Ciljanom terapijom xiap / proteasomski put prevladava rezistenciju u karcinomu prebacivanjem signala apoptoze u bax / Bak-neovisan način 'i i' | stanična smrt i bolest

Ciljanom terapijom xiap / proteasomski put prevladava rezistenciju u karcinomu prebacivanjem signala apoptoze u bax / Bak-neovisan način 'i i' | stanična smrt i bolest

Anonim

teme

  • apoptoza
  • Terapijska otpornost na rak
  • Stanična signalizacija
  • Ciljane terapije

Sažetak

TRAIL je obećavajuće sredstvo protiv raka, sposobno inducirati apoptozu u širokom rasponu tumorskih stanica otpornih na liječenje. U stanicama 'tipa II', signal smrti koji pokreće TRAIL zahtijeva pojačanje putem mitohondrijske apoptoze. Prema tome, deregulacija svojstvenog puta signalizacije apoptoze, na primjer gubitkom Baxa i Baka, daje otpornost na TRAIL i ograničava njegovu primjenu. Ovdje pokazujemo da unatoč otpornosti Bax / Bak dvostruko deficitarnih stanica, tretmanom TRAIL-om rezultiralo je aktivacijom kaspaze-8 i potpunom preradom kasaza-3 proenzima. Međutim, aktivna kaspaza-3 razgrađena je proteasomom i nije je moguće detektirati ako se ne inhibira put XIAP / proteasom. Izravna ili indirektna inhibicija XIAP od strane RNAi, mitramicina A ili SMAC mimetičkog LBW-242 kao i inhibicija proteasoma Bortezomibom prevladava TRAIL-rezistenciju Bax / Bakovih dvostruko deficitarnih tumorskih stanica. Štoviše, aktivacija i stabilizacija kaspaze-3 postaje neovisna od signala mitohondrijalne smrti, pokazujući da inhibicija puta XIAP / proteasom prevladava otpor pretvaranjem "tipa II" u stanice tipa "I". Naši rezultati nadalje pokazuju da je E3 ubikvitin ligaza XIAP ključna vrata za fenotip 'tipa II'. Farmakološka manipulacija XIAP-om je stoga obećavajuća strategija senzibiliziranja stanica za TRAIL i prevladavanja otpornosti na TRAIL u slučaju središnjih oštećenja na putu signala svojstva apoptoze.

Glavni

TRAIL (ligand koji izaziva faktore tumorske nekroze / lipand Apo2L) može inducirati staničnu smrt u širokom rasponu karcinoma otpornih na konvencionalnu terapiju bez vidljivih toksičnih nuspojava na normalno tkivo. 1 Izraz TRAIL-R1 neovisan je prognostički parametar, na primjer, za karcinom debelog crijeva i visoka ekspresija TRAIL-R1 korelira s produljenim preživljavanjem bez bolesti. 2 Nadalje, TRAIL i smrtonosni ligandi CD95L / FasL i TNF α senzibiliziraju tumorske stanice na ionizirajuće zračenje i induciranu apoptozu 3, 4 iako profili toksičnosti mogu ugroziti (TNF α ) ili čak onemogućiti (CD95L / FasL) kliničku upotrebu.

Smrtni ligandi pokreću oligomerizaciju receptora i stvaranje signalnog kompleksa koji izaziva smrt (DISC), što rezultira aktiviranjem inicijacijske kaspaze-8. U stanicama tipa I, aktivna kaspaza-8 izravno posreduje dovoljnu aktivaciju efektorske kaspaze-3 koja pokreće izvršenje apoptoze. Suprotno tome, u stanicama tipa II, smrtni signal zahtijeva pojačavanje aktiviranjem intrinzičnog staničnog puta smrti 5 kroz cijepanje posredovano kaspazom-8 i aktiviranjem Bida, proteina Bcl-2, jedinog za BH3, jedini za BH3. 6

Dakle, proteini iz obitelji Bcl-2 su ključni regulatori apoptoze posredovane mitohondrijalnim i smrtnim receptorima. Članovi obitelji pokazuju homologiju u barem jednoj od četiri domene Bcl-2 homologije (BiH). Anti-apoptotičke proteine ​​ove porodice (Bcl-2, Bcl-x L Bcl-w, Mcl-1 i Bfl-1 / A1) karakterizira prisustvo svih četiri bh. Domene. Pro-apoptotički članovi mogu se podijeliti u višedominske BH123 homologe (Bax i Bak) i proteine ​​podfamije samo za BH3 (Bad, Bim, Puma, Noxa, Nbk / Bik, Bmf, Bnip3, Hrk i Bid). 7

Aktivirana, skraćena (t) Ponuda aktivira Bax-ovu aktivaciju da inducira permeabilizaciju mitohondrijalne membrane (MMP) praćenu oslobađanjem apoptogenih čimbenika iz mitohondrijskog intermebranskog prostora u citosol. Jedan od tih čimbenika, citokrom c , povezuje se s APAF-1 i pro-kaspazom-9 kako bi tvorio 'apoptosom', platformu koja olakšava autokatalitičku aktivaciju kaspaze-9, što zauzvrat pokreće kaskadu efektora. Drugi pro-apoptotički faktor koji se oslobađa nakon MMP-a je SMAC / DIABLO. 8, 9 SMAC potencira apoptozu neutralizacijom citosolnog inhibitora apoptoznih proteina (IAP). IAP-ovi, obitelj od osam ljudskih analoga, uključujući cIAP1, cIAP2 i XIAP, potonji najsnažniji, 10 sprječavaju nenamjernu aktivaciju kaspaze. XIAP to čini tako što se izravno veže na kaspaze kroz domenu bakulovirus IAP ponavljanja (BIR). Mnogi humani tumori pokazuju visoku razinu IAP-a, uključujući XIAP i abberantnu ekspresiju IAP-a, povezan je s otpornošću na terapiju i lošom prognozom. 11 Pored regulacije XIAP-a, deregulacija proteinskih i anti-apoptotskih proteina iz porodice Bcl-2 središnji je mehanizam koji je uključen u TRAIL-rezistenciju. 12, 13 Nedavno smo pokazali da gubitak Baxa, usprkos izrazu njegovog homologa Baka, pruža otpornost na apoptozu izazvanu TRAIL-om. Međutim, inhibicija endogenog Bakovog antagonista Mcl-1 omogućuje TRAIL-u da ubija stanice putem Baka. 14

Ovdje pokazujemo da inhibicija puta XIAP / proteasoma čini Bax / Bakove stanice karcinoma dvostrukog deficita osjetljive na TRAIL. Budući da je pojačanje mitohondrijskog signala receptora smrti u ovim stanicama nemoguće, deregulacija XIAP pretvara tip II u stanice tipa I. Ovi rezultati pokazuju da u TRAIL-induciranoj apoptozi XIAP diktira način II stanične smrti i da je prebacivanje režima ćelijske smrti obećavajuća strategija za prevladavanje TRAIL-rezistencije u stanicama s središnjim oštećenjima signala mitohondrijske apoptoze.

Rezultati

Da bismo procijenili strategije za prevladavanje otpornosti na TRAIL, pozabavili smo se ulogom XIAP u modelu staničnih linija karcinoma debelog crijeva HCT116. Usporedili smo utjecaj smanjenja regulacije Mcl-1 i XIAP na izogenske HCT116 masne stanice tretirane TRAIL-om, stanice HCT116 s nedostatkom Bax-a (nazvane HCT116 Bax) i stanice lišene Baxa i Baka (nazvane HCT Bax-/ Bak-). 15 Specifični gubitak ekspresije proteina postignut je nokautom bax-a 16 i stabilnim propadanjem Bak-posredovanog shRNA-om 17 i potvrđen je analizom Western blot-a (Slike 1a i c mogu se usporediti jer predstavljaju iste membrane).

Image

Uključivanje XIAP interferencijom RNA omogućava TRAIL-u da inducira Bax / Bak-neovisnu smrt stanica u stanicama tipa II. HCT116 wt, Bax− i Bax− / Bak− stanice su transficirane kontrolnom, Mcl-1 ili XIAP-siRNA. Nakon 24 sata, proteinski ekstrakti su pripremljeni i analizirani od Western blot-a. S lijeve strane ( a - c ) prikazan je Mcl-1 i XIAP pad vrijednosti i status ekspresije za Bax i Bak za odgovarajuće HCT116 stanične linije. Stanice su zatim tretirane s 50 ng / ml TRAIL-a, uzgajane dodatna 24 sata, a apoptotičke stanice određene su protočnim citometrijskim mjerenjem sadržaja stanične DNA. ( a ) HCT116 wt stanice osjetljive su na apoptozu izazvanu TRAIL-om nakon smanjivanja regulacije Mcl-1 ili XIAP. ( b ) Mcl-1 kao i smanjivanje regulacije XIAP-a prevladava TRAIL-rezistenciju HCT116 Bax-stanica. ( c ) Smanjena regulacija Mcl-1 ne uspijeva prevladati TRAIL-rezistenciju HCT116 Bax-/ Bak-stanica. Suprotno tome, obustava XIAP-a omogućava TRAIL-u da ubije HCT116 stanice sa nedostatkom Baxa / Baka. Rezultati su dati kao srednje vrijednosti ± SD iz tri pokusa za odnosne stanične linije u desnom dijelu ( a - c )

Slika pune veličine

HCT116 stanice su transficirane kontrolnom, Mcl-1- ili XIAP-siRNA, a snižavanje vrijednosti proteina potvrđeno je analizom western blota (slika 1, lijevo). Nakon snižavanja regulacije Mcl-1 ili XIAP, stanice se inkubiraju s 50 ng / ml TRAIL-a tijekom 24 sata, a indukcija apoptoze analizira se protočnim citometričkim mjerenjem stanica sa sadržajem hipodiploidne DNA. TRAIL-tretman rezultirao je apoptotskom fragmentacijom DNA u oko 28% HCT116 wt stanica. Osjetljivost prema TRAIL-u povećana je rušenjem Mcl-1, a još više padom XIAP-a, oko 35 i 42% dotičnih stanica bilo je apoptotično (Slika 1a, desno).

Za razliku od HCT116 masnih stanica, HCT116 stanice s nedostatkom Baxa bile su rezistentne na apoptozu izazvanu TRAIL-om. Međutim, smanjivanje regulacije Mcl-1 ili XIAP učinilo je da ove stanice budu osjetljive na TRAIL. U usporedbi sa 6% kontrolnih stanica, apoptoza izazvana TRAIL-om porasla je do 32 i 41% nakon smanjivanja vrijednosti Mcl-1 ili XIAP (slika 1b, desno).

Suprotno tome, otpornost na HCT116 Bax-/ Bak-stanice ne može se prevladati inhibicijom Mcl-1. Međutim, smanjivanje vrijednosti XIAP snažno je senzibiliziralo ove dvostruko deficitarne stanice za apoptozu izazvanu TRAIL-om. Stanice koje su transficirane kontrolnom ili Mcl-1-siRNA i tretirane TRAIL-om pokazale su apoptotsku fragmentaciju DNA u <6% stanica, koja se povećala na 34% nakon smanjenja vrijednosti XIAP-a (Slika 1c, desno).

Bojenje stanica dodataka V-FITC / propidium jodid (PI) HCT116 wt i HCT116 Bax- / Bak- nakon tretiranja TRAIL-om potvrdilo je da stanična smrt nastaje apoptozom i da TRAIL-rezistencija HCT116 Bax-Bak-stanica može biti prevladana sa regulacija XIAP-a (dopunska slika S1). Nadalje, redukcija XIAP nadmašuje otpornost Bcl-2 ili Bcl-x L prekomjerno eksprimirajućih HCT116 stanica, što potvrđuje naš nalaz da nakon TRAIL-tretmana stanice s nedostatkom XIAP umiru neovisno o Bcl-2 obiteljskom proteinu reguliranom putu (dodatna slika S2).

Kako su kaspaza-8 i -3 ključni za apoptozu izazvanu TRAIL-om, sljedeće smo ispitivali u kojoj mjeri Bax / Bakov nedostatak utječe na preradu kaspaze-8 i -3. Tretirali smo HCT116 wt i Bax− / Bak- stanice pomoću TRAIL-a i analizirali obrazac cijepanja ovih kaspaza. Razine pro-kaspaze-8 i -3 su usporedive u obje ćelijske linije (Slika 2a, lijevo). Nakon TRAIL-tretmana, pro-kaspaza-8 se cijepa u obje stanične linije i obrađuje u svoje aktivne podjedinice u sličnom obimu. Zanimljivo je da u obje stanične linije aktiviranje kaspaze-8 ide zajedno s cijepanjem zimogena pro-kaspaze-3, što ukazuje da je aktivacija kaspaze-8 nakon TRAIL-tretmana dovoljna za cijepanje pro-kaspaze-3. Unatoč tome, cijepanje pro-kaspaze-3 prati obrada u njegove aktivne pod18 jedinice p18 / p16 samo u HCT116 osjetljivim HCT116 masnim stanicama. Suprotno tome, HCT116 rezistentne Bax-/ Bak- stanice otporne na TRAIL pokazale su da ne obrađuje kaspazu-3 do njegovih aktivnih podjedinica (slika 2a, lijevo). Stoga se, za razliku od cijepanja zimogena pro-kaspaze-3, koja je neovisna o Baxu i Baku, prerada pro-kaspaze-3 u njegove aktivne podjedinice oslanja na netaknut intrinzični mitohondrijski put.

Image

TRAIL-inducira obradu pro-kaspaze-3 u stanicama s dvostrukim nedostatkom Bax / Bak-a, ali ne uspijeva prevladati inhibiciju XIAP-om i razgradnjom proteasomalne kaspaze-3. ( a ) HCT116 wt i Bax− / Bak− stanice su tretirane s 50 ng / ml TRAIL, a obrada pro-kaspaza-8 i -3 analizirana je imunoblotiranjem. TRAIL-tretmanom inducirano cijepanje pro-kaspaze-8 i -3 u obje stanične linije. Rascjep pro-kaspaze-8 popraćen je stvaranjem njegovih aktivnih podjedinica. Suprotno tome, obradu pro-kaspaze-3 u njegove aktivne podjedinice moguće je otkriti samo u HCT116 wt, ali ne i u HCT116 Bax-Bak-stanicama (lijevo). Dodatna redukcija XIAP-a u kombinaciji s TRAIL-om uzrokovala je potpunu preradu pro-kaspaze-3 u njegove aktivne podjedinice u HCT116 Bax− / Bak-stanicama (desno). ( b ) HCT116 wt i Bax-Bak-stanice inkubirane su inhibitorom proteasoma MG132 prije TRAIL-tretmana. Nakon inhibicije proteasoma, TRAIL-tretman rezultirao je potpunom preradom pro-kaspaze-3 u njegove aktivne podjedinice u obje stanične linije. ( c, d ) Pored TRAIL-a, HCT116 wt i Bax / Bak-stanice tretirane su s 1 μM MG132 ( c ) ili s 1 μM bortezomiba (BZM) ( d ). Stanice su kultivirane 24 sata, sabrane i apoptotske ćelije određene su protočnim citometrijskim mjerenjem sadržaja stanične DNK. HCT116 masne stanice su senzibilizirane za TRAIL-induciranu apoptozu pomoću MG132 ili BZM. Nadalje, inhibicija proteasoma omogućava TRAIL-u da uništi stanice HCT116 sa nedostatkom Baxa / Baka

Slika pune veličine

Da bismo analizirali da li ubikvitin ligazna aktivnost XIAP posreduje razgradnju kasapice-3 podjedinice, oborili smo XIAP. U HCT116 Bax-Bak-stanicama transficiranim s kontrolnom siRNA, TRAIL-tretmanom je rezultirano cijepanjem pro-kaspaze-3 bez stvaranja aktivne kaspaze-3. Suprotno tome, smanjivanje regulacije XIAP-a u kombinaciji s TRAIL-om uzrokovalo je potpunu obradu pro-kaspaze-3 u njegove aktivne podjedinice (Slika 2a, desno). To ukazuje da je aktivnost kaspaze-8 pokrenuta TRAIL-om dovoljna za cijepanje pro-kaspaze-3, dok je aktivacija kaspaze-3 spriječena XIAP-posredovanom degradacijom prerađene kaspaze-3.

Za ispitivanje proteasomske razgradnje aktivne kaspaze-3, tretirali smo HCT116 wt i Bax- / Bak-stanice s netoksičnim koncentracijama inhibitora proteasoma MG132. U HCT116 wt stanicama, aktivirana kaspaza-3 izazvana TRAIL-om povećana je nakon dodatnog tretmana s MG132 (slika 2b, lijevo). Što je još važnije, u HCT116 Bax-Bak-ćelijama, sam TRAIL je inducirao cijepanje pro-kaspaze-3 bez otkrivenih razina aktivnih podjedinica, dok je kombinacija inducirala potpunu obradu kaspaze-3 u njegove aktivne podjedinice (slika 2b, desno).

U skladu s povećanom aktivacijom kaspaze-3, apoptoza izazvana TRAIL-om povećana je u HCT116 wt stanicama nakon dodatne inhibicije proteasoma. Nadalje, tretman MG132 prevladao je TRAIL-rezistenciju Bax / Bax-nedostatnih HCT116 stanica (Slika 2c). Poput MG132, bortezomib (BZM), prvi terapeutski inhibitor proteasoma, senzibilizirao je HCT116 wt stanice za apoptozu izazvanu TRAIL-om i nadvladao TRAIL-rezistenciju HCT116 Bax-Bak-stanica (slika 2d), što ukazuje da je osjetljivost na apoptozu izazvanu TRAIL-om inhibicija proteasoma uzrokovana je stabilizacijom aktivne kaspaze-3 i ne oslanja se na svojstveni apoptotski put.

Kako bismo dalje istražili način aktivacije kaspaze-3 u prisutnosti ili odsutnosti XIAP-a u odnosu na signalizaciju apoptoze tipa I / II, analizirali smo TRAIL-induciranu apoptozu u stanicama podvrgnutim padu regulacije kaspaze-8 i Bida. U HCT116 wt stanicama, TRAIL-inducirana apoptoza bila je popraćena procesiranjem pro-kaspaze-8, cijepanjem Bida i preradom pro-kaspase-3 u aktivne podjedinice (slika 3a). Smanjenje regulacije kaspaze-8 ili Bida inhibira indukciju apoptoze. Ali za razliku od silazne regulacije kaspaze-8, koja je blokirala cijepanje pro-kaspaze-3 izazvanog TRAIL-om, pad odustajanja od ponude nije umanjio cijepanje pro-kaspaze-3, što ukazuje da se većina otkrivene pro-kaspaza-3 obrade događa ispred mitohondrija pojačana petlja. Međutim, iako je pro-kaspaza-3 cijepljena, podjedinice su smanjene nakon smanjenja ponude (Slika 3a, desno), što ukazuje da obrada pro-kaspaze-3 u aktivne podjedinice ovisi o Bidu.

Image

Nakon prigušivanja XIAP-a, apoptoza izazvana TRAIL-om i aktivacija kaspaza-3 postaju neovisni od Bida, Baxa i Baka. ( a ) HCT116 wt stanice transficirane su kontrolnom, kaspaznom 8- ili Bid-siRNA i potom inkubirane s TRAIL-om. TRAIL-inducirana fragmentacija DNA blokirana je smanjivanjem regulacije ili kaspaze-8 ili Bida (lijevo). Western blot analiza potvrdila je smanjivanje regulacije odgovarajućih proteina (desno). Nadalje, analiza zapadne mrlje pokazala je da oborenje kaspaze-8 blokira cijepanje pro-kaspaze-3. Suprotno tome, obustava Bida nije inhibirala cijepanje pro-kaspaze-3 već obradu kaspaze-3 u njegove aktivne podjedinice. ( b ) s HCT116 wt tretira se kao u ( a ). Pored toga, srušen je XIAP. Nakon knockdown-a XIAP, apoptoza uzrokovana TRAIL-om inhibirana je smanjenjem regulacije kaspaze-8, ali više ne padom regulacije Bida (lijevo). U ovom okruženju, aktiviranje pro-kaspaze-3, naznačeno aktivnom podjedinicom, uzrokovano TRAIL-om, ovisi o kaspazi-8, ali nije ovisilo o Bidu. ( c ) HCT116 Bax-Bak-stanice tretirane su kao u ( b ). Nakon smanjenja regulacije XIAP-a, apoptoza izazvana TRAIL-om (lijevo) prati aktivaciju kaspaze-3 (desno). Oba se mogu blokirati srušenjem kaspaze-8. Suprotno tome, aktiviranje kaspaze-3 i apoptoza nisu blokirani smanjenjem regulacije ponude. Dakle, inhibicija XIAP-a omogućuje TRAIL-u da aktivira kaspazu-3 i inducira apoptozu unatoč kombiniranom gubitku Bida, Baxa i Baka

Slika pune veličine

Dodatnim obustavom XIAP-a obnovljena je indukcija apoptoze TRAIL-om u HCT116 wt stanicama s padom Bid-a (slika 3b, lijevo) i rezultiralo potpunim cijepanjem pro-kaspaze-8 i pro-caspase-3, praćeno visokim razinama p18 kaspaze -3 podjedinica (slika 3b, desno). Propadanje indukcije apoptoze oslabljenog kaspazom-8, cijepanje Bida i cijepanje kaspaze-3 u odsutnosti ili prisutnosti XIAP knockdown-a (slike 3a i b). Ovi rezultati potvrđeni su u HCT116 Bax-Bak-stanicama u kojima silazna regulacija XIAP-a prevladava otpornost prema TRAIL-u (slika 3c, lijevo), a indukcija apoptoze popraćena je cijepanjem pro-kaspaze-8 i Bid-a. Nadalje, nepostojanje XIAP-a olakšalo je preradu pro-kaspaze-3 u aktivne podjedinice (slika 3c, desno). Ovi događaji su inhibirani knockdown-om caspase-8, ali ne i padom Bid-a. Dakle, inhibicija XIAP omogućava TRAIL-u da aktivira kaspazu-3 i inducira apoptozu unatoč kombiniranom gubitku Bida, Baxa i Baka, jasno pokazujući da je indukcija stanične smrti neovisna o svojstvenom apoptotičkom putu i slijedi način I.

Zatim smo usporedili vremenski ovisnu regulaciju apoptoze izazvane TRAIL-om u HCT116 wt i u HCT116 Bax- / Bak- stanicama nakon smanjivanja XIAP. Analiza Western blot-a TTRAIL-tretiranih HCT116 wt stanica otkrila je ranu obradu kaspaze-8, praćenu aktivacijom Bid-a, indiciranu povećanom razinom tBid-a koja se može otkriti već nakon 4 sata liječenja (slika 4a, lijevo). Nadalje, kaspaza-8 i aktivacija Bida izazvana TRAIL-om praćeni su citokromom c i SMAC oslobađanjem koji se podudaraju s aktivacijom kaspaze-3 i cijepanjem PARP (slika 4a, lijevo). Analiza Western blot-a nadalje otkrila je vremenski ovisnu degradaciju XIAP-a kao odgovor na TRAIL, što može odražavati autoubikvitaciju i naknadnu proteasomsku degradaciju ili cijepanje posredovano kaspazom. 18

Image

Prijelaz propusnosti mitohondrija prethodi indukciji stanične smrti u HCT 116 stanicama, ali nije uključen u apoptozu uzrokovanu TRAIL-om nakon smanjivanja XIAP u HCT 116 stanicama s nedostatkom Bax / Bak. ( a ) 24 sata nakon transfekcije HCT116 wt s kontrolnom siRNA (lijevo) i HCT116 Bax-/ Bak- s XIAP-siRNA (desno), stanice su tretirane TRAIL-om i uzgajane na određeno vrijeme. Western blot analiza otkrila je ranu obradu kaspaze-8 i -3 i cijepanje Bida i PARP-a u obje stanične linije. U HCT116 masnim stanicama, citokrom c i SMAC oslobađanje u citosolu uočeno je 4 sata nakon TRAIL tretmana. Suprotno tome, otpuštanje citokroma c i SMAC bio je kasni događaj u HCT116 Bax-/ Bak-stanicama. ( b ) Stanice su tretirane kako je opisano u ( a ), sakupljene, a postoci stanica s gubitkom ΔΨm određeni su protočnim citometrijskim mjerenjem JC-1 fluorescencije. Pored toga, postoci apoptotskih stanica određeni su protočnim citometrijskim mjerenjem hipodiploidnih stanica. Te su analize otkrile da u HCT116 wt stanicama gubitak potencijala mitohondrijske membrane prethodi apoptotičkoj fragmentaciji DNA. To je u suprotnosti s HCT116 Bax-Bak-stanicama s redukcijom regulacije XIAP, gdje gubitak potencijala mitohondrijske membrane, oslobađanje citokroma c i SMAC kasne su pojave. Podaci izraženi kao srednje vrijednosti ± SD iz tri pokusa

Slika pune veličine

Za analizu raspršivanja potencijala mitohondrijske membrane (ΔΨm) nakon TRAIL-tretmana, stanice su inkubirane s fluorohromom JC-1, koji pokazuje nakupljanje ovisno o potencijalu membrane u mitohondrijama. Mjerenje intenziteta fluorescencije JC-1 protočnom citometrijom pokazalo je vremenski ovisnu akumulaciju HCT116 wt stanica s poremećajem ΨΨm nakon tretmana TRAIL-om. To je rani događaj otkrio već nakon 6 sati tretmana koji je prethodio fragmentaciji DNK (slika 4b, lijevo).

Analogno, HCT116 Bax-Bak-stanice sa reduciranim XIAP-om pokazale su obradu kaspaze-8 i Bid-a kao rane događaje tijekom apoptoze izazvane TRAIL-om, otkrivenu 4 sata nakon tretmana. Za razliku od HCT116 wt stanica, cijepanje Bida se ipak nije podudaralo s otpuštanjem citokroma c ili SMAC. Oboje su se pojavili tek kasno nakon tretmana TRAIL-om, otkriti nakon 12 h (slika 4a, desno). To ukazuje da tBid nije uspio pokrenuti put mitohondrije. Ipak, tretman TRAIL-om u odsustvu XIAP-a rezultirao je ranom aktivacijom kaspaze-3, što se podudaralo s cijepanjem PARP-a (slika 4a, desno). Nadalje, unatoč ranoj indukciji apoptoze, ali u skladu s odgođenom kinetikom citokroma c i oslobađanjem SMAC-a, MMP je također bio kasni događaj u tim stanicama. Zanimljivo je da je za razliku od HCT116 wt stanica, raspad ΔΨm pratio fragmentaciju DNA nakon TRAIL-tretmana u HCT116 Bax-Bak-stanicama (slika 4b, desno), što ukazuje da MMP dolazi kasno i podudara se sa staničnom propašću umjesto da igra rana, regulatorna uloga. Ukratko, smanjivanje regulacije XIAP olakšava signalizaciju apoptoze izazvanu TRAIL-om koja je neovisna o oslobađanju MMP-a, citokroma c i SMAC, a koji se čini kao sekundarni učinci.

Vremenska analiza vremenskog odziva obojenja od Anexin V-FITC / PI nakon tretmana TRAIL potvrđuje različit način umiranja stanica. Rane apoptotičke stanice detektirale su se već 4 sata nakon TRAIL-tretmana u HCT116 wt stanicama i u HCT116 Bax- / Bak-stanicama s reguliranim XIAP-om. Međutim, HCT116 wt stanice imaju tendenciju prema ranoj pojavi kasnog apoptotičkog fenotipa, prepoznatljivog nakon 8 h TRAIL-tretmana. Suprotno tome, kasne apoptotske HCT116 Bax-Bakkove stanice detektirale su se najranije nakon 12 h (dopunska slika S3). Zanimljivo je da u ovom trenutku HCT116 Bax-Bak-stanice također pokazuju otpuštanje MMP i citokrom c (slike 4a i b). Uzeto zajedno, rezultati pokazuju da oslobađanje MMP-a i citokroma c , koje se javljaju rano u stanicama tipa II i kasno u stanicama tipa I, prati kasni apoptotički / nekrotični fenotip stanica.

S obzirom na terapeutski utjecaj naših nalaza, sljedeće smo pitali mogu li male molekule za koje se zna da snižavaju ili inhibiraju XIAP mogu prevladati otpornost stanica koje nedostaju Bax / Bak. Antitumorsko sredstvo Mitramicin A (Mit A) senzibilizira različite stanične stanice raka na apoptozu posredovanu TRAIL-om smanjivanjem regulacije XIAP-a. 19 Da bismo potvrdili smanjivanje XIAP od strane Mit A, tretirali smo HCT116 wt i HCT116 Bax- / Bak-stanice s različitim koncentracijama Mit A tijekom 24 sata. Naknadna analiza razina XIAP potvrdila je smanjenu XIAP ekspresiju (Slika 5a). To je popraćeno povećanom osjetljivošću TRAIL-a u stanicama HCT116 wt, uglavnom zbog ovisnosti o Bax / Bak-u, aditivne toksičnosti Mit A. Nadalje, Mit A tretman efikasno je prevladao TRAIL-rezistenciju stanica HCT116 sa nedostatkom Baxa / Bak-a (Slika 5a, donja ploča).

Image

Smanjenje regulacije ili inhibicija XIAP Mitramicinom A, odnosno LBW-242, nadvladava TRAIL-rezistenciju. ( a ) HCT116 wt i Bax-Bak-stanice su prethodno inkubirane s naznačenim koncentracijama Mit A i primijećeno je sniženje regulacije XIAP nakon imunoblotiranja (gornja ploča). Stanice su zatim tretirane s TRAIL-om i kultivirane tokom 24 sata. Mjerenje apoptotskih stanica protočnom citometrijom otkrilo je da Mit A senzitizira Bax / Bak-nedostatne stanice za apoptozu izazvanu TRAIL-om. Podaci izraženi kao srednje vrijednosti ± SD iz tri pokusa (donja ploča). ( b ) Za inhibiranje funkcije XIAP, obje ćelijske linije su tretirane sa 10 μM SMAC mimetičkog LBW-242 pored TRAIL-a. U HCT116 wt stanicama, obrada kaspaze-3 izazvana TRAIL-om povećana je za LBW-242 (gornja lijeva). Povećana obrada kaspaze-3 paralelna je s pojačanom indukcijom apoptoze (donje lijevo). U HCT116 Bax-/ Bak-stanicama pro-kaspaza-3 je cijepljena TRAIL-tretmanom. Proteolitički fragmenti su, međutim, detektirani tek nakon dodavanja LBW-242 (gore desno). Aktivacija kaspaze-3 rezultirala je indukcijom apoptoze, što ukazuje da LBW-242 može prevladati TRAIL rezistenciju stanica HCT116 sa nedostatkom Baxa / Baka (donje desno). Statističke signifikantnosti određene su korištenjem neparnog Studentova t- testa. Razine statističke značajnosti označene su zvjezdicama (* P <0, 05; ** P <0, 01)

Slika pune veličine

Pored toga, usmjerili smo XIAP izravno upotrebom SMAC mimetičke LBW-242, sintetičke male molekule koja se veže i inhibira IAP. Tretiranje stanica HCT116 s LBW-242, osim TRAIL-a, smanjilo je XIAP ekspresiju (slika 5b, gornja ploča, trake 2 i 4), što bi moglo biti posljedica cijepanja XIAP-a kaspazom-3 ​​u povratnoj petlji ili autoubikvitacijom i proteasomalnom razgradnjom. Nadalje, inhibicija XIAP-a rezultirala je povećanjem TRAIL-inducirane apoptoze u HCT116 wt stanicama i, što je još važnije, nadvladala TRAIL-rezistenciju Bax / Bakovih dvostruko deficitarnih stanica (Slika 5b, donja ploča). Resenzibilizacija HCT116 Bax-/ Bak-stanica uzrokovana je potpunom preradom pro-kaspaze-3, jer su aktivne podjedinice bile detektirane tek nakon kombiniranog liječenja s TRAIL-om i LBW-242 (slika 5b, gornja ploča). Dakle, poput BZM, MG132 ili Mit A, LBW-242 prevladava otpornost prema TRAIL-u i olakšava aktiviranje kaspaze-3 i indukciju apoptoze TRAIL-om na način I.

Da bismo analizirali igra li XIAP sličnu ulogu u staničnoj smrti uzrokovanoj drugim receptorima smrti, obrađivali smo stanice s TNF α ili CD95L / FasL. U HCT116 wt stanicama, TNF a tretman rezultirao je slabom indukcijom apoptoze; ∼ 10% stanica bilo je apoptotično (Slika 6a). U usporedbi s TNF-om, fragmentacija DNA izazvane CD95L / FasL bila je izraženija i 24% stanica podvrgnuto je apoptozi. Međutim, nakon smanjenja vrijednosti XIAP- a TNF α kao i CD95L / FasL-inducirana apoptoza povećani su do 16%, odnosno 37%. Za razliku od HCT116 wt stanica, niti TNF α niti CD95L / FasL nisu inducirale apoptozu u HCT116 Bax- / Bak- stanicama. Međutim, otpornost je prevladana smanjenjem regulacije XIAP, što je rezultiralo sa oko 17% i 25% apoptotskih stanica nakon tretmana TNF α ili CD95L / FasL (Slika 6b). Sve u svemu, ovi podaci pokazuju da smanjivanje regulacije XIAP omogućava receptorima smrti da ubijaju stanice tipa II nezavisno od mitohondrijalne smrti, prebacivanjem apoptotičko-signalnog puta s tipa II na tip I.

Image

XIAP posreduje otpornost na TNF α i CD95 / FasL-induciranu apoptozu u stanicama Bax / Bak-nedostatka HCT116. ( a ) HCT116 wt stanice transficirane su kontrolnom ili XIAP-siRNA i kultivirane tokom 24 sata. Nakon obaranja XIAP-a, stanice su tretirane s TNF a ili CD95L / FasL i kultivirane dodatnih 24 h. Mjerenje fragmentacije apoptotske DNA pokazalo je da su HCT116 wt stanice osjetljive na TNF a - ili CD95L / FasL-induciranu apoptozu nakon silazne regulacije XIAP-a. ( b ) HCT116 Bax-Bak-stanice tretirane su kao u ( a ). Mjerenje apoptotskih stanica otkrilo je da HCT116 Bax- / Bak-stanice transficirane kontrolnom siRNA rezistentne su na TNF α - ili CD95L / FasL-induciranu staničnu smrt. Međutim, smanjivanje regulacije XIAP-a omogućilo je TNFa i CD95L / FasL (TRAIL) da induciraju apoptozu, unatoč nedostatku Baxa / Baka. Prikazani su podaci izraženi kao srednje vrijednosti ± SD iz tri pokusa. Razine statističke značajnosti označene su zvjezdicama (* P <0, 05; ** P <0, 01)

Slika pune veličine

Rasprava

Strategije za prevladavanje otpornosti prema TRAIL-u uključuju inhibiciju signala za preživljavanje, na primjer, NF-B B put, 20 inhibiciju proteasoma 21 ili inhibiciju histon-deacetilaze. 22 Inhibitori kinaze Roscovitin ili Sorafenib senzibiliziraju stanice raka na TRAIL pomoću pleiotropnih mehanizama koji uključuju olakšano stvaranje DISC i aktivaciju kaspaze-8, smanjivanje cFLIP i XIAP i supresiju Mcl-1. 14, 23, 24 Strategije koje izravno ciljaju obitelj Bcl-2 uključuju BH3 mimetike poput ABT-737 koji se vežu na hidrofobni žlijeb izložen na površini antiapoptotskih proteina, blokiraju njihovu funkciju proživljavanja i potenciraju apoptozu posredovanu TRAIL-om. 25 Međutim, stanična smrt se još uvijek oslanja na prisutnost Baxa i Baka kao MMP posrednika. Inhibicija IAP-a je još jedan obećavajući pristup senzibiliziranju tumorskih stanica otpornih na liječenje za TRAIL. Pokazalo se da je posebno inhibicija XIAP-a malim molekularnim mimetičarima SMAC sinergirana s TRAIL-om i da potencira apoptozu uzrokovanu TRAIL-om u različitim stanicama karcinoma. 26, 27

Nismo se pozabavili samo ulogom, već i farmakološkim ciljanjem XIAP u signalizaciji tipa I / II. Za razliku od stanica tipa I, stanice II tipa zahtijevaju aktiviranje petlje za pojačavanje mitohondrija da bi se postigla potpuna aktivacija kaspaze koja ovisi o aktivaciji Bida. Zanimljivo je da je nedavno izvješće pokazalo da gubitak XIAP ublažava potrebu za licitacijom hepatatocita izazvanog hepatocitima izazvanim CD95 / Fas miševima. 28

Ovdje smo pokazali da je otpornost na TRAIL stanice karcinoma tipa II s oštećenjima signala središnje mitohondrijske smrti inhibicijom XIAP. To je omogućilo TRAIL-u da inducira apoptozu u stanicama koje prekomjerno eksprimiraju anti-apoptotičke proteine ​​Bcl-2 ili Bcl-x L ili u stanicama nedostatnim za pro-apoptotičke proteine ​​Bax, Bak i Bid. U tim uvjetima apoptozu ne prati MMP i otpuštanje citokroma c ili SMAC, što ukazuje da indukcija stanične smrti nije ovisna o svojstvenom putu. To je suprotno Bax / Bak pozitivnim stanicama, gdje oslobađanje MMP-a i citokroma c prethodi apoptozi. Dakle, smanjivanje vrijednosti XIAP zaobilazi blokadu ćelijske smrti na razini mitohondrija prebacivanjem signala apoptoze s tipa II na tip I. Ovo promatranje značajno proširuje druga istraživanja koja su identificirala razinu aktivacije kaspaze-8 nakon aktivacije receptora smrti kao kritični diskriminacijski faktor između signalizacija apoptoze tipa I / II. 5 Prema ovom modelu, stanice tipa I pokazuju jaku aktivaciju kaspaze-8 nakon ligacije receptora smrti kako bi se izravno aktivirala kaspaza-3, čime se zaobilazi mitohondrija. Suprotno tome, stanice tipa II stvorile bi samo male količine aktivne kaspaze-8 na DISC-u, a snažna aktivacija kaspaze-3 događa se na nivou sekundarnom od mitohondrijskih događaja. Međutim, u HCT116 stanicama aktiviranje kaspaze-8 inducirano TRAIL-om je dovoljno za cijepanje pro-kaspaze-3 bez obzira na gubitak Bax / Bakove ekspresije. Unatoč tome, pro-kaspaza-3 obrađuje se u njegove aktivne podjedinice samo u stanicama s netaknutim mitohondrijskim apoptotičkim-signalnim putem. U nedostatku MMP-a, podjedinice kaspaze-3 razgradile su se XIAP / proteasomskim putem. Nakon aktivacije mitohondrija kroz Bax / Bak, SMAC, oslobođen u citosol, inhibira XIAP i sprječava razgradnju podjedinica kaspaze-3 što rezultira snažnom aktivacijom kaspaze-3 (Slika 7). Slijedom toga, inhibicija XIAP omogućuje kaspazi-8 da izravno inducira dovoljne količine aktivne kaspaze-3 u stanicama HCT116 sa nedostatkom Bax / Bak-a, čime se oslobađanje SMAC-a čini neophodnim. Zajedno, pokazujemo da nije omjer aktivne kaspaze-8, već aktivnost XIAP, koja razlikuje indukciju stanične smrti putem puta II ili tipa I.

Image

Model XIAP kao sklopka između signalizacije tipa I i II. Pojedinosti potražite u tekstu. Mit A, Mitramicin A; BZM, bortezomib

Slika pune veličine

Farmakološkim ciljanjem ove prekidače I / II prevladala bi potreba za Bax / Bakovim iskustvom. U ovom smislu pokazujemo da se obrada pro-kaspaze-3 u njegove aktivne podjedinice bez aktiviranja mitohondrija može provesti inhibicijom proteasoma. Proteasome inhibitors may sensitize tumor cells for TRAIL by enhanced cell surface expression of TRAIL-R1 (DR4) and TRAIL-R2 (DR5), enhanced activation of the initiator caspase-8 and downregulation of cFLIP. 29, 30 Furthermore, bortezomib-induced stabilization of the Bax protein as well as increased levels of Nbk/Bik and Bim were implicated in sensitization for TRAIL killing. 31, 32 Our data suggest that the stabilization of active caspase-3 by blocking its proteasomal degradation, by either inhibiting proteasomal activity or preventing XIAP-mediated ubiquitylation, is the main mechanism responsible for sensitization. Interestingly, the caspase-3 fragments, which accumulate upon proteasome inhibition in addition to TRAIL-treatment, seem to be unubiquitinated (Figure 2a). Caspases have been shown to inhibit XIAP by cleavage 33 and this feedback loop might be responsible for the accumulation of unubiquitinated active caspase-3 upon inhibition of the proteasome. However, inhibition of the proteasome or XIAP result in sufficient generation of active caspase-3 and mediate a switch from a type II to a type I mode of cell death. This notion is supported by experiments where we inhibited XIAP function by the use of the synthetic small molecule IAP inhibitor LBW-242 that mimics the activity of SMAC. LBW-242 is a promising compound to overcome drug resistance. 34, 35 Here, we show that LBW-242 overcomes resistance of Bax/Bak-deficient cancer cells and re-sensitizes these cells to TRAIL. Loss of both Bax or Bak expression has been reported for a number of tumors. 36, 37, 38, 39 Whereas loss of Bax is a frequent event in human cancer, for example, in colon cancers having a microsatellite mutator phenotype, Bak expression persists in most cancers and loss of both is a rare event. Notably, loss of Bax, despite expression of Bak, is sufficient for tumor cells to acquire TRAIL-resistance. In addition, the intrinsic apoptotic pathway of tumor cells can be blocked by other mechanisms, for example, upregulation of Bcl-x L (which efficiently inhibits both, Bax and Bak) or endogenous Bak-inhibitors Mcl-1 or VDAC2 in Bax-deficient carcinoma. 14, 15, 40 The data presented in this study indicate that use of SMAC mimetics is a suitable strategy to antagonize therapy resistance caused by all these central defects in the intrinsic apoptosis machinery and delineates the combined use of TRAIL together with SMAC mimetics as a useful strategy. Altogether, these data show that targeting of XIAP enables death receptor signaling to kill type II cells via a type I pathway and define XIAP as a crucial decision point between these two cell death pathways.

Dodatna informacija

Datoteke slika

  1. 1.

    Dopunska slika S1

  2. 2.

    Dopunska slika S2

  3. 3.

    Dopunska slika S3

Word dokumenti

  1. 1.

    Dopunske slikovne legende

Glosar

Bak

Bcl-2 homologous antagonist/killer

Bax

Bcl-2-associated x protein

Bcl-2

B-cell lymphoma 2

Bcl-x L

long splice variant of Bcl-x

BH3

Bcl-2 homology region 3

Bid

BH3-interacting domain death agonist

BZM

bortezomib

CD95/FasL

cluster of differentiation 95/fibroblast-associated ligand

IAP

inhibitor of apoptosis proteins

Mcl-1

myeloid cell leukemia 1

Mit A

Mithramycin A

MMP

mitochondrial membrane permeabilization

PI

propidium iodide

SMAC/DIABLO

second mitochondria-derived activator of caspase/direct IAP-binding protein with low pI

TNF

faktor nekroze tumora

TRAIL

tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand

XIAP

X-linked inhibitor of apoptosis

Dodatne informacije nalaze se u ovom radu na web stranici Cell Death and Disease (//www.nature.com/cddis)