Inhibicija male molekule ligand-stimulirane bijesne-diaph1 signalizacije transdukcije | znanstvena izvješća

Inhibicija male molekule ligand-stimulirane bijesne-diaph1 signalizacije transdukcije | znanstvena izvješća

Anonim

teme

  • Razvoj lijekova
  • screening

Sažetak

Receptor za napredne proizvode glikacije (RAGE) veže raznolike ligande povezane s kroničnom upalom i bolešću. Studije NMR spektroskopije i rendgenske kristalizacije izvanstaničnih domena RAGE pokazuju da se RAGE ligandi vežu različitim mehanizmima koji ovise o naboju i hidrofobnosti. Citoplazmatski rep (ct) RAGE je važan za RAGE ligand-posredovanu signalizaciju i posljedičnu modulaciju ekspresije gena i staničnih svojstava. RAGE signalizacija zahtijeva interakciju ctRAGE s unutarćelijskim efektorom, sisavcima dijafani 1 ili DIAPH1. Pregledali smo biblioteku od 58 000 malih molekula i identificirali 13 malih molekularnih konkurentskih inhibitora ctRAGE interakcije s DIAPH1. Ovi spojevi, koji pokazuju in vitro i in vivo inhibiciju molekularnih procesa ovisnih o RAGE, predstavljaju privlačne molekularne skele za razvoj terapeutika protiv RGE posredovanih bolesti, poput onih povezanih s dijabetičkim komplikacijama, Alzheimerovom bolešću i kroničnom upalom i pružaju podrška izvodljivosti inhibicije interakcije bjelančevina i proteina (PPI).

Uvod

Receptor za napredne krajnje proizvode glikacije (RAGE) je multi-ligandski receptor imunoglobulinske super-porodice molekula stanične površine 1, 2, 3, 4 . Izvanstanični dio RAGE sastoji se od tri domena slična imunoglobulinu, V, C1 i C2, nakon čega slijedi jedna transmembranska raspona domena i kratka citoplazmatska domena 5, 6, 7, 8 . Citoplazmatska domena ljudske RAGE, cTRAGE, visoko je napunjena i sastoji se od 43 aminokiseline (LWQRRQRRG EERKAPENQE EEEERAELNQ SEEPEAGESS TGGP) 5 . Ligandna stimulacija RAGE aktivira transdukcijske putove signala, poput proteina kinaza koje se aktiviraju mitogenom (MAPK); Rho GTPaze; i fosfatidilinozitol 3-kinaza (PI3K) / Akt, na način koji ovisi o staničnoj vrsti i akutnosti nasuprot hroničnosti poticajnog signala 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 . ctRAGE je važan za RAGE prijenos signala; pokusi in vitro i in vivo u kojima je ta domena receptora izbrisana otkrili su da je presudno za prijenos učinaka nizvodno od strane RAGE liganda 17 .

Prethodno smo ispitivali bliže mehanizme pomoću kojih je ctRAGE izvršio ove učinke na signalizaciju potaknutu ligandom koristeći dvo-hibridnu analizu kvasca i utvrdio je da ctRAGE komunicira s FH1 domenom (formin homologna domena 1) sisavaca u obliku dijafone 1 (DIAPH1) 11, 18, 19 . Eksperimenti ko-imunoprecipitacije i imunokalizacije potvrdili su ovu interakciju u staničnim modelima. Mala interferencija (si) RNA-posredovana redukcija ekspresije DIAPH1, ali ne i kodirajuća siRNA-a, blokirala je učinke RAGE liganda poput karboksi metil lizina, naprednih produkata glikacije (CML-AGEs) i S100 / kalgranulina 20, 21 na staničnu signalizaciju u različitim tipovi stanica, uključujući vaskularne stanice, imunološke stanice, kardiomiocite i transformirane stanice 11, 16, 22, 23 . In vivo , u makrofagovima iz koštane srži i staničnim glatkim mišićnim stanicama (SMC) lišen Diaph1 (gen koji kodira DIAPH1), RAGE ligandi nisu uspjeli pokrenuti staničnu signalizaciju 16, 23 . Suprotno tome, stanični podražaji, koji nisu RAGE ligandi, poput faktora rasta (PDGF) -BB koji potiče iz trombocita, stimulirali su aktivaciju Akt stanične signalizacije, migraciju i proliferaciju SMC usprkos smanjenoj ekspresiji DIAPH1 16 . Ovi podaci sugeriraju da obaranje ekspresije DIAPH1 ne daje generalizirano i nespecifično suzbijanje intracelularnih efektorskih putova.

Na temelju ovih podataka koji upućuju na to da je DIAPH1 potreban za transdukciju RAGE signala, korištena je NMR spektroskopija za identifikaciju površina interakcije između ctRAGE i DIAPH1 FH1 domene. Mapiranje uočenih promjena kemijskog pomaka na molekularnu površinu ctRAGE pokazalo je da se površina interakcije između RAGE citoplazmatske domene i FH1 DIAPH1 sastoji od malog pozitivno nabijenog flastera formiranog od Q3, R4, R5 i Q6 s ukupnom površinom manjom od 200 Å 2 24 . Kad su R6 / Q6 mutirani na alaninske ostatke, primarni mišji SMC inkubirani s RAGE ligandom S100B ili CML-AGE pokazali su značajno smanjenu signalizaciju (fosforilacija Akt) i migraciju i proliferaciju SMC nasuprot vektorskoj kontroli ili RAGE divljih vrsta. PDGF-BB, a ne RAGE ligand, pokrenuo je signalizaciju i pokrenuo proliferaciju i migraciju u SMC, čak i u prisutnosti ovih mutacija u RAGE citoplazmatskoj domeni 24 .

Eksperimentalni dokazi upućuju na to da se različiti ligandi RAGE vežu na izvanstanične domene receptora različitim biofizičkim mehanizmima. Park i njegove kolege pokazali su da se prepoznavanje RAGE liganda S100B po RAGE događa pomoću entropijski posredovanog procesa koji uključuje hidrofobnu interakciju ovisnu o Ca2 + sa RAGE izvanćelijskim domenima V-C1 7 . Koch i njegove kolege također su utvrdili važnost RAGE V-C1 u vezivanju za S100B 6 . Međutim, Xie i kolege pokazali su da se različiti S100, S100A12, veže za C1-C2 domene RAGE 25, a Leclerc i kolege pokazali da se drugi S100 ligand od RAGE, S100A6, također veže za C1-C2 izvanstanične RAGE domene 14 . Suprotno tome, RAGE vezanje za AGE posreduje prepoznavanjem negativnih naboja koji pokazuju AGE-modificirani proteini. Xue i kolege pokazali su da se specifični AGE-ovi, karboksietillizin (CEL) i hidroimidazolon uklapaju u pozitivno nabijene džepove unutar V domene 8, 26 . U slučaju amiloid-ß-peptida, dokazi govore da je V domena glavno mjesto prepoznavanja ovog liganda 27, 28 . Uzeti zajedno, ovi primjeri podvlače složenost vezanja RAGE liganda na izvanćelijske domene receptora. Stoga smo zaključili da je ključno identificirati različite načine antagonizacije interakcije ligand i RAGE. Zbog zahtjeva da se utvrdi vjerodostojnost vezanja RAGE citoplazmatske domene na DIAPH1 kao ključni mehanizam transdukcije RAGE signala, uzeta zajedno s činjenicom da se inhibicija vanćelijske domene RAGE još nije pokazala u potpunosti sigurnom i učinkovitom u različitim pato-biološke postavke koje karakteriziraju RAGE djelovanje na ljudsku bolest, usredotočili smo se na ciljanje interakcije ctRAGE-DIAPH1.

S obzirom na složenu, multi-ligandnu prirodu liganda koje se vežu na izvanstanične domene RAGE, mi smo umjesto toga pokušali otkriti inhibitore malih molekula interakcije ctRAGE s DIAPH1. Iako se razvoj inhibitora interakcije bjelančevina i proteina (PPI) smatrao izazovnim, objavljeni dokazi snažno podržavaju snažno zanimanje za ovu klasu ciljeva lijekova, posebice jer je PPI vrlo važan u većini bioloških procesa 29, 30 . Stoga smo razvili test probira visoke propusnosti s kojim smo ispitali malu biblioteku molekula od 58.000 spojeva. Od ovih molekula, 13 je pokazalo inhibiciju vezanja ctRAGE na DIAPH1 i, NMR spektroskopijom, pokazalo izravno vezanje na ctRAGE. Te identificirane molekule inhibiraju in vitro i in vivo pokrenute RAGE ligandom transdukciju signala. Sveukupno, ovi podaci utvrđuju da je citoplazmatska domena RAGE-a vjerna meta za terapijsku intervenciju u RAGE posredovanim patologijama i ilustriraju novi mehanizam specifične inhibicije RAGE signalizacije.

Rezultati

Provjera visoke propusnosti i identifikacija inhibitora malih molekula ctRAGE interakcije s DIAPH1

Slika 1a ilustrira shematski prikaz ljudskog ctRAGE; prikazane su homologije između ctRAGE čovjeka, štakora, miša i pasa. Da bismo identificirali inhibitore interakcije ljudskog ctRAGE s DIAPH1, uspostavili smo test vezanja za ispitivanje ChemBridge-ove 58.000 DIVERSet biblioteke, CT488A. Protokol ispitivanja vezivanja i rezultati prikazani su u Dodatnoj tablici S1. Anti-DIAPH1 IgG nanosi se na jažice testnih ploča s 384 jažice nakon čega slijedi blokiranje nevezanih mjesta na jažicama s goveđim serumskim albuminom (BSA). Nakon ovog koraka, ploče obložene antitijelom inkubiraju se sa lizatom humane HeLa stanice (izvor DIAPH1) nakon čega slijedi inkubacija s ispitnim malim molekulama (10 µM) i ctRAGE označenim sa GFP. 777 malih molekula koje su pokazale ≥50% inhibicije specifičnog vezivanja podvrgnuto je ponavljanju i odgovoru na četiri doze (10 µM, 1 µM, 0, 1 µM i 0, 01 µM). Ukupno, 97 spojeva pokazalo je inhibiciju inhibicije vezivanja ctRAGE-DIAPH1 ovisno o dozi. Dopunska slika S1a-m pokazuje rezultate ispitivanja u četiri točke reakcije na doze za spojeve 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 i 13 i identificira složene strukture. Napominjemo da je spoj 3, koji nije član početne biblioteke spojeva, blizak analogu spoja 4 i kupljen je za dodatnu podršku ovoj seriji nakon primarnog ispitivanja.

Image

( a ) Shematski prikaz RAGE i poravnavanje slijeda ctRAGE. Homološki ostaci su crvene boje. "TMH" označava transmembransku spiralu, a "EXRAGE" označava vanćelijski dio RAGE. Ostaci R5 i Q6, uključeni u RAGE signalizaciju, označeni su plavom bojom. ( b, c ) Prekrivanje 1 H { 15 N} HSQC NMR spektra slobodnih [ U- 15 N] ctRAGE (crno) i [ U- 15 N] ctRAGE vezano na spoj 3 ( b ) i 6 ( c ) ( Crvena). Označeni su NMR vrhovi ctRAGE ostataka koji su podvrgnuti ekstenzivnom širenju zbog interakcije s knjižničnim spojevima. ( d, e ) Površina interakcije između ctRAGE i spojeva 3 ( d ) i 6 ( e ). Ostaci Q3, R4, R5 i Q6 prethodno su uključeni u vezanje ctRAGE na DIAPH1.

Slika pune veličine

Nakon ovih eksperimenata, provedena je NMR spektroskopija da bi se utvrdila precizna mjesta interakcije ovih 97 spojeva sa ctRAGE. Promjene kemijskih pomaka proteina NMR izuzetno su osjetljive na vezanje proteina-liganda i rutinski se koriste za identificiranje interakcijskih površina protein-ligand 31 . Na temelju NMR eksperimenata, trinaest spojeva pokazalo se specifično vezanje za ctRAGE. Na primjer, 1 H { 15 N} HSQC NMR spektri [ U- 15 N] ctRAGE otkrivaju da se oba spoja 3 i 6 vežu na površinu ctRAGE koja se sastoji od Q3, R4, R7, G9 i R12, što je slično RAGE citoplazmatska domena - mjesto interakcije DIAPH1 24, sugerirajući tako da oba spoja izravno interferiraju u ovoj vezivajućoj interakciji (Spoj 3, Sl. 1b, d i Spoj 6, Sl. 1c, e). Napominje se da mjesta interakcije ctRAGE sa spojevima 3 i 6 ne preklapaju se u potpunosti, jer spoj 6 također zahvaća R8, S30 i S39. Nadalje, spoj 3 također zahvaća R5 i Q6 ct RAGE.

NMR spektri [ U- 15 N] ctRAGE vezani za preostalih jedanaest odabranih spojeva prikazani su na Dodatnim slikama kako slijedi: spojevi 1, 2, 4, 5 (dopunska slika S2a-d); spojevi 7, 8, 9 i 10 (dopunska slika S2e-h); i spojevi 11, 12 i 13 (dopunska slika S2i-k). Mjesta interakcije ctRAGE s preostalim spojevima ne preklapaju se u potpunosti i također sadrže ostatke uključene u interakciju ctRAGE-DIAPH1 24 . Uzeto zajedno, ovi podaci pokazuju da je iz izvorne biblioteke identificirano trinaest spojeva koji su prikazali nM konstante disocijacije za njihovo specifično vezanje na RAGE citoplazmatsku domenu. Dopunska tablica S2 rezimira ove podatke.

Nativna triptofanska fluorescencija ctRAGE korištena je za mjerenje afiniteta vezanja trinaest spojeva koji su pokazali inhibiciju inhibicije ctRAGE-DIAPH1 ovisne o dozi i pokazali su specifično vezanje na ctRAGE. U tim eksperimentima titracije fluorescencije konstante disocijacije, Kd, ​​procijenjene su iz promjena vršnih intenziteta fluorescencije u ovisnosti o koncentraciji slobodnog spoja, a podaci su odgovarali jednadžbi, (F - F 0 ) / F max = [spoj] / (K d + [spoj]), gdje je F intenzitet fluorescencije pri određenoj koncentraciji spoja, F 0 je intenzitet fluorescencije u slijepu, a F max je maksimalni intenzitet fluorescencije. Trinaest spojeva, prikazanih na slici 2a-m, pokazali su nizak nanomolarni afinitet za ctRAGE.

Image

( a –m) Vezanje spojeva 1–13 na ctRAGE praćeno je nativnom triptofanskom fluorescencijom ctRAGE. Konstante disocijacije (K d ) prikazane su na slici.

Slika pune veličine

Na temelju tih nalaza, pokušali smo utvrditi je li trinaest spojeva utjecalo na posljedice RAGE liganda u in vitro staničnim ispitivanjima i in vivo.

Učinci spojeva 1–13 na staničnu signalizaciju potaknutu RAGE ligandom: Akt i ERK1 / 2

Ispitali smo učinke spojeva 1–13 na staničnu signalizaciju u primarnim SMC mišje aorte. U SMCs smo prethodno pokazali da mutacija dvaju ključnih aminokiselinskih ostataka ctRAGE, R5 / Q6, blokira staničnu signalizaciju induciranu RAGE ligandima. U primarnim mišjim aortnim SMC-ima testirali smo učinke CML-AGE RAGE liganda na Akt i ERK1 / 2 fosforilaciju, jer su ti putevi semenski povezani s osnovnim svojstvima ovih stanica i njihovim reakcijama na stres, kao što su rast, proliferacija, hipertrofija, migracija i opstanak 32 . Kao što je prikazano na slici 3a, b, u odnosu na medij bez seruma (na slici označeno kao SFM ili S), liječenje primarnih mišjih aortnih SMC s RAGE ligandom CML-AGE (10 μg / ml) (označeno kao CML ili C u slika) rezultiralo je 1, 4- i 1, 9 puta povećanjem fosfo / ukupno-ERK1 / 2 i fosfo / ukupnog Akt; p <0, 001, respektivno. Prethodna obrada stanica 1, 5 sat sa spojevima 1, 2, 3, 4, 5, 9, 10, 11 i 13, 1 µM rezultirala je značajnim suzbijanjem fosfo / ukupnog ERK1 / 2 posredovanog CML-AGE. Samo spojevi 6, 7, 8 i 12 nisu značajno utjecali na ERK1 / 2 signalizaciju (Sl. 3a). Prethodna obrada stanica 1, 5 sat sa spojevima 1, 2, 3, 4, 6, 9, 10, 11 i 13, 1 µM rezultirala je značajnim suzbijanjem CML-AGE-posredovane stimulacije fosfo / total-Akt (Sl. . 3b). Samo spojevi 5, 7, 8 i 12 nisu značajno suzbili Akt signalizaciju posredovanu RAGE ligandom (Sl. 3b).

Image

Primarni mišji SMC inkubirali su se sa spojevima 1–13 (1 µM) 1, 5 h i zatim obrađivali RAGE ligandom CML-AGE (10 µg / ml) 20 minuta. Stanice su skupljene, a ukupni lizati su podvrgnuti Western blotiranju antitijelima protiv fosfo-ERK i fosfo-AKT. Blotsi su ponovno ispitani s antitijelima na ukupni-ERK i ukupni-AKT i relativnu optičku gustoću (ROD). ( a ) Prikazane su kvantificirane razine fosforiliranog / ukupnog ERK-a normaliziranog na ukupni ERK. ( b ) Prikazane su kvantificirane razine fosforiliranog / ukupnog AKT-a normaliziranog na ukupni AKT. Prikazani rezultati ispitivanja reprezentativni su za tri neovisna eksperimenta. Trake pogrešaka predstavljaju SEM. * označava p <0, 05 uspoređujući CML-AGE sa CML-AGE i tretmanom spoja i # ukazuje na p <0, 001 uspoređujući samo nosač CML-AGE sa sredstvom bez seruma (SFM). Iznad svake zapadne mrlje S = medij bez seruma i C = CML-AGE; brojevi iznad mrlja označavaju složeni broj.

Slika pune veličine

Učinci spojeva 1–13 na migraciju stanica glatkih mišićnih mišića RAGE ligandom

Zatim smo testirali učinke trinaest olovnih spojeva na suzbijanje stanične migracije RAGE ligandom. Da bi se to postiglo, aortni SMC-i uzgajani su do ušća u ploče obrađene staničnom kulturom, a zatim su podvrgnute "ranjavanju" koristeći jednu vertikalnu ogrebotinu u sredini svake jažice p200 vrhom pipete. Odmah nakon ranjavanja, slojevi se prethodno obrađuju s ispitivanim spojevima 1–13 u trajanju od 1, 5 sata. Spojevi su zatim uklonjeni iz monoplasta i zamijenjeni svježim medijem koji sadrži RAGE ligand CML-AGE (10 μg / ml). Prvo smo proučavali učinke spojeva u mišjim aortnim SMCs. U usporedbi s liječenjem ovih stanica s medijum bez seruma, liječenje RAGE ligandom CML-AGE rezultiralo je značajnim povećanjem rasta područja (μm 2 ); p <0, 001. Predradnja sa svim spojevima, 1–13, rezultirala je statistički značajnim suzbijanjem povećanog porasta SMC posredovanog CML-AGE-om (slika 4a i dopunska slika S3a).

Image

Migracija stanica nakon inkubacije sa spojevima 1–13 procijenjena je u mišjoj SMC ( a, c ) i humanoj SMC ( b ) migraciji. SMC su narasle do ušća i preko noći su gladile serum. Sljedećeg jutra uklonjen je medij bez seruma i dodani spojevi 1–13 (1 µM). Odmah nakon dodavanja spojeva, jednoslojni sloj je ranjen vrhom p200 pipete i ostavljen je da se inkubira 1, 5 h. Nakon ove inkubacije, uklonjeni su spojevi i 7 sati dodan svježi medij koji sadrži RAGE ligand, CML-AGE (10 μg / ml) ( a, b ) ili opći efektor, PDGF-BB (10 ng / ml) ( c )., Sve su slike izmjerene na T0 i T7 h i izračunato je površina u kojem su efektivne migracijske stanice izračunate. Svaki je spoj testiran u tri neovisne jažice i svaka je jažica fotografirana na 3 odvojena mjesta za ukupno 9 slika korištenih za procjenu urastanja područja. Trake pogrešaka predstavljaju SEM. * označava p <0, 05 uspoređujući CML-AGE sa CML-AGE i tretmanom spoja i # ukazuje na p <0, 001 uspoređujući nosač CML-AGE sa sredstvom bez seruma (SFM).

Slika pune veličine

Zatim smo testirali učinke spojeva 1–13 na migraciju SMC aorte čovjeka. Provedena su analogna ispitivanja onima provedena na mišjim SMC-ima. Kao što je prikazano na slici 4b, primjećeno je značajno povećanje površine izrasle nakon tretiranja RAGE ligandom CML-AGE ligandom u odnosu na medij bez seruma; p <0, 001. Predobrada humanih SMC-a sa svim spojevima, 1–13, rezultirala je značajnim smanjenjem porasta površine posredovane CML-AGE u odnosu na nosač; p <0, 05 (Sl. 4b).

Učinci spojeva 1–13 na migraciju glatkih mišićnih stanica potaknuti ne-RAGE ligandom, PGDF-BB

Zatim je bilo neophodno ispitati učinke spojeva na biološka djelovanja ne-RAGE liganda. Kao što je spomenuto gore, za razliku od liječenja RAGE ligandom S100B, u prisutnosti mutiranog R5 / Q6 u RAGE citoplazmatskoj domeni, PDGF-BB stimulira značajnu migraciju i proliferaciju mišjih SMC 24 . Da bismo se pozabavili ovim konceptom s novootkrivenim inhibitorima male molekule interakcije RAGE citoplazmatske domene s DIAPH1, testirali smo učinke spojeva 1–13 na migraciju SMC-a stimuliranu PDGF-BB. Kao što je prikazano na slici 4c i dopunskoj slici S3b, liječenje spojevima 1–13 (1 µM) nije imalo supresivni učinak na migraciju mišjeg SMC-a stimuliranog PDGF-BB. Uzeto zajedno, ovi podaci pokazuju da u SMC-ima male molekule 1–13 pokazuju selektivnost u inhibiciji stanične migracije inducirane RAGE ligandom CML-AGE liganda, ali ne kao odgovor na ne-RAGE stimulanse liganda, PDGF-BB.

Učinci spojeva 1–13 na RAGE ligand-stimuliranu upalu u endotelnim stanicama i THP1 stanicama sličnim makrofazima

Pored snažnih učinaka na migraciju vaskularnih stanica, RAGE ligandi su ključni posrednici upale u takvim uvjetima kao što su ateroskleroza, autoimunost, dijabetičke komplikacije i u središnjem živčanom sustavu 17, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40 . Tako smo testirali učinke spojeva 1–13 na RAGE ligand-posredanu upalnu stimulaciju u endotelnim stanicama i stanicama sličnim makrofazima.

Prvo smo testirali učinke RAGE liganda CML-AGE u primarnim endotelnim ćelijama aorte mišje (MAEC). Liječenje CML-AGE (10 µg / ml) rezultiralo je 25-puta i 45-puta povećanje mRNA transkripta za citokine Tnfa i Il6 u usporedbi s vehiklom, SFM (Sl. 5a, b, respektivno). Da bismo procijenili učinke spojeva, prethodno smo tretirali MAEC tijekom 1, 5 h sa spojevima 1–13 (1 µM). Predradnja sa svih trinaest spojeva, 1–13, rezultirala je značajnim suzbijanjem regulacije Tnfa posredovane CML-AGE (Sl. 5a). Nadalje, predobrada sa spojevima 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 11, 12 i 13 rezultirala je značajnim suzbijanjem regulacije Il6 posredovane CML-AGE (Sl. 5b).

Image

Primarne endotelne stanice mišje aorte ( a, b ) ili humane THP1 stanice ( c, d ) podvrgnute su 1, 5 h inkubaciji sa spojevima 1–13 (1 µM) nakon čega je slijedila stimulacija CML-AGE (10 µg / ml) 6 h, Stanice su zatim sakupljene i provedena je ekspresija gena upalnih markera Tnfα i Il6, normaliziranih na β-aktin ( a, b ) ili 18s rRNA ( c, d ). Testovi su izvedeni u tri primjerka, a rezultati su reprezentativni za tri neovisna pokusa. Trake pogrešaka predstavljaju SEM. * označava p <0, 05 uspoređujući CML-AGE sa CML-AGE, a liječenje sjedinjenjem # označava p <0, 001 uspoređujući CML-AGE sa SFM sredstvom (SFM).

Slika pune veličine

Zatim smo testirali učinke CML-AGE u stanicama THP1 humanih makrofaga na povećanje regulacije upalnih medijatora. U usporedbi s nosačem, SFM, CML-AGE stimulirao je 2, 2-puta i 82-puta povećanje mRNA transkripta za citokine Tnfa i Il6 (Sl. 5c, d, respektivno). Analogno eksperimentima s MAEC-om, THP1 stanice su prethodno tretirane 1, 5 h sa spojevima 1–13 (1 µM) prije dodavanja RAGE liganda. Predradnja sa svih trinaest spojeva rezultirala je značajnim suzbijanjem regulacije TNFa posredovane CML-AGE (Sl. 5c). Tretman sa svim osim spoja 13 rezultirao je značajnim suzbijanjem ugulacije IL6 -stimulirane CML-AGE (Sl. 5d).

Uzeti zajedno, ovi podaci pokazuju da inhibitori male molekule ctRAGE interakcije s DIAPH1 suzbijaju upale posredovane RAGE ligandom u endotelnim stanicama i stanicama sličnim makrofazima THP1.

Učinci spojeva na RAGE ligand-posredovanu stimulaciju upale in vivo

Zatim je bilo neophodno ispitati sposobnost trinaest spojeva da in vivo blokiraju RAGE ligand posredovanu upalu . U našem prethodnom radu koristili smo antitijela na RAGE kako bismo definitivno ilustrirali da infuzija divljeg dijabetičkog miševa divljeg tipa s AGE- ovima regulira Il6 u vaskularnim tkivima, putem RAGE 41 . Da bismo testirali ovaj koncept u ovoj studiji, tretirali smo miševe divljeg tipa s CML-AGE (150 μg) intraperitonealnom injekcijom nakon prethodne obrade s četiri doze spojeva 1–13 (5 mg / kg po dozi, razmak 12 h). Trideset minuta nakon četvrte doze spoja, miševima je ubrizgan CML-AGE i žrtvovano je 4 sata kasnije. Bubrežno tkivo je uzeto i podvrgnuto kvantitativnom PCR u stvarnom vremenu za otkrivanje transkripata koji kodiraju upalne medijatore. CML-AGE je rezultirao u značajnom porastu transkripta mRNA za Tnfa i ll6; p <0, 001 (sl. 6a, b). Predobrada sa spojevima 1, 2, 3, 5, 6, 8, 9, 10, 11, 12 i 13 rezultirala je značajnim suzbijanjem regulacije Tnfa mRNA posredovane CML-AGE; p <0, 05 (Sl. 6a); i predobrada sa svim spojevima 1–13 rezultirala je značajnom supresijom Il6 mRNA nasuprot nosaču u bubregu nakon injekcije RAGE liganda, CML-AGE; p <0, 05 (Sl. 6b).

Image

( a, b ) Miševi C57BL / 6J podvrgnuti su intraperitonealnoj primjeni četiri doze spoja 1–13 (5 mg / kg svakih 12 h) ili jednake količine vehikla (PBS). Trideset minuta nakon konačne injekcije miševima je ubrizgan CML-AGE (150 μg) intraperitonealnom primjenom. Četiri sata kasnije miševi su žrtvovani i izvađen je bubreg. Kvantitativni PCR u realnom vremenu proveden je za detekciju Tnfa ( a ) i Il6 ( b ). ( c ) Procjena spojeva o funkcijskom oporavku srca kod dijabetesa. C57BL / 6 miševima izvedeno je dijabetes tipa 1 sa streptozotocinom. Nakon srednjeg raspona 37–45 dana neliječene hiperglikemije, miševi su žrtvovani i srca su brzo pronađena radi procjene učinkovitosti spojeva 1–13 (1 µM) ili vehikla, DMSO, na tlaku razvijenog u lijevom ventrikulu (LVDP) nakon ishemije. Sva srca podvrgnuta su 30 minuta globalne ishemije praćene 60 minuta reperfuzije. Ispitni spojevi uvedeni su 10 minuta prije početka ishemije i nastavljeni su tijekom protokola reperfuzije. U ( a – c ), N = 5–6 miševa po grupi. Trake pogrešaka predstavljaju SEM. U ( a - c ), * označava p <0, 05 u odnosu na odgovarajuću kontrolu, a u ( a, b ), # označava p <0, 001 uspoređujući CML-AGE sa PBS tretmanom.

Slika pune veličine

Učinak spojeva na ishemiju / reperfuzijsku ozljedu dijabetičkog srca

Konačno, testirali smo učinke ovih spojeva u sredinama u kojima se prirodno akumuliraju RAGE ligandi, posebno srce dijabetičara. Zapravo, naš prethodni rad povezao je put RAGE s ozljedom dijabetičkog srca; nadalje, identificirali smo da ishemija / reperfuzija sama stvara RAGE ligande 42, 43, 44 . Da bismo testirali ovaj koncept s našim novo identificiranim malim molekulama, napravili smo miševe divljeg tipa s dijabetesom streptozotocinom. Nakon srednjeg raspona 37–45 dana trajne, neliječene hiperglikemije, srca su dohvaćena i podvrgnuta ex vivo ishemiji / reperfuzijskoj ozljedi. Utvrđeno je da u tom okruženju dijabetička srca imaju veće ozljede u usporedbi sa srcem bez dijabetesa 45 . U našim eksperimentima, infuzirali smo nosač (DMSO) nasuprot spojevima 1–13 (krajnja koncentracija, 1 µM), počevši deset minuta prije početka ishemije, i nastavili tijekom perioda od 1 h ishemije / reperfuzije. Na kraju reperfuzije izmjerili smo razvijeni tlak lijeve klijetke (LVDP) u srcima, ključnu mjeru funkcionalnog oporavka nakon ozljede. Kao što je prikazano na slici 6c, u usporedbi s nosačem DMSO, u kojem smo primijetili 36% funkcionalni oporavak, liječenje spojevima 3, 7, 9 i 11 rezultiralo je statistički značajno višim LVDP-om, 55, 57, 56, 57 i 66%, respektivno; p <0, 05. Ni u kojem slučaju nijedan od spojeva nije značajno smanjio oporavak LVDP-a. Napominjemo da nisu uočene razlike u razinama glukoze ili tjelesne težine među skupinama (dopunska tablica S3).

Rasprava

Unatoč opsežnim dokazima da RAGE-ovisna modulacija staničnih svojstava ovisi o stimulaciji pretvorbe signala, neposredni mehanizmi koji stoje na osnovi RAGE signalizacije otkriveni su tek nedavno. Otuda, otkriće da je ctRAGE vezan DIAPH1 i da je DIAPH1 potreban za učinke stimulacije RAGE liganda u vaskularnim i imunološkim stanicama postavilo je pozornicu za otkrivanje potpuno nove klase antagonista RAGE puta. U trenutnoj studiji, da rezimiram; izveli smo test povezivanja visoke propusnosti da bismo ispitali biblioteku male molekule sa 58 000 spojeva za identifikaciju inhibitora interakcije ctRAGE i DIAPH1. Nizom reakcija na dozu, NMR spektroskopijom i eksperimentima s titriranjem fluorescencije, identificirali smo trinaest „hit“ spojeva koji su pokazali afinitet vezanja na nt ctRAGE i koji su ometali kompleks ctRAGE-DIAPH1. U in vitro, ex vivo i in vivo ispitivanjima, ovi spojevi su pokazali inhibicijske učinke na transformaciju RAGE signala, staničnu migraciju, upalnu ekspresiju gena i uzrokovanu ishemijom poremećaja rada srca u izoliranom perfuziranom dijabetičkom srcu. Značajno, mjesta koja se preklapaju od spojeva na ctRAGE mogu naglasiti razlike u njihovoj sposobnosti miješanja u RAGE funkciju (Sl. 1d, e). Iako su prethodne studije sugerirale da se ctRAGE može vezati na različite unutarćelijske efektorske molekule, poput kinaze koja se odnosi na izvanćelijsku kinazu (ERK) ili adapter proteina interleukin 1 receptora (TIR) ​​46, 47, bez inhibitora interakcije ovih unutarćelijskih ciljeva sa ctRAGE još nisu pokazali in vivo dokaze supresije stanične stimulacije posredovane RAGE ligandom, kao što je ovdje prikazano. Nedavno izvješće opisuje stvaranje peptida inhibitora ctRAGE; međutim, učinkovitost peptida proučena je samo u kontekstu suzbijanja transdukcije signala in vitro analizama 48 .

Prethodne studije su zaključile da ctRAGE sadrži unutrašnju fleksibilnost 24, 49, čime se podvlači strukturna raznolikost koja je uočena među trinaest spojeva malih molekula identificiranih iz 58 000 spojenih knjižnica. Naši rezultati sada potvrđuju mišljenje da fleksibilni dijelovi proteina mogu poslužiti kao valjana terapijska meta 50 . Primjetno je da su među tih trinaest spojeva strukturne sličnosti nekih od njih dovele do njihova svrstavanja u različite „olovne serije“ nasuprot jedinstvenim strukturno jedinstvenim „singleton“ inhibitorima ctRAGE-DIAPH1 inhibitora.

Vjerojatna ranjivost spojeva identificiranih u izvornoj biblioteci zahtijevat će ublažavanje u budućim studijama, poput povećanja topljivosti, propusnosti, stabilnosti, plazme i metaboličke stabilnosti i in vivo poluživota, kao i smanjenja potencijalnih toksičnosti uslijed nepoznatih neprolaznih ciljne aktivnosti. Iako nisu primijećene vidljive toksičnosti na staničnim modelima ili in vivo u stanicama ili životinjama tretiranim spojevima male molekule, moguće je da bi dugotrajna primjena izazvala moguće nuspojave. U tom je kontekstu također moguće da su obveze topljivosti i propusnosti, posebno ograničene učinkovitosti za neke spojeve in vitro i in vivo. Budući smjerovi koji su aktivno u tijeku uključuju rigorozni napredak odnosa strukturne aktivnosti kemijski različitih područja kako bi se optimizirali djelotvornost i fizičke karakteristike spojeva potrebnih za liječenje.

Ciljna interakcija ctRAGE-DIAPH1 uključuje razvoj PPI-ja. Za razliku od različitih PPI inhibitora na bazi peptida, kod kojih imunogenost i proteolitička digestija sredstava mogu predstavljati značajnu prepreku 51, posebno u upalama oboljelim sredinama, sadašnji pristup koji se ovdje predlaže koristi male spojeve molekula kao pretpostavljene inhibitore interakcije ctRAGE s DIAPH1. Doista, Sheng i njegove kolege nedavno su pregledali stanje na ovom polju 52 i istaknuli brojna nedavna klinička ispitivanja koja su otkrila drogabilnost inhibitora PPI male molekule u ciljanju karcinoma ili očnih poremećaja. U tim uspješnim primjerima, mali molekularni PPI inhibitori imaju usporediv afinitet prema prirodnim proteinima vezivnim sredstvima.

Obrazloženje za blokadu transdukcije RAGE signala podržano je radom na raznim predkliničkim modelima bolesti kao što su dijabetes i njegove komplikacije, Alzheimerova bolest 53, 54, kardiovaskularna bolest 42, 44, 55, 56, imuno / upalni poremećaji 57, 58 i rak 59, 60, kao primjeri. RAGE ligandi se nakupljaju u tim postavkama i stoga njihov doprinos patogenezi stanične disfunkcije i oštećenja tkiva kod ovih bolesti može u konačnici biti ublažen modulacijom RAGE signalizacije.

Na kraju, napominjemo da su terapeutske mogućnosti u vezi s patobiologijom RAGE privukle značajnu pažnju u znanstvenoj zajednici. Pored strategija koje ciljaju izravni antagonizam RAGE blokadom vezanja liganda na RAGE izvanstaničnu domenu tipa V, poput azeliragona (u fazi 3 klinička ispitivanja) 61 i FPS-ZM1 27, mogu se dobiti i drugi pristupi poput topivih molekula tipa RAGE biti od koristi. U potonjem slučaju podrazumijeva se davanje topljivih (s) RAGE sekvestora RAGE ligandi, čime se sprječava interakcija tih liganda sa staničnim receptorima 38, 62 . Međutim, mora se napomenuti da kao što je receptor promiskuitetan, tako su i ligandi. Mogućnost da sRAGE modulira adaptivne funkcije podskupine ovih RAGE liganda u njihovom vezanju na različite korisne receptore stanične površine, potrebno je razmotriti u budućim studijama. Bez obzira na ta razmatranja, postoje dokazi koji sugeriraju nakupljanje sRAGE-a u plazmi / serumu ljudskog subjekta, ako ne i terapijskim dijelovima, uistinu mogu biti korisni biomarkeri RAGE aktivnosti i stanične uznemirenosti 63, 64 . U kojoj mjeri inhibicija transdukcije RAGE signala, kao što je ovdje postulirani pristup, kao i kombinirane strategije za te RAGE pristupe, ostaje da se utvrdi i dalje je predmet aktivnih istraga.

Ukratko, izvedivost ciljanja transacije RAGE signala dokazuje se slijedećim razmatranjima: prvo, naši objavljeni podaci pokazuju da je površina interakcije RAGE s DIAPH1 mala, manja od 200 Å2, te da je stoga moguće ciljati strategijom male molekule; drugo , unatoč upozorenjima u pogledu topljivosti, propusnosti, stabilnosti i poluživota, mnogi od trinaest spojeva identificiranih u izvornoj biblioteci, koji su pokazali nM afinitet prema ctRAGE, pokazali su učinkovitost u blokiranju RAGE liganda, ali ne i RAGE neovisnih podražaja, posredovana funkcija. Zaključujemo da ovi identificirani spojevi imaju značajan potencijal kao skele za drogu za daljnji razvoj u liječenju poremećaja povezanih s RAGE.

metode

Test probira s visokom propusnošću

Anti-DIAPH1 antitijelo (Santa Cruz Biotechnology, Dallas TX), 62, 5 ng / jamici, pripremljeno je kao razrjeđenje 1: 160 u 0, 1M Na2C03 pH = 9, 6; konačni volumen, 0, 05 ml, i nanosi se na jažice ploča od 384 jažice 16 sati na 4 ° C. Ploče su isprane s PBS-om, a zatim je blokirano 1, 5 sati goveđi serumski albumin (BSA) (3%) (0, 1 ml / jažica) na sobnoj temperaturi. Nakon toga je uslijedilo ispiranje s PBS-om i dodavanje humanog HeLa staničnog lizata (izvor DIAPH1), 10 µg / jažici, 3 sata na sobnoj temperaturi. Jažice su isprane s PBS-om, a zatim je 2 sata tretirano testirane male molekule Chembridgeove biblioteke DIVERSet Ct488 (krajnja koncentracija, 10 µM) i GFP-ctRAGE (konačna koncentracija, 64, 5 µM) tijekom 2 sata na sobnoj temperaturi. Ispitni spojevi dodani su u originalne bibliotečke pločice koristeći JANUS Automated Workstation (Perkin Elmer, Waltham, MA). Vezanje GFP-ctRAGE na DIAPH1 određeno je u EnVision Multilabel Reader-u (Perkin Elmer, Waltham, MA) i rezultati su normalizirani kako je opisano u Dodatnoj tablici S1. Sva ispiranja ploča izvršena su korištenjem Model Elx405 (Bio Tek, Winooski, VT).

Eksperimenti s fluorescentnom titracijom

Eksperimenti s fluorescencijom nativnog triptofana provedeni su korištenjem fluorijskog spektrofluorometra Horiba Jobin Yvon Yvon. U pokusima s fluorescentnom titracijom upotrebljeno je 97 spojeva iz biblioteke koji su prošli test ELISA. 1 mM knjižničnog spoja je otopljeno u 10 mM fosfatnom puferu [pH 7, 0] i 50% DMSO. ctRAGE je bio bakterijski eksprimiran i pročišćen kako je opisano 24 . 10 nM otopine ctRAGE pojedinačno je titrirano od 0, 1 nM-100 µM sa spojevima u 100 μL 10 mM fosfatnog pufera [pH 7, 0] i 5% DMSO. Valne duljine pobude i emisije bile su 280 nm i 352 nm. Konstante disocijacije, Kd, ​​procijenjene su iz promjena vršnih intenziteta fluorescencije u funkciji koncentracije slobodnog spoja primjenom softvera Prism 5 (GraphPad). Podaci se uklapaju u jednadžbu, (F - F 0 ) / F max = [spoj] / (K d + [spoj]) gdje je F intenzitet fluorescencije u određenoj koncentraciji spoja, F 0 je intenzitet fluorescencije u slijepu, a F max je maksimalni intenzitet fluorescencije.

NMR spektroskopija

NMR eksperimenti provedeni su na Bruker Avance III spektrometrima opremljenim krioprondom, koji rade na 1 H frekvencijama od 500 MHz i 700 MHz. U pokusima NMR korišteno je 97 spojeva iz biblioteke koji su prošli test ELISA. NMR uzorci sadržavali su 50 μM rep [ U- 15 N] RAGE i 10 μM knjižničnog spoja u 10 mM fosfatnom puferu [pH 7, 0] i 5% d6 -DMSO. Svi su spektri sakupljeni na 298 K, što je dalo visokokvalitetne NMR spektre [ U- 15 N] ctRAGE 24 . Koristili smo Watergate verziju 1 H { 15 N} uređenog heteronuklearnog jednosmjernog kvantnog koherencija (HSQC) eksperimenta 65 zabilježenog sa 64 prolaznih točaka kao 512 × 64 složenih točaka u dimenzijama protona i dušika, apodiziranih kvadratom kosinusa i zvona funkcija i ispunjena nula na 1024 × 128 bodova prije Fourierove transformacije. Odgovarajuće širine hvatanja bile su 12 i 35 ppm u dimenzijama 1 H i 15 N, respektivno. Spektri su obrađeni pomoću programa TOPSPIN 2.1 (Bruker, Inc), a program CARA 66 korišten je za spektralnu analizu. Kemijski pomaci [ U- 15 N] ctRAGE dodijeljeni su 24 . Za preraspodjelu [ U- 15 N] RAGE repnih vrhova koji su promijenili položaj zbog složene tvorbe, pretpostavili smo minimalne promjene kemijskog pomaka 67, izračunato kao ΔΩ = ((ΔΩ HN ) 2 + (0.25 * ΔΩ N ) 2 ) 1/2, gdje Ω NH i Ω N predstavljaju amidni kemijski pomak amida vodika i dušika. Promjene vršnog intenziteta izračunate su kao: (I / I ref ) bez - (I / I ref ) kompleksa, gdje sam I pojedinačni vršni intenzitet, a ref je vršni intenzitet glutamina od 7, 45 ppm i 112, 5 ppm u protonu i dimenzije dušika, odnosno one se ne mijenjaju tijekom titracije.

Western Blotting

Ukupni proteinski ekstrakti pripremljeni su iz primarnih stanica glatkih mišića aorte mišje koristeći pufer za staničnu lizu (Cell Signaling Technology, Beverly, MA). Jednake količine proteina (30 µg / uzorak) podvrgnute su SDS-PAGE (4–12%), nakon čega je uslijedio elektroforetski prijenos na membrane nitroceluloze. Nespecifično vezivanje blokirano je 1 h inkubacijom membrana s BSA (5%). Blot je inkubiran s jednim od slijedećih antitijela kao primarnim antitijelom za reakciju: anti-fosfo-ERK1 / 2 (P-ERK1 / 2) IgG, anti-total-ERK1 / 2 (T-ERK1 / 2) IgG, anti-fosfo-AKT (P-AKT) IgG i anti-total-AKT (T-AKT) IgG (Cell Signaling Technology). Svako primarno antitijelo korišteno je u razrjeđivanju od 1: 1000 preko noći na 4 ° C prema uputama proizvođača. Sekundarna antitijela konjugirana s hrenovom peroksidazom (1: 2, 500; Amersham Biosciences) korištena su za identificiranje mjesta vezanja svakog primarnog antitijela.

Stanična kultura i in vitro ispitivanja na uzgojenim SMC-ima

Mišićne vaskularne SMC kultivirane su iz aorte muških mišića starih 10 tjedana primjenom modifikacije postupka Travo i Barret 68 . SMC su uzgajane prema protokolu eksplanta u skladu s institucionalnim smjernicama. Mišični aortni vaskularni SMT divljeg tipa izolirani su i korišteni između prolaza 8 do 12. Stanične glatke mišićne mišiće aorte kupljene su iz American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA) i uzgajane u skladu s metodama koje preporučuje ATCC. Miševi endotelnih stanica aorte miševa bili su od miševa divljeg tipa C57BL / 6J u dobi od 6-8 tjedana (Jackson Laboratories, Bar Harbor ME) i korišteni su u prolazu 10 69 . THP-1 stanice dobivene su iz američke zbirke tipičnih tkiva (ATCC, Manassas VA) i korištene su prema uputama proizvođača.

Količinski PCR u stvarnom vremenu

Ukupna RNA ekstrahirana je iz stanica i tkiva pomoću RNeasy lipidnog kompleta (Qiagen, Hilden, Njemačka). cDNA je sintetizirana s MultiScribe reverznom transkriptazom (Applied Biosystems, Foster City, CA). Kvantitativna PCR u stvarnom vremenu provedena je metodom TaqMan (50 ° C 2 min, 95 ° C 10 min i 40 ciklusa od 95 ° C tokom 15 s i 60 ° C tokom 1 minute) s preliminarnim setima primera (Primijenjeno Biosystems). Relativno obilje transkripta normalizirano je prema ekspresiji 18S rRNA (za ljudske stanice) ili β-aktina (za mišje stanice i tkiva) primjenom metode ΔΔCt. Dopunska tablica S4 navodi specifične primere korištene u navedenim studijama.

Migracija mišićnih ćelija

Migracija kao odgovor na RAGE ligand CML-AGE (CML, 10 μg / ml) ili opći efektor, a ne RAGE ligand, PDGF-BB, 10 ng / ml (R&D sustavi, Minneapolis, MN, USA) je ocijenjena s rana test. Stanice su uzgajane do ušća u ploče sa 12 jažica i gladovale su preko noći. Sljedećeg jutra uklonjen je medij bez seruma i dodani spojevi 1–13. Odmah nakon dodavanja spojeva, jednoslojni sloj je ranjen pomoću p200 vrha pipete i spojevi su ostavljeni da se inkubiraju 1, 5 h. Nakon ove inkubacije, svi spojevi su uklonjeni i 7 sati je dodan svježi medij koji sadrži RAGE ligand ili opći efektor, PDGF-BB. Stanice su održavane na 37 ° C i 5% C02. Slike su dobivene na T0 i T7. Izmjerena je svaka slika i izračunato je površina u kojem su efektivne migracijske stanice.

Studije na životinjama

Svi postupci na životinjama odobreni su od strane institucionalnih odbora za njegu i upotrebu životinja sa Sveučilišta Columbia i Sveučilišta u New Yorku i izvode se u skladu s Nacionalnim institutima za zdravstvenu zaštitu životinja. Specifični eksperimenti na miševima opisani su u nastavku.

Izolirano perfuzirano srce i mjerenje rada srca

Muški C57BL / 6 miševi, u dobi od 8-12 tjedana, nabavljeni su od laboratorija Jackson i dobivali su dijabetičare 55 mg / kg intraperitonealnim putem streptozotocina (STZ) (Sigma Aldrich, St. Louis MO) dnevno u svježem citratnom puferu ( 0, 05 mol / l; pH 4, 5) 5 dana uzastopno. Kontrolni miševi primili su samo citratni pufer. Miševi koji su pokazali glukozu u serumu ≥250 mg / dl smatrani su dijabetičarima. Životinje su žrtvovane u prosjeku dijabetesa u 37 i 45 dana. Eksperimenti su izvedeni koristeći izovolumski pripravak za mišje srce kao što smo prethodno objavili 70, 71 . Nakon što je postignuta duboka anestezija, srca su brzo izrezana, stavljena u ledeni hladni Krebs-Henseleit pufer i zatim retrogradno perfuzirana s modificiranim Krebs-Henseleit puferom koji sadrži (u mM) NaCl 118, KCl 4, 7, CaCl 2 2, 5, MgCl 2 1, 2, NaHCO 3 25, glukoza 5, palmitat 0, 4, albumin goveđeg seruma 0, 4 i inzulin 70 mU / L, na 37 ° C, u ne-recirkulirajućem načinu kroz aortu. Perfusat je uravnotežen sa smjesom 95% O2 -5% CO2, koja je održavala perfusat PO2> 600 mm Hg. Tlak lijevog ventrikula razvijen (LVDP) izmjeren je pomoću balona od lateksa u lijevoj klijetci i kontinuirano se pratio na ADI diktafonu. Sva mišja srca podvrgnuta su 30 minuta početnog praćenja, nakon čega slijedi 30 minuta ishemije bez protoka i 60 minuta reperfuzije (I / R). Ispitni spojevi uvedeni su 10 minuta prije početka ishemije i nastavljeni su tijekom protokola reperfuzije. Imajte na umu da su nakon potvrde dijabetesa miševi nasumično dodijeljeni grupi liječenja. Dopunska tablica S3 pokazuje razinu glukoze u krvi, tjelesnu težinu i dane dijabetesa za sve miševe u dodijeljenom kombiniranom tretmanu u odnosu na skupine nosilaca.

Infuzija CML-AGE in vivo i učinci spojeva 1–13

Muški, divlji tip C57BL / 6J miševi kupljeni su u Jackson Laboratories. U dobi od 8 tjedana, miševi su prethodno tretirani s 4 doze spojeva 1–13, 5 mg / kg, intraperitonealnom primjenom dva puta dnevno ukupno dva dana i četiri ukupne doze. Kontrolni tretman sastojao se od DMSO razrijeđenog u PBS-u. Trideset minuta nakon posljednje doze, intraperitonealni način ubrizgan je CML-AGE (150 μg). 4 sata kasnije, miševi su žrtvovani i brzo je pronađeno bubrežno tkivo za pripremu mRNA i provođenje kvantitativnog PCR u realnom vremenu za sljedeće transkripte mRNA, Tnfa i Il6.

Statistička analiza

Svi podaci su izraženi kao srednja vrijednost ± SEM. Statistička značajnost analizirana je neparnim dvorednim t-testom pomoću GraphPad Prism verzije 6.0f za MacOS X, GraphPad Software, La Jolla CA. p vrijednosti <0, 05 smatrane su statistički značajnim.

dodatne informacije

Kako citirati ovaj članak : Manigrasso, MB i sur. Inhibicija male molekule transformacije signala RAGE-DIAPH1, stimulirane ligandom. Sci. Rep. 6, 22450; doi: 10.1038 / srep22450 (2016).

Dodatna informacija

PDF datoteke

  1. 1.

    Dodatna informacija

komentari

Slanjem komentara slažete se s našim Uvjetima i smjernicama zajednice. Ako ustanovite da je nešto zloupotrebno ili nije u skladu s našim uvjetima ili smjernicama, označite to kao neprimjereno.