Trgovina adam10 posredovanom sap97, ovisna o pkc fosforilaciji | stanična smrt i bolest

Trgovina adam10 posredovanom sap97, ovisna o pkc fosforilaciji | stanična smrt i bolest

Anonim

teme

  • Alzheimerova bolest
  • Stanična signalizacija
  • Trgovanje membranom

Sažetak

Dezintegrin i metaloproteinaza 10 (ADAM10) je glavna α -sekretaza koja katalizira izbacivanje ektodomainskih proteina amiloidnog prekursora (APP) u mozak i sprječava stvaranje amiloida. Njegova aktivnost ovisi o pravilnom unutarćelijskom prometu i umetanju sinaptičke membrane. Ovdje ćemo opisati da u hipokampalnim neuronima protein-97 (SAP97), ekscitacijski skeletni skeletni element, upravlja prometom ADAM10 od dendritičnih Golgijevih ispoljavanja do sinaptičkih membrana. Taj je postupak posredovan prethodno ne-karakteriziranom proteinom kinazom C fosfositom u SAP97 SRC homologiji 3 domeni koja modulira povezanost SAP97 s ADAM10. Takav je mehanizam neophodan za promet ADAM10 od pretpostavki Golgije do sinapse, ali ne utječe na transport ADAM10 iz endoplazmatskog retikuluma. Značajno je da je ovaj proces izmijenjen u mozgu Alzheimerove bolesti. Ovi rezultati pomažu u razumijevanju mehanizma odgovornog za modulaciju ADAM10 unutarćelijskog puta i mogu predstavljati inovativnu terapijsku strategiju za fino podešavanje aktivnosti lijevanja ADAM10 prema APP-u.

Glavni

Genetske studije o Alzheimerovoj bolesti (AD) ukazuju na gene faktora rizika koji kodiraju proteine ​​s poznatom funkcijom u lokalnoj trgovini. 1 Uz različite pristupe, također je opisan unutarstanični transport dezintegrina i metaloproteinaze 10 (ADAM10), enzima odgovornog za cijepanje α -sekretaze koja sprečava stvaranje amiloida β u primarnim neuronima, 2, 3 . ADAM10 sadrži signal zadržavanja endoplazmatskog retikuluma (ER) 4, dok je njegova aktivnost uglavnom lokalizirana u trans- Golgi mreži ili na plazma membrani. 2, 5

Prethodno smo identificirali protein-97 povezan sa proteinima-SAP97 (SAP97), članom proteinske skele povezane sa membranom, koja upravlja trgovinom glutamatnim receptorima, kao ADAM10 partnera. SAP97 se veže na prolinom bogate sekvence citosolne domene ADAM10 sa domenom SRC homologije 3 (SH3), te na taj način dovodi proteazu na postsinaptičku membranu i povećavajući cijepanje α -sekretaze. 6 Zanimljivo je da je interakcija ADAM10 / SAP97 smanjena u hipokampusu bolesnika s AD7, a poremećaj povezanosti ADAM10 / SAP97 kod glodavaca dovodi do stvaranja netransgeničnog modela bolesti. 8 S druge strane, pronalaženje membrana ADAM10 posreduje mehanizam ovisan o AP2-klatrinu uključen u dinamičku regulaciju sinaptičke lokalizacije / aktivnosti ADAM10. 9 Svi ovi podaci tvrde za ulogu ADAM10 trgovine u patogenezi AD-a.

Usprkos ovim saznanjima, unutarstanični signalni putevi koji reguliraju trgovinu ADAM10 još uvijek se ograničavaju. Nekoliko studija neovisno je izvijestilo da protein kinaza C (PKC) i proteinakinaza aktivirana mitogenom čine dva središnja signalna čvorišta za regulaciju cijepanja α -sekretaze. 10

Konkretno, aktivacija PKC potiče put cijepanja ne-amiloidogenog a- sekretaze, 11, 12, 13, 14, a liječenje PKC aktivatorom povećava cijepanje ADAM10 supstrata. 15 Uz to, sposobnost PKC-a da regulira aktivnost ADAM10 može biti povezana s izmjenom ADAM10 subcelularne lokalizacije. 15

Ovdje smo identificirali PKC mjesto fosforilacije u SH3 domeni SAP97 koja može modulirati interakciju s ADAM10 i promovirati njezinu trgovinu od dendritičnih Golgijevih ispostava do sinapse. Ovi rezultati pridonijeli su razumijevanju mehanizma odgovornog za modulaciju ADAM10 unutarćelijskog puta i mogli bi pružiti pozadinu za razvoj učinkovite terapijske strategije za podešavanje ADAM10 aktivnosti.

Rezultati

PKC aktivacija potiče ADAM10 / SAP97 interakciju

Prvo smo provjerili učinak PKC aktivacije na interakciju ADAM10 / SAP97 pomoću eksperimenata za prijenos energije bioluminiscencije (BRET). Nakon potvrđivanja metodologije (slika 1a), analiza BRET u stvarnom vremenu pokazala je da PKC aktivacija povećava trend BRET signala nakon primjene PKC aktivatora (slika 1b).

Image

PKC aktivacija promovira ADAM10 / SAP97 asocijaciju. ( a ) BRET eksperimenti na živim stanicama ljudskog embrionalnog bubrega 293 (HEK293). Spojili smo C kraj ADAM10 na energetski donor Renilla luciferazu (ADAM10-Rluc) i N kraj SAP97 na akceptor YFP (YFP-SAP97). Pod uvjetom stalne razine ekspresije ADAM10-Rluc, BRET signal se hiperbolično povećao kao funkcija razine ekspresije YFP-SAP97. Zasićenje BRET signala kada su sve molekule darivatelja povezane s akceptorom pokazalo je specifičnu interakciju između proteina ADAM10 i SAP97 ( R2 = 0, 9824, jednadžba nelinearne regresije, pretpostavljajući jedno mjesto vezanja; GraphPad Prism, La Jolla, Kalifornija, SAD), ( b ) Tretman Phorbol 12-miristat-13-acetatom (PMA) povećava BRET signal nakon 30 min u stanicama koje su transficirane ADAM10-Rluc i YFP-SAP97 (Fluo / Lumi = 0, 091 ± 0, 009). Podaci predstavljaju prosjek ± SEM za tri neovisna pokusa. ( c ) Ukupni homogenati (HOMO) i TIF kontrolne (CTRL) i PDBu tretirane kriške hipokamena imunoprecipitirane su (IP) s pAb na ADAM10 i supopadanje SAP97 je ocijenjeno. PDBu povećava su-oborinu ADAM10 / SAP97 samo u TIF-u, ali ne i u HOMO-u. ( d ) Kvantifikacija eksperimenata u ( c ) ( n = 3, * P = 0, 006, PDBu naspram CTRL, upareni t- test). U ovom i svim sljedećim brojkama podaci predstavljaju srednju vrijednost ± SEM

Slika pune veličine

Ko-imunoprecipitacijski (IP) testovi na kriške hipokamena otkrili su značajno povećanje ADAM10 / SAP97 vezivanja 30 min nakon PKC aktivacije i pokazali su da se on pojavljuje u specifičnom odjeljku, to jest u Triton netopljivoj frakciji (TIF), sinaptičkoj i staničnoj subfrakcija membrane 16 (slike 1c i d).

PKC fosforilacija SAP97 T629 potiče interakciju ADAM10 / SAP97

Zatim smo procijenili je li ADAM10 ili SAP97 PKC supstrat. Prvo, analiza aminokiselina (aa) otkrila je S741 kao pretpostavljeno mjesto fosforilacije PKC u domeni ADAM10 u interakciji sa SAP97 6 (slika 2a). 17 Testovi fosforilacije in vitro otkrili su uključivanje fosfora-32 ( 32 P) ovisno o PKC-u samo u divlju vrstu (wt) ADAM10-C-terminalnu (Ct) domenu. I mutatanti u sekvencijskom deletiranju repa ADAM10 i mutant S741 do Mutanta nisu pokazali ugradnju 32 P, što potvrđuje da je S741 mjesto PKC fosforilacije (Slike 2b i c). Da bismo procijenili ulogu identificiranog mjesta PKC fosforilacije u modulaciji interakcije ADAM10 / SAP97, izveli smo padajuće testove s glutation- S -transferazom (GST) fuzijskim proteinima fosforiliranim ili ne PKC. Ni fosforilacija ADAM10-Ct, niti mutacije u A PKC fosfosita S741 utječu na vezanje ADAM10 na SAP97 (slike 2d i e), što sugerira da nije relevantno za stvaranje kompleksa ADAM10 / SAP97.

Image

PKC ovisna fosforilacija repa ADAM10 ne utječe na povezanost sa SAP97. ( a ) citoplazmatski rep (Ct) ADAM10 i deletacijski mutanti aa sekvenci. Podebljano je i PKC fosfosit. ( b ) GST-ADAM10-Ct i mutanti za deleciju su inkubirani ili ne sa PKC u prisutnosti [ γ - 32 P] ATP. Samo GST-ADAM10-Ct je fosforiliran. Razine fuzijskih proteina bile su usporedive što je pokazalo Coomassie bojenje (donja ploča). ( c ) In vitro fosforilacija GST-ADAM10-S741A fuzijskog proteina. Mutacija S741A dovodi do snažnog smanjenja fosforilacije ADAM10-Ct. Razine fuzijskih proteina bile su usporedive što je pokazalo Coomassie bojenje (donja ploča). ( d ) Nakon PKC fosforilacije, GST fuzijski proteini repa ADAM10 korišteni su za provođenje padajućeg testa za otkrivanje SAP97. PKC fosforilacija ADAM10 ne utječe na vezanje SAP97. ( e ) Kvantifikacija eksperimenata u ( d ) ( n = 3, P > 0, 05 fosforiliranog u odnosu na ne-fosforilirani, upareni t- test). U ovom i svim sljedećim padajućim eksperimentima, podaci su normalizirani na GST optičku gustoću (OD) i prikazani kao postotak ne-fosforiliranih proteina u istom eksperimentu

Slika pune veličine

U drugom koraku istražili smo je li SAP97 supstrat PKC-a, provodeći eksperimente metaboličkog obilježavanja s [ 32 P] ortofosfatom u žutim fluorescentnim proteinima (YFP) -SAP97wt-transfektiranim stanicama COS-7. Autoradiografija je otkrila specifičnu radioaktivnu vrpcu koja odgovara YFP-SAP97 u uzorcima ćelija obrađenih s fhorbol 12, 13-dibutiratom (PDBu), pokazujući da SAP97 prolazi PKC fosforilaciju u živim stanicama (slika 3a). Testirali smo prisutnost PKC mjesta fosforilacije unutar različitih SAP97 domena. GST-SAP97wt i GST-SAP97-SH3 fuzijski proteini, ali ne i ostali mutanti za deleciju, fosforilirani su (Slika 3b). Štoviše, mutant za brisanje GST-SAP97-GKΔ fosforilira se u istoj mjeri kao SAP97wt, demonstrirajući odsutnost relevantnih PKC fosfozita u HOOK-GK domeni (slika 3c). Analiza SH3 sekvence predviđala je četiri PKC konsenzusna motiva (S582, S597, T629 i S642; Slika 3d). Testovi fosforilacije in vitro s mutantima GST-SAP97wt ili S / T do A na pretpostavljenim PKC fosfosima pokazali su da obje mutacije T629 i S642 do reducirane fosforilacije SAP97, dok zamjena S582 i S597 nisu značajno utjecale na ugrađivanje 32 P (Slike 3e i f). Dosljedno tome, gubitak i T629 i S642 u mutantu za brisanje GST-SAP97-624Δ koji nedostaje Ct području SAP97 značajno je smanjio ugradnju 32 P (Slike 3d, g i h). Da bismo procijenili mijenja li PKC fosforilacija SAP97 interakciju ADAM10 / SAP97, izvršili smo padajuće testove s GST fuzijskim proteinima fosforiliranim ili ne PKC. Analiza je otkrila da fosforilacija i GST-SAP97wt i GST-SAP97-SH3 značajno povećava povezanost s ADAM10 (slike 3i i j).

Image

PKC fosforilacija SAP97 T629 izaziva udruživanje ADAM10 / SAP97. ( a ) COS-7 stanice transficirane YFP-SAP97wt inkubiraju se sa [32P] ortofosfatom, a zatim izlažu ili ne PDBu. Stanični lizati su IP sa anti-GFP antitijelom (Ab). Autoradiografija je otkrila specifičnu radioaktivnu vrpcu koja odgovara YFP-SAP97 u stanicama liječenim PDBu. ( b ) In vitro fosforilacija GST-SAP97wt i GST fuzijskih proteina različitih SAP97 domena. Autoradiografija je otkrila dvije specifične pojaseve koje odgovaraju GST-SAP97wt i GST-SAP97-SH3. ( c ) In vitro fosforilacija GST-SAP97wt i GST-SAP97-GKΔ. Proteini su odvojeni elektroforezom natrijevim dodecil sulfat-poliakrilamidnim gelom (SDS-PAGE) i otkriveni su autoradiografijom. Uzorci potječu iz istog pokusa i gela, ali trake nisu u susjedstvu s gelom. Nedostatak SAP97 HOOK-GK domena ne utječe na PKC fosforilaciju SAP97 ( n = 3, GST-SAP97-GKΔ = + 0, 4 ± 7, 7%; P > 0, 05, GST-SAP97-GKΔ naspram GST-SAP97wt, upareni t -test ). ( d ) SAP97-SH3 domena i SAP97-624Δ mutantni sekvenci za brisanje. Masnim slovima podebljani su pretpostavljeni PKC fosfoziti. ( e ) In vitro fosforilacija GST-SAP97 fuzijskih proteina koji nose pojedinačne mutacije pretpostavljenih PKC fosfozita. Samo mutanti GST-SAP97-T629A i GST-SAP97-S642A pokazuju smanjenje fosforilacije PKC u usporedbi s GST-SAP97wt. ( f ) Kvantifikacija 32 P ugradnje pokusa u ( e ) ( n = 3, * P = 0, 0096 GST-SAP97-T629A nasuprot GST-SAP97wt; P = 0, 0063 GST-SAP97-S642A nasuprot GST-SAP97wt, neparni t -test ). ( g ) In vitro fosforilacija GST-SAP97wt i GST-SAP97-624Δ. Manjak T629 i S642 značajno smanjuje PKC fosforilaciju SAP97. Uzorci potječu iz istog pokusa i gela, ali trake nisu u susjedstvu s gelom. ( h ) Kvantifikacija uključenja pokusa u (P) od 32 P ( n = 3, * P <0, 05 GST-SAP97-624Δ naspram GST-SAP97wt, upareni t -test). Podaci su izraženi kao postotak GST-SAP97wt. ( i ) GST-SAP97wt i GST-SAP97-SH3 su in vitro fosforilirani PKC ili potom inkubirani s HOMO mozga štakora da se istaloži ADAM10. PKC fosforilacija povećava ADAM10 vezanje. ( j ) Kvantifikacija eksperimenata u ( I ) ( n = 3, * P = 0, 01 GST-SAP97-SH3 fosforilirani u odnosu na ne-fosforilirani; P = 0, 0026 GST-SAP97 fosforilirani u odnosu na nefosforilirani, upareni t -test). ( k ) Ponižavajuća analiza vezanja ADAM10 na različite mutante GST-SAP97 nakon in vitro PKC fosforilacije. Manjak T629 sprečava PKC-inducirano povećanje asocijacije ADAM10 / SAP97. ( l ) Kvantifikacija eksperimenata u ( k ) ( n = 3, * P = 0, 011 GST-SAP97w fosforilirano u odnosu na ne-fosforilirano; P = 0, 0475 GST-SAP97-S642A fosforilirano u odnosu na nefosforilirani, upareni t -test)

Slika pune veličine

Značajno je da eliminacija oba fosfozita u mutantu za brisanje GST-SAP97-624Δ ukida porast oborina ADAM10 uzrokovan PKC-om (slike 3k i 1). Međutim, mutacija T629 na A, ali ne i mutacija S642 na A, spriječila je PKC-inducirano povećanje asocijacije ADAM10 / SAP97, što ukazuje na to da je samo fosforilacijsko mjesto T629 relevantno za interakciju ADAM10 / SAP97 (slike 3k i l). Konačno, niti mutacija drugog pretpostavljenog PKC fosfozita niti brisanje domene HOOK-GK ne utječu na vezanje ADAM10 izazvanog PKC-om na SAP97 (dopunske slike 1A i B).

Podržavajući specifičnost, PKC fosforilacija GST-SAP97wt i pojedinačnih mutanata kojima nedostaju fosfositi SH3 nisu promijenili vezivanje za druge partnere SAP97, to je sidro proteina A-kinaze 150 (AKAP150), GluA1 i GluN2A (dopunske slike 1C-E),

Ovi rezultati pokazuju da fosforilacija SAP97 na T629 pozitivno modulira interakciju ADAM10 / SAP97.

Fosforilacija T629 utječe na strukturu SAP97

Kako bismo dalje istražili kako fosforilacija SAP97 T629 utječe na vezanje ADAM10 / SAP97, proveli smo modelnu studiju.

3D struktura SH3-GK domena proteina SAP97 nedavno je riješena rendgenskom kristalografijom. 18 SH3 domena SAP97 formirana je s pet β- nizova i definirana je kao "podijeljena" SH3, 18 zbog posebnosti: lanac β 5 smješten je nakon intervenirajuće domene pod nazivom HOOK domena i nije povezan s redoslijedom ostale četiri niti (slika 4a). 18 T629 se nalazi na početku takozvane 'distalne petlje' koja spaja žice β 3 i β 4, dok se S642 nalazi na početku HOOK domene (slike 4a i b).

Image

PKC fosforilacija ostatka T629 utječe na strukturu SAP97. ( a ) Aa slijed i topologija SH3 domene SAP97. Plave strelice predstavljaju β- pramenove, a linije predstavljaju petlje. Navedena je i domena HOOK. Ostaci T629 i S642 prikazani su podebljanim slovima. ( b ) Vrpčni prikaz SH3-HOOK-GK domena SAP97. SH3 domena prikazana je plavom bojom, a domene HOOK i GK u svijetloplavoj boji. Ostaci T629 i S642 prikazani su u obliku plavih štapića. ( c i d ) Elektrostatički potencijal mapiran na molekularnoj površini SH3 domene u odsutnosti ( c ) ili prisutnosti ( d ) fosforilacije na ostatku T629. Domene HOOK i GK prikazane su svijetlo plavom bojom, dok je domena SH3 obojena prema elektrostatičkom potencijalu, plava je pozitivna, bijela je neutralna, a crvena negativna. Ostaci K607 i T629 prikazani su kao štapići. ( e ) RMSF od RT i udaljene petlje. Permisijski RMSF od RT i distalne petlje u prisutnosti (plava linija) i u odsutnosti (crvena linija) fosforilacije T629. ( f ) Ribbon prikaz SH3 domene SAP97 izdvojenog iz simulacije u odsutnosti (crvena) ili prisutnost (plava) fosforilacije. Ostatak proteina je u svijetloplavoj boji. SH3 domene složene sa SAP97-SH3 domenom prikazane su u svijetlosivoj boji, a kokristalizirani peptidi u tamno sivoj boji. Ostaci T629 i K607 prikazani su kao štapići

Slika pune veličine

Fosforilirano mjesto T629 modelirano je u 3D strukturi domene SAP97-SH3 nakon čega se energija svela na minimum. Kao što se očekivalo, uvođenje nabijene fosfatne skupine uzrokuje promjenu elektrostatičkog potencijala (slike 4c i d). Glavne razlike u elektrostatičkom potencijalu nalaze se u RT i distalnoj petlji domene SAP97-SH3 (slike 4c i d). Pregled minimizirane strukture sugerira da fosforilacija omogućuje stvaranje elektrostatičke interakcije fosfata s K607 smještenom na RT petlji, interakciju koja se ne može uspostaviti u nedostatku fosforilacije (slike 4c i d). Očekuje se da će to povećati krutost RT petlje, uključene u interakciju s drugim molekularnim partnerima, kao ADAM10.

Da bi se potvrdila ova hipoteza, provedene su simulacije molekularne dinamike od 10 ns za kompleks SAP97-SH3 u prisutnosti i odsutnosti T629 fosforilacije. Na slici 4e prikazana je srednja kvadratna fluktuacija korijena (RMSF) izračunata za RT i distalnu petlju u prisutnosti i odsutnosti fosforilacije T629. U nedostatku fosfatne skupine, dvije petlje su pokretne i pretpostavljaju različite konformacije, povećavajući strukturnu fleksibilnost mjesta interakcije (Slika 4e). Nakon fosforilacije, struktura domene SH3 postaje kruta, posebno na razini RT i distalnih petlji koje su zaključane u definiranoj konformaciji (slike 4e i f). Čvrstoća ovih petlji utječe na strukturu mjesta vezivanja specifično za PxxP motiv.

Slika 4f prikazuje strukture 15 različitih domena SH3 kokristalizirane s različitim partnerima i prikačene na snimke sa slika 4a i b. Svi peptidi kokristalizirani s SH3 domenima su u izravnom kontaktu s lancima β 3 i β 4 i s RT petljom (slika 4f), što, prema tome, potencijalno predstavlja mjesto vezanja za ADAM10.

Uzimajući u obzir ove rezultate, očekuje se da fosforilacija T629 uglavnom utječe na RT petlju. Kao posljedica toga, SAP97 mjesto vezanja pretpostavlja čvršću konformaciju koja vodi do jače interakcije s Ct regijom ADAM10.

Fosforilacija SAP97 kod T629 ima funkcionalnu i patološku ulogu

Interakcija ADAM10 / SAP97 smanjena je u hipokampi bolesnika s AD-om na Braaku 4, što sugerira poremećaj tereta SAP97 u patologiji. 7 Stoga smo pitali može li promjena PKC fosforilacije u ostatku T629 SAP97 biti odgovorna za smanjenje povezanosti ADAM10 / SAP97 u bolesnika s AD.

U tu svrhu proizvedeno je fosfo-specifično antitijelo (Ab) uzgojeno protiv T629 (SAP97-T629P Ab), afinitet je pročišćen i testiran na specifičnost (dodatne slike 2A i B).

Analizirali smo razinu fosforilacije SAP97 na T629 u hipokampija kod bolesnika s AD-om kod Braaka 4 19 i sa zdravih kontrolnih skupina (HC-ova) prilagođenih dobi. Ukupni homogenati hipokampa bolesnika s HC-om i AD-om bili su IP sa SAP97-T629P Ab i ukupna SAP97 je ocijenjena. Kvantitativna analiza pokazala je značajno smanjenje fosforilacije SAP97 kod AD hipokampa u usporedbi s HC-ima (slike 5a i b). IP je bio specifičan jer nije detektiran signal u nedostatku fosfo-Ab (dopunska slika 2C). Kao što je prethodno pokazano, na uzorku nije utjecala ukupna razina SAP97. 7

Image

Fosforilacija SAP97 kod T629 smanjena je u hipokampima bolesnika s AD i utječe na lokalizaciju / aktivnost ADAM10. ( a ) IP proveden od bolesnika s HC-om i AD-om post mortem hipokampi homogenata (HOMO) s Ab uzgojenim protiv fosforiliranog T629 (anti-SAP97-T629P). WB analiza provedena je sa SAP97 Ab. Fosforilacija SAP97 T629 smanjena je u bolesnika s AD u usporedbi s HC-om. Lijeva staza, WB izvedena na HC-ima i AD hipokampi HOMO nije pokazala promjene razine SAP97. ( b ) Kvantifikacija IP eksperimenata u ( a ) ( n = 12, * P = 0, 012 AD u odnosu na HC, upareni t- test). ( c ) Reprezentativni WB sAPPa i ukupnog sAPP-a koji se oslobađa iz stanica ljudskog embrionalnog bubrega 293 (HEK293) koji stabilno eksprimiraju APP i transficirani su bilo s YFP-SAP97wt ili s fosfomimetičkim mutantima. Ekspresija SAP97wt potiče aktivnost ADAM10, a mutirani oponašajući T629 fosforilaciju dodatno pojačava taj učinak. ( d ) Kvantitativna analiza eksperimenata u ( c ). Razine sAPPα normalizirane su na ukupnom sAPP-u, a podaci su izraženi kao postotak ispitnih stanica ( n = 4, * P <0, 05 u usporedbi s ismijavanjem; # P <0, 05 nasuprot YFP-SAP97-T629D, jednosmjerna analiza varijance (ANOVA ), Bonferronijev post hoc test). ( e ) Stanice COS-7 transficirane su samim ADAM10 cijelom dužinom (fl) ili kofeficirane bilo YFP-SAP97wt ili fosfomimetski mutanti i obojene za površinsku / ukupnu ekspresiju ADAM10. Sam ADAM10fl bio je slabo lokaliziran na površini unatoč intenzivnom unutarćelijskom obilježavanju. Suprotno tome, ko-transfekcija ADAM10fl i YFP-SAP97wt ili mutanta povećala je površinsku ekspresiju ADAM10fl. Primjetno je da je mutant YFP-SAP97-T629D imao najjači učinak na površinsku ekspresiju ADAM10fl. Linija skale, 10 µm. ( f ) Kvantifikacija eksperimenata u ( e ) (* P <0, 05 prema ADAM10fl; # P <0, 05 u odnosu na YFP-SAP97-T629D; 16 stanica po uvjetu iz dva neovisna pokusa; jednosmjerna ANOVA, Bonferronijev post hoc test)

Slika pune veličine

Da bi se provjerilo može li doći do genetske modulacije interakcije ADAM10 / SAP97, regrutovano je 100 bolesnika s AD 20 i generirani polimorfizam unutar SH3 domene SAP97. Nisu otkrivene genetske varijacije unutar SH3 domene SAP97 u bolesnika s AD, što sugerira da su drugi stanični mehanizmi mogli biti odgovorni za smanjenu PKC fosforilaciju SAP97 kod T629 u AD.

Budući da SAP97 regulira lokalizaciju i aktivnost ADAM10 sinaptičke membrane, 6 testirali smo može li ta specifična fosforilacija imati ulogu u kontroliranju aktivnosti ADAM10. Otpuštanje topljivog amiloidnog prekursora proteina α (sAPPa) značajno je poraslo kada su stanice HEK293, koje stabilno eksprimiraju ljudski APP, bile transficirane s YFP-SAP97wt. Međutim, razina sAPPa nadalje se povećala kada su stanice izrazile mutant oponašajući fosforilaciju SAP97 na T629 (YFP-SAP97-T629D), ali ne i na S642 (YFP-SAP97-S642D), što ukazuje da fosforilacija T629 posebno pojačava aktivnost ADAM10 (slike 5c i d).

Nadalje, stanice COS-7 transficirane su samo ADAM10 ili su kofeficirane bilo YFP-SAP97wt ili fosfomimetičkim mutantima. Koekspresija SAP97 donosi gotovo dvostruko povećanje nivoa ADAM10 na površini. Ipak, stanice koje eksprimiraju SAP97 mutirane u T629, ali ne i u S642, pokazuju jače površinsko označavanje ADAM10 u usporedbi sa stanicama koje su transficirane SAP97wt. Kvantitativna analiza potvrdila je da fosforilacija SAP97 na T629, ali ne i na S642, značajno povećava površinsku / ukupnu razinu ADAM10 (slike 5e i f).

Ovi podaci ukazuju na funkcionalnu ulogu fosforilacije SAP97 ovisne o PKC na T629 u regulaciji lokalizacije / aktivnosti ADAM10 i uključenosti ovog procesa u AD.

PKC aktivacija inducira SAP97 posredovanje ADAM10 od trgovine Golgi do ispoljavanja do postiinaptičke gustoće

Na temelju tih nalaza istražili smo kako fosforilacija SAP97 ovisna o PKC utječe na ADAM10 trgovinu neuronskim stanicama.

Da bismo analizirali distribuciju ADAM10 i SAP97 duž sekretornog puta, pročistili smo TIF i mikrosomalnu frakciju (P3), obogaćenu proteinima Golgi i ER, od kriški hipokampala (dopunska slika 2D). Kvantitativna analiza IP analiza otkrila je značajan porast SAP97-T629P u ukupnom homogenatu (HOMO) i u TIF, ali ne i u P3 frakciji, u križama tretiranim PDBu u usporedbi s kontrolom (dodatne slike 2E i F), sugerirajući da se fosforilacija SAP97 kod T629 uglavnom događa u sinoptičkoj frakciji membrane, kao što je prethodno pokazano povećanje povezanosti ADAM10 / SAP97 (Slike 1c i d).

Nadalje, razina ADAM10 povećana je u TIF-u i istodobno smanjena u P3 frakciji nakon tretiranja PDBu, što ukazuje da PKC aktivacija pokreće promet ADAM10 iz ER i Golgi u membranu. Nisu utvrđene promjene ukupne razine ADAM10 i SAP97 (slike 6a i b).

Image

PKC aktivacija pospješuje isporuku ADAM10 u postsinaptički odjeljak. ( a ) Reprezentativni WB od ADAM10 i SAP97 lokalizacije u HOMO, TIF i P3 frakciji nakon PKC aktivacije u kriške hipokamele (PDBu, 100 nM, 30 min). PKC aktivacija mijenja ADAM10 i SAP97 staničnu distribuciju. ( b ) Kvantifikacija eksperimenata u ( a ) ( n = 7, ADAM10, * P = 0, 008, TIF, PDBu u odnosu na kontrolu (CTRL); P = 0, 008, P3, PDBu u odnosu na CTRL; SAP97, P = 0, 02, P3, PDBu prema CTRL, upareni t- test). U ovom i svim sljedećim eksperimentima s frakcioniranjem, podaci se izražavaju kao postotak CTRL. ( c ) Reprezentativna WB od ADAM10 i SAP97 lokalizacije u križcima hipokamera tretiranim BFA prije aktiviranja PKC-a. BFA utječe na ADAM10, ali ne i na SAP97 trgovinu. ( d i e ) Kvantifikacija eksperimenata u ( c ) ( n = 5, * P <0, 05 nasuprot CTRL; # P <0, 05 u odnosu na PDBu, jednosmjerna analiza varijance (ANOVA), Bonferronijev post hoc test). ( f ) Bojenje ADAM10 / dsRed-ER i ADAM10 / GM130 u dendritima i soma neurona nakon PDBu tretmana. PKC aktivacija smanjuje razinu ADAM10 u dendritičkim i somatskim ER i Golgi. U svim su eksperimentima primarni neuroni držani u kulturi 14 DIV prije pokusa liječenja i bojanja. Linija skale, 10 µm. ( g ) Kvantifikacija eksperimenata u ( f ) (24 neurona po uvjetu iz tri neovisna pokusa, dsRED-ER: dendriti, * P = 0, 001; soma, * P = 0, 009; GM130: dendriti, * P = 0, 0017; soma, * P = 0, 0006, PDBu u odnosu na CTRL neparni t- test). ( h ) bojenje ADAM10 / PSD-95 koje pokazuje da PKC aktivacija povećava razinu ADAM10 u PSD-u. Linija skale, 10 µm. ( i ) Kvantifikacija eksperimenata u ( h ) (24 neurona po uvjetu iz tri neovisna pokusa, * P = 0, 00001, PDBu naspram CTRL, neparni t- test). ( j ) reprezentativno bojenje SAP97 / GM130 u dendritima i soma neurona nakon PDBu tretmana; PKC aktivacija smanjuje razinu SAP97 u dendritičkim i somatskim Golgijevima. Linija skale, 10 µm. ( k ) Kvantifikacija eksperimenata u ( j ) (24 neurona po uvjetu iz tri neovisna eksperimenta, dendriti, * P = 0, 0001; soma, * P = 0, 0006, PDBu naspram CTRL, neparni t- test)

Slika pune veličine

Da bismo odredili koji je unutarstanični odjeljak uključen u ADAM10-uzrokovanu PKC-om, koristili smo brefeldin-A (BFA), koji inhibira transport proteina iz ER do Golgija. 21 Pred tretman s BFA sprečava PKC-inducirano smanjenje nivoa ADAM10 u P3 frakciji i odgovarajuće povećanje TIF-a, dok na SAP97 trgovinu nije utjecao (slike 6c i e). Prema tome, PKC aktiviranje pokreće ADAM10 transport iz ER, dok PKC-inducirana SAP97 trgovina uključuje odjeljke post-ER.

Kako ovi rezultati načelno pokazuju odsutnost sličnog uzorka stanične distribucije ADAM10 i SAP97 nakon aktiviranja PKC-a, proveli smo kolokalizacijske analize u kulturama hipokampa kako bismo razjasnili ove podatke.

Transficirali smo dsRed-ER da bismo vizualizirali i somatske ER i ER pod-dijelove. 22, 23 Imunoreaktivnost markera Cis -Golgi marker 130 (GM130) identificirala je somatske Golgijeve i dendritičke Golgijeve odlaze, dok je postinaptička bojanje gustoće-95 (PSD-95) otkrila postinaptičku gustoću (PSD).

PKC aktivacija značajno smanjuje i ADAM10 / dsRed-ER i ADAM10 / GM130 kolokalizaciju u dendritima i somi i istodobno povećava kolokalizaciju ADAM10 / PSD-95 (slike 6f-i).

Suprotno tome, PKC aktivacija značajno smanjuje kolokalizaciju SAP97 / GM130 i u dendritima i u somi, bez utjecaja na kolokalizaciju SAP97 s dsRed-ER i PSD-95 (slike 6j i k i dodatne slike 3A i B).

Ovi podaci govore da aktiviranje PKC-a pokreće ADAM10 transport iz ER-a i Golgija, dok PKC-izazvana trgovina SAP97 počinje od Golgija.

PKC fosforilacija SAP97 na T629 relevantna je za lokalnu trgovinu ADAM10

Da bismo ispitali subcelularnu lokalizaciju formacije ADAM10 / SAP97, koristili smo prethodno okarakterizirani pro peptid koji prodire u stanicu, a koji je sposoban interferirati s interakcijom ADAM10 / SAP97 (dopunska slika 3C). 6, 8, 24 Tretmani kontrolnim peptidom (Ala) korišteni su kao kontrola.

Liječenje pro peptida u hipokampalnim neuronima dovelo je do nakupljanja ADAM10 u Golgijevim ispostavama, jer enzim nije uspio prebaciti se na postsinaptički odjeljak, što je dokazano smanjenjem stupnja kolokalizacije ADAM10 / PSD-95 (slike 7a i b). Nisu uočene promjene u lokalizaciji ADAM10 u somatskim Golgijevima i somatskim / dendritičkim ER (dopunske slike 3D i E), niti promjene u raspodjeli SAP97 u ER, Golgi i PSD (dopunske slike 3F-H) u stanicama koje su tretirane pro peptidom. Ovi rezultati pokazuju da se stvaranje ADAM10 / SAP97 kompleksa događa u dendritičnim Golgijevim stanicama, što upućuje na zaključak da trgovina ADAM10 posredovana SAP97 slijedi nekonvencionalni tajni put. 23, 25

Image

PKC fosforilacija SAP97 na T629 pokreće promet ADAM10 od Golgijevih odlazaka do sinapse. ( a ) obojenje ADAM10 i PSD-95 / GM130 u dendritima neurona nakon tretmana Ala ili Pro peptidom. Pro peptid utječe na obrazac distribucije ADAM10 u Golgijevim ispostavama i na PSD. Linija skale, 10 µm. ( b ) Kvantifikacija eksperimenata u ( a ) (24 neurona po uvjetu iz tri neovisna pokusa, GM130, * P = 0, 0006; PSD-95, * P = 0, 04, Pro u odnosu na Ala, neparni t- test). Podaci su izraženi kao postotak Ala. ( C ) Reprezentativni WB od ADAM10 i SAP97 lokalizacije u kriške hipokampa prethodno obrađenih s Ala ili Pro peptidom i izložen PDBu; Pro peptid sprječava promet ADAM10 na sinapsu bez utjecaja na distribuciju SAP97. ( d ) Kvantifikacija eksperimenata u ( c ) ( n = 5, * P <0, 05 nasuprot CTRL; # P <0, 05 nasuprot Pro + PDBu, jednosmjerna analiza varijance (ANOVA), Bonferronijev post hoc test). ( e ) lokalizacija ADAM10 u dendritičnim i somatskim Golgijevima bilo hipokampalnim neuronima koji su bili izloženi PDBu, bilo Ala-peptidnim ili Pro-peptidima. Pro peptid sprječava PDBu-inducirani promet ADAM10 iz dendritičnih Golgijevih zaleđa. Linija skale, 10 µm. ( f ) Kvantifikacija eksperimenata u ( e ) (24 neurona po uvjetu iz tri neovisna pokusa, * P <0, 05 u odnosu na CTRL; # P <0, 05 u odnosu na Pro + PDBu, jednosmjerna ANOVA, Bonferronijev post hoc test). ( g ) bojenje ADAM10 / PSD-95 u dendritima neurona Ala / Pro tretiranih prije inkubacije PDBu. Pro tretman utječe na isporuku ADAM10 PSD-u. Linija skale, 10 µm. ( h ) Kvantifikacija eksperimenata u ( g ) (24 neurona po uvjetu iz tri neovisna pokusa, * P <0, 05 prema CTRL; # P <0, 05 u odnosu na Pro + PDBu, jednosmjerna ANOVA, Bonferronijev post hoc test). ( i ) Reprezentativno dendritično ADAM10 / GM130 obojenje neurona koji su transficirani bilo YFP-SAP97wt ili fosfositnim mutantima. Mutanti SAP97 koji oponašaju ili ukidaju T629 fosforilaciju utječu na lokalizaciju ADAM10 u Golgijevim stanicama. Linija skale, 10 µm. ( j ) Kvantifikacija eksperimenata u ( I ) (16 neurona po uvjetu iz dva neovisna pokusa, * P <0, 05 u odnosu na YFP-SAP97wt; # P <0, 05 u odnosu na YFP-SAP97-T629D ili YFP-SAP97-T629A, jednosmjerna ANOVA, Bonferronijev post hoc test). ( k ) ADAM10 / PSD-95 bojenje neurona koji eksprimiraju ili YFP-SAP97wt ili fosfositne mutante. Mutacije T629 modificiraju sinaptičke razine ADAM10. Linija skale, 10 µm. ( l ) Kvantifikacija eksperimenata u ( k ) (16 neurona po uvjetu iz dva neovisna pokusa, * P <0, 05 u odnosu na YFP-SAP97wt; # P <0, 05 u odnosu na YFP-SAP97-T629D ili YFP-SAP97-T629A, jednosmjerna ANOVA, Bonferronijev post-hoc test)

Slika pune veličine

Tada smo zaključili da ako SAP97 posreduje transport ADAM10 uzrokovan PKC-om iz Golgijevih ispostava do PSD-a, uklanjanje ADAM10 / SAP97 kompleksa trebalo bi to spriječiti.

U tu svrhu, kriške hipokampa prethodno su tretirane ili Pro peptidom ili Ala peptidom prije aktiviranja PKC-a. Tretman pro peptida spriječio je PKC-inducirano povećanje razine ADAM10 u TIF-u, ali nije utjecao na smanjenje ADAM10 u P3 frakciji (slike 7c i d). Kao što se očekivalo, inkubacija s Pro peptidom ne utječe na promjene uzrokovane PKC-om u razinama SAP97 u P3 frakciji (Slika 7c).

Ovi su rezultati u potpunosti razjašnjeni slikovnim eksperimentima na neuronskim kulturama. Prisutnost Pro peptida blokirala je PAMC-inducirani promet ADAM10 od dendritičkog Golgija prema PSD, ali nije utjecao na PKC-aktivirani transport ADAM10 iz somatskih Golgija i iz ER (slike 7e i f i dodatne slike 4A i B). Štoviše, Pro peptidni tretman nije interferirao sa PKC-induciranim promjenama u staničnoj distribuciji SAP97 (dopunske slike 4C-E). Ovi podaci pokazuju da je SAP97 odgovoran za ADAM10-uzrokovanu PKC trgovinom iz dendritičnih Golgijevih ispostava prema PSD-u.

Jesu li učinci PKC aktivacije na promet ADAM10 posebno posljedica fosforilacije SAP97 na T629? Da bismo riješili ovo pitanje, procijenili smo učinke mutanata koji oponašaju ili ukidaju fosforilaciju SAP97 na T629 na lokalizaciju ADAM10.

Hipokampalni neuroni su transficirani bilo YFP-SAP97-T629D ili YFP-SAP97-T629A i fiksirani za analizu kolokalizacije ADAM10 s GM130 ili PSD-95.

Prekomjerna ekspresija YFP-SAP97-T629D uzrokovala je značajno smanjenje nivoa ADAM10 u dendritičnim Golgijevim stanicama i dopisno povećanje postotka preklapanja između dendritičkih ADAM10 i PSD-95 puncta. Suprotno tome, u stanicama koje su transficirane sa mutiranim YFP-SAP97-T629A, ADAM10 se akumulira u dendritičnim Golgijevim zaostalima i ne uspijeva prometovati u postsinaptički odjeljak. Nadalje, transfekcija mutanta SAP97 na S642, PKC fosfosit koji nije relevantan za asocijaciju ADAM10 / SAP97, ne utječe na lokalizaciju ADAM10 i u dendritičnim Golgijem i PSD, isključujući nespecifične učinke (slike 7i-l). Ne vide se nikakve promjene raspodjele ADAM10 kod somatskog Golgija (dopunska slika 4F).

Rasprava

Sinaptička trgovina ključni je modulator aktivnosti α -sekretaze. Međutim, signalne staze koje mogu potaknuti lokalni ADAM10 trgovinu bodlji još uvijek nisu poznate.

Ovdje identificiramo novi PKC fosfosit u SAP97, protein odgovoran za isporuku ADAM10 kičmi. 6 PKC fosforilira SAP97-SH3 domenu, modulirajući i ADAM10 / SAP97 povezanost i sinaptičku isporuku ADAM10. Ovaj mehanizam ima patogenu ulogu, jer smo primijetili značajno smanjenje fosforilacije SAP97 u bolesnika s AD, što može biti odgovorno za ranije prijavljeni kvar u sinaptičkoj trgovini i aktivnosti ADAM10. 7 Konačno, pokazali smo da trgovina ADAM10 podrazumijeva tranzit kroz dendritične Golgijeve krajnje stanove gdje se događa nastajanje kompleksa ADAM10 / SAP97.

Naši rezultati pokazuju da PKC aktivacija podstiče promet ADAM10 prema naprijed na postynapse izazivajući izlaz ADAM10 iz ER. 4 Pokazali smo da PKC stimulacija dovodi do smanjene lokalizacije ER / Golgi ADAM10 i do istodobnog povećanja razine enzima u PSD.

Paralelno smo procijenili lokalizaciju SAP97, za koju je ranije pronađeno da se obogaćuje u ER, gdje je predloženo da prenese AMPA ( α -amino-3-hidroksi-5-metil-4-izoksazolepropionsku kiselinu) receptore. 26 Nadalje, SAP97 je identificiran kao vezivni partner i supstrat za PKC te je također potreban za PKC-ovisnu stimulaciju stanične migracije. 27 Analiza slike pokazala je da PKC aktivacija smanjuje lokalizaciju SAP97 kako u somatskim Golgijevim, tako i u dendritičnim Golgijevim stanicama.

Golgijevi odlazeći smatraju se produžetkom somatskog Golgijevog 25 ili mjesto biosinteze za proteine ​​integralnih membrana prevedenih iz dendritički lokaliziranih mRNA. 28, 29 Kako se prije pokazalo da je SAP97 potreban za NMDAR-ove trgovine nekonvencionalnom tajnom stazom koja koristi dendritičke Golgijeve zapreke, 23 smo upitali da li ADAM10 / SAP97 kompleks također prolazi kroz ovaj pretinac.

Kad se miješamo u nastajanje kompleksa ADAM10 / SAP97, pomoću pro peptida propusnog za stanicu, 6, 8 ADAM10 se ne može dostaviti u sinapsu i akumulira se u dendritičnim Golgijevim stanicama, što sugerira da se ADAM10 povezuje sa SAP97 u ovom podćelijskom odjeljku.

Štoviše, odvajanje ADAM10 i SAP97 sprječava PKC-ovo aktiviranje transporta ADAM10 iz Golgijevih odlazaka na PSD, bez utjecaja na sortiranje enzima putem ER-somatskog konvencionalnog puta Golgi. Stoga je interakcija ADAM10 / SAP97 neophodna za PKC-inducirani ADAM10 promet preko nekonvencionalnog sekretornog puta, koji može pružiti platformu za lokalnu kontrolu umetanja ADAM10 u sinapsu, omogućavajući tako neuronima da čvršće i lokalnije reguliraju njegovu aktivnost.

Nadalje, otkrili smo da PKC aktivacija pozitivno modulira povezanost ADAM10 sa SAP97. Iako se ispostavilo da su i ADAM10 i SAP97 PKC supstrati, samo PKC fosforilacija SAP97 utječe na stvaranje kompleksa ADAM10 / SAP97. Identificirali smo T629 unutar SAP97-SH3 domene kao novi PKC fosfosit, čija fosforilacija povlači za sobom povećanu interakciju s ADAM10. Napominjemo, da fosforilacija SAP97 T629 ne utječe na interakciju s drugim partnerima koji se vežu za SAP97, isključujući šansu da ova posttranslacijska modifikacija općenito utječe na sposobnost vezanja SAP97. Simulacije molekularne dinamike pokazale su da fosforilacija T629 dovodi do čvršće konformacije mjesta vezivanja za SAP97 i, stoga, vjerojatno posreduje jačoj interakciji s citoplazmatskim repom ADAM10.

Fosforilacija SAP97 T629 ima važne implikacije na ADAM10 aktivnost, jer utječe na razinu ADAM10 membrane i, zauzvrat, na cijepanje APP. U heterolognim sustavima, prekomjerna ekspresija mutanta SAP97-T629D, koji oponaša fosforilaciju, potiče transport ADAM10 do plazma membrane i povećava oslobađanje sAPP α . Zatim su slikarske studije otkrile da fosforilacija SAP97 T629 posebno promiče transport ADAM10 iz Golgijevih odlagališta u pretinačno mjesto. Suprotno tome, gubitak ovog specifičnog PKC fosfozita uzrokuje nakupljanje ADAM10 u Golgijevim stanicama i smanjenje njegove sinaptičke razine.

Prethodno smo pokazali da je smanjenje aktivnosti α -sekretaze središnje u ranim fazama patogeneze AD i posljedica je neuspjeha u procesima egzocitoze / endocitoze ADAM10. 7, 9 Ovdje ćemo opisati značajno smanjenje fosforilacije ovisne o PKC-u SAP97 T629 u hipokampi bolesnika s AD, što je ishod u skladu s prethodnim istraživanjima koja su pokazala da bolesnici s AD-om imaju nižu razinu PKC-aktivnosti. 30 Nadalje, ova promjena nije povezana s prisutnošću genetskih varijacija u SH3 domeni SAP97.

Ovi rezultati dodaju još jednu pločicu našem razumijevanju složene unutarćelijske kaskade događaja odgovornih za neispravan promet ADAM10 i cijepanje APP-a u AD neuronima. Da li su ADAM10 trgovanje naprijed i endocitoza neovisni putevi ili djeluju sinergistički na razvoj neispravnog cijepanja APP-a još ostaje za razumjeti.

Nedavna istraživanja pokazala su da smanjenje aktivnosti α -sekretaze može uzrokovati AD. 31 Nadalje, skromno povišenje aktivnosti ADAM10 može biti korisno za AD i dobro se tolerira u mozgu odraslih, podupirući hipotezu da se terapijske strategije za povećanje aktivnosti α -sekretaze putem ureagulacije ADAM10 predviđaju kao efikasne za AD. 31, 32, 33

Dakle, naši nalazi pružaju neuronski specifičan mehanički okvir prema kojem je ADAM10 dendritički promet od Golgijevih odlagališta do sinapse i njegova aktivnost prolijevanja pod nadzorom fosforilacije SAP97 T629 od strane PKC-a. Kako je ovaj mehanizam izmijenjen u ranim fazama AD-a, on može predstavljati molekularnu metu za terapiju zasnovanu na α -sekretazi zasnovanoj na mozgu koja bi mogla biti korisna alternativna ili kombinirana terapija trenutnim terapeuticima.

Materijali i metode

Studije na ljudima

Hipokampi šest pacijenata s AD-om i šest HC-a dobiveni su od Netherland Brain Bank (NBB, Amsterdam, Nizozemska). Utvrđeni Braak i Braak kriteriji korišteni su za kategorizaciju AD tkiva. 19 pacijenata s AD-om ispunilo je Braak 4 stadij. U skladu s tim, u hipokampusu su se u hipokampusu pojavile tange i neuritični plakovi. HC nemaju povijest psihijatrijske ili neurološke bolesti i nemaju dokaze o neurodegeneraciji koja je povezana s godinama. Tkiva su sakupljena u roku od najviše 6–8 h nakon smrti, kako bi se smanjila razgradnja.

TIF i P3 priprema

TIF i P3 izolirani su iz akutnih križa hipokampala štakora. Rezovi su homogenizirani na 4 ° C u ledeno hladnom puferu za lizu s inhibitorima proteaze, inhibitorima fosfataze, 0, 32 M saharoze, 1 mM HEPES, 0, 1 mM PMSF, 1 mM MgCl 2 koristeći staklo-teflonski homogenizator (VWR, Radnor, PA, SAD). HOMO je centrifugiran na 10 000 × g 20 min na 4 ° C. Pelet (P1) je korišten za pročišćavanje TIF-a i supernatanta (Sl) za dobivanje frakcije P3. Ekstrakcija P1 Triton X-100 provedena je na 4 ° C 20 minuta u ekstrakcijskom puferu (0, 5% Triton X-100, 150 mM KCl i inhibitori proteaze). Nakon ekstrakcije, uzorci su centrifugirani na 100 000 × g 1 h pri 4 ° C i pelet (TIF) je ponovo suspendiran u 20 mM HEPES s inhibitorima proteaze. Triton-topiva frakcija zadržana je za Western blot (WB) analizu. Supernatant Sl je centrifugiran na 100 000 × g 2 sata na 4 ° C i mikrosomalna peleta (P3) resuspendirana u puferu za liziranje. 34

Imunotaloženie

Either aliquots of human hippocampi HOMO or HOMO/TIF/P3 fraction from hippocampal slices were incubated overnight at 4 °C in RIA buffer (200 mM NaCl, 10 mM EDTA, 10 mM Na 2 HPO 4, 0.5% NP-40, 0.1% SDS) in a final volume of 150 μl with an Ab against ADAM10 or SAP97-T629P Ab. Protein A/G beads (Tebu-bio, Peterborough, UK) were added and incubation was continued for 2 h by shaking at RT. Beads were collected by centrifugation and washed three times with RIA buffer. In IP assays performed with SAP97-T629P Ab, the samples were incubated and washed with RIA buffer containing SDS 1% to avoid any interference of protein–protein interactions. Sample buffer for SDS-PAGE was added and the mixture was heated for 3 min. Beads were collected by centrifugation and a volume of supernatants was applied onto SDS-PAGE; the immunocomplex precipitated was revealed by anti-SAP97 Ab.

Ispitivanje prema dolje

Aliquots of rat HOMO were diluted with TBS 1 × to a final volume of 1 ml and incubated 2 h with 26 μl of cold phosphorylated or not GST fusion proteins. After incubation, beads were washed five times with TBS and 0.1% Triton X-100. Bound proteins were resolved by SDS-PAGE and subjected to immunoblot analysis with anti-SAP97, anti-ADAM10, anti-AKAP150, anti-GluA1, anti-GluN2A and anti-GST Ab.

Immunocytochemistry and colocalization analysis

Primary neurons were kept in culture 14 days in vitro (DIV) before treatment and staining experiments. For colocalization analysis, transfected neurons were fixed in 4% PFA with 4% sucrose in PBS (pH 7.4) at 4 °C or in methanol at −20 °C and immunostained for ADAM10, SAP97 and GM130 or PSD-95; primary and secondary antibodies were applied in GDB buffer 35 (30 mM phosphate buffer, pH 7.4, containing 0.2% gelatin, 0.5% Triton X-100 and 0.8 M NaCl). To evaluate surface and total staining, transfected COS-7 cells were fixed with 4% PFA, 4% sucrose in PBS (pH 7.4) and then incubated with anti-ADAM10 Ab. To visualize surface expression, cells were then blocked with 4% normal serum, followed by a 555-conjugated secondary Ab. Afterwards, cells were permeabilized with 0.1% Triton X-100 for 10 min and intracellular expression of ADAM10 and SAP97 was determined by incubating cells with the appropriate Ab, anti-ADAM10 Ab or anti-green fluorescent protein (GFP) Ab (for SAP97wt and mutants constructs), and then with a 488- or 633-conjugated secondary Ab.

In vitro fusion protein phosphorylation assay

GST-purified fusion proteins were incubated or not with 10 ng of active PKC for 30 min at 37 °C, in the presence of 10 mM Tris-HCl (pH 7.4), 10 mM MgCl 2, 0.5 mM CaCl 2 and 10 μ M ATP ([ γ - 32 P]ATP 2 μ Ci per tube; 3000 Ci/mmol; Perkin-Elmer, Waltham, MA, USA). Proteins were separated on SDS-PAGE and phosphoproteins were revealed by autoradiograph.

Microscope image acquisition and data analysis

Fluorescence images were acquired using the AIM 4.2 software (Zeiss, Jena, Germany) and the confocal LSM510 Meta system (Zeiss) with a × 63 objective and a sequential acquisition setting at 1024 × 1024 pixel resolution; for each image, 0.5 μ m sections were acquired to span the entire cell and z-projection was obtained using the AIM 4.2 software. Images were processed using ImageJ (National Institute of Health, Bethesda, MD, USA) and Adobe Photoshop software (Adobe Systems Incorporated, San Jose, CA, USA). Quantification analyses were performed blind after randomization of the images. Quantification of WB analysis was performed by means of computer-assisted imaging (ImageJ) after normalization on tubulin or GST levels. Values are expressed as mean±SEM of at least three independent experiments. For surface/total ratio assays and colocalization analysis, cells were chosen randomly for quantification from four different coverslips (two or three independent experiments), images were acquired using the same settings/exposure times and at least eight cells for each condition were analyzed. Colocalization analysis was performed using AIM 4.2 software (Zeiss) on a pixel basis. We draw an ROI of the area of interest and we evaluated the colocalization coefficients and expressed it as the percentage of colocalization. For quantification of surface/total ratios, all images were analyzed using Image J. The average intensity of surface fluorescence staining was determined after cell tracing, and normalized to the total intensity to correct for differences in expression. Surface ratios were obtained by dividing the background subtracted fluorescence intensities.

statistika

Statistical evaluations were performed by using two-tailed Student's t -test (a P -value <0.05 was considered significant) or, when appropriate, by using one-way ANOVA followed by Bonferroni's post hoc test.

Odobrenje studije

All experimental procedures were carried out with care to minimize discomfort and pain to treated animals, in accordance with the guidelines of the European Communities Council (Directive of November 24, 1986, 86/609/EEC). For the experiments carried on human brain samples, all procedures were in accordance with the NIH Guide for Care and Use of laboratory human tissues and were approved by the Ethics Committee of the University of Milan. For the genetic analysis, written informed consent (from the subject or from the responsible guardian if the subject was incapable) was obtained, before study initiation, for blood collection and genotyping. The work conformed to the Declaration of Helsinki and approved by the local Ethics Committee.

Dodatna informacija

Word dokumenti

  1. 1.

    Dopunski materijal i metode

  2. 2.

    Dopunske slikovne legende

Datoteke slika

  1. 1.

    Dopunska slika 1

  2. 2.

    Dopunska slika 2

  3. 3.

    Dopunska slika 3

  4. 4.

    Dopunska slika 4

Glosar

alanine

OGLAS

Alzheimerova bolest

ADAM10

A disintegrin and metalloproteinase 10

AKAP

A-kinase anchor protein

APP

Amyloid Precursor Protein

BFA

brefeldin-A

BRET

bioluminescence resonance energy transfer

Ct

C terminal

CTRL

kontrolirati

ER

endoplazmatski retikulum

GFP

zeleni fluorescentni protein

GM130

cis -Golgi marker 130

GST

glutation S -transferaza

HC

healthy control

HOMO

homogenate

IP

imunoprecipitaciju

32 P

phosphorus-32

PDBu

phorbol 12, 13-dibutyrate

PKC

protein kinaza C

PSD-95

postsynaptic density-95

P3

microsomal fraction

S

serine

SH3

SRC homology 3

T

threonine

TIF

Triton-insoluble fraction

Wt

wild-type

YFP

yellow fluorescent protein

Dodatne informacije nalaze se u ovom radu na web stranici Cell Death and Disease (//www.nature.com/cddis)