Robusna ekspresija gena specifičnih za kardiomiocite nakon sistemske injekcije aav: in vivo isporuka gena slijedi raspodjelu poissona | genska terapija

Robusna ekspresija gena specifičnih za kardiomiocite nakon sistemske injekcije aav: in vivo isporuka gena slijedi raspodjelu poissona | genska terapija

Anonim

teme

  • Dostava gena
  • Genska ekspresija
  • Virusni vektori

Sažetak

Novo izolirani serotipi AAV-a lako prelaze endotelnu barijeru kako bi se osigurala učinkovita isporuka transgena kroz cijelo tijelo. Međutim, tkivna specifičnost je poželjna u većini eksperimentalnih studija i protokola genske terapije. Dosadašnji napori na ograničavanju ekspresije gena na miokard često su se oslanjali na izravno ubrizgavanje u srčani mišić ili intrakoronarnu perfuziju. Ovdje izvještavamo o AAV vektorskom sustavu koji koristi promotor srčanog troponina T (cTnT). Korištenjem luciferaze i pojačanog zelenog fluorescentnog proteina (eGFP), učinkovitost i specifičnost ekspresije gena srčanih reporter pomoću AAV serotip kapsida: AAV-1, 2, 6, 8 ili 9 testirani su nakon sustavne primjene miševima starijim od 1 tjedna. Analize luciferaze pokazale su da cTnT promotor djeluje u kombinaciji sa svakom od AAV serotip kapsida, kako bi se osigurala ekspresija gena specifičnih za kardiomiocite, ali AAV-9, a pomno praćen AAV-8, bio je najučinkovitiji. AAV9 posredovana ekspresija gena iz cTnT promotora bila je 640 puta veća u srcu u usporedbi sa sljedećim najvišim tkivom (jetrom). fluorescencija eGFP pokazala je transdukcijsku učinkovitost od 96% koristeći AAV-9 u dozi od samo 3, 15 × 10 10 virusnih čestica po mišu. Nadalje, intenzitet fluorescencije eGFP kardiomiocita izmjeren na osnovi stanice po ćeliju pokazao je da se ekspresija gena posredovanog AAV-om u srcu može modelirati kao Poissonova raspodjela, za što je potrebno prosječno gotovo dva vektorska genoma po stanici da bi se postiglo 85% transdukcijska učinkovitost.

Uvod

Važni ciljevi suvremenih biomedicinskih istraživanja uključuju rasvjetljavanje molekularne osnove kardiovaskularnih bolesti i razvoj novih pristupa liječenju i prevenciji. Razvoj učinkovitih tehnika za izravan prijenos in vivo gena važan je ne samo za ubrzavanje osnovnih znanstvenih studija na životinjskim modelima, već i za ostvarivanje znatnog potencijala za izravnu kliničku primjenu. Međutim, dosadašnji napredak u ljudskoj genskoj terapiji ograničen je nedostacima u dostupnim sustavima za dostavu gena. Idealan vektorski sustav za srčanu gensku terapiju isporučio bi gene učinkovito i konkretno kardiomiocitima, osigurao bi dugoročnu ekspresiju gena, bio bi bez imunoloških odgovora, predstavljao bi minimalan rizik za domaćina i mogao bi se davati srcu bez kompliciranih kirurških zahvata, U prošlosti je korišteno nekoliko metoda za fokusiranje isporuke virusa posredovanog virusom u srce: prvenstveno izravnom injekcijom u srčani mišić 1, 2 i složenim intrakoronarnim perfuzijskim tehnikama koje zahtijevaju operaciju na otvorenom prsima kako bi se prekrila aorta. 3, 4 Uporaba vaskularnih permeabilizirajućih sredstava kao što su histamin, papaverin ili supstanca P s kardioplegijom i / ili hlađenje cijelog tijela također se koristi u pokušajima poboljšanja učinkovitosti konvencionalnih AAV-2 vektora za transdukciju skeletnih i srčanih miocita in vivo , 4, 5 Ironično je da konvencionalni AAV serotip (AAV-2) korišten u ogromnoj većini do sada izvedenih AAV studija pati od relativno niske brzine transdukcije i produljene faze kašnjenja (do 6 tjedana) prije nego što se postigne potpuna ekspresija u srce. 6, 7 Unatoč ovim ograničenjima, AAV-2 vektori često su pogodovali protokolima kliničke genske terapije zbog širokog raspona tkivnog tropizma i minimalnih imunoloških komplikacija povezanih s vektorima (recenzirali Wu i sur. 8 ). U novije vrijeme izoliran je niz novih AAV serotipova, a neki od njih (na primjer, AAV-1, AAV-6, AAV-8 i AAV-9) učinkovito prelaze endotelnu barijeru kako bi se učinkovito transducirali različiti organi. 9, 10, 11, 12, 13 Za AAV-9 kapsid prethodno je objavljeno da pokazuje skromne sklonosti srčanom tkivu in vivo , kako kod jednodnevnih novorođenih miševa 10, 11 tako i kod odraslih miševa. 9 Nadalje, pokazano je da je transformacija AAV-9 u srce, pluća i tibialis prednji mišić superiorna i neovisna o dobi, dok su jetra i bubrezi loše transducirani kod novogodišnjih novorođenčadi u usporedbi s odraslim miševima. 11

Novi serotipi AAV omogućavaju ekspresiju transgena 9, 14 u ranom početku i posreduju visoko učinkoviti prijenos gena na različita tkiva kod novorođenih miševa, 10, 11, 13 odraslih miševa, 9, 10, 11, 12 štakora, 15 očnjaka 16 i čak i primati koji nisu ljudi. Iako je poželjno sa stajališta opće upotrebe, širok raspon tkivnog tropizma koji pokazuje većina AAV serotipa može postati odgovornost u specifičnim aplikacijama genske terapije, gdje je često važno ograničiti ekspresiju gena na određenu vrstu stanice. Uključivanje genskih regulatornih elemenata koji daju ekspresiju gena specifičnih za tkivo razvijeno je, kao opća strategija ciljanja genske terapije na određena tkiva od interesa.

Kao jedna od tri podjedinice troponina (troponin C, troponin T i troponin I) koji se nalazi u srčanim tankim filamentima, srčani troponin T (cTnT) veže se na tropomiozin kako bi tvorio kompleks troponin-tropomiozin, koji ima važnu ulogu u regulaciji kontraktilne funkcija. 18 Ma i sur. , 19 obavili su mutacijske analize na cTnT promotorskoj regiji i izvijestili da je −375 do +43 regija (u odnosu na početno mjesto transkripcije cTnT) dovoljna za dodjelu ekspresije gena specifičnih za kardiomiocite. Slijedi da bi se ovaj skraćeni cTnT promotor mogao pokazati korisnim za preferencijalno ograničavanje ekspresije terapeutskih gena na kardiomiocite u srcu, kako za osnovne znanstvene eksperimente, tako i za protokole srčane genske terapije.

U ovom su istraživanju konstruirali AAV vektore u kojima skraćeni cTnT promotor potiče ekspresiju luciferaze ili pojačanog zelenog fluorescentnog proteina (eGFP). Rezultirajući AAV vektori pakirani su u panel AAV serotipova (AAV-1, 2, 6, 8 ili 9). Minimalni promotor cTnT bio je dovoljan da preferirano ograniči ekspresiju gena gotovo isključivo na kardiomiocite, čak i nakon sistemske primjene. Zatim smo sustavski davali AAV vektore koji izražavaju luciferazu i uspoređivali učinkovitost transdukcije dostupnih serotipova AAV kapsida. Ovi su eksperimenti pokazali da je AAV-9, kojeg slijedi AAV-8, najučinkovitiji kapsidni serotip za isporuku gena kardiomiocita. Konačno, okarakterizirali smo raspodjelu eGFP ekspresije u mišjem srcu nakon davanja gena posredovanih AAV-9 sistemskom injekcijom i otkrili smo da intenzitet stanične fluorescencije slijedi Poissonovu raspodjelu, služeći kao osjetljiva mjera broja AAV genoma izraženih u svakom kardiomiocita na staničnoj razini. Ovaj nalaz, zauzvrat, otkriva da je potrebno izraziti prosječno dva virusna genoma (vg) po stanici kako bi se osiguralo da 85% stanica izražava barem jedan genom (kao što je predviđeno Poissonovom raspodjelom).

Rezultati

CTnT promotor usmjerava ekspresiju gena specifičnih za kardiomiocite

Početna usporedba AAV vektora koji sadrže citomegalovirus (CMV) i cTnT promotore (Slika 1a) izvedena je korištenjem najučinkovitijeg kapsidnog serotipa koji je bio dostupan u to vrijeme (AAV-6). ACMVLuc ili AcTnTLuc pakirani u AAV-6 kapside davani su miševima starijim od jednog tjedna intravenskim (iv) injekcijama. In vivo snimanje bioluminiscencijom otkrilo je da je ekspresija luciferaze vidljiva unutar 3 dana nakon primjene vektora. Ekspresija luciferaze uočena je po cijelom tijelu kod miševa kojima je ubrizgan ACMVLuc (Slika 1b, CMV). Međutim, kod miševa kojima je ubrizgan AcTnTLuc, ekspresija je bila ograničena na lijevu stranu torakalne šupljine (Slika 1b, cTnT). Ex vivo snimanje bioluminiscencije na različitim organima ovih miševa pokazalo je da je kod miševa ACMVLuc izraz luciferaze bio bogat u mišićnim tkivima (srčanim, interkostalnim i gastrocnemiusovim mišićima) i jetri (slika 1c, CMV). Međutim, kod miševa koji su primili AcTnTLuc, ekspresija lucifereaze pronađena je u srcu (Slika 1c, cTnT). Kvantitativna analiza ekspresije luciferaze provedena je provođenjem ispitivanja in vitro luciferaze na različitim organima kao što je prikazano na slici 1d. Kod miševa koji su primili ACMVLuc ekspresija je uglavnom pronađena u mišićnim tkivima i jetri te u manjoj mjeri u bubrezima, plućima, slezini i timusu. U interkostalnom mišiću, ekspresija CMV promotora bila je devet puta veća od one u srcu. Međutim, kod miševa koji su primili AcTnTLuc, ekspresija luciferaze u srcu bila je gotovo sto puta veća nego u bilo kojem drugom ispitivanom tkivu (uključujući jetru, interkostalni i gastrocnemius mišić, slika 1d). Ovi podaci jasno pokazuju da je AAV-posredovana ekspresija gena iz skraćenog cTnT promotora poželjno ograničena na srce nakon sistemske primjene.

Image

( a ) Shematski prikaz vektora AAV divljeg tipa i AAV: ACMVLuc i AcTnTLuc nose komplementarnu DNK luciferaze krijesnica koju pokreću citomegalovirus (CMV) i cTnT promotori. AcTnTeGFP nosi pojačani protein zelene fluorescencije proteina (eGFP) vođen cTnT promotorom. AAV invertirani terminalni repetiti (ITR) i SV40 poliadenilacijski signal (pA) su također naznačeni. ( b ) Bioluminescentno snimanje ilustrira ekspresiju gena specifičnog za kardiomiocite koje usmjerava cTnT promotor. AAV vektori (ACMVLuc (CMV) i AcTnTLuc (cTnT)) pakirani su u AAV-6 kapside. Jednotjednim miševima ( n = 4 po skupini) ubrizgani su naznačeni AAV vektor (1 × 10 11 virusnih genoma po mišu) kroz jugularnu venu. ( b ) in vivo bioluminiscencijske slike dobivene 28. dana nakon davanja vektora. ( c ) Ex vivo slike bioluminiscencije navedenih tkiva (srce; H, jetra; L, timus; T, bubrezi; K, slezina; S, gastrocnemius mišić; Gn, mozak; B, interkostalni mišić; Ic) od miševa koji su primili ACMVLuc (CMV) ili AcTnTLuc (cTnT). Orgulje su uronjeni u otopinu D -luciferina u trajanju od 1 minute, a bioluminescencija je slikana odmah nakon toga pomoću sustava IVIS 100. ( d ) Grafički prikaz koji pokazuje aktivnosti luciferaze u proteinskim ekstraktima naznačenih tkiva od miševa koji su primili ACMVLuc (CMV) ili AcTnTLuc (cTnT). Aktivnost luciferaze izražena je kao relativna svjetlosna jedinica po mg tkiva (RLUs po mg tkiva).

Slika pune veličine

AAV serotipovi AAV-8 i AAV-9 pružaju vrhunsku učinkovitost transdukcije

Nakon uspostave korisnosti skraćenog cTnT promotora za preferencijalno ograničenje ekspresije gena na srce, provedeno je istraživanje za usporedbu učinkovitosti i specifičnosti srčanog ekspresije posredovane cTnT primjenom kapsida iz AAV serotipa 1, 2, 6, 8 i 9. Bioluminescentno snimanje miševa pokazalo je da su signali luciferaze kod svih miševa ograničeni na lijevu stranu torakalne šupljine, bez obzira na serotip koji se koristi (Slika 2a). Izlaz svjetlosti bio je najveći kod miševa koji su primali reporterske gene upakirane u AAV-8 i AAV-9 kapside. Izlaz svjetlosti bio je značajno niži kod miševa kojima su ubrizgani AAV-1 i AAV-6 kapsidi. Ipak, AAV-1 i AAV-6 kapsidi bili su još daleko učinkovitiji od uobičajenih AAV-2, koji su stvorili vrlo nisku razinu bioluminescence. Testovi luciferaze in vitro provedeni na ekstraktima organskih proteina iz istih miševa (Slika 2b) potvrdili su da je aktivnost luciferaze najmanja u skupini s AAV-2. U usporedbi s konvencionalnim AAV-2 kapsidom, srčana ekspresija luciferaze bila je 26 puta veća s AAV-1, 28 puta veća s AAV-6, 271 puta veća s AAV-8 i 358 puta veća s AAV-9 kapsidima, Ovi podaci pokazuju da je serotip AAV-9 (nakon kojeg slijedi pomno AAV-8) daleko učinkovitiji od serotipova AAV-2, AAV-1 i AAV-6 u isporuci gena u srce nakon iv injekcije. Kad se isporučuje s kapsidom AAV-9, cTnT promotor specifičan za kardiomiocite usmjeravao je razine ekspresije luciferaze koje su bile> 640 puta veće u srcu nego u sljedećim najvišim tkivima (mišići jetre, interkostale i gastrocnemiusa).

Image

Bioluminescentno snimanje uspoređujući efikasnost pet AAV serotipa za isporuku gena specifičnih za kardiomiocite. AAV vektor AcTnTLuc pakiran je u naznačene AAV serotipne kapside (AAV-2, AAV-1, AAV-6, AAV-8 i AAV-9). Jednomjesečnim miševima ( n = 4 po skupini) ubrizgani su 1 × 10 11 virusnih genoma po mišu kroz jugularnu venu. ( a ) In vivo slike bioluminiscencije dobivene 28. dana nakon davanja vektora. ( b ) Grafički prikaz koji pokazuje aktivnosti luciferaze u ekstraktima proteina iz različitih tkiva (mozak; B, bubreg; K, pluća; L, slezina; S, timus; T, interkostalni mišić; Ic, gastrocnemius; Gn, srce; H, jetra; L) prikupljen 28 dana nakon davanja vektora. Aktivnosti luciferaze izražene su kao relativne svjetlosne jedinice na mg tkiva (RLUs po mg tkiva).

Slika pune veličine

AAV vektori pružaju homogenu transdukciju kardiomiocitima tijekom miokarda ventrikula

Da bi se ispitala raspodjela tkiva, AAV vektor AcTnTeGFP pakiran je u kapside iz AAV serotipa 1, 2, 6, 8 i 9. AAV vektori su davani miševima starijim od jednog tjedna kroz jugularnu venu u dozama 3, 15 × 10 9, 1 × 10 10, 3, 15 × 10 10 i 1 × 10 11 vg po mišu. U miša starog 2, 5 g, jednog tjedna, ove doze odgovaraju 1, 26 × 10 12, 4 × 10 12, 1, 26 × 10 13 i 4 × 10 13 vg po kg tjelesne težine. Četiri tjedna nakon primjene vektora, pripremljeno je kriokosekcije od 6 µm, a analiza eGFP ekspresije fluorescentnom mikroskopijom otkrila je da su AAV-2 transducirani kardiomiociti slabo čak i kod najveće testirane doze (1 × 10 11 vg) (slike 3 i 4a). Nasuprot tome, AAV-9 transducirani kardiomiociti su učinkovitiji od bilo kojeg drugog testiranog serotipa. Promatrana je transdukcijska stopa od 96 ± 2% s AAV-9 u dozi od samo 3, 15 × 10 10 vg po mišu (Slike 3 i 4a). Sa AAV-8 uočena je stopa transdukcije od 95 ± 3% pri dozi od 1 × 10 11 vg po mišu. Vrhunska transdukcijska učinkovitost AAV-9 nad AAV-8 bila je još vidljivija u nižim rasponima doza (1 × 10 10 vg po mišu i nižim). Sa AAV-1 i 6, učinkovitost transdukcije bila je približno 75% pri najvišoj ispitivanoj dozi (1 × 10 11 vg po mišu). Usporedba učinkovitosti transdukcije između različitih serotipova u dozi od 3, 15 × 10 9 vg po mišu pokazala je da su AAV-9 transducirani kardiomiociti 5, 8 puta učinkovitiji od AAV-8 i 22 puta efikasnije od AAV-1 ili -6.

Image

Fluorescentna mikroskopija krioksocijacija srca od miševa koji su tretirani povećanim dozama AAV vektora pakiranih u AAV kapsidnim serotipima 2, 1, 6, 8 i 9. AAV vektor AcTnTeGFP pakiran je u AAV kapside iz navedenih serotipova (AAV-2, AAV- 1, AAV-6, AAV-8 ili AAV-9). Tjedanima starim miševima ubrizgana je naznačena doza ( n = 2 po doziranju) virusnih genoma kroz jugularnu venu. Četiri tjedna nakon davanja vektora, 6 μm kriocekcije srca pripremljeno je za analizu fluorescentnom mikroskopijom. Sve ovdje prikazane slike snimljene su pri × 40 uvećanju s konstantnom izloženošću od 0, 5 s.

Slika pune veličine

Image

Broj kopija AAV vektorskog genoma u srcu nakon sistemske primjene povećanih doza AAV vektora pakiranih u AAV kapsidnim serotipima 2, 1, 6, 8 i 9. ( a ) Grafički prikaz koji prikazuje povećanje postotka transdukcije kao funkcija primijenjene doze za svaki od pet kapsidnih serotipa. ( b ) Grafikon koji ilustrira linearnu povezanost između vektorske doze i prosječnog broja kopija vektora genoma po μg genomske DNA za svaki od pet kapsidnih serotipa. ( c ) Grafikon postotka transdukcije u odnosu na prosječni broj kopiranja vektora po μg genomske DNK ilustrira umjetnu visoravnu nametnutu definiranjem 'transducirane' stanice kao stanice koja sadrži jedan od više vektorskih genoma.

Slika pune veličine

AAV vektori isporučuju više kopija genoma po stanici nakon sistemske primjene

Zatim smo odredili broj kopija vektorskog genoma po ćeliji kao neovisnu mjeru učinkovitosti prijenosa gena za svaki od serotipova kapasidne kapi AAV. Četiri tjedna nakon sistemske primjene vektora, ukupan genomski DNK pripremljen je iz mišjih srca, a prosječni broj kopija vektorskog genoma po µg genomske DNA određen je kvantitativnim PCR-om u stvarnom vremenu. Rezultati su sažeti na slici 4b. Prosječni broj kopija vektora po stanici linearno se povećavao na način ovisan o dozi za AAV serotipove -1, -6, -8 i -9 tijekom doze u rasponu od 3, 15 × 10 9 do 1 × 10 11 vg po mišu (slika 4b). Međutim, broj vektorskih kopija po stanici transduciran AAV-2 povećao se za samo 60% u istom rasponu doza, što ukazuje da je AAV-2 slabo prikladan za isporuku srčanih gena. Brojevi kopija vektorskog genoma po µg genomske DNK ∼ 1 × 10 6 ili više detektirani su u dozama od 3, 15 × 10 10 za AAV-1 i AAV-6, 1 × 10 10 za AAV-8 i 3, 15 × 10 9 vg po miš za AAV-9. Ovi rezultati potvrđuju da serotip AAV-9 omogućuje superiorni izravan prijenos gena u mišjim srcima nakon sistemske primjene. Ograničenje korištenja 'transdukcijske učinkovitosti' (utvrđeno brojenjem transgenih pozitivnih stanica) za kvantitativni izravan prijenos gena prikazano je na slici 4c, gdje je postotak transduciranih stanica (koji sadrže najmanje jedan vektorski genom) platoa na 100%, iako srednji broj vektorske kopije po μg genomske DNK i dalje se povećava s povećanjem doze (Slika 4b).

Specifičnost AAV-9 kapsida u kombinaciji s cTnT promotorom dokazuje nedostatak eGFP ekspresije u glatkim mišićima ili endotelnim ćelijama u srcu: Fluorescentna slika niskog uvećanja ekspresije eGFP-a u mišjim dijelovima srca tretiranim AcTnTeGFP vektorom pakiranim u AAV- 9 kapsida ilustrira homogenu raspodjelu ekspresije gena koja se vidi u desnoj i lijevoj klijetki srca (slika 5a). Fluorescentno snimanje pri srednjem povećanju (slika 5b) prikazuje položaj arteriola (označeno okvirom) koji je prikazan pod velikim povećanjem na slici 5c. Pomni pregled ove slike otkriva da su stanice glatkog mišića i endotela potpuno lišene fluorescencije, čak i dok unutarnja elastična lamina pokazuje predviđenu autofluorescenciju i kardiomiociti koji okružuju arteriole bili su jako pozitivni na ekspresiju eGFP-a. Imunohistokemijske analize provedene na serijskim presjecima potvrdile su ekspresiju eGFP-a isključivo u kardiomiocitima, a ne u vaskularnim glatkim mišićima ili endotelnim stanicama (dopunska slika S1). Ovaj rezultat nadalje naglašava specifičnost kojom kombinacija AAV-9 kapsida i cTnT promotora povoljno ograničava ekspresiju gena na kardiomiocite unutar srca.

Image

Fluorescentna mikroskopija krvnih krvnih korekcija srca koja ilustrira pojačanu ekspresiju zelenog fluorescentnog proteina (eGFP). Prikazane su reprezentativne fluorescentne slike srčanih kriosekcija miševa kojima je ubrizgan AcTnTeGFP (AAV-9, 3, 15 × 10 10 virusnih genoma po mišu). ( a ) Kratki presjek koji prikazuje homogenost ekspresije kroz opseg lijeve i desne komore. ( b ) Slike srednjeg uvećanja sa smjenom C označene bijelom kutijom. ( c ) × 200 Povećavajuća slika koja prikazuje nedostatak eGFP ekspresije u endotelu (otvorena strelica) i stanicama glatkih mišića (čvrsta strelica) smještenih unutar arteriola. ( d i e ) Usporedba detekcije eGFP proteina fluorescentnim slikanjem i imunohistokemijskim bojenjem. Provedena je imunohistokemijska analiza da bi se potvrdila ekspresija eGFP-a uočena fluorescentnom mikroskopijom. Prvo, ekspresija eGFP-a u mišjem srcu dokumentirana je fluorescentnom mikroskopijom krvnih krvnih frakcija ( d ). Nakon toga, nakon uklanjanja pokrivača, isti dijelovi su obrađeni imunohistokemijom ( e ) za detekciju eGFP-a.

Slika pune veličine

eGFP fluorescencija otkriva da izravni prijenos gena slijedi Poissonovu raspodjelu

Pažljivim pregledom eGFP fluorescentnih slika (slike 3, 5a-d i 6a) otkriveno je da se čini da intenzitet fluorescencije eGFP u pojedinim kardiomiocitima odražava učinak doze gena. Odnosno, čini se da varijacije u intenzitetu fluorescencije eGFP između stanica nisu slučajne, već su pokazale kvantno svojstvo, tako da su eGFP-pozitivne stanice mogle biti grupirane u skupine stanica koje su imale slične razine intenziteta fluorescencije (vidjeti sliku 6a), Kako bi se nastavilo ovo promatranje, izvršena je kvantitativna analiza slike na kriosekcijama srca miševa transduciranih AcTnTeGFP pakiranim u AAV-8 i AAV-9 u intermedijarnim dozama (3.15 × 10 9 i 1 × 10 10 vg po mišu). k- analiza klastera muškaraca intenziteta fluorescencije kardiomiocita doista je potvrdila da su se ovi intenziteti grupirali oko cjelobrojnih vrijednosti, a jednosmjerna varijancijska analiza praćena Dunnettovom T3 post-hoc analizom potvrdila je da se svaki klaster značajno razlikovao od bilo kojeg drugog ( P <0, 05 za bilo koji par u paru) usporedba). Slika 6 prikazuje primjer ove analize koja je izvedena na mišu ubrizganom AAV-9 u dozi od 1 × 10 10 vg po mišu. Histogram dobiven analizom klastera intenziteta kardiomiocita prikazanih na slici 6a prikazan je na slici 6b, gdje su boje crvena, zelena, plava, svijetloplava, ljubičasta i žuta korištene za predstavljanje n = 0, 1, 2, 3, 4 i 5 AAV genoma po ćeliji, respektivno. Svaki je kardiomiocit na slici 6a tada retrospektivno obojen u skladu s istom klasifikacijskom shemom za ilustrativne svrhe kao što je prikazano na slici 6c. Postotak kardiomiocita u svakom klasteru (slika 6d, stvarni) tada je korišten za izračunavanje ukupnog srednjeg broja vg po ćeliji u svim klasterima ( n = 2, 0), a ta srednja vrijednost korištena je kao Poissonov parametar ( λ = 2, 0) za generirati teoretsku Poissonovu raspodjelu (Slika 6d, Poissonova srednja = 2, 0). Konačno, analiza je ponovljena s AAV-9 u drugoj dozi (3, 15 × 10 9 vg po mišu), i opet s AAV-8 u dvije doze (3, 15 × 10 9 i 1 × 10 10 vg po mišu, vidjeti dodatne slike S1 -S3). Zajedno, rezultati analize slika dobili su skup od 24 stvarne vrijednosti za postotak stanica u svakom vidnom polju koji sadrže n = 0, 1, 2, 3, 4 ili 5 izraženo vg po ćeliji (od kojih je šest prikazano u Slika 6d). Stvarne vrijednosti zatim su korelirane s teoretskim vrijednostima dobivenim iz odgovarajućih Poissonovih raspodjela (Slika 6e) kako bi se ilustrirala prediktivna snaga ovog pristupa. Jaka korelacija ( R2 = 0, 85) sugerira vezu između intenziteta fluorescencije eGFP i broja kopija vektorskog genoma po stanici, te da se intenzitet fluorescencije eGFP na osnovi kardiomiocita može modelirati u smislu Poissonove raspodjele.

Image

In vivo isporuka srčanih gena slijedi Poissonovu raspodjelu. Intenzitet stanične pojačane fluorescencije proteina zelene fluorescencije (eGFP) u kriokostacijama srca korišten je za procjenu broja izraženih virusnih genoma (vg) u pojedinim kardiomiocitima. ( a ) Fluorescentna slika iz srca miša kojoj je ubrizgan AcTnTeGFP (AAV-9, 1 × 10 10 vg po mišu). Vrh svake strelice identificira stanicu koja je naknadno identificirana k- sredinom klaster analize koja sadrži n = 0 (crvena), 1 (zelena), 2 (plava), 3 (svijetloplava), 4 (ljubičasta) i 5 ili veći (žuti) AAV genoma po ćeliji. ( b ) Trodimenzionalni grafikon koji prikazuje intenzitet videa ( y os) pojedinih kardiomiocita ( x os) iz svake skupine koji sadrže 0, 1, 2, 3, 4 ili 5 vektorske genome (vg) po ćeliji ( z os), što je određeno algoritmom grupiranja. Svaka traka predstavlja jedan kardiomiocit iz vidnih polja prikazanih u ( a ). Crvena, zelena, plava, svijetloplava, ljubičasta i žuta predstavljaju skupine koje sadrže 0, 1, 2, 3, 4 ili 5 AAV genoma po kardiomiocitu. ( c ) Kolorirana slika koja prikazuje razvrstavanje svakog kardiomiocita u grozdove koji sadrže n = 0, 1, 2, 3, 4 ili 5 AAV genoma po ćeliji, kao što su označene bojama crvena, zelena, plava, svijetloplava, ljubičasta i žuta, odnosno. ( d ) Grafički prikaz koji pokazuje postotak kardiomiocita koji izražavaju 0, 1, 2, 3, 4 ili  5 vg po ćeliji, kako je opisano u odjeljku Materijali i metode (stvarni) u usporedbi s odgovarajućom teorijskom raspodjelom (Poisson srednja vrijednost) dobivenom koristeći sredinu stvarnog vg po ćeliji (2, 0) kao Poissonov parametar ( λ ) = 2, 0 za generiranje odgovarajuće Poissonove distribucije. ( e ) Korelacija između stvarnih postotaka stanica koji izražavaju ' n ' vg kako je određeno analizom slike i teorijskih postotaka predviđenih Poissonovom raspodjelom. Postoci kardiomiocita koji izražavaju 0, 1, 2, 3, 4 ili  5 vg po stanici su određeni kao što je gore opisano (za AAV-9 pri 1 × 10 10 vg po mišu) kao i za AAV-9 pri 3, 15 × 10 9 vg po mišu i AAV-8 pri 3, 15 × 10 9 i 1 × 10 10 vg po mišu (vidi Dodatne informacije). Prosječni brojevi vg po ćeliji utvrđeni analizom slike tada su korišteni kao Poissonovi parametri ( λ ) za generiranje teorijske raspodjele postotaka (kao u d ) za AAV-8 i -9 u obje doze (3.15 × 10 9 i 1 × 10 10 vg po mišu). Linearna regresijska analiza povezanosti stvarne i teorijske postotne vrijednosti dala je R2 = 0, 85 s nagibom blizu jedinstva i y presjekom blizu nule, što ukazuje na jaku povezanost između empirijskih podataka i teorijske raspodjele koju je predvidio Poisson.

Slika pune veličine

Rasprava

Pokazalo se da su novoizolirani AAV serotipovi (AAV-1, -6, -8 i -9) efikasno isporučuju gene raznim organima, uključujući koštani mišić, srce, jetru i pluća, te pružaju kontinuiranu ekspresiju gena nakon sistemske primjene. 9, 10, 12, 13, 20 Širok raspon tkivnog tropizma koji su izloženi raznim AAV serotipovima upućuje na to da bi AAV trebao imati široku korisnost u isporuci gena u sustave više organa, ali liječenje pojedinih bolesti često zahtijeva ograničavanje ekspresije terapijskih gena na određeni ciljni organ ili tip stanice. Terapeutski geni stavljeni pod kontrolu snažnih virusnih promotora proizvode visoku razinu ekspresije proteina s minimalnom specifičnošću tkiva (na primjer, slika 1b, CMV). Međutim, ekspresija terapijskih gena u izvan-ciljanim tkivima često može dovesti do štetnih nuspojava. Lokalna isporuka u srce intramuskularnom injekcijom može biti moguća u podskupini kardioloških postupaka, kao što su operacije zaobilaženja koronarnih arterija ili tijekom interventnih postupaka koji mogu uključivati ​​injekciju na bazi katetera u miokard. 21 Međutim, ovi pristupi nisu samo invazivni, već zahtijevaju injekcijske matrice visoke gustoće da bi se postigli homogeni obrasci ekspresije gena. Ovo je istraživanje ispitalo korisnost kombiniranja promotora specifičnog za kardiomiocite s kapsidima nedavno izoliranih serotipova AAV (AAV-1, -6, -8 i -9) za postizanje stabilne ekspresije gena za kardiomiocite nakon iv primjene na miševima.

Rekombinantni AAV genomi duljine do 5, 2 kb mogu se pakirati u AAV kapside bez narušavanja infektivnosti. S obzirom na ograničenje pakiranja, poželjno je smanjiti veličinu promotora kako bi se prilagodili većim terapijskim opterećenjima. Prije su Aikawa i sur. 6 je izvijestilo o ekspresiji gena specifičnog za kardiomiocite iz AAV vektora koji ima promotor teškog lanca od 363 bp (-344 do +19) upakovan u AAV-2 kapside nakon izravne injekcije u zid miokarda, jetru, skeletni mišić i mozak. Iako bi se činilo da promotor teškog lanca α-miozina slične veličine, snage i specifičnosti cTnT promotora koji se ovdje koristi, ograničena učinkovitost AAV-2 kapsida učinila je izravnom intramiokardijalnom injekcijom potrebnu u prethodnoj studiji, a visoka učinkovitost i prirodni kardiotropizam AAV-9 kapsida podržavao je iv primjenu u ovom istraživanju. Su i Kan 22 koristili su AAV-2 vektor koji nosi promotor lakog lanca miozina (MLC) -2v u kombinaciji s elementima odgovora hipoksije za ishemijsku ekspresiju gena specifičnog za srce nakon izravne injekcije u miokard. U novije vrijeme Muller i sur. 23 su koristili 1, 5 kb MLC promotor u kombinaciji s elementima koji pojačavaju CMV i testirali učinkovitost srčane specifične ekspresije gena iz serotipova AAV -1, -2, -4, -5, -6 i mutirajućeg AAV-2 (R484E, R585E). Najefikasniji serotip bio je AAV-6, a mutirani AAV-2 je osigurao ekspresiju gena za srce kod štakora Sprague-Dawley nakon sistemske primjene. Raake i sur. 24 konstruirao AAV vektor koji sadrži hibridni promotor 1, 5 kb, sastavljen od pojačivača CMV spojenog s MLC promotorom štakora (CMV-MLC2v), upakovanog u AAV-2 ili AAV-6 i pokazao ekspresiju gena specifičnog za kardiomiocite nakon vektorske primjene tlakom -regulirana retroinfuzija prednje interventrikularne srčane vene. Međutim, 1, 5 kb CMV-MLC2v fuzijski promotor zauzima 29% prostora za kloniranje u AAV vektoru, ostavljajući samo 3, 4 kb za umetanje gena od interesa i signala poliadenilacije. Suprotno tome, cTnT promotor koji je ovdje prijavljen zauzima <10% prostora za kloniranje u AAV i pruža snažnu, kardiomiocitnu ekspresiju, čak i nakon sistemske injekcije. Iako ovdje korišteni minimalni cTnT promotor ima samo 418 bp 19, on ipak daje visoki stupanj specifičnosti kardiomiocita bez značajnog gubitka snage promotora u odnosu na sveprisutno aktivan i jak CMV promotor (Slika 1b). Koristeći cTnT promotor upakovan u AAV9 kapside, razina luciferazne ekspresije bila je> 640 puta veća u srcu nego u sljedećem tkivu koje se najviše ekspresionira (jetra, a usko slijede interkostalni i gastrocnemius mišići). Ovaj izvanredni stupanj specifičnosti postignut je zadržavajući> 40% snage dostupne od CMV promotora. Bez obzira na AAV serotip koji je testiran, cTnT promotor je preferencijalno ograničio ekspresiju gena na srce (Slika 2). Kako bi se potvrdili ovi nalazi, imunohistokemija eGFP-a i aktinog glatkog mišića izvedena je na serijskim odsjecima srčanog tkiva kod miša prethodno tretiranog vektorom AAV-9 koji izražava eGFP iz cTnT promotora. Rezultati su pokazali da je ekspresija eGFP obilna kardiomiocitima, ali je gotovo neotkrivena u staničnim glatkim mišićima ili endotelijalnim stanicama (dopunska slika S1).

Rezultati luciferaze na slici 2 pokazuju da AAV-9 transducira srce 1, 3 puta i 14 puta efikasnije od AAV-8 odnosno AAV-1. Superiorna transdukcija kardiomiocita serotipom AAV-9 nad AAV-8 nakon iv primjene na miševima u skladu je s dva prethodna izvješća. 9, 10 Međutim, izravne usporedbe s tim prethodnim studijama nisu moguće jer su koristile drugačiji sustav reportera (β-galaktozidaza), a ispitivanja su izvršena u različitim vremenskim točkama nakon iv ubrizgavanja (2 tjedna 9 i 4 tjedna 10 ). Bez obzira na ove razlike, više grupa koje koriste različite promotore, reporterski sustav i vremena praćenja dosljedno su otkrile da je AAV-9 kapsid efikasniji za prijenos srčanih gena od bilo kojeg drugog testiranog kapsida do danas. Although all injections reported here were performed in 1-week-old mice, this strategy was employed only to take advantage of their low body weight in minimizing the amount of vector needed for each experiment. In recent studies, we found that the same weight-adjusted dose (vg g −1 body weight) yielded similar levels of gene expression in adult mice as when injected in 1-week-old mice (data not shown). Furthermore, the time course of cardiac gene expression from the cTnT promoter after AAV9-mediated gene transfer in adult mice is consistent with the time course previously published for the non-tissue-specific CB promoter. 25

In human gene therapy protocols, viral vector burden should be kept to the minimum to avoid vector-related side effects. It is therefore critical to determine the minimal gene dose necessary to achieve therapeutic effect. In the case of a secreted gene product, it may not be necessary to transduce every cell in the target organ. But for most therapeutic genes that remain intracellular, it will be desirable to obtain a uniform distribution of gene expression with transduction efficiencies approaching 100%. From this perspective, the results summarized in Figure 6 are particularly enlightening because they reveal that AAV-mediated gene delivery follows a Poisson distribution.

The Poisson distribution provides a model for the number of discrete events occurring in a specified space or time interval. It is assumed that the events are independent of one another, and that the expected number of such events can be specified over a significant space/time interval. A well-studied example of a spatial Poisson process is the number of raindrops falling on a detector (that is, a disdrometer). 26 In this case, the process of counting raindrops within a specified area has no memory in the sense that one raindrop falling does not affect another. By analogy, we show here (for the first time) that the same law may govern the number of AAV particles transducing individual cardiomyocytes during direct in vivo gene transfer.

It has previously been shown that the majority of the AAV genomes in muscle cells persist as transcriptionally active monomeric or head-to-tail circular concatemeric episomes. 27, 28 Thus, the level of gene expression resulting from AAV-mediated gene delivery to cardiomyocytes (and perhaps other muscle cells) should primarily be determined by gene dose and may be independent of genomic mechanisms, such as gene silencing, chromosomal localization and histone modification. It has previously been proposed that viral-mediated gene transfer might follow a Poisson distribution in vitro , 29 but no supporting evidence was provided. In contrast, the close correlation between our empirical results and the theoretical results predicted by the Poisson distribution (Figure 6e) suggests that the level of transgene expression in an AAV-transduced cardiomyocyte is primarily a function of gene dose, and establishes a method for determining gene dose on a cell-by-cell basis by performing image analysis on histological sections. The image analysis in this study was motivated by the hypothesis that doubling (or tripling, quadrupling and so on) the number of reporter genes per cell would follow the same general law of gene dose illustrated by haploid insufficiency. That is, transcription and translation are seldom rate limiting, and doubling the number of genes in a cell will often double the amount of protein produced.

When considered in light of Poisson, Figure 6d illustrates that it will be necessary (for example) to introduce an average of nearly two AAV genomes per cell in order to assure that 85% of target cells express at least one gene. This highlights the fact that direct gene transfer is fundamentally different from transgenesis or homologous recombination, because germline transmission of only a single gene is sufficient to insure its delivery to 100% of the cells in a tissue; whereas for direct gene transfer, a mean hit-rate of one vector genome per cell is only adequate to insure that 63% of the cells will express at least one genome, and a mean of five vector genomes per cell is necessary to target >99% of the cells in a tissue (as defined by the Poisson distribution, see Supplementary Figure S4, panel E in Supplementary Information).

These results also have important ramifications for the interpretation of eGFP expression in studies of direct in vivo gene transfer. That is, eGFP has not always been preferred as a reporter gene for studies of gene transfer to the heart, in part, because it can be difficult to distinguish authentic eGFP fluorescence above endogenous background autofluorescence unless the promoter is quite strong. Nevertheless, several previous studies have used eGFP as a reporter gene to monitor AAV-mediated direct gene transfer to the heart. 30, 31 Interestingly, at least two of these studies used the ubiquitously strong CMV promoter, and the same quantal pattern of fluorescence intensity reported here is indeed evident in the previous fluorescence photomicrographs of eGFP expression. 30, 31 Although the quantal pattern of authentic eGFP expression is clear in these figures, this pattern has not previously been explained, perhaps because the method of direct intra-myocardial injection 31 or lower transduction rates 30 made the quantal pattern less striking (compare for example, the top and bottom rows in Figure 3).

Although this report identifies a new approach for the quantitative determination of vector genomes per cell by image analysis of biofluorescence intensities in tissue sections, the limitations should also be acknowledged. This approach is not applicable unless the promoter is strong enough to produce enough fluorescent protein to be detected above endogenous autofluorescence. Furthermore, it is difficult to apply this technique when the mean hit-rate exceeds between 5 and 10 vgs per cell, because this may exceed the linear range that can be accommodated by a single exposure, causing cluster analysis to fail (see bottom right panel in Figure 3). Thus, the dynamic range of this approach is currently limited to mean hit-rates between 0.1 to 10 vgs per cell. Fortunately, this corresponds to a physiologically significant range; that is, transduction efficiencies (as defined by 1 vg per cell) of 10 to 100%. Finally, this approach depends upon efficient, homogeneous methods of vector delivery (intravenous or intra-arterial) and cannot be applied until after gene expression has reached an equilibrium state in non-dividing cells.

The >640-fold level of tissue specificity obtained here by employing the cTnT promoter in combination with the highly efficient AAV-9 capsid should immediately prove useful in expediting small animal studies of cardiac gene function, both in normal and diseased states. However, it should be acknowledged that the tissue tropisms displayed by the various AAV serotypes have been shown to vary between species. 16 Furthermore, transcriptional targeting with tissue-restricted promoters does not reduce gene transfer to off-target tissues, only the levels of off-target gene expression. It should be possible to reduce viral burden, and further improve the safety profile of the highly efficient AAV serotypes for cardiac gene therapy, by targeting transduction more specifically to cardiomyocytes. The potential of genetically engineering the AAV capsid to achieve transductional targeting to the heart has already been demonstrated in the context of AAV-2, 23 albeit at significantly lower transduction efficiencies than possible with AAV-9. Thus, the strategy of combining transcriptional and transductional targeting 23, 32 with highly efficient AAV serotypes holds significant promise for the future of both basic science and translational research applications in the cardiovascular system.

Dodatna informacija

Datoteke slika

  1. 1.

    Dopunska slika S1

  2. 2.

    Dopunska slika S2

  3. 3.

    Dopunska slika S3

  4. 4.

    Dopunska slika S4

Word dokumenti

  1. 1.

    Dopunske slikovne legende

    Dodatne informacije prate rad na web stranici Gene Therapy (//www.nature.com/gt)