Prekomjerna ekspresija rnaset2 uzrokovana stresom posreduje apoptozu melanocita putem traf2 puta in vitro | stanična smrt i bolest

Prekomjerna ekspresija rnaset2 uzrokovana stresom posreduje apoptozu melanocita putem traf2 puta in vitro | stanična smrt i bolest

Anonim

teme

  • apoptoza
  • Stanična signalizacija
  • patogeneza

Sažetak

Nedavno istraživanje povezanosti u genomu utvrdilo je vezu između vitiliga i genetske varijante gena ribonukleaze T2 ( RNASET2 ); međutim, funkcionalne uloge RNASET2 u pitigenezi vitiliga ili u apoptozi melanocita tek treba utvrditi. Trenutna studija je osmišljena kako bi istražila obrazac ekspresije RNASET2 vezan za vitiligo i njegovu molekularnu funkciju koja uključuje signalne proteine ​​i putove povezane sa apoptozom. Rezultati su pokazali prekomjernu ekspresiju RNASET2 u uzorcima epiderme kod 40 bolesnika s vitiligom u usporedbi s onom iz zdravih kontrolnih skupina. Nadalje, in vitro analize pokazale su da je prekomjerna ekspresija RNASET2 inducirana u uzgojenim primarnim ljudskim melanocitima i keratinocitima stresnim uvjetima, odnosno, izlaganjem UV zračenju, vodikovom peroksidu i upalnim faktorima, te dovela do povećane apoptoze stanica putem tumora Faktor 2 povezan s receptorima nekroze (TRAF2) - prolazi kroz fizičku interakciju RNASET2 s TRAF2. Stoga, RNASET2 može doprinijeti patogenezi vitiliga inhibiranjem TRAF2 ekspresije i, kao takav, RNASET2 može predstavljati potencijalnu terapijsku metu vitiliga.

Glavni

Vitiligo je klasificiran kao idiopatska, stečena, ograničena bolest, a trenutne procjene globalne prevalencije kreću se između 0, 5 i 2%. Primarni fizički simptom je patchy depigmentacija kože i nadlaktice koja se očituje gubitkom funkcionalnih epidermalnih melanocita. 1, 2 Studije patogenih mehanizama vitiliga okarakterizirale su proces molekularne bolesti kao multifaktorski i složen, ali tek treba utvrditi precizan skup faktora ili njihove dinamičke interakcije koje promiču razvoj i napredovanje vitiliga. Međutim, postavljeno je nekoliko teorija za objašnjenje patogeneze vitiliga na temelju histoloških, kliničkih i etioloških nalaza, od kojih su najpopularnije autoimunost, genetski čimbenici i oksidativni stres. Iako je vjerojatno da stvarni mehanizam bolesti uključuje složenu interakciju više procesa; na primjer, nakupljene genetske i epigenetske promjene mogu povećati osjetljivost melanocita na ozljede ili uništavanje pretjeranim UV zračenjem, hidrogen peroksidom (H 2 O 2 ) i faktorima zapaljenja (koji su svi definirani kao faktori rizika od vitiliga), također je moguće da poremećaji u signalnim putovima apoptoze doprinose gubitku melanocita. 3 U nedavnoj studiji povezanosti genoma (GWAS) generaliziranog vitiliga u kineskoj populaciji Han, gen koji kodira ribonukleazu T2 (RNASET2) identificiran je kao faktor rizika bolesti. 4 Ribonukleaze (RNases) su sveprisutni, očuvani enzimi koji djeluju u širokom spektru normalnih fizioloških procesa, poput imunoloških odgovora domaćina. Poremećaji u njihovim ekspresijskim profilima povezani su s različitim patološkim stanjima, uključujući karcinom i autoimune bolesti. Studije kojima se utvrđuje uloga RNASET2 u karcinomu rasvijetlile su njegove supresivne učinke - neovisne o njegovoj nukleaznoj aktivnosti - na rast stanica i metastatski potencijal, kako in vitro tako i in vivo . 5, 6, 7 Do danas, RNASET2 jedini je član Rh / T2 / S porodice kiselih hidrolaze identificiranih u ljudi, 8 no novija istraživanja RNASET2 ortologa u Saccharomyces cerevisiae , Rny1, pokazala su sličnu funkciju, u da Rnyl može posredovati inhibiciji rasta stanica kao odgovor na uvjete oksidativnog stresa i da je ta aktivnost neovisna o katalitičkoj aktivnosti enzima. 9

U silikonskoj analizi sekvence aminokiselina RNASET2 identificiran je navodni motiv vezivanja za faktor 2 povezan s receptorom faktora nekroze faktora tumora (TRAF2), 10 koji je nedavno prepoznat kao faktor određivanja praga apoptoze kroz njegove aktivnosti ubikvitin ligaze koje djeluju na kaspaza- 8. 11 Ovo otkriće postaje posebno intrigantno ako se razmotri u kontekstu kliničkih i laboratorijskih histoloških podataka o tkivima zahvaćenim vitiligom koji su pokazali apoptozu, a ne za staničnu smrt, što je odgovorno za gubitak melanocita. 12 Stoga smo pretpostavili da interakcija TRAF2 i RNASET2 može doprinijeti patogenezi vitiliga kod ljudi, možda narušavajući mehanizam apoptoze u uključenim stanicama (melanociti i keratinociti).

Ovdje smo opisali našu studiju koristeći in vitro pristupe za određivanje uzorka ekspresije RNASET2 vezanog za vitiligo pomoću uzorka bolesnika i zdravih tkiva od podudarnih kontrolnih davalaca i otkrili molekulski mehanizam koji uključuje RNASET2 koji posreduje signalizacijski put apoptoze TRAF2-kaspaza koristeći kulturiranu primarni humani epidermalni melanociti (HEM) i keratinociti (HEK).

Rezultati

Epitelmis Vitiligo značajno je poboljšao ekspresiju RNASET2

Da bi se istražila funkcionalna implikacija RNASET2 -detektiranog GWAS- ovog faktora u patogenezi vitiliga, kvantitativnom reverznom transkripcijom otkrivena je diferencijalna ekspresija RNASET2 između lezija tkiva kod pacijenata s vitiligom ( n = 40) i zdravim tkivima kod davatelja ( n = 40). PCR (qRT-PCR) i Western blotting. Za transkript (vitiligo naspram kontrole: 4.056 ± 1.115 naspram 1.034 ± 0.166; P <0.001) i proteinske ekspresije RNASET2 značajno je veći u uzorcima epiderme vitiliga (slike 1a i b). Imunohistokemijska analiza uzoraka epiderme vitiliga pokazala je snažno citoplazmatsko bojenje za RNASET2, a bojenje u zdravim tkivima bilo je značajno manje (Slika 1c).

Image

RNASET2 je prekomjerno izražen u kliničkim uzorcima epitelnih lezija pacijenata s vitiligom. ( a ) Ekspresija RNASET2 mRNA u 40 uzoraka vitiliga i 40 zdravih tkiva otkrivenih qRT-PCR i prikazana kao srednja vrijednost ± SD iz tri neovisna pokusa. * P <0, 01 ( b ) Ekspresija proteina RNASET2 u dva reprezentativna uzorka vitiliga i jednom zdravom uzorku otkrivenom Western blottingom. ( c ) Ekspresija proteina RNASET2 u reprezentativnim zdravim i vitiligo tkivima otkrivenim imunohistokemijom. Povećanje: × 400

Slika pune veličine

Stresni uvjeti induciraju pojačanu ekspresiju RNASET2 u HEK-ovima i HEM-ovima

Da bi se istražilo je li stres potencijalni mehanizam opaženog pojačanja RNASET2 ekspresije u vitiligo epidermalnim lezijama, učinci UV zračenja, H2O2 i upalni faktori na HEKs i HEM su ispitivani in vitro . Sva tri stresna stanja inducirala su ekspresiju RNASET2 (i transkripta i proteina) na način ovisan o koncentraciji (Slike 2 i 3). Imunofluorescentna analiza je također pokazala povećanje količine i disperzije RNASET2 iz citoplazme u staničnu membranu i u supernatant kulture (ovisno o izlučivanju u vanćelijski prostor); nasuprot tome, kontrolni HEK-ovi i HEM-ovi u nestetnim uvjetima pokazali su najviše razine RNASET2 u citoplazmatskoj regiji koja je najbliža jezgru (Slike 2 g i 3 g).

Image

RNASET2-inducirana stresom ekspresija u HEK-ovima. ( a i b ) prekomjerno UV zračenje. ( c i d ) H202. ( e i f ) LPS. ( a, c i e ) Grafikoni ekspresije mRNA-normalizirane RNASET2-aktinom, a koje se normalizuje aktinom, otkrivene su qRT-PCR nakon 24 sata pod stresnim uvjetima. Podaci su izraženi kao srednja vrijednost ± SD vrijednosti iz triju neovisnih pokusa. # P <0, 05, * P <0, 01 u odnosu na kontrolnu skupinu, jednosmjernom ANOVA s Dunnettovim višestrukim usporednim testom. ( b, d, i f ) detekcija Western blot-a ekspresije proteina RNASET2 nakon 48 h pod stresnim uvjetima. ( g ) Indirektno otkrivanje imunofluorescencije RNASET2 ekspresije proteina u HEK-u nakon 48 sati pod stresnim uvjetima. Uvećanje: × 200. Pokusi zapadnog blotiranja i imunofluorescencije ponovljeni su najmanje tri puta i prikazani su reprezentativni rezultati

Slika pune veličine

Image

RNASET2 ekspresija stresa u HEM-u. ( a i b ) prekomjerno UV zračenje. ( c i d ) H202. ( e i f ) LPS. ( a, c i e ) Grafikoni ekspresije mRNA-normalizirane RNASET2-aktinom, a koje se normalizuje aktinom, otkrivene su qRT-PCR nakon 24 sata pod stresnim uvjetima. Podaci su izraženi kao srednja vrijednost ± SD vrijednosti iz triju neovisnih pokusa. # P <0, 05, * P <0, 01 u odnosu na kontrolnu skupinu, jednosmjernom ANOVA s Dunnettovim višestrukim usporednim testom. ( b, d, i f ) detekcija Western blot-a ekspresije proteina RNASET2 nakon 48 h pod stresnim uvjetima. ( g ) Indirektno otkrivanje imunofluorescencije RNASET2 ekspresije proteina u HEK-u nakon 48 sati pod stresnim uvjetima. Uvećanje: × 200. Pokusi Western blot-a i imunofluorescencije ponovljeni su najmanje tri puta i prikazani su reprezentativni rezultati

Slika pune veličine

HEK-ovi i HEM-ovi koji prekomjerno izražavaju RNASET2 su manje održivi

Kako bi se istražilo može li primijećena prekomjerna ekspresija RNASET2 u epidermalnim lezijama vitiliga utjecati na preživljavanje endotelnih stanica, procijenjena su održivost i apoptotička priroda HEK-a i HEM-a nakon prekomjerne ekspresije RNASET2 posredovane lentivirusom (Slika 4). Obje vrste stanica pokazale su smanjenu vitalnost (slike 4e, f i h) i pojačanu apoptozu (slike 4 g i i) kada je RNASET2 bio prekomjerno eksprimiran, u usporedbi sa stanicama transduciranim praznim vektorom. Konkretno, postotak stanične apoptoze za VECTOR naspram OE RNASET2 u stanicama HEK-a (4.167 ± 0.330 nasuprot 23.467 ± 1.482; P = 0.003) i HEM stanicama (5.400 ± 0.455 nasuprot 27.333 ± 1.053; P = 0.001) bili su statistički značajni. Kako bismo dokazali da je veća indukcija apoptoze umjesto staničnog ciklusa doista bitna za prekomjernu ekspresiju RNASET2, izveli smo analize staničnog ciklusa transfektiranih HEK-ova i otkrili da prekomjerna ekspresija RNASET2 nije uzrokovala očite poremećaje u staničnom ciklusu (podaci nisu prikazani). Nadalje, inkubirali smo HEK i HEM stanice s prekomjernom ekspresijom RNASET2 u nedostatku ili prisutnosti 10 μ M zVAD-fmk, te postotak apoptoze stanica za OE RNASET2 nasuprot OE RNASET2-10 μ M zVAD u stanicama HEK-a (23.467 ± 1.482 nasuprot 5.567 ± 0.713; P = 0.002) i HEM stanice (27.333 ± 1.053 nasuprot 7.600 ± 0.980; P = 0.001) bile su statistički značajne (Slike 4g i i). Rezultati analiza apoptoze i analiza staničnog ciklusa dokazali su da je prekomjerna ekspresija RNASET2 doista bitna za staničnu apoptozu.

Image

Lentivirusom posredovani RNASET2 prekomjernom ekspresijom ometa rast HEK-a i HEM-a in vitro . U 72 h nakon transfekcije, ( a i b ) slika HEK-a (uvećanje: × 100) i HEM (× 200) transfektirana s praznim vektorom (VECTOR) ili divljim tipom RNASET2 vektora prekompresije (OE RNASET2) i ( c i d ) prekomjerna ekspresija RNASET2 u HEK-ovima i HEM-ima potvrđena zapadnim blotiranjem. Transficirane stanice su sakupljene i sjeme za daljnje analize. ( e i f ) Grafikoni krivulja rasta s vremenom kako je naznačeno za HEK-ove i HEM-ove. ( g i i ) Analize HEK-a i HEM-a koji su podvrgnuti apoptozi u odsutnosti ili prisutnosti 10 µM zVAD-fmk tijekom 24 sata na dan 3 nakon sjetve. ( e - g i i ) Podaci su izraženi kao srednja vrijednost ± SD vrijednosti iz triju neovisnih pokusa. ( h ) Ispitivanje HEK-a u koloniji provedeno je na dan 14 nakon sjetve. Eksperimenti su ponovljeni najmanje tri puta i prikazani su reprezentativni rezultati

Slika pune veličine

HEK-ovi i HEM-ovi koji prekomjerno izražavaju RNASET2 preosjetljivi su na oksidativni stres

S obzirom na to da prekomjerna ekspresija kvasca RNase RNY1 uzrokuje preosjetljivost na oksidativni stres induciran s H202, 9 istraživali smo da li RNASET2 ima analognu biološku funkciju u patogenezi vitiliga. Prvo smo izveli preliminarne eksperimentalne doze (0–100 µM ) i kinetičke (1–24 h) eksperimente, te utvrdili optimalne uvjete za oksidativni stres, tj. HEK: 5 µM H H 2 O 2 za 24 h i HEM: 0, 5 µM H202 tokom 24 h (slike 5a i b). Zapravo, prekomjerna ekspresija RNASET2 posredovana lentivirusom uzrokovala je preosjetljivost HEK-a i HEM-a na oksidativni stres induciran s H2O2, o čemu svjedoči veća stopa neto apoptoze stanica (slike 5c i d) i karakteristične morfološke promjene (slike 5e i f) u usporedbi sa stanicama transduciranim s praznim vektorom.

Image

HEK-ovi i HEM-ovi koji prekomjerno izražavaju RNASET2 preosjetljivi su na oksidativni stres. Transficirane stanice su sakupljene i sjeme za daljnje analize. Svi su pokusi provedeni 3. dana nakon sadnje. ( a i b ) Analize apoptoze sa ili bez različite koncentracije H2O2 tijekom 24 sata u HEK-ovima (1, 5 i 10 µM) i HEM-ima (0, 1, 0, 5 i 1 µM). ( c i d ) Usporedba neto ćelijske apoptoze a i b inducirane od H2O2 u HEKs / HEMs-VECTOR i HEKs / HEMs-OE RNASET2. Upareni t- test korišten je za utvrđivanje važnosti razlika između skupina. ( e i f ) Promjene u staničnoj morfologiji prije i tijekom oksidativnog stresa. Primjećeni su HEKs-VECTOR i HEKs-OE RNASET2 nakon 24-satne izloženosti 5 µM H2O 2 (lijevo), dok su HEM-VECTOR i HEM-OE RNASET2 primijećeni nakon 24-satne izloženosti 0, 5 µM H2O 2 (desno). Eksperimenti su ponovljeni najmanje tri puta; prikazani su reprezentativni primjeri

Slika pune veličine

RNASET2 HEK-ovi koji prekomjerno eksprimiraju smanjuju sintezu melanina

Da bi se dodatno istražila funkcionalna uloga RNASET2 u pitigenezi vitiliga, nekoliko katalitičkih i signalnih faktora prethodno identificiranih kao povezanih s procesom bolesti ispitivano je u HEK-ovima i HEM-ovima s prekomjernom ekspresijom RNASET2, posredovanom lentivirusom. HEKs prekomjerno eksprimirajući RNASET2 pokazao je značajno smanjenu ekspresiju pro-opiomelanokorortina (POMC), i na razini transkripta (slika 6a) i proteina (slika 6b). HEM-ovi prekomjerni ekspresije RNASET2 pokazali su smanjenu aktivnost tirozinaze (TYR) (slika 6c) i sintezu melanina (slika 6d).

Image

Prekomjerna ekspresija RNASET2 u HEK-ima i HEM-u dovodi do smanjene sinteze melanina. Transficirane stanice su sakupljene i sjeme za daljnje analize. Svi su pokusi provedeni 3. dana nakon sadnje. ( a i b ) U HEK-ovima, OE RNASET2 značajno je smanjio ekspresiju POMC-a kako je otkriveno ( a ) qRT-PCR i ( b ) western blottingom. ( c - f ) U HEM-ovima, OEE RNASET2 značajno je smanjio sintezu melanina, kao što pokazuje ( c ) test TYR aktivnosti i ( d ) klantifikacija melanina. ( e i f ) U HEM-ovima, OE od RNASET2 značajno je smanjio ekspresiju MITF, TYR i TRP-1 što je otkriveno ( e ) qRT-PCR i ( f ) Western blottingom. Kvantitativni podaci prikazani su kao srednja vrijednost ± SD iz tri neovisna pokusa. Kvalitativni eksperimenti ponovljeni su najmanje tri puta i prikazani su reprezentativni rezultati

Slika pune veličine

Da bi se istražili učinci prekomjerne ekspresije RNASET2 na sintezu melanina u HEM-ima, otkriveni su nivoi ekspresije njegovih ključnih faktora, faktor transkripcije povezan s mikroftalmijom (MITF), TYR i protein-1 povezan s TYR (TRP-1). I razina transkripta (slika 6e) i proteina (slika 6f) sva tri faktora značajno su regulirana u HNEM-ima prekomjernog ekspresije RNASET2, u usporedbi s kontrolnim HEM-ovima koji su transfektirani s praznim vektorom. Ovi rezultati sugeriraju da prekomjerna ekspresija RNASET2 može izravno smanjiti melanogenezu HEM-a in vitro .

RNASET2 doprinosi staničnoj smrti kroz svoj motiv koji veže TRAF2, ali neovisan o katalitičkoj aktivnosti

Da bi se istražio mehanizam kojim RNASET2 posreduje staničnu smrt, ispitivani su učinci poremećaja dvije njegove komponente povezane s funkcijom, katalitičkim mjestom i predviđenim motivom vezivanja TRAF2. Gubitak održivosti HEK-a i HEM-a i povećana apoptoza uočena pri prekomjernoj ekspresiji RNASET2 bili su slični gubitku koji je zabilježen pri prekomjernoj ekspresiji katalitički neaktivne verzije RNASET2 (Slika 7). Konkretno, postotak stanične apoptoze za VECTOR nasuprot OE katalitički neaktivnog mutanta RNASET2 (RNASET2-ci) u stanicama HEK-a (4.533 ± 0.351 u odnosu na 22.300 ± 1.374; P = 0.001) i HEM-stanica (5.6 ± 0.748 nasuprot 26.8333 ± 1.144; P = 0, 001) bili su statistički značajni (slike 7g i h). Međutim, prekomjerna ekspresija mutirane verzije RNASET2 na mjestu koje veže TRAF2 nije dovela do iste smanjene vitalnosti stanica (slike 7e i f) i visoke razine apoptoze u HEK stanicama (OE RNASET2-ti nasuprot OE RNASET2: 6.367 ± 0.903 nasuprot 21.667 ± 0, 939; P = 0, 002) i HEM stanice (OE RNASET2-ti nasuprot OE RNASET2: 7, 367 ± 1, 066 nasuprot 27, 267 ± 1, 087; P = 0, 004; Slike 7 g i h) kao divlji tip RNASET2 prekomjerne ekspresije, što sugerira potencijalnu patološki relevantnu ulogu za RNASET2-TRAF2 interakciju u vitiligu. Da bismo dodatno dokazali da su stanice prekomjerne ekspresije RNASET2 preosjetljive na oksidativni stres kroz motiv koji veže TRAF2, ali neovisne o katalitičkoj aktivnosti, inkubirali smo transficirane HEK i HEM stanice (neo, RNASET2 transficirane ili RNASET2 mutante transfektirane) s optimalnom koncentracijom H2O2 kao što je naznačeno za 24 sata, i otkrili su da RNASET2-ti mutant štiti HEK i HEM stanice od apoptoze pokrenute H20, dok mutant RNASET2-ci nije. Konkretno, razine stanične apoptoze nakon oksidativnog stresa za OEE RNASET2-ti nasuprot OEE RNASET2 u stanicama HEK-a (14.667 ± 0.710 nasuprot 40.667 ± 1.856; P = 0.001) i HEM-stanicama (18.533 ± 0.713 u odnosu na 54.900 ± 1.445; P = 0, 002) bili su statistički značajni (slike 7g i h).

Image

Doprinos katalitičke aktivnosti i mjesta vezanja TRAF2 učincima rasta stanica posredovanih prekomjernom ekspresijom RNASET2 u HEK-ovima i HEM-ovima. U 72 h nakon transfekcije, ( a i b ) slika HEK-a (uvećanje: × 100) i HEM (× 200) transfektirana s praznim vektorom (VECTOR), divljim tipom RNASET2-prekomjernog ekspresije (OE RNASET2), katalitički neaktivnim RNASET2- vektor ekspresije (OE RNASET2-ci) ili mutant mjesta prekomjernog ekspresije RNASET2 (OE RNASET2-ti) na mjestu TRAF2 (i c i d ) prekomjerna ekspresija RNASET2 u HEK-ima i HEM-u, potvrđen zapadnjačkim blotiranjem. Transficirane stanice su sakupljene i sjeme za daljnje analize. ( e i f ) Grafikoni krivulja rasta s vremenom kako je naznačeno za HEK-ove i HEM-ove. ( g i h ) Analiza apoptoze HEK-a sa ili bez izloženosti 5 µM H2O2 (lijevo) i HEM-a sa ili bez izlaganja 0, 5 µM H2O2 (desno) 24 h na dan 3 nakon sjetve. Podaci su izraženi kao srednja vrijednost ± SD vrijednosti iz triju neovisnih pokusa. * P <0, 01

Slika pune veličine

RNASET2 potiče apoptozu putem TRAF2-kaspaznog puta

Fizička interakcija RNASET2-TRAF2 potvrđena je imunoprecipitacijom FLAG-obilježenog divljeg tipa RNASET2 anti-TRAF2 monoklonskim antitijelom (Slika 8a). Zatim, za početak istraživanja potencijalnog mehanizma interakcije RNASET2-TRAF2, posebno u odnosu na učinke na staničnu apoptozu, ispitana je Western blot analiza diferencijalne ekspresije TRAF2, kaspaze-8 i kaspaze-3 nakon prekomjerne ekspresije RNASET2. Otkriveno je da prekomjerna ekspresija RNASET2 uzrokovana leentivirusom u HEM-u prati smanjenu ekspresiju TRAF2 i pojačanu proteolitičku aktivaciju i kaspaze-8 i kaspaze-3 (slike 8b i c).

Image

RNASET2 potiče apoptozu putem TRAF2-kaspaznog puta. ( a ) imunoprecipitacija RNASET2 s TRAF2. pmRFP-TRAF2 je transfektiran u stanice H1299 zajedno s GV287-RNASET2-FLAG (trake 2 i 4) ili samostalno (trake 1 i 3). Prikazana je Western blot membrana koju je probilo antitijelo protiv TRAF2 (gornja) i protiv FLAG (donja). ( b ) detekcija zapadnog mrlja TRAF2 i ekspresije kaspaze-8 u HEM-u. OE od RNASET2 i OE od RNASET2-ci proizveli su proteolitičku aktivaciju kaspaze-8 i nisku TRAF2 ekspresiju u usporedbi s VECTOR-om i OE RNASET2-ti. ( c ) detekcija ekspresije kaspaze-3 zapadnim upijanjem. ( d ) Hipotezirani doprinos prekomjerne ekspresije proteina RNASET2 u patogenezi vitiliga. RNASET2 može poticati staničnu apoptozu i preosjetljivost na stres putem TRAF2-kaspaznog puta

Slika pune veličine

Rasprava

Vitiligo se očituje progresivnim uništavanjem melanocita i ima komponente osjetljivosti kako u genetičkoj tako i u izloženosti okolišu (tj. UV, H2O2 i lipopolisaharidu (LPS)). Iako su identificirali različite čimbenike rizika od vitiliga, molekularni mehanizmi njegove složene temeljne patogeneze ostaju uglavnom nepoznati. Trenutno istraživanje RNASET2 daje nove uvide u mehanizme vezane za staničnu smrt i apoptozu epitelnih stanica u zahvaćenim tkivima.

RNaze sisavaca sadrže heterogenu skupinu regulatornih enzima koji su uključeni u široku lepezu normalnih bioloških procesa, uključujući ekspresiju gena i staničnu diferencijaciju. RNASET2 je relativno novo priznati član Rh / T2 / S porodice RNases; kao takvi, ovdje prikazani podaci ne samo da otkrivaju novu patogenu mrežu vitiliga, već i unapređuju naše razumijevanje RNASET2 općih bioloških svojstava.

Konkretno, trenutna studija pružila je klinički relevantne dokaze prekomjerne ekspresije RNASET2 u lezijama humanog vitiliga u usporedbi sa zdravim tkivom i otkrila je da stresni uvjeti u okolišu povezani s vitiligom mogu potaknuti ekspresiju RNASET2 u uzgojenim ljudskim primarnim melanocitima i keratinocitima. Značajno je da ovi in vitro stresni uvjeti također potiču dinamično kretanje RNASET2 iz perinuklearnog područja u staničnu membranu i van u izvanćelijski prostor (podaci nisu prikazani); ovi su rezultati preliminarni i očekuje se da će detaljna ispitivanja koja su u tijeku potvrditi u kojoj mjeri je ovaj dinamički profil paralela ranije prikazan za kvasni ortolog RNASET2, Rny1p. 8 Nedavna studija pokazala je da prekomjerna ekspresija ljudskog RNASET2 u kvascu rezultira cijepanjem tRNA i rRNA i oštećenjem rasta. 9 Budući da tRNA i rRNA imaju odlučujuću ulogu u procesu sinteze proteina, cijepanje tRNA i rRNA uslijed prekomjerne ekspresije RNASET2 može dovesti do poremećaja sinteze proteina. To bi mogao biti razlog nedostatka povezanosti mRNA RNASET2 i ekspresije proteina pri 0, 6 J uskopojasnom UVB (NB-UVB) zračenju u stanicama HEK-a (Slika 2a) i 0, 4 i 0, 5 J NB-UVB zračenja u stanicama HEM-a ( Slika 3b) i pri 100 i 200 µg / ml LPS u stanicama HEK-a (Slika 2e).

Rny1p je opsežno proučavan i okarakteriziran je kao sklop unutarćelijskog kruga koji može kontrolirati sudbinu stanica, bez obzira na citosolnu sposobnost cijepanja RNA. 9, 13 Prethodna studija koja je pokazala oksidativnom translokacijom Rny1p iz vakuole u citosol također je pokazala da ovaj dinamični proces dovodi do aktiviranja signala stanične apoptoze, neovisnog o katalitičkoj aktivnosti enzima. 9 Ovaj je posljednji nalaz potvrđen i in vivo modelom tumora. 14 U trenutnoj studiji pokazano je da RNASET2 inducira apoptozu ljudskih primarnih melanocita i keratinocita i da izaziva preosjetljivost na oksidativni stres, bez obzira na katalitičku aktivnost enzima. Ovi se nalazi također slažu s biološkim svojstvima koja su dokazana za ostale članove obitelji T2 RNase. 15

P-CM-stimlacijski hormon koji potiče POMC ( α -MSH) eksprimira se u središnjem živčanom sustavu i perifernim tkivima kao što je koža, s primarnom ekspresijom kože u keratinocitima. 16 U skladu s tim, definirane su robusne funkcije α -MSH u molekularnim procesima pigmentacije kože, apoptoze, upale i UV-inducirane imune supresije. 17, 18 Nadalje, pokazalo se da je α -MSH stimulacija kognitivnog receptora na melanocitima, melanokortin 1 receptoru rezultirala indukcijom cAMP-a povezane s G-proteinom, što pak vodi put CRE-MITF i potiče proliferaciju stanica i melanin sinteza. 19 Dakle, značajno smanjena ekspresija POMC-a opažena u HEK-ovima koji prekomjerno eksprimiraju RNASET2 u trenutnoj studiji može predstavljati izravnu (ili indirektnu) vezu sa slabom proliferacijom melanocita i potisnutom sintezom melanina. MITF se smatra glavnim regulatornim transkripcijskim faktorom melanocita, koji izravno reguliraju gene specifične za melanocite, poput Tyr i Trp-1 (koji su također povezani sa sintezom melanina); 20. njegovi transkripcijski učinci širokog raspona utječu na opstanak stanica, napredovanje staničnog ciklusa, migraciju i diferencijaciju. 21 Dakle, značajno smanjena ekspresija Mitf, Tyr i Trp-1 primijećena u HEM-ima koji prekomjerno eksprimiraju RNASET2 u ovom trenutnom istraživanju može predstavljati izravnu vezu s inhibicijom melanogeneze RNASET2 (Slika 8d).

Molekularni mehanizmi apoptoze izazvane prekomjernom ekspresijom RNASET2 još su jedna nepoznanica ovog enzima. Prethodna analiza strukture RNaseT2 radi pružanja uvida u njegove biološke uloge identificiranjem pretpostavljenih funkcionalnih mjesta pronašla je sačuvani motiv koji veže TRAF2. 10 Kao što svi znamo, mehanizmi aktivacije kaspaze vezani za apoptozu su dobro definirani, ali mehanizmi i funkcionalne uloge suprotstavljenih načina inaktivacije ostaju nejasni. Nedavna studija objavila je da TRAF2 komunicira s kaspazom-8 u signalnom kompleksu koji izaziva smrt. TRAF2 ima kritičnu funkciju u regulaciji apoptoze usmjeravanjem ovisne o RING polubikvitaciji kaspaze-8, učinkovito obilježava proteazu za proteasomalnu degradaciju pri autoprocesiranju i citoplazmatskoj translokaciji. Stoga, iscrpljivanje TRAF2 snižava prag signala za apoptozu. 11 U trenutnoj studiji, opazili smo snižavanje regulacije TRAF2 zajedno s prekomjernom ekspresijom RNASET2. Kako je TRAF2 postavio kritičnu barijeru za opredjeljenje za apoptozu stanica označavanjem aktivirane kaspaze-8 s vremenskim prekidačem za zaustavljanje K48-ubikvitin, smanjivanje TRAF2 moglo je sniziti prag signala za apoptozu, a zatim aktiviranjem (putem cijepanja) kaspaze-3, silaznog efektora od kaspaza-8, povećana je u stanicama s prekomjernom ekspresijom RNASET2 (Slika 8d). Moguće je da tada prekomjerna ekspresija RNASET2 može promovirati apoptozu putem TRAF2-kaspaznog puta, a taj bi postupak bio neovisan o katalitičkoj aktivnosti. Iznenađujuće, rezultati trenutne studije pokazali su da kad je mjesto mutacije TRAF2 u RNASET2 mutirano, promotivni učinci na apoptozu su poremećeni. Također smo proveli RNASET2-tiko-imunoprecipitaciju i otkrili smo da RNASET2-ti doista ne uspije imunoprecipitirati TRAF2 ili očito oslabiti interakciju u usporedbi sa široko-tipnim RNASET2 (podaci nisu prikazani). Rezultati su pokazali da RNASET2-ti mutant ne može podržati TRAF2 vezanje, čime se dodatno potvrđuje da RNASET2 i TRAF2 doista djeluju. Ovi nalazi poslužili su za provjeru fiziološke važnosti za predviđeno mjesto TRAF2. Da bismo istražili detaljan mehanizam nizvodno, osmislili smo niz eksperimenata za sljedeću fazu. Ponovno ćemo potvrditi specifičnu interakciju između RNASET2 i TRAF2 kritičnog za staničnu smrt u fiziološkom sustavu (model zebrefish) i istražiti učinke RNASET2 na TRAF2 (transkripcijski, translacijski ili posttranslacijski?). Kao što je važno, ko-imunoprecipitacija RNASET2 i TRAF2 u ovoj studiji, prema nama najboljim saznanjima, predstavljaju prvi prijavljeni dokaz povezanosti RNASET2 i TRAF2 u ljudskim stanicama.

Nadalje, autoimunost je također uključena u patogenezu vitilioga. Nedavne studije također su pokazale da omega-1, član obitelji RNase T2 izlučen iz jajašca Schistosoma mansoni , doprinosi polarizaciji Th2 CD2 + T ćelijama dendritičkim stanicama, 22, 23 nagovještavajući da je ljudski RNASET2 mogao biti uključen u imunološki odgovor, i stoga je podloga patogeneze vitiliga.

Ukratko, ovdje predstavljena studija pokazuje da je prekomjerna ekspresija proteina RNASET2 povezana s vitiligom i da temeljni patogeni mehanizam može uključivati ​​RNASET2 stimulaciju stanične apoptoze i preosjetljivost na stres putem TRAF2-kaspaznog puta. Molekularni mehanizmi RNASET2 otkriveni ovom studijom mogu predstavljati manipulativne karakteristike pomoću kojih se može poboljšati kliničko upravljanje pacijentima s vitiligom.

Glosar

RNASET2

ribonukleaza T2

TRAF2

faktor 2 povezan s receptorima tumorske nekroze

GWAS

studija povezanosti u genomu

RUB

primarni humani epidermalni melanocit

HEK

primarni humani epidermalni keratinocit

NB-UVB

uskopojasni UVB

H202

vodikov peroksid

LPS

lipopolisaharid

OE

Prekomjerna ekspresija

RNASET2-ci

katalitički neaktivni mutant RNASET2

RNASET2-ti

RNASET2 nedostaje domena koja veže TRAF2

POMC

pro-opiomelanokortin

a -MSH

α -melanocit stimulirajući hormon

MITF

faktor transkripcije povezan s mikroftalmijom

TYR

tirozinaze

TRP-1

TYR-povezani protein-1