Terapijska učinkovitost dna cjepiva usmjerena na endotelni tip ćelije antigen delta nalik ligandu 4 u karcinomu mlijeka | onkogena

Terapijska učinkovitost dna cjepiva usmjerena na endotelni tip ćelije antigen delta nalik ligandu 4 u karcinomu mlijeka | onkogena

Anonim

teme

  • Rak dojke
  • DNK cjepiva
  • Angiogeneza tumora

Sažetak

Notch ligand delta sličan ligand 4 (DLL4) je bitna komponenta izražena endotelnim vršnim stanicama tijekom angiogenog klijanja. Opisali smo konceptualno novu terapijsku strategiju ciljanja angiogeneze tumora i endotelnih vršnih stanica na temelju DNA vakcinacije protiv DLL4. Imunizacija plazmidnom DNK koja kodira DLL4 in vivo elektroporacijom ozbiljno je usporila rast ortotopski implantiranih karcinoma mliječnih proizvoda u miševa induciranjem neproduktivnog angiogenog odgovora. Mehanički gledano, cijepljenje je rezultiralo prekidom tolerancije na samo-antigen, DLL4, što je dokazano proizvodnjom inhibicijskih i inherentno terapijskih antitijela protiv mišjeg DLL4. Važno je da nisu zabilježeni dokazi za odgođen odgovor zacjeljivanja rana ili toksičnost povezana s farmakološkom blokadom signala DLL4 kod miševa imuniziranih s DLL4 cjepivom. Stoga smo razvili dobro podnošenu strategiju cijepljenja DNA koja cilja ciljne stanice endotelija i antigena DLL4 s dokazanom terapijskom učinkovitošću na mišjim modelima karcinoma mliječnih mlijeka; oboljenje za koje se navodi da dramatično inducira ekspresiju DLL4. Moguće je da indukcija imuniteta prema glavnim medijatorima patološke angiogeneze može pružiti zaštitu protiv ponavljajuće maligne bolesti u okruženju adjuvantne terapije.

Uvod

Najčešće korišteni cilj za razvoj anti-angiogenih režima terapeutske vrijednosti kod raka je vaskularni endotelni faktor rasta (VEGF), zbog njegove dobro dokumentirane uloge u promicanju rasta endotelnih stanica, migracije i klijanja (Pourgholami i Morris, 2008). Nedavno je signalizacija delta sličnim ligandom 4 (DLL4) kroz njegov receptor Notch1 identificirana kao jednako kritična komponenta fiziološke i patološke neovaskularizacije (Noguera-Troise i sur., 2006; Ridgway i sur., 2006; Hellstrom i sur., 2007; Scehnet i sur., 2007). DLL4 je specifično induciran od strane VEGF-a u klijavim endotelnim stanicama, pri čemu on orkestrira stvaranje pravilnih angiogenih klica. Blokada funkcije DLL4 rezultira hipersproproziranjem zbog gubitka lateralne inhibicije fenotipa endotelnih vršnih stanica posredovanog putem Notch1. Posljedično, postavlja se pretjerani, ali neproduktivni angiogeni odgovor, karakteriziran lošom perfuzijom što rezultira hipoksijom. U eksperimentalnim tumorima, DLL4 signalizacija Notch1 u endotelu djeluje na poboljšanje vaskularne funkcije (Li i sur., 2007). Suprotno tome, neutralizacija aktivnosti DLL4 smanjuje rast tumora u pretkliničkim modelima, i kao pojedinačno sredstvo, i u kombinaciji s inhibicijom VEGF (Noguera-Troise i sur., 2006; Ridgway i sur., 2006). Malo se zna o lokalizaciji DLL4 u ljudskim tkivima. Međutim, DLL4 se selektivno izražava endotelom malignih tkiva, ali ne i normalnim pandanima u dojci i debelom crijevu (Jubb i sur., 2009, 2010).

Tijekom posljednjih godina ideja iskorištavanja imunološkog sustava za borbu protiv raka intenzivno se razvijala. Terapijsko cijepljenje protiv raka provodi se korištenjem širokog raspona modaliteta cjepiva od peptida ili rekombinantnih proteina koji predstavljaju antigene povezane sa tumorom, do cjepiva koja se sastoje od autolognih tumorskih stanica (Pejawar-Gaddy i Finn, 2008). Studije o cijepljenju kod ljudi, kako s rekombinantnim proteinima (Ullenhag i sur., 2004), tako i s genetskim virusnim cjepivima za virusni vektor (Schlom i sur., 2007), rezultirale su produženim preživljavanjem bolesnika. Genetska vakcinacija, odnosno prijenos genetski kodiranog antigena za unos i translaciju u stanicu domaćina, nova je i obećavajuća metoda imunizacije i protiv malignih i zaraznih bolesti (Liu i sur., 2006). Pored prednosti, kao što su mogućnost istodobne uporabe više antigena i jednostavnost modifikacije i proizvodnje, svojstvena svojstva prokariotske kralježnice DNA također rezultiraju stimulacijom urođenog imunološkog sustava, pružajući tako dodatna adjuvantna svojstva tijekom imunizacije (Liu i sur., 2006). Za rutinsku upotrebu odobreno je nekoliko veterinarskih DNK cjepiva, uključujući cjepivo protiv konja zapadnog Nila (Davis i sur., 2001) i cjepivo za liječenje uznapredovalog melanoma pasa (Bergman i sur., 2003). Oni, zajedno s nedavnom studijom koja pokazuje da vakcinacija plazmidnom DNA kod ljudi rezultira zaštitom od izazivača gripe (Jones i sur., 2009), jasno pokazuju terapeutski potencijal cijepljenja plazmidnom DNA.

U ovom istraživanju smo opisali razvoj strategije cijepljenja DNA usmjerenih na stanice endotelnih vrhova tumora imunizacijom plazmidnom DNA koja kodira DLL4 . Imunizacija miševa in vivo elektroporacijom ublažila je rast tumora u dva ortotopična mišja modela ERCB2 ekspresionirajućeg karcinoma mlijeka. Tražeći mehanizam za uočene učinke, otkrili smo da je cijepljenje protiv DLL4 rezultiralo nesrazmjernim i slabo perfuziranim vaskularnim krevetom zbog indukcije snažnog i inhibicijskog humoralnog odgovora protiv samo-antigena, DLL4. Važno je da miševi imunizirani s DLL4 cDNA nisu pokazali kašnjenje u zacjeljivanju rana, što ukazuje da fiziološka angiogeneza nije utjecala strategijom cijepljenja. Stoga naša studija identificira cijepljenje DNA protiv angiogeneze tumora ciljanjem DLL4 kao obećavajući i dobro podnošen pristup za daljnji razvoj prema kliničkim ispitivanjima.

Rezultati

Ksenogena imunizacija DNA intradermalnom elektroporacijom inducira humoralni imuni odgovor na DLL4

Da bismo stvorili DLL4 plazmidno cjepivo, klonirali smo cDNA koja kodira humani DLL4 u vektor ekspresije pVAX1 ( DLL4 cjepivo), koji je posebno dizajniran za razvoj DNK cjepiva i odobren za uporabu na ljudima. Ekspresija proteina DLL4 potvrđena je Western blot analizom lizata iz HeLa stanica transfektiranih DLL4 plazmidom (slika 1a). Zatim smo imunizirali miševe koristeći jedan od dva različita protokola (slika 1b). Jedna skupina miševa imunizirana je tri puta 4 tjedna odvojeno ubrizgavanjem 40 μg cjepiva DLL4 ili praznim vektorom intradermalno u bok, na dvije lokacije, a zatim in vivo elektroporacijom na svakom mjestu ubrizgavanja (u daljnjem tekstu imenovan protokol imunizacije 1). Druga skupina miševa primila je dvije injekcije 80 µg cjepiva DLL4 intramuskularnom injekcijom odvojeno 4 tjedna i konačnu imunizaciju injekcijom 40 µg cjepiva DLL4 intradermalno na dvije lokacije, nakon čega je slijedila in vivo elektroporacija na svakom mjestu ubrizgavanja (u daljnjem tekstu označeno imunizacijski protokol 2). Nisu zabilježeni otvoreni štetni učinci imunoloških protokola na dobrobit miševa. Da bismo provjerili jesu li strategije imunizacije uspješne, analizirali smo serume imuniziranih miševa na antitijela protiv humanog DLL4 testom imunosorbentom vezanim za enzim. Za razliku od seruma iz miševa imuniziranih s praznim vektorom, serumi iz miševa imuniziranih ili protokolom 1 ili protokolom 2 sadržavali su antitijela koja prepoznaju rekombinantnu izvanstaničnu domenu humanog DLL4 u lako otkriti titre (Slika1c; podaci nisu prikazani).

Image

Imunizacija DLL4 kodiranom plazmidom rezultira imunološkim odgovorom na BALB / c miševima. ( a ) Ekspresija humanog DLL4 provjerena je prolaznom transfekcijom HeLa stanica s praznim vektorom ili vektorom koji kodira DLL4 (p DLL4 ) i analiziran je Western blotom. Rekombinantni humani DLL4 korišten je kao pozitivna kontrola (rhDLL4). ( b ) Ženke BALB / c miševi imunizirani su ili intramuskularno (IM) ili intradermalno (ID) u skladu s opisanim protokolima. Sve intradermalne injekcije date su u kombinaciji s elektroporacijom (EP). Tjedan dana nakon konačne imunizacije životinje su bile izazvane ortofopskom injekcijom D2F2 / E2 ili TUBO stanica u jastučić za mliječne masti. ( c ) Da bi se istražilo je li cijepljenje izazvalo imunološki odgovor, serum je uzet 10 dana nakon konačne imunizacije (protokol 1) i analiziran testom imunogorbensa koji je povezan sa humanim DLL4 (ELISA). Slika prikazuje reprezentativnu analizu za jednog od četiri analizirana miševa.

Slika pune veličine

Vakcinacija protiv antigena endotelnih vršnih stanica DLL4 terapeutski je efikasna u karcinomu mliječnih mlijeka

Da bismo ispitali ima li imunizacija miševa plazmidom DLL4 terapeutsku vrijednost, iskoristili smo ortofopske modele karcinoma mišjih mlijeka koji eksprimiraju ERBB2. D2F2 / E2 stanice su izvedene iz spontanog tumora mliječne žlijezde kod BALB / c miša i transficirane su cDNA koja kodira ERBB2 (Wei i sur., 1999). Imunostabilna analiza pokazala je da je DLL4 visoko i specifično izražen u vaskulaturi tumora D2F2 / E2 (Slika 2a). Miševi imunizirani s praznim vektorskim ili DLL4 cjepivom bili su izazvani ortofopično s tumorima 1 tjedan nakon zadnje imunizacije injekcijom D2F2 / E2 stanica u četvrti jastučić ingvinalne masne kiseline. Imunizacija protokolom 1 rezultirala je značajnim kašnjenjem rasta tumora u usporedbi s rastom tumora kod miševa imuniziranih s praznim vektorom (Slika 2b; P <0, 01). Na kraju eksperimenta, kontrolni miševi predstavljeni s prosječnim volumenom tumora od 372 ± 141 mm 3, dok su miševi ubrizgani DLL4 cjepivom pokazali prosječni volumen tumora od 134 ± 84 mm 3 . Slično tome, rast tumora kod miševa imuniziranih protokolom 2 značajno je odgođen, a na kraju pokusa prosječni volumen tumora bio je 143 ± 112 mm 3 (slika 2b; P <0, 05). U zasebnoj studiji, rast tumora kod miševa cijepljenih protiv DLL4 zabilježen je duže vrijeme nakon eutanazije miševa imuniziranih vektorima zbog etičkih razloga. Tumori u cijepljenih miševa nastavili su rasti, iako smanjenim tempom, a na kraju studije odgoda rasta u usporedbi s kontrolnom skupinom iznosila je 11 dana (Slika 2c).

Image

DNK cijepljenje protiv DLL4 rezultira suzbijanjem rasta tumora u BALB / c miševima. ( a ) Ekspresija DLL4 u endotelnim stanicama tumora D2F2 / E2 procijenjena je imunofluorescentnim bojenjem za endotelne markere, CD31 (crvena) i DLL4 (zelena). Stanične jezgre su bile kontrastirane pomoću DAPI (plava). Rast ortotopski implantiranog D2F2 / E2 ( b i c ) ili TUBO ( d ) karcinoma mlijeka u BALB / c miševima nakon imunizacije s praznim vektorom ili s DLL4 plazmidnom DNA u skladu s protokolom 1 (3 × ID + EP) ili protokolom 2 (2 × IM, 1 × ID + EP; n = 8 za sve grupe). Podaci prikazani u ( b i d ) reprezentativni su za tri neovisna pokusa. * P <0, 05, ** P <0, 01; Studentski t -test.

Slika pune veličine

Važno je da je oslabljeni rast tumora nakon DNA vakcinacije protiv DLL4, koristeći bilo koji od protokola, također primijećen kod miševa koji su ortofopski injicirani s mišjom staničnom linijom karcinoma mišjeg karcinoma ERBB2, TUBO (slika 2d; P <0, 05).

Uzeti zajedno, pokazali smo terapijsku učinkovitost DNA vakcinacije protiv DLL4 u dva različita modela miša karcinoma mliječne žlijezde koji eksprimiraju ERBB2.

Imunizacija DLL4 cjepivom potiče neproduktivnu angiogenezu

Nakon završetka terapijskih ispitivanja, tumori su izrezani, pregledani su grube fenotipske promjene i pripremljeni za histološku analizu. Otkriveni trombotski događaji na površini tumora otkriveni su za većinu tumora kod miševa imuniziranih s DLL4 cjepivom, dok nijedan od vektorski imuniziranih miševa nije predstavljen s tumorima koji pokazuju trombozu (Slika 3a). Zatim smo izvršili imunološku boju na antigenu endotelne ćelije, CD31, kako bismo ispitali vaskularnost tumora. U skladu s prethodnim studijama korištenjem sredstava za blokiranje DLL4 (Noguera-Troise i sur., 2006 .; Ridgway i sur., 2006), D2F2 / E2 tumori miševa imuniziranih s DLL4 cDNA bilo protokolom 1 ili protokolom 2 pokazali su 60 i 75% veću vaskularnu gustoću, u usporedbi s tumorima miševa imuniziranih s praznim vektorom (Slika 3b; podaci nisu prikazani; P <0, 01). Slični rezultati dobiveni su kod TUBO tumora (podaci nisu prikazani). Da bismo istražili funkcionalnost vaskularne tumorske tumore, sistemski smo perfuzirali miševe koji su nosili tumor s rajčinskim lektinom označenim fluoresceinom. Vaskularni ležaj u tumorima od miševa imuniziranih s DLL4 cjepivom je u velikoj mjeri nefunkcionalan, o čemu svjedoči udio perfuziranog vaskularnog područja od 11 ± 1% (Slika 3c). Suprotno tome, tumori miševa imuniziranih s praznim vektorom pokazali su krvni dio perfuzije vaskularnog područja od 41 ± 13% (Slika 3c; P <0, 01). Značajno je da su velike krvne žile pogodne za miševe inokulirane DLL4 cjepivom (slika 3c). Konačno, procijenili smo apoptotski indeks tumora D2F2 / E2 od miševa imuniziranih vektorima ili DLL4 imunološkom bojom za aktiviranu kaspazu-3. Došlo je do značajnog 2, 2-puta povećanja apoptotske stope tumorskih stanica nakon cijepljenja protiv DLL4 (Slika 3d; P <0, 05). Važno je da je zajedničko bojenje sa vaskularnim markerom CD31 pokazalo da nije došlo do promjene apoptotskog indeksa endotelnih stanica, što sugerira funkcionalno oštećenje endotelnih stanica, nego uklanjanje endotelnih stanica koje eksprimiraju DLL4 kao rezultat. cijepljenja (podaci nisu prikazani). Nije bilo razlike u indeksu proliferacije između dvije skupine (podaci nisu prikazani).

Image

Ciljanjem DLL4 cijepljenjem dolazi do prekomjernog stvaranja nefunkcionalnih krvnih žila. ( a ) Vizualnim pregledom izrezanih tumora D2F2 / E2 otkriveno je očigledna tromboza u tumorima miševa cijepljenih DLL4. ( b ) Gustoća krvnih žila D2F2 / E2 tumora vizualizirana imunološkanjem za marker CD31 endotelijalnih stanica (crveno; n = 5 za svaku skupinu). ( c ) Perfuzirane krvne žile tumora D2F2 / E2 kako je određeno vaskularnom perfuzijom, koristeći rajčni lektin s oznakom fluoresceinom (zeleni; n = 5 za svaku skupinu). Ukupna površina vaskularnog sloja prikazana je imunološkom bojom za CD31 (crvena; n = 5 za svaku skupinu). Područje perfuzije frakcije izraženo je kao perfuzirano područje podijeljeno s ukupnim vaskularnim područjem za svako polje. ( d ) Apoptotički indeks D2F2 / E2 tumorskih stanica kako je određeno imunološkom bojom za aktiviranu kaspazu-3 ( n = 5 za svaku skupinu). * P <0, 05, ** P <0, 01; Studentski t -test.

Slika pune veličine

Stoga smo utvrdili da DNA vakcinacija protiv DLL4 dovodi do promicanja neproduktivne angiogeneze u tumorima, što rezultira povećanom apoptotičkom brzinom tumorskih stanica.

Inhibicija rasta tumora posredovana je humoralnim odgovorom protiv DLL4

Kako bismo rasvijetlili mehanizam kojim imunizacija DLL4 plazmidnom DNK pokazuje terapeutski učinak, proveli smo niz studija koje su imale za cilj istražiti specifičnu ulogu imunološkog odgovora T-stanice i / ili B-stanice. Miševi su imunizirani s praznim vektorom ili DLL4 cjepivom, nakon čega je slezina izrezana i pripremljena je jednostanična suspenzija splenocita. Aktivnost T ćelija mišjeg DLL4 procijenjena je IFN-y ELISpot nakon stimulacije splenocita rekombinantnim vanćelijskim dijelom mišjeg DLL4 ili s bazenom mišjih DLL4 izvedenih peptida za koje se predviđa da se vežu s visokim afinitetom na H2-K d i Molekule H2-D d MHC klase I izražene BALB / c miševima. Nasuprot splenocitima poliklonalno stimuliranim konkanavalinom A, koji su stvorili visoku razinu IFN-γ, nije bilo vidljive indukcije IFN-γ u splenocitima peptidima dobivenim od DLL4, bez obzira na prethodnu imunizaciju s cDNA DLL4 (Slika 4a), Međutim, splenociti miševa koji su primili DLL4 cjepivo pokazali su višu bazalnu razinu IFN-γ nakon izazivanja tumora, u usporedbi s miševima cijepljenim s praznim vektorom (Slika 4b; P <0, 001 za protokol 1, P <0, 01 za protokol 2). Da bismo procijenili je li T stanično posredovani odgovor prema DLL4 dio mehanizma efektora terapeutske učinkovitosti, iscrpili smo CD4 + ili CD8 + T stanice prije izazova tumora ubrizgavanjem antitijela za CD4 ili CD8 u imunizirane miševe. Nakon dvije injekcije protutijela, CD4 + i CD8 + T stanice su iscrpljene za 99, 5 odnosno 99, 6%, kako je procijenjeno protočnom citometrijom (Slika 4c). Značajno, nakon iscrpljivanja T stanica, terapijska učinkovitost cjepiva DLL4 na rast ortotopsko implantiranih karcinoma mliječnih mlijeka D2F2 / E2 nije smanjena, što ukazuje na to da T stanice nemaju primarni dio korisnih učinaka (Slika 4d; P < 0, 01 za sve DLL4- imunizirane skupine prema kontroli). Ovo je otkriće u skladu s nedostatkom pojačane infiltracije imunoloških stanica u D2F2 / E2 ili TUBO tumore cijepljenih miševa, što je procijenjeno imunološkom bojom za CD45 (podaci nisu prikazani).

Image

T stanice nisu posrednici efektorskih funkcija DLL4 cjepiva. ( a ) Odgovori T-ćelija mišjih DLL4 nakon imunizacije protokolom 1 (3 × ID + EP) ili protokolom 2 (2 × IM, 1 × ID + EP) procijenjeni su IFN-γ ELISpot stimulacijom splenocita mišjim DLL4 peptida ili rekombinantnog mišjeg vanćelijskog dijela DLL4 ( n = 5 za svaku skupinu). Rekombinantni karcinoembrionski antigenski proteini i karcinoembrionski antigenski peptidi korišteni su kao negativne kontrole. Poliklonski stimulans konkanavalin A (conA) korišten je kao pozitivna kontrola. Eksperiment je ponovljen tri puta. ( b ) Aktivnost splenocita kod miševa nakon imunizacije protokolom 1 (3 × ID + EP) ili protokolom 2 (2 × IM, 1 × ID + EP) u vrijeme žrtvovanja nakon izazivanja tumora, procijenjena je IFN-y ELISpot bez antigena -specifična stimulacija (vektor, n = 9; protokol 1, n = 8; protokol 2, n = 5). ( c ) Iscrpljivanje stanica CD4 + ili CD8 + započeto je tri dana prije izazivanja tumora injekcijom antitijela anti-CD4 ili anti-CD8 i provjereno protočnom citometrijskom analizom periferne krvi 5 dana nakon ubrizgavanja antitijela. Krivulja rasta tumora od vektora imuniziranih miševa duplicirana je sa slike 2c, koja prikazuje eksperiment izveden istovremeno s pokusom iscrpljivanja T stanica. ( d ) Rast ortotopski implantiranih D2F2 / E2 tumora kod kontrolnih miševa i kod miševa osiromašenih CD4 + / CD8 + stanicama nakon cijepljenja s DLL4 plazmidnom DNA ( n = 6 za sve skupine). ** P <0, 01, *** P <0, 001; Studentski t -test.

Slika pune veličine

Zatim smo analizirali serum od miševa imuniziranih s praznim vektorom ili DLL4 plazmidom na prisustvo antitijela reaktivnih protiv mišjeg DLL4 korištenjem enzimski povezanog imunosorbenskog testa. Serum kontrolnih imuniziranih miševa nije sadržavao imunoglobuline protiv DLL4 (slika 5a). U oštrom kontrastu, svi analizirani serumi miševa koji su primili DLL4 cjepivo, bilo prema bilo kojem protokolu, pokazali su visoke titre antitijela specifičnih za mišji DLL4 (Slika 5a). Nadalje smo procijenili potencijal antitijela prisutnih u serumu od DLL4 imuniziranih miševa da interferiraju sa DLL4 signalizacijom tijekom razvojne angiogeneze mrežnice. Ubrizgavanje DLL4 imunološkog seruma u P3 štenaca pokrenulo je deblju mrežnicu kapilara mrežnice s povećanim brojem grana i vršnih stanica u usporedbi s vektorskim imunološkim serumom na P5 (slika 5b), što ukazuje na prisutnost neutralizirajućih antitijela prema mišjem DLL4. Konačno, da bismo ispitali je li DLL4 imunološki serum inherentno terapeutski, tretirali smo naivne miševe koji nose tumor D2F2 / E2. Zapanjujuće je da je serum iz DLL4 imuniziranih miševa značajno usporio rast tumora, u usporedbi sa serumom kontrolnih imuniziranih miševa (Slika 5c; P <0.01), što sugerira da je terapijska učinkovitost cjepiva posredovana humoralnim odgovorom protiv mišjeg DLL4.

Image

Supresija rasta tumora kod miševa cijepljenih protiv DLL4 posreduje se indukcijom anti-DLL4 antitijela. ( a ) Prisutnost antitijela na mišja DLL4 antitijela u serumu DLL4 imuniziranih miševa analizirana je ELISA. Slika prikazuje reprezentativnu analizu za jednog od četiri analizirana miševa. ( b ) obojenje IsolectinB4 cijelih mrežnih mrežnica P5 od miševa tretiranih imunološkim serumom iz vektora ili DLL4 imuniziranih miševa prema protokolu 1 (3 × ID + EP; n = 4 za svaku skupinu). Strelice označavaju endotelne stanice morfološki identificirane kao vršne stanice. ( c ) Rast ortotopsko implantiranih D2F2 / E2 tumora kod miševa koji su tretirani serumom od miševa imuniziranih vektorom ( n = 12) ili DLL4 plazmidne DNA ( n = 16) u skladu s protokolom 1 (3 × ID + EP). Eksperiment je ponovljen dva puta sa sličnim rezultatima. ** P <0, 01; Studentski t -test.

Slika pune veličine

Ukratko, razvili smo strategiju imunizacije koja može razbiti toleranciju na antigen endotelnog vrha, DLL4, rezultirajući u indukciji DLL4-specifičnih inhibicijskih antitijela koji luče terapijsku aktivnost.

Vakcinacija protiv DLL4 nije povezana s toksičnošću ili zakašnjelim zacjeljivanjem rana

Nedavno istraživanje farmakološke blokade signalizacije DLL4 korištenjem antitijela, zamki ili inhibitora γ-sekretaze izvijestilo je o toksičnostima, uključujući atrofiju stanica jetre, nekrotične srčane lezije i benigne, potkožne ulceracijske neoplazme povezane s dugotrajnom uporabom (Yan i sur., 2010), Da bismo istražili da li cijepljenje protiv DLL4 uzrokuje sličnu patologiju, na miševima smo izvršili nekropsije 5 mjeseci nakon prve imunizacije. Miševi imunizirani s DLL4 cjepivom predstavljeni su jetrima koja se ne mogu razlikovati od miševa imuniziranih vektorima (Slika 6a). Osim toga, nisu zabilježena nekrotična područja u srcu miševa cijepljenih protiv DLL4 (podaci nisu prikazani). Štoviše, u našim istraživanjima koja su upotrebljavala> 80 miševa imuniziranih DLL4 vektorom, nisu primijećene ulceracijske potkožne lezije. Značajno je da nije došlo do kašnjenja u ponovnom rastu krzna na mjestu imunizacije, a ubodne rane iz postupka elektroporacije zacijelile su se bez komplikacija.

Image

Nema dokaza za toksičnost jetre ili odgođeno zacjeljivanje rana nakon imunizacije cjepivom DLL4. ( a ) Bojenje hematoksilinom i eozinom tkivnih dijelova jetre od miševa koji su pokrenuli postupak imunizacije praznim vektorom ili cjepivom DLL4 5 mjeseci ranije. ( b ) Brzina zarastanja izražena kao% zatvaranja rana nanesenih miševima imuniziranim s praznim vektorom ili cjepivom DLL4 ( n = 8 miševa po skupini, dvije rane po mišu). * P <0, 05, ponovljene mjere ANOVA.

Slika pune veličine

Jedan važan faktor koji treba uzeti u obzir pri razvoju pristupa zasnovanih na cjepivu koji ciljaju angiogenu vaskulaturu je je li inhibitorni učinak ograničen na angiogenezu tumora ili se proširuje i na fiziološku tvorbu posuda. Da bismo riješili ovo pitanje, dokumentirali smo postupak zacjeljivanja punih rana pune debljine kod miševa imuniziranih s praznim vektorom ili cjepivom DLL4 . Kao što je prikazano na slici 6b, zacjeljivanje rana odvijalo se sličnom brzinom bez obzira na prethodnu imunizaciju, s tim da su rane nanesene miševima imuniziranim DLL4 dostigle gotovo potpuno zatvaranje u odnosu na ranije miševe imunizirane vektorima (slika 6b; P <0, 05).

Uzeto zajedno, nisu zabilježeni nikakvi štetni događaji koji su posljedica blokade fiziološke signalizacije DLL4 u homeostazi jetre ili zacjeljivanju rana kod miševa koji su bili podvrgnuti našoj strategiji cijepljenja.

Rasprava

DLL4 signalizacija predstavlja uzbudljivu novu metu za ograničavanje funkcionalne angiogeneze tumora, što pokazuju nedavna istraživanja (Noguera-Troise i sur., 2006; Ridgway i sur., 2006). Prema tome, inhibicija DLL4 signalizacije primjenom neutralizirajućih antitijela ili topljivim DLL4-Fc fuzijskim proteinom rezultira dramatično oslabljenim rastom tumora u mišjim modelima ksenografta. Fenotipske analize pokazuju prividno paradoksalno povećanje vaskularnosti zbog blokade signalizacijom putem DLL4-Notch1. DLL4 signalizacija putem svog receptora, Notch1, izražena susjednom endotelnom stanicom, neophodna je za formiranje odgovarajućeg broja endotelnih vršnih stanica u odnosu na endotelne stabljike (Hellstrom i sur., 2007). Stoga, smanjena aktivacija Notch1 dovodi do suvišnog stvaranja endotelnih vršnih stanica, i kao rezultat toga, prekomjernog angiogenog klijanja i nefunkcionalne vaskularne mreže. Suprotno tome, ektopična aktivacija Notch1 pomoću DLL4 dovodi do inhibicije rasta tumora praćene hipovaskularnošću (Segarra i sur., 2008). Naše analize pokazale su da je vaskularni fenotip tumora uzgojenih kod miševa inokuliranih DNA vakcinom protiv DLL4 bio sličan onom tumora miševa koji su tretirani DLL4-blokirajućim antitijelima, odnosno povećana vaskularna gustoća paralelna sa smanjenom vaskularnom perfuzijom. U skladu s pojačanim, ali neproduktivnim, angiogenim klijanjem u tumorima imuniziranih miševa, perfuzija je bila ograničena na velike krvne žile. Nadalje, pronašli smo visoke titre antitijela protiv mišjeg DLL4 u serumu nakon imunizacije plazmidnom DNA koja kodira humani DLL4 ; otkriveno je da serum reproducira karakteristične promjene inhibicije signala DLL4 tijekom razvojne angiogeneze mrežnice i da inhibira rast tumora kod naivnih miševa. Primjetno, moćan humoralni odgovor protiv mišjeg DLL4 jasno pokazuje da je ksenogena strategija cijepljenja uspjela razbiti toleranciju na samo-antigen, DLL4. Međutim, unatoč našoj nesposobnosti da pokažemo prisutnost T-stanica specifičnih za DLL4 u cijepljenim miševima, splenociti imuniziranih miševa pokazali su veću bazalnu produkciju IFN-y; čija relevantnost ostaje neodređena. Nejasno je koji je tip stanice izvor IFN-γ, ali iscrpljivanje stanica CD4 + i CD8 + T ukazuje na to da ti tipovi stanica nemaju nikakvog utjecaja na efektorski mehanizam DLL4 cjepiva u korištenim modelima. Da li druge imunološke stanice, poput prirodnih stanica ubojica, doprinose proizvodnji IFN-γ i antitumorski učinci još trebaju biti istraženi.

Mogućnost imunizacije protiv angiogeneze tumora je intrigantna jer bi cijepljenje omogućilo poluprofilaktički pristup liječenju, odnosno sprečavanje recidiva kod pacijenata bez tumora, a ne liječenje već postojećih tumora. Dugotrajan i moćan imunitet protiv presudnih posrednika angiogeneze, kao što je DLL4, mogao bi zamisliti indukciju uspavanog, ne angiogenog stanja diseminiranih mikro metastaza, a time i trajnu zaštitu protiv rekurentnog rasta bez potrebe za kroničnim i skupi farmakološki tretmani s potencijalnim nuspojavama. Doista, mogućnost stvaranja dugoročne memorije protiv antigena tumorskih stanica nakon post-kirurškog cijepljenja prikazana je kod oboljelih od kolorektalnog karcinoma imuniziranih karcinoembrionskim antigenom, u kojima je titar antitijela 24 mjeseca nakon posljednje cijepljenja u korelaciji s dužim preživljavanjem (Ullenhag i sur., 2004). Vakcinacija s namjerom da se spriječi angiogeneza tumora provedena je ciljanjem različitih endogenih staničnih antigena, uključujući VEGFR2, angiomotin i receptor faktora rasta koji potiče iz trombocita (Niethammer i sur., 2002; Holmgren i sur., 2006; Kaplan i sur., 2006). U tom kontekstu, DLL4 predstavlja posebno atraktivan terapeutski cilj s obzirom na nedavno prepoznavanje vitalne uloge endotelnih vršnih stanica u organizaciji stvaranja angiogenog klice (Hellstrom i sur., 2007; Suchting i sur., 2007).

Uvođenje dugoročnog memorijskog odgovora protiv angiogeneze općenito, a posebno DLL4, postavlja važna pitanja sigurnosti. Iako su raspoloživi podaci ograničeni, dosadašnja istraživanja cijepljenja protiv angiogeneze ne pokazuju ili imaju samo manje učinke na zacjeljivanje rana ili embrionalnu angiogenezu (Niethammer i sur., 2002; Plum i sur., 2004). Isto tako, nismo pronašli dokaze za odgođeni odgovor zacjeljivanja rana nakon cijepljenja protiv DLL4, koji bi podržao daljnji razvoj terapije protiv angiogenih cijepljenja. No DLL4 može imati i drugu ulogu u održavanju homeostaze tkiva. Nedavno istraživanje pokazalo je pojavu jetrene toksičnosti, nekroze srca i benignih vaskularnih neoplazmi u koži nakon dugotrajne farmakološke blokade DLL4 (Yan i sur., 2010). Nisu primijećene patološke promjene kod miševa cijepljenih protiv DLL4 tijekom 5 mjeseci, što ukazuje da endogena indukcija antitijela koje ciljaju DLL4 dovodi do uravnoteženije inhibicije, nudeći terapijski prozor za selektivno liječenje zloćudnog rasta. Unatoč tome, potrebne su pažljivije analize rada organa i kroničnih učinaka kako bi se osigurala sigurnost postupka.

Malo se zna o ekspresiji DLL4 u ljudskim tumorima. Karcinomi bubrežnih stanica dramatično povećavaju DLL4, posebno u vaskulaturi, što pokazuje in situ hibridizacija, a ekspresija je u korelaciji s obiljem VEGF (Patel i sur., 2005). Ekspresija endotelnog DLL4 i VEGF-A je također korelirana u karcinomu debelog crijeva (Jubb i sur., 2009). Naše studije pokazuju da ponovljeno DNK cijepljenje protiv DLL4 ima terapijsku efikasnost u dva različita ortopična modela miša karcinoma mliječne žlezde koja eksprimira ERBB2. Zanimljivo je da je otkriveno da karcinomi dojke kod ljudi dosljedno povećavaju DLL4 prosječno 25 puta u usporedbi s normalnim tkivom dojke (Ayyanan et al., 2006). Međutim, nisu učinjeni napori koji bi pokazali je li ekspresija DLL4 ograničena na vaskulaturu. U odvojenom izvještaju, u kojem je korišten imunološki utjecaj, otkriveno je da je DLL4 u endotelu neovisan prognostički faktor nepovoljnog ishoda kod velikog broja bolesnika s karcinomom dojke (Jubb i sur., 2010). Dodatne studije koje ispituju povezanost razine ekspresije ili obrasca DLL4 s kliničkim parametrima stoga su visoko opravdane.

Nedavno je pokazano da blokada DLL4 signala smanjuje učestalost stanica koje iniciraju tumor u ksenografima karcinoma debelog crijeva (Hoey i sur., 2009), što ukazuje da mogu postojati dodatne koristi od inhibicije signalizacije DLL4, pored otvorenog anti- angiogeni učinci. Ipak, vjerovatno je da bi se terapijski potencijal strategije cijepljenja najbolje realizirao u kombinaciji s klinički odobrenim režimima koji ciljaju druge vrste stanica unutar tumora, kao što su kemoterapijski lijekovi (na primjer, taksani), ciljana terapija (na primjer, trastuzumab) ili druge anti-angiogene tretmane (na primjer, bevacizumab). Naš razvoj dobro podnošljivog i djelotvornog cjepiva protiv patološke angiogeneze ciljenjem DLL4 izraženog endotelnim vršnim stanicama postavlja temelj za pretkliničku optimizaciju terapijskog režima u pripremi za klinička ispitivanja.

Materijali i metode

Njega životinja

Sve opisane studije na životinjama odobrio je lokalni odbor za brigu o životinjama (Sjever Stockholm, Švedska).

Plazmidi i imunizacije

CDNA koja kodira humani DLL4 (Genecopoeia, Germantown, MD, SAD) klonirana je u pVAX1 vektor (Invitrogen AB, Carlsbad, CA, SAD) koristeći EcoRl i SalI restrikcijska mjesta. DNA za imunizaciju proizvedena je preparatom bez endotoksina upotrebom endo-free Giga kompleta (Qiagen, Hilden, Njemačka).

Ženke BALB / c miševi, stari 6 do 8 tjedana, imunizirani su tri puta u naznačenim intervalima (slika 1b), intramuskularnom injekcijom 80 µg DNA u musculus tibialis ili intradermalnom injekcijom 2 x 40 µg DNA odmah nakon čega slijedi elektroporacija, Intradermalna elektroporacija (2 impulsa, 1125 V / cm, 50 μs; +8 impulsa, 275 V / cm, 10 ms) mjesta ubrizgavanja izvedena je korištenjem elektroporacijskog sustava Derma Vax (Cyto Pulse Sciences, Inc., Glen Burnie, dr. Med., SAD).

Western blot

Ekspresija proteinskog produkta plazmidnog cjepiva provjerena je prolaznom transfekcijom HeLa stanica pomoću lipofektamina LTX (Invitrogen AB). Stanice su skupljene nakon 48 sati i podvrgnute su se zapadnom blotu koristeći zečje poliklonalno antitijelo protiv DLL4 (R&D Systems, Minneapolis, MN, USA).

Stanični vodovi i eksperimenti s izazovima tumora

Stanične stanice BALB / c karcinoma dojke, TUBO i D2F2 / E2, ljubazno su pružili prof Guido Forni (Sveučilište u Torinu, Italija) i prof Wei-Zen Wei (Državno sveučilište Wayne, MI, SAD). Za eksperimente s izazovima tumora, miševi su primili ortotopske injekcije 1 × 106 stanica TUBO ili D2F2 / E2 u četvrtom jajovodu masnih masnih kiselina.

Enzimski imunosorbentni test

Ploče su obložene preko noći na 4 ° C sa 2 pmol rekombinantnog humanog DLL4 (Bioinvent International, Lund, Švedska) ili 1 pmol rekombinantnog mišjeg DLL4 (R&D Systems) po jažici u 50 μl 0, 1 M natrijevog karbonata, pH 9, 5. Serumi su serijski razrijeđeni i inkubirani na pločama 1 sat na sobnoj temperaturi, a nakon što su protutijela vezana za ispiranje otkrivena korištenjem sekundarnih antitijela povezanih s alkalnom fosfatazom (Applied Biosystems, Carlsbad, CA, SAD).

ELISpot

Kompleti za test IFN-γ ELISpot dobiveni su od Mabtech AB, Nacka, Švedska. Ukratko, splenociti imuniziranih miševa su pročišćeni razdvajanjem fikollom (GE Healthcare Life Sciences, Uppsala, Švedska) i 2 x 105 stanica po jažici dodano je u ploču. DLL4-specifična stimulacija izvedena je s mišjim DLL4 9-mer peptidima dobivenim iz unutarćelijskog dijela DLL4 ili rekombinantnim izvanstaničnim dijelom DLL4 (R&D Systems) u krajnjoj koncentraciji od 5 µg / ml. Karcinoembrionski antigen BALB / c 9-mer peptid CEA 234 (Thermo Fisher Scientific, Ulm, Njemačka) ili rekombinantni karcinoembrionski antigen (Protein Sciences, Meriden, CT, SAD) korišteni su kao negativne kontrole. Poliklonalni stimulans konkanavalin A upotrijebljen je kao pozitivna kontrola.

Imunoziranje i kvantifikacija vaskularne gustoće i perfuzije

Miševima su injicirane intravenski s 50 μl rajčinog lektina s oznakom fluoresceina (Vector laboratories, Burlingame, CA, SAD), kojem je bilo dopušteno da cirkulira 4 minute prije nego što su miševi bili perfuzirani sa 10 ml ledeno hladne 0, 9% otopine NaCl (fosfat -puferirano), a zatim 10 ml 4% paraformaldehida. Tumori su izrezani i zamrznuti u optimalnoj temperaturi rezanja. Odjeljci tkiva su osušeni na zraku, fiksirani u acetonu i blokirani korištenjem proteinskog bloka bez seruma (DAKO, Glostrup, Danska). Imunoizovanje za CD31 provedeno je korištenjem antitijela MEC13.3 (BD ​​Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA), za DLL4 koristeći zečje poliklonalno antitijelo (R&D Systems). Vaskularna gustoća i perfuzija kvantificirani su kao postotak pozitivno obojenog područja, što je određeno u 10 polja velike snage po mišu za pet miševa u svakoj skupini.

Nabava slike mikroskopa

Snimanje je izvedeno pomoću mikroskopa Nikon Eclipse E800 opremljenog ciljevima Nikon Plan Fluor (× 10, NA 0.30; × 20, NA 0.50; × 40, NA 0.75, Nikon Instruments Europe, Amstelveen, Nizozemska) pri sobnoj temperaturi u zraku pomoću Alexa 594 i Alexa 488 spojena sekundarna antitijela. Slike su dobivene pomoću SPOT RTKE kamere (Diagnostic Instruments, Sterling Heigths, MI, USA) koristeći napredni softver SPOT.

Iscrpljivanje T stanica

Iscrpljivanje ili CD4 + ili CD8 + T stanica miševa cijepljenih DLL4 inicirano je ubrizgavanjem 200 μg antitijela štakorskih anti-CD4 (GK1.5) ili štakorskih antitijela na CD8 (TIB-105) 3 dana prije tumora izazov. Rat IgG štakora korišten je kao negativna kontrola (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA, SAD). Miševi su primali dodatne tjedne intraperitonealne injekcije tokom trajanja pokusa. Iscrpljivanje T stanica potvrđeno je protočnom citometrijskom analizom nakon bojenja stanica periferne krvi za CD4 i CD8 (BD Biosciences).

Prijenos seruma

Serum od životinja imuniziranih s praznim vektorom ili DLL4 vektor je sakupljen žrtvovanjem, skupljen i razrijeđen 1: 3 s 0, 9% -tnom otopinom NaCl (fosfat-puferiran). Prijenos seruma izvršen je intraperitonealnom injekcijom 30 μl seruma P3 NMRI štenadama ili 300 μl seruma neposredno nakon inokulacije tumora naivnim miševima, i dva puta tjedno u toku trajanja eksperimenta.

Analiza angiogeneze mrežnice

Retine su uklonjene iz P5 NMRI štenaca i cijele su cijele. Vaskulatura je vizualizirana bojenjem biotiniliranim izolektinomB4 (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, SAD), a zatim streptavidin-Alexa488 (Invitrogen).

Model i analiza rana

Ispitivanje zacjeljivanja rana provedeno je kao što je prethodno opisano (Botusan i sur., 2008) na miševima imuniziranim prema protokolu 1. Ukratko, izvedena je opća anestezija s 3% izofluranom, a dlaka na leđima obrijana je električnim škarama nakon čega krema za depilaciju. Koža je isprana alkoholom i napravljene su dvije rane pune debljine koje se protežu kroz pannicullus carnosus na dorzumu sa svake strane srednje linije, pomoću 6-mm ubodnog uboda. Nakon kirurškog postupka, životinje su individualno smještene. Tijekom prva 2 dana životinje su primale supkutani bupremorfin (0, 03 mg / kg) dva puta dnevno radi ublažavanja mogućih nevolja uzrokovanih postupkom. Svaki tretman ocjenjen je na osam životinja u skupini. Digitalne fotografije zabilježene su na dan operacije i svaki drugi dan nakon ranjavanja. Kružna referenca postavljena je usporedo kako bi se omogućila korekcija udaljenosti između fotoaparata i životinja. Površina rane izračunata je u pikselima, koristeći Slika J 1, 32 (Rasband, WS, ImageJ, Američki nacionalni institut za zdravlje, Bethesda, MD, SAD, //rsb.info.nih.gov/ij/), ispravljena za područje referentnog kruga i izraženo kao postotak izvorne površine.

Statistička analiza

Statističke analize provedene su korištenjem neparnih, dvostranih Student-ovih t- testova ili ponovljenih mjera ANOVA (zacjeljivanje rana) s α = 0, 05.