transficirane s Rb i Bag-1 siRNA 72 h prije nego što su bile izložene zračenju. Apoptoza je uspoređena u stanicama koje su transficirane s Rb, Bag-1 i / ili s negativnom kontrolnom siRNA. Rezultati predstavljaju sredstva tri neovisna eksperimenta ± SD, statističke razlike određene ANOVA-om s replikacijom i Tukeyevim post-hoc testom, ** P <0, 01 i * P <0, 05. (aii) Western blot koji pokazuje ekspresiju Rb i BAG-1 u stanicama SW480 tretiranim s Rb siRNA (trake 1 i 2) i / ili BAG-1 siRNA (trake 1 i 3). Kontrole su transficirane s relevantnim nekodirajućim negativnim siRNA. Izraz α -tubulina korišten je kao kontrola opterećenja. ( b ) Interakcija Rb-BAG-1 potrebna je za anti-apoptotičku funkciju Bag-1 u stanicama dobivenim RG / C2 kolorektalnim adenom. (bi) indukciju apoptoze u RG / C2 / E7 i RG / C2 / Neo staničnim linijama 72 h nakon izlaganja zračenju od 5 Gy γ . Stanice su stabilno transficirane s Iresneo2 (vektor) ili s ekspresijom Bag-1L. Rezultati predstavljaju sredstva tri neovisna eksperimenta ± SD, statističke razlike određene ANOVA-om s replikacijom i Tukeyevim post-hoc testom, *** P <0, 001. (bii) Western blot koji pokazuje Rb i BAG-1 ekspresiju u RG / C2 / RE7 staničnoj liniji i kontrolira RG / C2 / Neo. Stanice se stabilno transficiraju ili Bag-1L (trake 2 i 4) ili Iresneo2 vektorskom kontrolom (trake 1 i 3). Izraz α -tubulina korišten je kao kontrola opterećenja. Napominjemo, stabilna ekspresija proteina HPV-E7 nije smanjila razinu ekspresije Rb u tim stanicama (kao što je ranije izviješteno 22 )

Slika pune veličine

Da bismo potvrdili da je potrebna interakcija između Rb i BAG-1 da bi zaštitili stanice od apoptoze izazvane zračenjem, proučavali smo osjetljivost na zračenje RG / C2 stanica stabilno izražavajući HPV-E7, za kojeg je ranije izvješteno da prekida interakciju Rb / BAG-1, Napominjemo, ekspresija proteina HPV-E7 nije dovela do razgradnje proteina Rb u tim stanicama (slika 4bii), kao što je prethodno opisano. 22 Kako je ranije pokazano da je HPV-E7 ekspresija blokirala formiranje kompleksa BAG-1L-Rb, uspjeli smo se pozabaviti pitanjem da li nuklearni BAG-1 zahtijeva interakciju s proteinom Rb da bi potisnuo apoptozu u stanicama. Stanice su bile izložene zračenju od 5 Gy γ , a apoptoza je procijenjena 72 sata nakon tretmana (slika 4b). Važno je da je prekomjerna ekspresija BAG-1L bila sposobna zaštititi stanice od apoptoze izazvane zračenjem u kontrolnim RG / C2 / Neo stanicama (Rb funkcija divljih vrsta). Suprotno tome, ekspresija proteina E7 blokirala je anti-apoptotičku aktivnost proteina BAG-1L (slika 4bi), podupirući hipotezu da je interakcija između Rb i BAG-1 potrebna za ulogu preživljavanja BAG-1L u ozračene stanice.

Rasprava

Rb djeluje kao kritični koordinator u stanicama, a njegove višestruke uloge osiguravaju staničnu i tkivnu homoeostazu. 11 Iako dobro utvrđen protein-supresorski protein, intrigantno ekspresija Rb se ne gubi u kolorektalnoj karcinogenezi, 10, 11 sugerirajući da je funkcija Rb važna za razvoj kolorektalnog tumora. U stvari, izviješteno je da Rb djeluje kao faktor preživljavanja u velikom broju različitih tipova stanica. Stoga zadržavanje ekspresije Rb može biti korisno za ostale karcinome, kao i za kolorektalni karcinom, barem dok tumorske stanice ne dobiju druge mutacije koje blokiraju put stanica-smrti. 11 Mehanizam putem kojeg Rb može podržati tumorigenezu ostaje u potpunosti razjašnjen. U tom kontekstu bio je zanimljiv naš prethodni nalaz da Rb djeluje s anti-apoptotičkim proteinima BAG-1. Kako je za BAG-1 prijavljeno da je važan faktor preživljavanja u velikom broju različitih vrsta raka, uključujući kolorektalni karcinom, 23, 29, predložili smo da ekspresija Rb može povećati anti-apoptotičku funkciju BAG-1. Uzbudljivo, podaci predstavljeni u ovoj studiji pokazuju da je ekspresija Rb zapravo potrebna za anti-apoptotičku funkciju BAG-1, ne samo u staničnim linijama tumora debelog crijeva, već i u staničnoj liniji Saos-2 osteosarkoma. Ovo otkriće ne samo da ističe novu ulogu za Rb, promovirajući anti-apoptotičku funkciju proteina BAG-1 u stanicama kolorektalnog tumora, već također implicira da kompleks Rb-BAG-1 može biti važan u širem kontekstu, promovirajući aberant preživljavanje specifičnih tipova tumorskih stanica gdje Rb ne djeluje kao klasični gen supresor tumora.

Zanimljivo je da je u stanicama kolorektalnog karcinoma objavljeno da Rb potiče razvoj tumora sprečavanjem inhibicije transkripcije p- katenina E2F-1. Pokazano je da deregulacija E2F-1 deregulacijom E2F-1 suzbija aktivnost p- katenina u adenomatoznoj polipozi coli (APC) / glikogen sintaza kinazi-3 (GSK3) -ovisno, smanjujući ekspresiju ključnih ciljeva β- katenina, uključujući c- myc. Predloženo je da ova interakcija objašnjava zašto kolorektalni tumori, koji ovise o transkripciji β- katenina zbog njihove nenormalne proliferacije, zadržavaju RB1 netaknutom. 10 U ovom radu pokazujemo da je Rb funkcija potrebna i za anti-apoptotičku funkciju BAG-1 i predlažemo da osim regulacije aktivnosti E2F-1, Rb može utjecati i na sudbinu kolorektalnih tumorskih stanica interakcijom s BAG-1, Ovaj nalaz je od daljnjeg značaja za kolorektalnu karcinogenezu u svjetlu nedavnog izvještaja da ekspresija BAG-1 štiti stanice od c-MYC-inducirane apoptoze. Objavljeno je da je blokiranje BAG-1 dovoljno za pretvaranje stanica iz MYC-proliferacije u MYC-induciranu apoptozu. 37 Dakle, kako se c-MYC deregulira rano u kolorektalnoj karcinogenezi nakon aktivacije p- kateninom, predlažemo da ekspresija Rb može biti presudna i za inhibiciju apoptoze izazvane MYC promicanjem aktivnosti preživljavanja BAG-1 u kolorektalnom tumoru Stanice. Stoga bismo predložili da, osim što inhibira aktivnost E2F-1 (blokira inhibiciju wnt signalizacije i time potencira signalizaciju β- katenina), Rb može biti potreban za promicanje anti-apoptotičke funkcije BAG-1 zbog uslijed deregulirane c-MYC aktivnosti u kolorektalnim tumorskim stanicama (Slika 5). Dakle, moguće je da je sposobnost Rb da promovira anti-apoptotičku funkciju BAG-1 presudna odrednica za zadržavanje Rb ekspresije u tumorima sa dereguliranom c-MYC aktivnošću, promičući c-MYC-vođenu tumorigenezu i blokiranje MYC-inducirana apoptoza u ranim fazama kolorektalne karcinogeneze.

Image

Shema pro-tumorigenskih uloga Rb u kolorektalnom karcinomu (puna linija, iz studija; 10, 12, 37 isprekidana linija, regulacija funkcije). Shematski prikaz predložene dvostruke uloge Rb u stanicama kolorektalnog tumora: kao i inhibiranje aktivnosti E2F-1 (blokiranje inhibicije wnt signalizacije i time povećavanje aktivnosti β- katenina), Rb je dodatno potreban za promicanje anti-apoptotičke funkcije BAG-1 u kontekstu deregulirane c-MYC aktivnosti u kolorektalnim tumorskim stanicama

Slika pune veličine

S obzirom na njegovu ključnu anti-apoptotičku ulogu u velikom broju važnih tumora, postojao je značajan interes za inhibiranje funkcije pro-preživljavanja BAG-1 u stanicama raka. Iako su istraživanja koja ciljaju terapiju funkcije BAG-1 terapeutski bila u povojima, opisan je kratki inhibitorni peptid koji blokira povezanost sa vezanjem za HSP70, ključan za mnoge funkcije proživljavanja BAG-1. 42 Nadalje, ista je skupina identificirala inhibitor male molekule, tioflavin S, koji također posjeduje sposobnost vezanja i inhibicije C kraja BAG-1. Od posebnog interesa bio je činjenica da i kratki peptid i tioflavin S mogu inhibirati rast stanica u velikom broju staničnih linija karcinoma dojke koja eksprimira BAG-1, 43 što podržava pretpostavku da inhibicija funkcije BAG-1 ima terapeutski potencijal u većem broju vrsta tumora. Međutim, rezultati ove studije sugeriraju specifičniji način ciljanja BAG-1 funkcije u stanicama karcinoma. Pošto je pronađeno da je ekspresija Rb potrebna za anti-apoptotičku funkciju BAG-1, poremećaj interakcije Rb-BAG-1 (koji je neovisan o vezanju HSP70 22 ) posebno inhibira funkciju proživljavanja BAG- 1, ali nisu mnoge od aktivnosti BAG-1 ovisne o HSP70, potencijalno važne u normalnoj homoeostazi tkiva. Prema tome, ciljanje interakcije Rb-BAG-1 može potencijalno specifično inhibirati anti-apoptotičku funkciju BAG-1 u tumorskim stanicama, i stoga predstavlja potencijalno važnu novu metu za liječenje kolorektalnog karcinoma. Nadalje, kako smo pokazali suradnju Rb-BAG-1 u inhibiciji apoptoze u staničnoj liniji Saos-2 osteosarkoma, kao i u stanicama kolorektalnog tumora, možemo nagađati da takav pristup može imati širu primjenu, povećavajući osjetljivost većeg broja karcinoma do sadašnjih terapijskih režima.

Materijali i metode

Stanične linije i uvjeti kulture

Stanična linija S / RG / C2 koja je dobivena adenomom ljudskog kolonija stabilno zaražena onkoproteinom HPV-E7 (označenim RG / C2 / RE7 i odgovarajućom vektorskom kontrolom RG / C2 / Neo) održavana je na kondicioniranom mediju s neomicinom (G418) (Sigma, Poole, Velika Britanija) u koncentraciji 200 µg / ml (prethodno opisano 34 ). I Rb null Saos-2 stanice osteosarkoma (Američka kolekcija kultura tipova, Manassas, VA, SAD) i soj Saos-2 / Rb / DC / R5, 38 koji sadrži Tet / na inducibilni vektor koji izražava Rb (ljubazni poklon od S Weintraub, WA, USA) rutinski se uzgajaju u DMEM (PAA, Yeovil, Velika Britanija) uz dodatak 100 U / ml penicilina (Invitrogen, Paisley, Velika Britanija), 100 µg / ml streptomicina (Invitrogen), 2 mM glutamina (Sigma) i 15% fetalnog goveđeg seruma (FBS) (PAA). Ekspresija Rb inducirana je u Saos-2 / Rb / DC / R5 stanicama 24-satnim tretmanom s 1 µg / ml Dox (Sigma). Stanična linija SW480 koja je dobivena od karcinoma ljudskog koloničkog karcinoma dobivena je iz American Type Culture Collection i uzgojena u 10% FBS DMEM, kako je ranije opisano.

Stabilne transfekcije

Roditeljska stanična linija Saos-2 transficirana je koristeći Genejuice (Novagen, Merck, Nottingham, UK), prema uputama proizvođača s jednim od tri plazmida, bilo regijom Rb koja veže BAG-1, označenom sa Rb-ABC, ne-vežući C-fragment, Rb-C ili kontrolni pCDNA3.1 samo za vektor (Invitrogen). Klonovi su odabrani korištenjem 400 μg / ml G418 (Sigma) i održavani na 15% FBS DMEM koji je sadržavao 200 μg / ml G418. Provjera njihovog izražaja potvrđena je zapadnim blottingom.

I S / RG / C2 HPV-E7 eksprimirajuće stanice virusom i inducibilne Saos-2 / Rb / DC / R5 stanice su stabilno transficirane nuklearno lokaliziranom BAG-1L izoformom (poklon od G Packhama, Southampton, Velika Britanija) ili samo za pIRESneo2 vektor (Clontech, Mountain View, CA, SAD) koristeći Lipofectamine 2000 (Invitrogen) ili Genejuice za stanice Saos-2 / Rb / DC / R5 prema uputama proizvođača. Sakupljene kolonije održavane su na odgovarajućem mediju rasta koji sadrži 200 µg / ml G418. Verifikacija ekspresije BAG-1L utvrđena je Western blottingom.

Konfokalno snimanje

Stanice su posijane na 19 mm pokrivačima, u ploče sa šest jažica, i uzgajane 3 dana prije nego što su fiksirane s 4% paraformaldhidom (Sigma) i Triton-X (Sigma). Da se inducira ekspresija Rb u inducibilnom Saos-2 / Rb / DC / R5, 24 sata prije učvršćenja primijenjen je Dox tretman, 1 µg / ml. Stanice su obojene obojenim mišjim Rb antitijelima (BD Pharmingen Europe, Erembodegem, Belgija) i zečjim BAG-1 antitijelom TB-3 (poklon Graham Packham, Southampton, Velika Britanija), obje korištene u razrjeđivanju od 1: 100. Vizualizacija bilo je moguće upotrebljavati Alexa 488 (zeleni) anti-miš (Invitrogen) pri razrjeđivanju 1: 100 i Alexa 546 (crveni) anti-zec u 1: 200.

transfekcija siRNA (SW480 i Saos-2 / Rb / DC / R5)

SW480 stanice su sjeme uzgajane do 50% konflutacije u standardnim uvjetima tijekom 72 h, prije nego što su transficirane primjenom Lipofectamine 2000, prema uputama proizvođača. Supresija proteina Rb i / ili BAG-1 postignuta je siRNA oligonukleotidima (Applied Biosystems, Carlsbad, CA, SAD) pri konačnom razrjeđivanju koncentracije siRNA od 50 nM, kontroliranom negativnom sekvencom, bez homologije bilo kojoj sekvenci u čovjeku genoma. Ukupno je korišteno 50 nM siRNA da bi se postigla pouzdana supresija BAG-1 proteina kao što je prethodno objavljeno. 23, 36 Korištene su sljedeće sekvence: Rb sekvenca 5 '-GGUUCAACUACGCGUGUAAtt-3' i BAG-1 slijed 5 '-GGGAAAAUCUCUGAAGGAAtt-3'. Stanice Saos-2 / Rb / DC / R5 transficirane su s BAG-1 siRNA gornjom metodom, a ekspresija Rb je kontrolirana tretmanom s 1 µ g / ml Dox.

SDS-PAGE - zapadno brisanje

Uzorci stanica za Western bloting pripremljeni su liziranjem stanica tijekom 15 minuta u puferu za liziranje (Cell Signaling, Danvers, MA, USA) koji sadrži koktel inhibitora proteaze (Roche, Basel, Švicarska). Stanični ostaci su uklonjeni centrifugiranjem pri 18 500 okr / min, 10 minuta, na 4 ° C. Za utvrđivanje koncentracije uzoraka korišten je Bradford test; 100 μg ukupnog proteina razrijeđeno je u puferu Laemali i napunjeno po traci pomoću standardnih tehnika. Proteini su otopljeni na 10% gelu i preneseni na imobilon-P membranu PVDF (Millipore, MA, USA). Primarna antitijela se inkubiraju preko noći; Rb (BD Pharmingen Europe) u 1: 1000, BAG-1 i G3E2 (dar od G Packhama, Southampton, UK) u 1: 100 i α -tubulin (Sigma) kao kontrola opterećenja pri razrjeđivanju od 1: 10 000. Svi proteini su inkubirani s kozjim protu-mišjim sekundarnim antitijelom iz konjske peroksidaze (Sigma), a pojasevi su vizualizirani hemiluminiscencijom (Kirkegaard i Perry Laboratories, Gaithersburg, MD, SAD).

Liječenje γ-zračenjem

Stanice su tretirane na 70% konfluenciji, 24 sata nakon Dox indukcije Rb ili 72 sata nakon prolazne transfekcije siRNA. Duplirane tikvice zaraženih S / RG / C2, SW480 ili inducibilnih Saos-2 stanica bile su izložene ili 5 ili 10 Gy, iz izvora 137 C, s dozom od 0, 33 Gy / min, s 20 mM Hepes (Sigma) za puferiranje, Upotrijebljena doza γ- zračenja određena je različitom osjetljivošću staničnih linija na zračenje; doza je prilagođena za postizanje 25-30% apoptoze u netransfektiranim stanicama: stanice S / RG / C2 i SW480 tretirane su s 5 Gy, a stanice dobivene Saos-2 sa 10 Gy. Broj priloženih i plutajućih stanica određen je 72 sata nakon zračenja.

Procjena apoptoze

Razina apoptoze određena je kao što je prethodno opisano. Stanice su potvrđene kao apoptotske promjenama u morfologiji koje su otkrivene akridinskim narančastim bojenjem i cijepanjem kaspaze 3 i PARP, kao što je prethodno detaljno opisano. 34, 40

NF- κ B test izvješća (Saos-2 / Rb / DC / R5 i SW480)

Stanice su prolazno transficirane bilo s NF- κ B reporter plazmidom pNF- κ B-TA-luc ili s kontrolnim plazmidom pTA-luc (Clontech, BD Europe, Erembodegem, Belgija) kao što je prethodno opisano. 23 Ukratko, stanice Saos-2 / Rb / DC / R5 uzgajane su do 50% konfluencije, u standardnim uvjetima tijekom 72 h, prije nego što su bile kofeficirane s 2, 5 μg po tikvici bilo kojeg reporterskih konstrukcija i 50 nmM konačno razrjeđivanje BAG-1 siRNA oligonukleotida ili negativna kontrola. Nakon 24 sata, stanice su tretirane s 1 μg / ml Dox, gdje je potrebno da se inducira Rb ekspresija. SW480 stanice su tretirane sa 50 nM Rb i / ili BAG-1 siRNA ili negativnim kontrolnim oligonukleotidima kao što je gore opisano, nakon čega je slijedila transfekcija pNF- κ B-TA-luc ili kontrolni pTA-luc plazmid nakon 48 h. Da bi se stimulirala aktivnost NF- κB , stanice su dalje obrađene 16 h sa 10 ng / ml TNF- a (Saos-2 / Rb / DC / R5) ili sa 100 ng / ml TNF- a (SW480).

GFP snimanje

Roditeljske stanice Saos-2 posijane su na pokrivačima od 19 mm, u ploče sa šest jažica, i uzgajane 3 dana prije nego što su prolazne transfekcije prema uputama proizvođača, koristeći Genejuice za uvođenje pEGFP-Bag-1L (dar od G Packhama) 34 u ćelijama. Nakon dodatnih 24 sata, u normalnim uvjetima rasta, stanice su fiksirane s 4% paraformaldhida i Triton-X, i promatrane pod fluorescencijom.

Imunoziranje normalnih kolonskih kripta

Odjeljci su pripremljeni iz arhivske građe koja je pronađena iz dokumenata na Odjelu za histopatologiju, Bristol Royal Infirmary, UK, uz odobrenje lokalnog etičkog odbora. Normalna sluznica je dobivena iz granica resekcije najmanje 6 cm od mase tumora. Sekcije su obojene pomoću Rb antitijela (BD Pharmingen Europe) pri razrjeđivanju od 1: 1000 ili BAG-1 antitijela, TB-3 (dar od G Packham) korištenog u razrjeđivanju od 1: 1400.

Statistička analiza

Statistička analiza provedena je korištenjem SPSS statističkog softvera za Windows (verzija 19; SPSS Inc., Chicago, IL, USA). Za određivanje razlika među sredstvima primijenjena je analiza varijance. Eksperimenti su ponovljeni tri puta, a rezultati su predstavljeni kao srednje vrijednosti za tri odvojena pokusa. Uspravne usporedbe izvršene su korištenjem Tukeyeva post-hoc testa za višestruke usporedbe.

Glosar

BAG-1

Bcl-2 povezan athanogen 1

Dox

doksiciklin

NF- κ B

nuklearni faktor κ B

Rb

retinoblastoma protein

TNF α

faktor nekroze tumora α